Izolace NA z biologického materiálu

MUDr. Michal Jurajda

ÚPF LF MU

Zdroje NA

• Materiál získaný ex vivo - biopsie

• Archivní materiál - FFPE

Uchování a transport biol. materiálu

• Je dán účelem odběru a technikou a místem provedení odběru.

• Obecně se snažíme materiál co nejdříve zpracovat do podoby, kdy co nejméně podléhat degradaci

Charakter zpracovávaných tkání

• Buněčnost – determinuje množství NA

• Přítomnost lipidů – může interferovat s izolačními postupy

• Charakter extracelulární matrix – rozhoduje o možnostech homogenizace tkáně

• Přítomnost inhibitorů PCR – heparin, některé metabolity v rostlinných bb.

Homogenizace tkání

• Homogenizátory, desintegrátory

• Disruption x homogenization

Účel homogenizace a disrupce

• Disrupce – rozbití buněčných stěn, plazmatické membrány a organel.

• Homogenizace – snižuje viskozitu vzorku „trháním“ velkých molekul. (důležité při izolaci RNA).

Typy homogenizátorů

• „Stříkačka jehly“• Rotor-stator

homogenizátor• Kolonky

Mixer Mill

• Mlýn používající wolframové kuličky

Izolace nukleových kyselin

• Extrakce a precipitace

• Adsorpční metody– Kolonky– kuličky

Přístupy k izolaci DNA

buňka DNA

RNA proteiny

Lýza biomembrán

Nukleové kyseli-ny zůstávají v roztoku, bílkovi-ny se sráží a se-dimentují odstře-děním na rozhra-ní, lipidy jsou ex-trahovány do chloroformu

vodný roztok

(DNA, RNA)

chloroform(lipidy)

Rozhraní (bílkoviny)

RNA je příp. odstraněna RNázou

A. Odstraňujeme lipidy extrakcí chloro-formem, bílkoviny srážením fenolem

B. Za určitých podmínek absorbujeme DNA na povrch SiO2, ostatní odsajeme

SiO2 je obvykle v podobě skleně-ných částic, které jsou těžké, snad-no sedimentují, ostatní lze odsát.

Změnou podmínek dojde opět k uvolnění DNA do čistého roztoku

Kolonky Qiagen

buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění

Izolační kolonky

Odstranění RNA-áz

• DEPC diethyl pyrocarbonate

• Karcinogen

• Deaktivovatelný při 100 st.Chttp://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html

Izolace RNA

28S

18S

Spektrofotometrické stanovení

• Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica)

• A260 – absorbance vlastní NA

• A230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA)

• A280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin)

• A320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.

Spektrofotometry

• Kyvetové, bezkyvetové