Janvier 2020 Méthode qualitative et quantitative...2012/07/16 · 05/11/2013 Modification Logiciel V2.1 NA Rev. 2 (2013) 09/03/2015 Modification Logiciel V2.2 NA Rev. 2 (2013) 18/12/2015

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iQ-Check® Legionella pneumophila pour la recherche et le dénombrement des legionella pneumophila dans tous types d’eau

Janvier 2020

Méthode qualitative et quantitative

Attestation n° BRD 07/16-12/07 BIORAD 3 boulevard Raymond Poincaré 92430 MARNES – LA - COQUETTE FRANCE

Ce rapport comprend 28 pages dont 6 annexes. La reproduction de ce rapport n’est autorisée que

sous sa forme intégrale.

AFNOR Validation Rapport de synthèse iQ-Check® Legionella pneumophila

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Préambule Méthode étudiée : iQ-Check® Legionella pneumophila Protocole de validation : Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0 Méthode de référence : NF T90-471 (juin 2015) : Qualité de l’eau - Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR). ISO/TS 12869 (avril 2019) : Qualité de l'eau - Détection et quantification de Legionella spp. et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR). Domaine d’application: Tous types d’eau Organisme de certification : AFNOR Certification (http://nf-validation.afnor.org/)


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1 INTRODUCTION 5

2 ETAT DES MODIFICATIONS INTERVENUES DEPUIS LA PREC EDENTE VALIDATION 5

2.1 HISTORIQUE DE LA VALIDATION 5 2.2 BILAN DES MODIFICATIONS INTERVENUES DANS LA METHODE ALTERNATIVE 7 2.3 BILAN DES RECLAMATIONS UTILISATEURS CONCERNANT LA METHODE 7

3 PROTOCOLES DES METHODES 8

3.1 PRINCIPE DE LA METHODE 8 3.2 REFERENCES DU PROTOCOLE 9 3.3 RESTRICTIONS 9 3.4 METHODE DE REFERENCE 9

4 SYNTHESE DES RESULTATS OBTENUS 9

4.1 ETUDE COMPARATIVE 10 4.1.1 RACCORDEMENT DE LA SOLUTION CALIBRANTE ET DU MATERIAU DE REFERENCE A L’ETALON

PRIMAIRE. 10 4.1.2 FONCTION DE CALIBRAGE 11 4.1.3 VALIDATION DE LA LIMITE DE DETECTION 12 4.1.4 VALIDATION DE LA LIMITE DE QUANTIFICATION 14 4.1.5 SEUIL DE POSITIVITE 14 4.1.6 ETUDE DU RENDEMENT ET DE LA ROBUSTESSE DE L’EXTRACTION 15 4.1.7 SELECTIVITE : INCLUSIVITE ET EXCLUSIVITE 15 4.1.8 PRATICABILITE 16 4.2 ETUDE INTERLABORATOIRE 17 4.2.1 METHODOLOGIE 17 4.2.2 RESULTATS 17 4.2.3 CONCLUSION 17

5 CONCLUSIONS GENERALES 18

6 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE 18

ANNEXE 1 : RACCORDEMENT A L’ETALON PRIMAIRE 20

ANNEXE 2 : FONCTION DE CALIBRAGE 21

ANNEXE 3 : LIMITE DE DETECTION 22


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4

ANNEXE 4 : LIMITE DE QUANTIFICATION 23

ANNEXE 5 : RENDEMENT ET ROBUSTESSE 24

ANNEXE 6 : SELECTIVITE 27


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1 Introduction Les kits iQ Check® Legionella spp. et iQ Check® Legionella pneumophila ont été validés en 2007. Puis, ils ont fait l’objet de reconduction en 2011 et 2015 et d’une extension en 2012. BIORAD souhaite reconduire la méthode iQ Check® Legionella pneumophila selon le « Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0 ».

2 Etat des modifications intervenues depuis la précédente validation

2.1 Historique de la validation 2007 : � La méthode a été initialement validée en 2007. 2011 : � L’étude réalisée en 2010/2011 en vue de la reconduction de validation, a tenu compte

des modifications apportées à la fois au kit validé et au protocole de validation (révision n°1 prenant en compte la norme NF T90-471 publiée en avril 2010).

� Une étude tierce partie a porté sur les 2 premières phases du protocole de validation, afin de vérifier les performances annoncées par le fournisseur pour la nouvelle formulation du kit iQ-Check® L. pneumophila :

- Phase 1 : étude des limites de détection et de quantification de l’étape PCR, de la fonction de calibrage, du raccordement à l’étalon primaire, du rendement et de la robustesse de l’extraction en utilisant le kit Aquadien™. Le nouveau thermocycleur CFX 96 a été mis en œuvre.

