Ivan Piljac - Elektroforeza

7/21/2019 Ivan Piljac - Elektroforeza

1/186


2/186

UDBENICI SVEUILITA U ZAGREBU

MANUALIA UNIVERSITATIS ZAGRABIENSIS


3/186

U trokovima izdavanja ove knjige sudjelovalo je sredstvima za novanopodupiranje visokokolskog udbenika i znanstvene knjige u 2006. godini

MINISTARSTVO ZNANOSTI, OBRAZOVANJA I PORTAREPUBLIKE HRVATSKE


4/186

ELEKTROFOREZA

Napisao

IVAN PILJACumirovljeni redoviti profesor Prehrambeno-biotehnolokog

fakulteta Sveuilita u Zagrebu

Media PrintTISKARA HRASTI

Zagreb, 2006.


5/186

NakladnikMEDIA PRINTTISKARA HRASTId.o.o.ZAGREB, Murati 16,Za nakladnikaDARKO HRASTI, graf. ing.

UredioIVAN PILJAC

Recenziraliprof. dr. sc. BOIDAR GRABARIprof. dr. sc. NJEGOMIR RADIprof. dr. sc. ZORAN ZGAGA

LektoriraoIVAN MARTINI, prof.

Odobrio Senat Sveuilita u Zagrebu, na prijedlog Povjerenstava zaznanstveno-nastavnu literaturu Sveuilita u Zagrebu, rjeenjembroj 02-1535/4-2005 od 13. prosinca 2005.

CIP - Katalogizacija u publikacijiNacionalna i sveuilina knjinica Zagrab

UDK 543 . 545 . 2(075 . 8)

PILJAC, IvanElektroforeza / napisao Ivan Piljac.-

Zagreb : Media Print, 2006. - (UdbeniciSveuilita u Zagrebu = ManualiaUniversitatis studiorum Zagrabiensis)

ISBN 953-95404-0-2

I. Elekrtroforeza -- Udbenik

460418040

ISBN 953-95404-0-2


6/186

REPRINT

Vlastita naklada autora

Digitalizirano izdanje izvornika objavljenog 2006. god.

URL: http://www.fer.unizg.hr/_download/repository/Ivan_Piljac_-_Elektroforeza.pdf

Zagreb, 2015.

ISBN 978-953-58487-1-4


7/186

V

Predgovor

Poetna mi je namjera bila da metode elektroforeze opiem u jednom odpoglavlja novog izdanja mojeg sveuilinog udbenika Elektroanalitikemetode, teorijske osnove, mjerne naprave i primjena. Naime, udbeniksadri teorijska objanjenja mnogih fizikalno-kemijskih veliina i teorijskihmodela na kojima se temelje metode elektroforeze. Meutim, toliko jemetoda elektroforetske separacije, da sam se odluio izdati samostojnuknjigu.

Naime, razvojem metoda elektroforetske separacije dramatino rastenjihov broj: od pionirskog rada Tiseliusa, koji ini separaciju proteina uslobodnoj otopini, preko separacija na vrstim nosaima elektrolita: papiru,membrani celuloznog acetata i dr., do separacija na gelovima: krobu, agaru,agarazi i poliakrilamidnom gelu, u kojima se primjenjuju razliiti mehanizmirazdvajanja molekulskih iona temeljem njihova nativnog efektivnogelektrinog naboja, s primjesama izmijenjenog elektrinog naboja, temeljemveliine molekulskih iona, uinka molekularnog sita nosaa elektrolitneotopine i drugih specifinih svojstava.

iroku primjenu nalaze suvremene metode diskontinuiraneelektroforeze, SDS-elektroforeze, imunoelektroforeze, dvodimenzijskeelektroforeze visoke rezolucije i brojne metode elektroforeze u kapilari.

Osim uporabe u kemijskoj analizi, metode elektroforeze na gelovimajedinstvene su tehnike koje omoguuju utvrivanje sekvencija DNA, put su

za izolaciju molekulskih vrsta od proteina do gena, a sekvenciranjemaminokiselina put su prema kloniranju gena i sintezi proteina.Spektar mogunosti primjene brojem i raznolikou problem je za

poetnike, studente razliitih fakulteta, ali i za iskusne analitiare.Ova knjiga pokuaj je sistematskog pristupa metodama elektroforeze.Teorijske fizikalno-kemijske osnove elektroforetske separacije,

poboljanja rezolucije razdvajanja, identifikacije i detekcijemakromolekulskih iona, dane su u opsegu koji omoguava razumijevanjefizikalno-kemijskih mehanizama dionih procesa u razliitim metodamaelektroforeze.