- Phase 2 : étude de l’inclusivité et de l’exclusivité, de la praticabilité et de la qualité des réactifs.

� L’étude inter-laboratoire réalisée en 2007, n’a pas été refaite.


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� Les modifications intervenues depuis la validation initiale étaient les suivantes : - Dans le kit iQ-Check® L. pneumophila : origine différente de la Taq

polymerase et évolution de la chimie des sondes du contrôle interne (fluorophore TEXAS RED remplacé par le fluorophore HEX).

- Dans le kit Aquadien™ : 2 modalités d’utilisation selon la filtrabilité des échantillons (un protocole W2 pour échantillons colmatants s’ajoute au protocole classique) et la microfiltration double-tangentielle remplace la microfiltration horizontale pour l’étape de purification de l’ADN. Les membranes et matériaux restent de même composition.

- Un nouveau thermocycleur peut être utilisé : le CFX96 avec le logiciel CFX Manager Sofware Industrial Diagnostic Edition en version V1.1.

2012 : � Une extension de validation a été prononcée en 2012 suite à l’évolution des

caractéristiques du thermocycleur CFX96, qui devient le CFX96 Deep Well Touch. Les modifications portent sur le volume réactionnel du bloc chauffant, sur l’interface utilisateur (clavier et écran), et sur le logiciel CFX Manager qui passe en version V1.2.

� Le Bureau Technique d’AFNOR Certification a qualifié ces évolutions comme mineures et sans impact sur les performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été réalisé.

2013 : � Fin mai 2013 , la validation de la méthode iQ-Check® L. pneumophila a été étendue

à la norme ISO/TS 12869. Aucun complément d’étude de validation n’a été nécessaire : les essais précédemment réalisés selon la norme NF T90-471 répondent aux exigences de la norme ISO/TS 12869.

� Novembre 2013 : Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.1. Aucun complément d’étude de validation n’a été nécessaire

2015 : � Mars 2015 Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v2.2. Aucun

complément d’étude de validation n’a été nécessaire � Octobre 2015 : reconduction de la méthode iQ-Check® L. pneumophila avec

extension sur la détection (recherche qualitative) Legionella pneumophila sans test supplémentaire. Le Bureau Technique d’AFNOR Certification a qualifié cette évolution comme sans impact sur les performances du kit, aucun essai supplémentaire n’a donc été réalisé.

2018 : � Juin 2018 Evolution de la version du logiciel CFX manager IDE v3.0. Aucun

complément d’étude de validation n’a été nécessaire


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L’historique de validation est résumé dans le tableau ci-après :

Méthode

certifiée

Date

approbation

Objet commentaires Labo expert Protocole de

validation PCR

iQ-check®

Legionella

pneumophila

18/12/2007 Validation IPL SED Nord Rev. 0 (2006)

10/06/2011 Reconduction 1 Evolution du mix PCR

2 modalités d’extraction (protocole

W2)

Mise à jour selon protocole version 1

IPL SED Nord Rev. 1 (2011)

04/04/2012 Extension 1 Nouveau thermocycleur (Deep Well

touch)

Eurofins IPL Nord Rev. 1 (2011)

27/05/2013 Extension 2 Protocole de validation V.2 NA Rev. 2 (2013)

05/11/2013 Modification Logiciel V2.1 NA Rev. 2 (2013)

09/03/2015 Modification Logiciel V2.2 NA Rev. 2 (2013)

18/12/2015 Reconduction 2 Les modifications entre la version 2.0 et 3.0 du protocole de validation AFNOR concerne le seuil de positivité (détection qualitatif) et n’ont pas engendrées d’étude complémentaire.

AdGene avec

extension sur test

qualitatif

Rev 3 (2015)

Juin 2018 Logiciel V3.0

Dec. 2019 Reconduction 3 AdGene Rev 3 (2015)

2.2 Bilan des modifications intervenues dans la méthode alternative Le protocole de validation est identique à celui de la dernière reconduction. Modifications de la méthode alternative Il n’y a pas eu de modifications de la méthode alternative depuis la dernière reconduction.

2.3 Bilan des réclamations utilisateurs concernant la méthode Aucune réclamation client utilisateur n’a été enregistrée par AFNOR Certification.


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3 Protocoles des méthodes

3.1 Principe de la méthode Le kit iQ Check® Legionella pneumophila. est un kits destiné à la détection ou la quantification des bactéries du genre Legionella espèce pneumophila dans les échantillons d’eau, à l’aide de la PCR (Réaction de Polymérisation en Chaine) qui permet grâce à des séquences spécifiques du genre Legionella d’être amplifiées et détectées grâce à des sondes fluorescentes. Le principe repose sur trois étapes :

- Filtration de l’échantillon - Extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ - Amplification des séquences cibles Legionella pneumophila.

L’extraction de l’ADN via le kit Aquadien™ repose sur une lyse alcaline et un choc thermique suivi d’une purification par ultrafiltration. Une fraction de cet ADN est ensuite utilisée pour être amplifiée par PCR en temps réel. Au cours de la réaction de PCR, les amorces s’hybrident à la région cible. La Taq polymérase utilise alors ces amorces et les desoxynucléotides triphosphates (dNTPs) pour élonger l’ADN créant des copies de l’ADN cible de Legionella pneumophila. Durant la PCR, la sonde oligonucléotidique spécifique s’hybride aux amplicons. Cette sonde est marquée par un fluorophore qui émet une fluorescence uniquement après hybridation aux amplicons. En présence d’ADN cible dans l’échantillon, l’intensité de la fluorescence croit proportionnellement à l’augmentation de la quantité de produits amplifiés. La fluorescence est mesurée directement par le module optique du thermocycleur pendant l’étape d’hybridation. Le logiciel associé à l’appareil affiche en temps réel l’intensité de la fluorescence mesurée en fonction du nombre de cycle d’amplification. Pour chaque réaction, le logiciel détermine un Ct (cycle à partir duquel la fluorescence est supérieure au bruit de fond). La lecture des valeurs de Ct permet de détecter la présence des séquences d’ADN cibles de Legionella pneumophila, qui signale la présence de la bactérie dans l’échantillon d’eau analysée. La quantification est possible en utilisant des solutions d’ADN calibré iQ Check® Legionella Quantification Standards, raccordées à l’étalon primaire du Centre National de Référence des Légionelles. Pour chaque échantillon, un ADN synthétique servant de contrôle interne (IPC) est inclus dans la solution d’amplification pour détecter d’éventuels phénomènes d’inhibition de la PCR. L’IPC est amplifié en même temps que les séquences cibles de legionella pneumophila, avec les mêmes amorces, mais détecter avec un autre fluorophore.


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Les kits iQ Check® Legionella pneumophila sont validés avec les matériels suivants :

Logiciel

Opticon

Monitor 3.4

CFX manager Software

Industrial Diagnostic

Edition V2.2

CFX manager

Software Industrial

Diagnostic Edition V3.0

Chassis PTC-200 C1000 C1000 touch

Tête optique / bloc chauffant Chromo4 CFX96 CFX96 Deep well

3.2 Références du protocole Aquadien™ (Réf. 3578121) : 12/2015 – Code : 881116 iQ-Check® L. pneumophila (Réf. 3578103) : 12/2015 – Code : 881117

3.3 Restrictions

La certification du kit porte sur l’utilisation avec les thermocycleurs Bio-Rad Chromo™4 et CFX96.

3.4 Méthode de référence

� NF T90-471 (juin 2015) : Qualité de l’eau - Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR).

� ISO/TS 12869 (avril 2019) : Qualité de l'eau - Détection et quantification de

Legionella spp. et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR).

� Protocole de validation PCR : Protocole de validation pour les méthodes

commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0

4 Synthèse des résultats obtenus Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus avec la révision V1.0 du protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Ils sont également conformes avec la version V2.0 car elle ne contient aucune modification majeure engendrant d’étude complémentaire.


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4.1 Etude comparative 4.1.1 Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à

l’étalon primaire.

� Méthodologie Le raccordement de la solution calibrante de travail à l’étalon primaire est effectué pour couvrir le domaine de quantification avec 3 gammes de solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella pneumophila et comprenant 4 niveau de concentration d’unités génome de Legionella pneumophila sérogroupe 1 (QS1, QS2, QS3, QS4) et 3 gammes indépendantes d’étalon primaire préparées en ciblant les 4 niveaux de concentration de la gamme d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards. Le raccordement du matériau de référence à l’étalon primaire a été évalué en analysant les résultats de deux dépôts du matériau de référence fourni avec le kit iQ-Check® Legionella pneumophila. Les 6 gammes indépendantes obtenues et le matériau de référence ont été analysées avec le kit iQ-Check® Legionella pneumophila au cours de la même série d’amplification sur le thermocycleur CFX96.