Budui da, na hrvatskom jeziku, ne postoji knjiga o metodamaelektroforeze pa ni ustaljeno nazivlje, pokuao sam uvesti hrvatsku

nomenklaturu za ovo podruje.


8/186

VI

Za uloeni trud zahvaljujem se: prof. dr. sc. Njegomiru Radiu, prof. dr.sc. Boidaru Grabariu i prof. dr. sc. Zoranu Zgagi, recenzentima rukopisa,prof. dr. sc. Stanku Tonkoviu i prof. dr. sc. Mariju Cifreku na korisnimsavjetima u vezi s poglavljem o elektrinim izvorima za elektroforezu, teprof. dr. sc. Pavlu Mildneru, koji je proitao ureeni tekst knjige i akribijomdugogodinjeg glavnog urednika znanstvenog asopisa uoio i najmanjenedostatke.

Nadam se da e knjiga biti korisna studentima i diplomiraniminenjerima razliitih struka.

Ivan Piljac


9/186

VII

Sadraj

1. TEORIJSKE OSNOVE ........................................................ .................................. 1

2. ELEKTROFOREZA U SLOBODNOJ OTOPINI..................................................9

2.1. Elektroforeza pominih granica......................................................................9

2.2. Elektroforeza u protonoj otopini ..................................................... ............11

3. ELEKTROFOREZA U OTOPINI NA NOSAU................................................13

3.1. Elektroforeza na vrstom nosau..................................................................13

3.2. Elektroforeza u gelu......................................................................................143.2.1. krobni gel............................................................................................163.2.2. Agarozni gel..........................................................................................163.2.3. Poliakrilamidni gel................................................................................17

4. ELEKTROFOREZA U HOMOGENOM POLIAKRILAMIDNOM GELU UZHOMOGENI PUFER...............................................................................................21

4.1. Elektrini naboj elektroforetskih jedinki.......................................................21

4.2. Kontrola elektrinog naboja elektroforetskih jedinki....................................224.3.Uinak veliine pora ..................................................... ................................ 24

4.4. Naprave za elektroforezu ........................................................ ...................... 25

4.5. Priprava gela ....................................................... .......................................... 27

4.6. Detekcija i kvantifikacija razdvojenih molekulskih vrsta ............................. 314.6.1. Bojenje makromolekula ............................................................ ............314.6.2. Kvantifikacija denzitometrijom.............................................................354.6.3. Kvantifikacija videokamerom i digitalnim preslikaem .......................394.6.4. Detekcija i kvantifikacija radiometrijom...............................................39

4.7. Prijenos makromolekula iz gela na povrinu membrane .............................. 41

4.7.1. Prijenos difuzijom.................................................................................414.7.2. Prijenos ispiranjem kapilarnim protokom otopine pufera ..................... 424.7.3. Prijenos tlaenjem.................................................................................434.7.4. Prijenos elektroforezom ............................................................ ............43


10/186

VIII

4.8. Detekcija i kvantifikacija makromolekula na membrani .............................. 44

4.9. Primjene elektroforeze na homogenom poliakrilamidnom gelu

uz homogeni pufer ..................................................... .......................................... 46

5. ELEKTROFOREZA NA POLIAKRILAMIDNOM GELU UZ

DISKONTINUIRANE UVJETE..............................................................................47

5.1. Naelo nagomilavanja...................................................................................47

5.2. Viefazni pufer..............................................................................................51

5.3.Postupak i naprava........................................................................................52

5.4.Priprava otopine analita .......................................................... ...................... 54

5.5. Selektivno nagomilavanje.............................................................................55

5.6. Elektrini uvjeti elektroforeze.......................................................................55

5.7. Primjena........................................................................................................56

6. ODREIVANJE RELATIVNE MOLEKULSKE MASEELEKTROFOREZOM NA POLIAKRILAMIDNOM GELU.................................57

6.1. Fergusonov prikaz.........................................................................................58

6.2.Gel s gradijentom poroznosti........................................................................61