� Résultats Les paramètres analysés pour évaluer le raccordement des solutions calibrantes et du matériau de référence à l’étalon primaire sur le thermocycleur CFX96 et Chromo 4 sont repris dans le tableau suivant


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Droite de régression Corrélation Efficacité (%)

Gamme de référence (CFX96) C(t) moyen = -3,429.log(x) + 39,891 0,998 95,7

Gamme de référence (Chromo 4) C(t) moyen = -3,330.log(x) + 39,229 0,993 99,7

Solution calibrante Erreur de calibrage

QS1 QS2 QS3 QS4

Par niveau (CFX96) 0,03 0,12 0,12 0,10

Par niveau (Chromo 4) -0,05 0,00 0,00 0,06

Moyenne (CFX96) 0,09

Moyenne (Chromo 4) 0,00

Equivalence des pentes (CFX96) 0,07

Equivalence des pentes (Chromo 4) 0,11

Matériau de référence Erreur de calibrage

CFX96 0,09

Chromo 4 0,16

Les données brutes sont présentées en annexe 1.

� Conclusion

La solution calibrante et le matériau de référence du kit iQ-Check® L. pneumophila satisfont les conditions de raccordement à l’étalon primaire sur les thermocycleurs CFX96 et Chromo 4. 4.1.2 Fonction de calibrage

� Méthodologie L’étude de la fonction de calibrage est réalisée en déposant 5 gammes différentes de solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards (comprenant 4 niveaux de concentration d’unités génomes de Legionella pneumophila), fournie avec le kit iQ-Check® Legionella pneumophila. Les 5 mesures ont été effectuées avec le kit iQ-Check® Legionella pneumophila pour chaque niveau de concentration dans les conditions de reproductibilité.


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� Résultats Dans ces conditions, l’équation de la droite de régression et l’efficacité de la réaction de PCR ont été définis. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

Droite de régression -3,618.log(x) + 42,447

Efficacité 89,0 %

Performances de la régression linéaire :

QS1 QS2 QS3 QS4

Biais 0,00 -0,02 0,02 -0,01

Ecart type 0,15 0,03 0,04 0,07

Exactitude de

linéarité 0,15 0,03 0,05 0,07

Incertitude de

linéarité 0,47 0,10 0,15 0,22

Les données brutes sont présentées en annexe 2

� Conclusion Pour chaque niveau de la gamme, la régression linéaire satisfait l’exigence d’exactitude inférieure à 0,15. La linéarité est donc vérifiée sur tout le domaine couvert par la gamme de solutions d’ADN calibré iQ-Check® Legionella Quantification Standards fournie avec le kit iQ-Check® Legionella pneumophila. 4.1.3 Validation de la limite de détection

� Méthodologie L’évaluation de la limite de détection a été réalisée à partir de 30 dilutions indépendantes d’ADN de Legionella pneumophila à 5 UG par PCR. Les amplifications en duplicat ont été faites dans des conditions de répétabilité. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.


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� Résultats L’ensemble des résultats est présenté en annexe 3.

� Conclusion Les 30 duplicats sont positifs, la limite de détection est donc validée pour 5 UG/puits de PCR. L’ensemble des Ct présentés dans le tableau ci-dessus est inférieur à la l’intercept. La détection qualitative est conforme.


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4.1.4 Validation de la limite de quantification

� Méthodologie L’évaluation de la limite de quantification est réalisée en analysant 30 dilutions indépendantes de Legionella pneumophila à 15 UG par puit de PCR. Les 30 solutions ont été amplifiées simultanément en duplicat. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

� Résultats

Résultats

Valeurs théoriques ou critères

de validation

Moyenne x’ (Log UG/puits) 1,337 1,279

Ecart-type (Log UG/puits) 0,102

Biais 0,059

Exactitude de LQ 0,117 0,15

Incertitude de la LQ 0,240 L’ensemble des résultats est présenté en annexe 4.

� Conclusion

La valeur de l’exactitude de la limite de quantification estimée à 0,117. Cette valeur est inférieure à 0,15. La limite de quantification à 0,15 UG/puits PCR du kit iQ-Check® Legionella pneumophila est validée. 4.1.5 Seuil de positivité Le manuel utilisateur prévoit un Cq de 43 au-delà duquel les échantillons sont considérés comme étant inférieure à la limite de détection. L’ensemble des valeurs obtenues pour caractériser la limite de détection a un Cq plus faible que celui de 43. Cette valeur correspond donc bien à un seuil de positivité comme étant inférieure à la limite de détection.


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4.1.6 Etude du rendement et de la robustesse de l’extraction

� Méthodologie Les études de rendement ont été réalisées avec le kit d’extraction Aquadien™ (pour les eaux propres), et Aquadien W2 (pour les eaux colmatantes). Le rendement a été évalué sur 10 échantillons indépendants, artificiellement contaminés à deux niveaux de concentration (1000 et 100 000 UG/puit PCR) de Legionella pneumophila ATCC 33152 et pour 3 matrices différentes : eau stérile, eau chaude sanitaire, eau de tour aéro-réfrigérante. Les échantillons ont été artificiellement contaminés par la suspension mère dont la concentration a été déterminée par 3 quantifications après une étape d’extraction de l’ADN par le protocole de lyse directe sur 3 aliquots. Les résultats ont été obtenus sur CFX96.

� Résultats Rendement Protocole Aquadien Protocole Aquadien W2 Log Moyenne Log Moyenne Eau chaude sanitaire 1000 UG/L

100 000 UG/L -0,41 -0,40

-0,41 -0,47 -0,56

-0,51

Eau de tour aéroréfrigérante

1000 UG/L 100 000 UG/L

-0,17 -0,51

-0,34 -0,47 -0,51

-0,49

Eau minérale 1000 UG/L 100 000 UG/L

-0,18 -0,38

-0,28 -0,47 -0,44

-0,45

Rendement moyen (log) -0,34 -0,49 Variance (log) 0,03 0,01 Incertitude globale élargie (log) 0,77 0,98

Les données brutes sont présentées en annexe 5.

� Conclusion L’étude du rendement et de la robustesse de la méthode permet d’évaluer le rendement moyen de :

- la méthode Aquadien à -0,34 log - la méthode Aquadien W2 à -0,49 log

4.1.7 Sélectivité : inclusivité et exclusivité Pour chacune des souches testées, l’ADN a été extrait à partir d’une suspension bactérienne pure.


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� Inclusivité Les essais d’inclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ 100 UG/puits PCR, estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO à 600 nm. Les ADN des 15 souches Legionella pneumophila testées ont montré une amplification. Les résultats sont présentés en annexe 6.

� Exclusivité Les essais d’exclusivité ont été réalisés sur des extraits d’ADN à une concentration d’environ 10 000 UG/puits PCR estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO à 600 nm. Sur 16 souches non Legionella et 9 souches Legionella autres que pneumophila. Les résultats n’ont pas mis en évidence de réactions croisées. Les résultats sont présentés en annexe 6.

� Conclusion La sélectivité du kit iQ-Check® Legionella pneumophila est conforme. 4.1.8 Praticabilité

� Facilité d’utilisation : les réactifs sont tous fournis dans les kits, et sont prêts à l’emploi. Les séries d’analyse de 1 à 30 échantillons, dans le cadre d’une quantification, sont faciles à gérer. Un technicien connaissant les techniques de microbiologie, biologie moléculaire ainsi que le thermocycleur et son logiciel peut être formé en 1 jour.

� Rendu de résultats rapide : la durée des différentes phases est compatible avec un délai de rendu des résultats court (5 heures).

� Sécurisation des résultats : elle est garantie par l’utilisation d’un contrôle interne d’inhibition (dans le même puits que l’échantillon), et par un logiciel d’analyse des résultats. L’utilisation du logiciel assure en outre la traçabilité complète des informations.


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4.2 Etude interlaboratoire 4.2.1 Méthodologie Une étude inter-laboratoire a été réalisée en 2007, avec 14 laboratoires collaborateurs. Les résultats d'un laboratoire n'ont pas été pris en compte en raison d’un problème technique ayant conduit à l’invalidation de l’étalonnage. Au final, 13 laboratoires ont été retenus pour l’exploitation statistique. La finalité de cette étude est d’évaluer la fidélité (répétabilité et reproductibilité) de la méthode iQ-Check® L. pneumophila :

- pour l’étape d’amplification génique seule (envoi de deux solutions d’ADN de L. anisa et L. pneumophila sg1 à deux niveaux de concentration différents);

- pour l’ensemble de l’analyse (concentration, lyse, extraction, purification et amplification génique) sur des suspensions bactériennes caractérisées de L. pneumophila et Escherichia coli (CIP 54.8) à 2 niveaux de concentration différents;

- pour l’ensemble de l’analyse en situation réelle (eau chaude sanitaire naturellement contaminée en L. pneumophila et Legionella non pneumophila).