6.3. Priprava gela s gradijentom poroznosti.........................................................62

7. ELEKTROFOREZA NA POLIAKRILAMIDNOM GELU U PRISUTNOSTIADITIVA ................................................... ........................................................... ...67

7.1. SDS-elektroforeza na poliakrilamidnom gelu...............................................68

8. ELEKTROFOREZA NA GELU OD AGAROZE ............................................... 79

8.1. Metode imunoelektroforeze..........................................................................808.1.1. Metoda prema Grabaru i Williamsu......................................................828.1.2. Metoda prema Laurellu.........................................................................838.1.3. Unakrsna imunoelektroforeza .................................................. .............858.1.4. Dvojna unakrsna imunoelektroforeza ................................................... 868.1.5. Linijska imunoelektroforeza .................................................... .............878.1.6. Metoda polaganja..................................................................................898.1.7. Metode intermedijarnoga gela...............................................................898.1.8. Protusmjerna imunoelektroforeza ...................................................... ...90

8.1.9. Detekcija imunoprecipitata ...................................................... .............918.2. Elektroforeza proteina .................................................................... 93

8.3. Elektroforeza nukleinskih kiselina................................................................93


11/186

IX

8.3.1. Separacija ribonukleinskih kiselina (RNA)...........................................978.3.2. Sekvencija DNA molekula....................................................................97

9. IZOELEKTRINO SABIRANJE (FOKUSIRANJE)........................................103

9.1. Naelo metode .................................................... ........................................ 103

9.2. Oblikovanje gradijenta pH..........................................................................105

9.3. Nanoenje otopine analita...........................................................................108

9.4. Izoelektrino sabiranje u poliakrilamidnom gelu........................................108

9.5. Poliakrilamidni gel s nepominim gradijentom pH .................................... 110

9.6. Izoelektrino sabiranje u gelu od agaroze...................................................111

9.7. Detekcija proteina.......................................................................................112

9.8. Izoelektrino sabiranje za preparativne svrhe.............................................113

9.9. Izoelektrine membrane..............................................................................114

9.10. Ovisnost elektroforetske pokretljivosti proteina o pH .............................. 115

10. IZOTAHOFOREZA.........................................................................................119

10.1. Naelo metode ............................................................ .............................. 119

10.2. Naini izvoenja izotahoforeze.................................................................124

10.3. Detekcija sastojaka analita........................................................................125

11. DVODIMENZIJSKA (2D) ELEKTROFOREZA VELIKE REZOLUCIJE ...129

11.1. Nain izvoenja metode............................................................................129

11.2. Razdvajanje analita u prvom stupnju u gelu s nepominim............................

gradijentom pH .......................................................... ........................................ 131

11.3. Razdvajanje u drugom stupnju..................................................................134

11.4. Identifikacija i kvantifikacija ......................................................... ...........136

12. ELEKTROFOREZA U KAPILARI.................................................................139

12.1. Naelo metode i obiljeja (separacijske) kapilare.....................................140

12.2. Unoenje otopine analita u kapilaru..........................................................143

12.3. Razdvajanje sastojaka analita u kapilari .................................................. .14512.4. Elektroforeza u kapilari ispunjenoj otopinom pufera................................146

12.5. Elektroforeza u kapilari ispunjenoj molekularnim sitom..........................148


12/186

X

12.6. Elektroforeza u kapilari s izoelektrinim sabiranjem................................149

12.7. Elektroforeza u kapilari s elektrolitom i micelama................................... 152

12.8. Detekcija i kvantifikacija..........................................................................153

12.9. Primjena....................................................................................................157

13. VISOKONAPONSKI IZVORI ZA ELEKTROFOREZU................................160

VANIJE KNJIGE S PODRUJA ELEKTROFOREZE......................................166

Popis simbola..........................................................................................................169

Predmetno kazalo ........................................................... ........................................ 169