- Egalement, une eau garantie sans ADN de Legionella a été envoyée. 4.2.2 Résultats

Type d’échantillons Solution d’ADNs calibrés Eau de distribution dopée Echantillon

naturel

Niveaux de dopage

L. pneumophila

ATCC 33152

2000

UG/µl

20000

UG/µl

4000

UG/200 ml

40000

UG/200 ml Eau chaude

sanitaire

naturellement

contaminée

L. anisa 500 UG/µl 5000

UG/µl

1000

UG/200 ml

10000

UG/200 ml

E. coli 5000

UG/200 ml

50000

UG/200 ml

Nombre de

laboratoires

participant 14 14 14 14 14

retenus 13 13 13 13 13

Test d’homogénéité Nbre d’analyses 20 20 9 9 9

Moyenne (Log) 2.91 3.97 3.42 4.41 3.76

Résultats

Moyenne (Log) 2.93 3.96 3.40 4.44 3.18

r (Log) 0.18 0.08 0.23 0.20 0.62

R (Log) 0.20 0.15 0.96 0.84 0.87

Sr (Log) 0.06 0.03 0.1 0.07 0.22

SR (Log) 0.04 0.05 0.24 0.29 0.21

4.2.3 Conclusion


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Les valeurs de répétabilité r (Log) se situent autour de 0.1 pour les solutions d’ADN (étape de PCR uniquement), et autour de 0.2 - 0.6 pour les suspensions bactériennes (méthode globale), ce qui est acceptable. Cela signifie qu’au sein d’un même laboratoire, on s’attend à des écarts de mesure, sur un même échantillon, de l’ordre d’un facteur 2.5. La répétabilité n’apparaît donc pas comme une source majeure d’erreur. Les valeurs de reproductibilité R (Log) se situent autour de 0.2 pour les solutions d’ADN (étape de PCR uniquement), et autour de 0.9 pour les suspensions bactériennes (méthode globale). Par rapport à la répétabilité, cet ordre de grandeur reste conforme à ce que l’on a l’habitude de rencontrer en analyse microbiologique de l’environnement. Ce qui signifie qu’entre deux laboratoires, on s’attend à des écarts de mesure, sur un même échantillon, de l’ordre d’un facteur 8. La reproductibilité ne participe donc pas de manière démesurée à la dispersion des résultats.

5 Conclusions générales Les performances de la méthode iQ-Check® L. pneumophila sont conformes aux exigences des normes NF T90-471 et ISO/TS 12869 ainsi qu’au protocole de validation AFNOR : Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) V3.0 Le kit iQ-Check® Legionella spp est un kit validé pour la détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR).

6 Etude bibliographique

Trois études ont été publiées depuis 2016 :

• Ditommaso, S., Giacomuzzi, M.,Elisa Ricciardi, M. Zotti, C., 2016. Cultural and Molecular Evidence of Legionella spp. Colonization in Dental Unit Waterlines: Which Is the Best Method for Risk Assessment? International Journal of Environmental Research and Public Health. 13(2): 211

• Montagna, M. T., et al. 2017. Evaluation of Legionella Air Contamination in Healthcare Facilities by Different Sampling Methods: An Italian Multicenter Study. International Journal of Environmental Research and Public Health. 14(7): 670

• Bonetta, S., Pignata, C., Bonetta, S., Meucci, L., Giacosa, D., Marino, E., Gilli, G., Carraro, E., 2017. Viability of Legionella pneumophila in Water


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Samples: A Comparison of Propidium Monoazide (PMA) Treatment on Membrane Filters and in Liquid. International Journal of Environmental Research and Public Health. 14(5), 467

Dans ces articles, les méthodes iQ-Check Legionella ont été employés avec satisfaction.

Il n’y a pas eu de validations externes réalisées par un autre organisme de certification.


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Annexe 1 : Raccordement à l’étalon primaire Résultats provenant iQ-Check™ Quanti L. pneumophila – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

durables Nord


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Annexe 2 : Fonction de calibrage

Niveau (UG/puits) x i 19 390 3900 39000 19 390 3900 39000

x' i =Log(x i ) 1,28 2,59 3,59 4,59 1,28 2,59 3,59 4,59

gamme gamme 1 37,60 33,28 29,21 26,01 yij 37,08 33,15 29,30 25,40 37,34 33,22 29,26 25,71

gamme 2 37,47 33,21 29,33 25,99 k=5 répétitions 37,61 33,05 29,42 25,85 37,54 33,13 29,38 25,92

gamme 3 37,65 33,11 29,44 26,06 37,34 33,22 29,31 26,15 37,50 33,17 29,38 26,11

gamme 4 38,39 33,01 29,26 25,71 37,77 33,00 29,45 25,54 38,08 33,01 29,36 25,63

gamme 5 38,58 33,23 29,30 26,02 38,60 33,06 29,72 25,97 38,59 33,15 29,51 26,00

Moyenne mi 37,81 33,13 29,37 25,87 37,81 33,13 29,37 25,87

Estimation de la droite de régression Pente a = -3,618

Ordonnée à l'origine b = 42,447

Estimation de l'efficacité Efficacité e = 89,0%

Vérification des performances de la régression liné aire

Droite de calibrage 40

38 gamme 1

gamme 2

36 gamme 3

34 gamme 4

gamme 5

32

C(t

)