13/186

1. TEORIJSKE OSNOVE

Elektroforezom nazivamo migraciju (putovanje) elektriki nabijenihestica kroz otopinu zbog djelovanja elektrinog polja. Za razliku od drugihelektroanalitikih metoda s pomou kojih analitiki podatak dobivamotemeljem elektrokemijskog procesa koji se odvija na radnoj ili indikatorskojelektrodi, u elektroforezi analitiki ili drugi podatak utvrujemo na temeljurazdiobe analiziranih elektriki nabijenih estica to se dogaa u medijuizmeu elektroda. Elektrode slue iskljuivo za uspostavljanje elektrinog

polja kroz otopinu odnosno medij u kojem se nalaze elektriki nabijeneestice. Premda se na elektrodama, zbog razlike elektrinog potencijala

izmeu povrine kovinskih elektroda i otopine odvijaju procesi oksidacije iredukcije, tj. elektroliza vode, ti procesi na elektrodama u elektroforezi nisuvani. Budui da se elektrino polje izmeu elektroda u elektroforeziuspostavlja razlikom potencijala odnosno naponom od nekoliko stotinavolta, zanemariv je napon od nekoliko volta potreban za elektrolizu vode naelektrodama u odnosu prema uspostavljenom vanjskom elektrinom naponu.Stoga je praktino ukupni napon elektroforeze djelatan kroz sloj otopineizmeu jedne i druge elektrode elektroforetske elije.

Povijesno se naziv elektroforeza rabio za migraciju elektriki nabijenihkoloidnih estica. Danas se rabi u irem znaenju. Dakle, elektroforezom

nazivamo migraciju elektriki nabijenih estica bile one jednostavni ilimakromolekulski ioni ili koloidne estice odnosno nakupine (agregati)veeg broja estica. Budui da brzina migracije elektriki nabijene esticekroz otopinu, pod utjecajem elektrine sile, ovisi o elektrinom nabojuestice i njezinom obliku i veliini, elektroforeza omoguuje separaciju, tj.razdvajanje elektriki nabijenih estica temeljem razlike u brzini putovanjapojedine vrste estica kroz otopinu. Zbog svoje jednostavnosti metodeeklektroforeze nalaze iroku primjenu u kemijskoj analizi, ali i upreparativnim tehnikama. Naroito je vana njezina primjena u biokemiji imolekularnoj biologiji u analizi, razdvajanju i proiavanju velikihmolekula, kao to su molekule proteina i nukleinskih kiselina, u separaciji

jednostavnih molekulskih vrsta, tj. elektriki nabijenih molekula eera,

aminokiselina, peptida, nukleotida i jednostavnih iona.Koncentracija elektroforezeom razdvojenih estica u stupcu otopine,

odnosno na ploi ili valjku drugog (netekueg, poluvrstog) medija, izmeu


14/186

Elektroforeza2

elektroda utvruje se razliitim, danas brojnim, metodama detekcije.Odreivanjem nazonosti i koncentracije pojedine vrste estica dobivaju sekvalitativni i kvantitativni analitiki pokazatelji o razdvojenim esticamaanalita.Naelo elektroforeze moe se razabrati iz slike 1.1.

start

uinak naboja

uinak radijusa

uinak oblikaSlika 1.1. Naelo elektroforeze

U slobodnoj otopini pod utjecajem elektrinog polja estice istogradijusa a veeg naboja prevaljuju u odreenom vremenu dulji put. esticemanjeg radijusa a istog naboja putuju bre. Oblik estice utjee na brzinumigracije. Izmeu dviju elektroda koje su uronjene u otopinu elektrolitauspostavlja se razlika potencijala s pomou vanjskog elektrinog izvora.

Izmeu elektroda, tj. kroz elektrolitnu otopinu, uspostavlja se elektrinopolje kojemu jakost (E) ovisi o uspostavljenom naponu i meusobnojudaljenosti elektroda. Elektrino polje djeluje na elektriki nabijenu esticuu elektrolitnoj otopini elektrinom silom (F) koja je jednaka umnokuelektrinog naboja estice (q) i jakosti elektrinog polja (F=qE). Zbogdjelovanja elektrine sile ubrzavaju se elektriki nabijene estice. Putovanjuestice suprotstavlja se sila trenja u otopini kroz koju

estice putuju. Silatrenja ovisi o viskoznosti otopine i o veliini i brzini putovanja estice.