30

28 26 24 22 20 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 x'i

Niveau x i 19 390 3900 39000 19 390 3900 39000

x' i =Log(x i ) 1,28 2,59 3,59 4,59 1,28 2,59 3,59 4,59

gamme gamme 1 1,34 2,53 3,66 4,54 yij 1,48 2,57 3,63 4,71 1,41 2,55 3,65 4,63

gamme 2 1,38 2,55 3,63 4,55 k=5 répétitions 1,34 2,60 3,60 4,59 1,36 2,58 3,61 4,57

gamme 3 1,33 2,58 3,60 4,53 1,41 2,55 3,63 4,50 1,37 2,57 3,61 4,52

gamme 4 1,12 2,61 3,64 4,63 1,29 2,61 3,59 4,67 1,21 2,61 3,62 4,65

gamme 5 1,07 2,55 3,63 4,54 1,06 2,59 3,52 4,55 1,07 2,57 3,58 4,55

Moyenne mi 1,28 2,57 3,61 4,58 1,28 2,57 3,61 4,58

Biais

Ecart type S =

Exactitude de linéarité ELIN =

Incertitude de linéarité ULIN =

0,00 -0,02 0,02 -0,01

0,15 0,03 0,04 0,07

0,15 0,03 0,05 0,07

0,47 0,10 0,15 0,22


V0 Janvier 2020

22

Annexe 3 : Limite de détection Résultats provenant iQ-Check™ Quanti L. pneumophila – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

durables Nord

Echantillons à la concentration 5UG

Sample C(t) I.C. C(t) SQ e1 N/A 32,04 N/A

38,81 32,02 3,68 e2 39,05 32,08 3,11

38,83 31,98 3,63 e3 37,98 31,86 6,66

39,52 31,72 2,23 e4 38,57 31,87 4,38

39,44 31,77 2,35 e5 42,73 32,05 0,23

40,3 32,03 1,28 e6 39,9 31,93 1,71

39,65 31,99 2,03 e7 38,37 31,81 5,04

39,73 31,88 1,92 e8 39,28 32,05 2,65

39,02 31,89 3,18 e9 38,69 32,09 4,01

39,19 31,98 2,81 e10 40,62 31,79 1,02

39,18 31,92 2,84 e11 39,56 31,89 2,17

38,09 31,86 6,15 e12 39,1 32,01 3,01

39,2 31,6 2,79 e13 40,67 31,77 0,98

39,55 32,02 2,19 e14 39,01 31,96 3,20

40,25 31,68 1,33 e15 38,17 31,71 5,81

38,93 31,68 3,40 e16 39,69 31,67 1,97

41,36 31,64 0,61 e17 38,62 31,95 4,22

41,32 31,86 0,62 e18 38,65 32,04 4,14 Contrôle Gamme Standard

38,54 31,99 4,45 e19 39,27 31,55 2,67 Content C(t) I.C. C(t) SQ

38,13 31,71 5,98 QS1 36,21 31,82 19,00e20 39,24 31,85 2,72 QS1 36,42 31,93 19,00

39,47 32,02 2,31 QS2 32,65 32,13 390,00e21 38,12 32,17 6,03 QS2 32,35 31,98 390,00

39,76 31,93 1,88 QS3 28,99 31,86 3900,00e22 40,31 32,02 1,27 QS3 29,14 32,11 3900,00

40,17 31,89 1,41 QS4 25,53 32,64 39000,00e23 39,48 31,93 2,30 QS4 25,64 32,9 39000,00

40,21 31,77 1,37 e24 41,17 31,97 0,69

Contrôle négatif

39,48 32,18 2,29 e25 39,95 32,23 1,65

40,02 32,15 1,56 Content C(t) I.C. C(t) SQ e26 39,93 31,74 1,67 Neg Ctrl N/A 32,17 N/A

42,08 32,62 0,36 Neg Ctrl N/A 32,08 N/A e27 41,1 31,93 0,73

42,21 32 0,33 e28 40,01 32,2 1,57

41,14 32,01 0,71 e29 N/A 32 N/A

38,17 32,07 5,82 e30 37,35 31,95 10,36

38,08 31,97 6,19


V0 Janvier 2020

23

Annexe 4 : limite de quantification Résultats provenant iQ-Check™ Quanti L. pneumophila – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

durables Nord LQ à 15UG

Gamme de calibrage QS

UG/puits Moy Log (UG/puits) C(t)