Porastom brzine poveava se sila trenja.Kada se elektrina sila i sila trenja izjednae, elektriki nabijena estica

putuje odreenom stalnom (konanom) brzinom prema elektrodielektroforetske elije. Elektriki nabijene estice u otopini mogu biti

jednostavni ioni ili vee estice koje, kada su dovoljno velike, imaju svojstvokoloidnih estica.

Za putovanje manje, solvatizirane odnosno hidratizirane, elektrikinabijene estice kroz slobodnu otopinu, to moemo predoiti kao putovanjekuglaste materijalne estice kroz otopinu, sila trenja, koja je posljedicaviskoznosti otopine, prema Stokesovu zakonu jednaka je 6rv, gdje je

viskoznost otopine, rradijus a vbrzina estice. Elektrina sila koja djeluje naesticu jednaka je umnoku naboja estice i jakosti elektrinog polja (qE).


15/186

Teorijske osnove 3

Kada estice dostignu konanu brzinu kretanja, elektrina sila jednaka jesili trenja. Omjer konane brzine migracije i jakosti elektrinog polja nazivase elektrina odnosno elektroforetska pokretljivost estice (uef):

ef6

qu

E r

= = (1-1)

Na povrini vee vrste, koloidne, elektriki nabijene estice stvara seelektrini dvostruki sloj. Njega ini sloj slobodnih (elektrikinekompenziranih) elektrinih naboja na povrini koloidne estice iodgovarajui broj iona suprotnog naboja u otopini tik uz povrinu koloidneestice. Taj elektrini dvostruki sloj istovjetan je dvosloju koji se stvara nadodirnoj povrini kovinske elektrode u otopini elektrolita.

Elektrini naboji na povrini koloidne estice i ioni u otopini privlae seCoulombovim (elektrinim) silama. Solvatizirani odnosno hidratizirani ionikoji ine sloj elektrinog naboja dvosloja u otopini mogu se pribliitipovrini vrste koloidne estice na udaljenost vanjske Helmholtzove ravnine.

Zbog termikog gibanja estica u otopini elektrini sloj u otopini nijekompaktan nego je dijelom i difuzan. Dakle, dio naboja elektrokemijskogdvosloja u otopini nalazi se u tz. Gouy-Chapmanovu difuzijskom sloju.

Postoje li u otopini i ioni koji se mogu specifino adsorbirati na vrstojpovrini koloidne estice, teite njihova naboja nalazi se na udaljenostiunutarnje Helmholtzove ravnine i svojim nabojem pridonose nabojupovrine vrste koloidne estice.

Budui da su u elektrokemijskom dvosloju razdvojeni elektriki nabojiizmeu povrine koloidne estice i otopine, uspostavlja se razlikaelektrinog potencijala. Ta se razlika potencijala izmeu povrine vrstekoloidne estice i otopine ostvaruje kroz kompaktni (Helmholtzov) i difuzni(Gouy-Chapmanov) sloj.

Uzmemo li da je elektrini potencijal u sloju otopine izvanelektrokemijskog dvosloja nula, onda je sloj u otopini na vanjskojHelmholtzovoj ravnini na potencijalu V. Taj elektrini potencijal ovisi okoliini naboja u difuznom dijelu elektrokemijskog dvosloja i opermitivnosti odnosno dielektrinosti otopine (). Taj se potencijal esto urazmatranju elektrokinetikih pojava odnosno u kemiji koloida naziva zeta

potencijal(). Ako ne postoji difuzni dio elektrokemijskog dvosloja odnosnoako se sveukupni elektrini naboj dvosloja na strani otopine nalazi uvanjskoj Helmholtzovoj ravnini, onda je zeta potencijal jednak nuli. Vanjskoelektrino polje nema uinka na takvu koloidnu eticu i ona nee oitovatielektrokinetiko gibanje.

Debljina difuznog sloja naboja na strani otopine ovisi o sastavuelektrolitne otopine, poglavito o njezinoj ionskoj jakosti. Tako u elektrolitnojotopini monovalentne soli koncentracije 0,1 mol L1debljina difuznog slojaiznosi 3 nm, u otopini koncentracije 0,01 mol L1 iznosi 30 nm, a u vrlo


16/186

Elektroforeza4

razrjeenim otopinama moe biti do 100 nm. Prema Debye-Hckelovumodelu tumaenja elektrokemijskog dvosloja u jakim elektrolitima debljinadifuznog dijela dvosloja jest 1. To je veliina koju nazivamo Debyevaduljina i iskazana je relacijom:

21

2

1

=

IF

TR

(1-2)

gdje je - permitivnost odnosno dielektrinost otopine (F m-1), F Faradayeva konstanta,R opa plinska konstanta, T termodinamikatemperetura, aI ionska jakost otopine iskazana relacijom:

( ).....2 2 21 1 2 2 3 312

I c z c z c z= + + + (1-3)

gdje ci predstavlja koncentraciju, a zi nabojni broj pojedine vrste iona uotopini.

Na elektrini naboj u difuznom dijelu dvosloja (qd) vanjsko elektrinopolje jakosti Edjeluje silom jednakom umnoku naboja u difuznom sloju i

jakosti elektrinog polja (qdE).Pretpostavimo li da je koloidna estica kuglastog oblika radijusa r s

difuznim slojem naboja debljine 1 i da je r 1, onda je s kinetikogstajalita radijus estice koja se kree u mediju praktino jednak debljinidifuznog sloja odnosno jednak je 1. Elektrinoj sili putovanja esticesuprotstavlja se sila trenja, koja je prema Stokesovu zakonu jednaka61v, gdje je viskoznost otopine a v brzina estice. Elektrokinetikipotencijal odnosno .(zeta) potencijal u odnosu prema elektrinom naboju udifuznom dijelu dvosloja uz navedeni pretpostavljeni oblik i veliinu

koloidne estice iskazan je relacijom:

d1

q

= (1-4)

Elektrina sila iskazana zeta potencijalom jednaka je 1E. Kada sesila trenja i elektrina sila izjednae, koloidna estica putuje konanombrzinom. Za to ustaljeno stanje (eng. steady state) omjer brzine putovanjakoloidne estice i jakosti elektrinog polja naziva se elektroforetskapokretljivost (uef) estice.

ef f

6

vu

E

= = = (1-5)


17/186

Teorijske osnove 5

Numeriki faktor (f) vrijednosti jest 1/6 prema izvodu iz Stokesovazakona. Meutim, moe imati i vrijednost do 1/4. Naime, njegova vrijednostovisi o odnosu radijusa estice i debljine difuznog sloja. Za vee vrijednostir/1, tj. ako je radijus estice znatno vei od debljine difuznog sloja,numeriki faktor uvijek je 1/4, bez obzira na oblik koloidne estice.Meutim, ako je radijus estice manji u odnosu prema debljini difuznogsloja, f je 1/4 za cilindrinu esticu, a 1/6 za kuglastu esticu.

Prevaljeni put estice jednak je umnoku njezine brzine i vremenamigracije (l = v t). Iskae li se u relaciji 1-5 brzina kao omjer puta i vremenamigracije, dobije se da je prevaljeni put iskazan relacijom:

efl u E t = (1-6)

gdje su: l - prevaljeni put estice a t - trajanje elektroforetskog procesaodnosno migracije.

Iz relacije 1-6 vidljivo je da je migracijski put estice proporcionalanelektroforetskoj pokretljivosti estice. Drimo li jakost elektrinog polja i

vrijeme migracije konstantnim, mjerenjem migracijskog puta razliitihestica utvrujemo njihovu relativnu elektroforetsku pokretljivost. Odnosno,poznajemo li meusobne odnose elektroforetskih pokretljivosti razliitihestica pri zadanim eksperimentalnim uvjetima, moemo izraunati utjecaj

jakosti elektrinog polja i vremena migracije i tako izabrati najbolje uvjeteza njihovo razdvajanje. To vrijedi za migraciju estica u slobodnoj otopini, ito priblino, jer na migraciju estica utjeu jo neki imbenici, posebiceuinak temperature zbog topline osloboene tokom elektrine struje krozmedij.

Medij kroz koji protjee elektrina struja predstavlja elektrini otpor (R).Elektrini otpor medija izravno je razmjeran razmaku izmeu elektroda (l), aobrnuto razmjeran umnoku povrine presjeka kojim tee elektrina struja

(A) i elektrine provodnosti otopine (); (R = l/A).Pod utjecajem uspostavljenog napona kroz medij protjee elektrina

struja kojoj je jakost prema Ohmovu zakonu jednaka omjeru napona ielektrinog otpora medija (I=U/R).