QS1 1,278753601 38,05

19 1,278753601 38,52

QS2 2,591064607 33,2

390 2,591064607 33,46

QS3 3,591064607 30,68

3900 3,591064607 29,87

QS4 4,591064607 26,88

39000 4,591064607 26,62

Pente -3,451

Ordonnée origine 42,559

Corrélation (r 2) 0,995

Efficacité (%) 94,869

LQPCR à 15UG : 30 mesures en réplicat C(t) UG/puits Réplicat Moyenne UG/puits Moy UG/puits x' (Log) Moyenne x' LQ-1 37,93

37,94 21,9

21,8 1,341

37,94 21,7 1,338 1,340 LQ-2 37,94

38,12 21,8

19,4 1,338

38,31 17,0 1,231 1,285 LQ-3 37,82

38,45 23,6

16,9 1,373

39,09 10,1 1,005 1,189 LQ-4 38,05

38,02 20,3

20,6 1,306

38 21,0 1,321 1,314 LQ-5 38,82

37,77 12,1

30,5 1,083

36,73 48,8 1,689 1,386 LQ-6 38,2

38,08 18,3 1,263

37,96 21,5 19,9 1,332 1,298 LQ-7 37,67

37,47 26,1

30,1 1,417

37,27 34,1 1,532 1,474 LQ-8 36,48

36,98 57,5 1,761

37,48 29,6 43,5 1,472 1,616 LQ-9 38,28

38,02 17,3 1,240

37,76 24,6 21,0 1,390 1,315 LQ-10 38,12

37,88 19,3

22,9 1,286

37,64 26,6 1,425 1,356 LQ-11 37,45

38,35 30,1

19,6 1,480

39,25 9,1 0,959 1,219 LQ-12 37,7

37,8 25,5

23,9 1,408

37,91 22,3 1,347 1,377 LQ-13 37,42

37,5 30,8

29,2 1,489

37,58 27,6 1,443 1,466 LQ-14 38,08

37,86 19,8

23,2 1,298

37,64 26,6 1,425 1,361 LQ-15 38,32

37,83 16,9

24,7 1,228

37,34 32,5 1,512 1,370 LQ-16 38,02

38,17 20,6 1,315

38,32 16,9 18,8 1,228 1,272 LQ-17 38,73

37,72 12,8 1,109

36,7 49,6 31,2 1,698 1,403 LQ-18 38,4

38,34 16,0 1,205

38,28 17,3 16,7 1,240 1,222 LQ-19 38,38

38,02 16,3 1,211

37,66 26,3 21,3 1,419 1,315 LQ-20 38,36

37,98 16,5

21,9 1,217

37,6 27,3 1,437 1,327 LQ-21 37,87

37,62 22,8

27,4 1,359

37,36 32,0 1,506 1,432 LQ-22 37,74

38,37 24,8

17,8 1,396

39 10,7 1,031 1,214 LQ-23 37,49

37,46 29,3

30,0 1,469

37,43 30,6 1,486 1,477 LQ-24 37,06

38,23 39,1

23,7 1,593

39,39 8,3 0,918 1,256 LQ-25 37,78

37,61 24,2

27,3 1,385

37,44 30,4 1,483 1,434 LQ-26 38,38

38,52 16,2

14,8 1,211

38,67 13,4 1,127 1,169 LQ-27 37,5

37,71 29,1

25,6 1,466

37,92 22,0 1,344 1,405 LQ-28 38,8

38,42 12,3

16,3 1,089

38,04 20,4 1,309 1,199 LQ-29 39,12

38,18 9,9

22,3 0,996

37,24 34,7 1,541 1,269 LQ-30 37,81

37,86 23,8

23,0 1,376

37,91 22,2 1,347 1,361

Moyenne x' 1,337

Ecart-type s 0,102

Biais 0,059

Exactitude de LQ ELQ 0,117

Incertitude ULQ 0,240


V0 Janvier 2020

24

Annexe 5 : Rendement et robustesse Résultats provenant iQ-Check™ Quanti L. pneumophila – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement

durables Nord


V0 Janvier 2020

25


V0 Janvier 2020

26


V0 Janvier 2020

27

Annexe 6 : Sélectivité Résultats provenant iQ-Check™ Quanti L. pneumophila – Extension 2011 - v01 réalisé IPL santé, environnement durables Nord


V0 Janvier 2020

28

Documents

Janvier 2020 Méthode qualitative et quantitative...2012/07/16 · 05/11/2013 Modification Logiciel V2.1 NA Rev. 2 (2013) 09/03/2015 Modification Logiciel V2.2 NA Rev. 2 (2013) 18/12/2015