Umnoak napona i jakosti struje predstavlja snagu (P) koja se prolaskomstruje kroz otpor medija oituje kao osloboena toplina i iskazana jerelacijom:

22UP U I I R

R= = = (1-7)

Omjer jakosti elektrine struje i povrine kojom tee struja jest gustoaelektrine struje (J =I/A). Jakost elektrinog polja iskazana je omjeromuspostavljenog napona i razmaka izmeu elektroda elije.


18/186

Elektroforeza6

Iskaemo li otpor kako je navedeno, slijedi da je jakost elektrinog poljaomjer gustoe elektrine struje (J) i elektrine provodnosti otopine;E =U/l =

IR/l=I/A=J/, odnosno brzina migracija (v = uefE ) jest v= uefJ/. Dakle,brzina migracije estica izravno je razmjerna umnoku elektroforetskepokretljivosti estica i gustoe elektrine struje, a obrnuto razmjernaelektrinoj provodnosti elektrolitne otopine

Promjena temperature medija u elektroforetskoj eliji, uzrokovanatoplinom koja se oslobaa tokom elektrine struje kroz medij u eliji, utjeena sve veliine koje odreuju brzinu migracije.

Kako je vidljivo iz relacija 1-4, 1-5 i 1-6, elektrokinetiki potencijal, atime i elektroforetska pokretljivost estica obrnuto je razmjerna drugomkorijenu ionske jakosti. to je manja ionska jakost, vea je brzina migracije.Pri veoj ionskoj jakosti brzina migracije manja je, meutim, pokazano je dapri razdvajanju uz veu ionsku jakost razdvojene zone bolje su odijeljenenego pri manjoj ionskoj jakosti. to je vea ionska jakost, vea je elektrinaprovodnost elektrolitne otopine, pa je vea, uz konstantni napon, i jakostelektrine struje kroz elektroforetsku eliju. Uz jau elektrinu struju

osloba

a se vie topline pa raste temperatura medija ueliji. Porastomtemperature smanjuje se viskoznost otopine pa se poveava brzina difuzije

iona i tako se smanjuje i elektrini otpor otopine. Uz konstantan naponelektroforeze i dalje raste jakost struje i time i osloboena toplina.

Porast temperature medija uzrokuje poveanu brzinu isparavanjaotapala, ali i konvekciju (mijeanje) medija, napose pri elektroforezi uslobodnoj otopini, pa se mijeaju granice razdvajanja i smanjuje rezolucijarazdvajanja estica razliitih elektroforetskih pokretljivosti.

Sadri li ispitivani sustav temperaturno osjetljive molekulske vrste,poveana temperatura moe uzrokovati i kemijske promjene analita, npr.denaturaciju proteina ili smanjenje enzimske aktivnosti.

Problemi vezani na osloboenu toplinu mogu se smanjiti radom uz

manju elektrinu snagu. Uz manju elektrinu snagu trajanje separacije, zaiste duljine puta migracije, mora biti znatno dulje. Meutim, uz dulje vrijemeseparacije otrina razdvojenih vrpci manja je, i to zbog difuzije molekula izvrpce u okolnu otopinu. Stoga se za svaku vrstu analita morajueksperimentalno utvrditi optimalni uvjeti elektroforeze.

Odvoenje osloboene topline, postupkom hlaenja, jedan je od znatnihproblema u mnogim metodama elektroforeze. Hlaenjem se neizbjeivouspostavlja razlika temperature izmeu dijelova medija u eliji koji su boljeodnosno slabije hlaeni. Postojanje gradijenta temperature uzrokuje razlike ubrzini migracije istovrsnih estica, a time i distorziju njima pripadajuihvrpci separacije. Pri elektroforezi u cilindrinom gelu ili gelu u ploi,hlaenje je uinkovitije uz stijenku cilindra ili ploe. Zato je uz stijenku

brzina migracije manja nego u sreditu pa nastaju zakrivljene (nasmijane)vrpce separacije. Zato je nuno elektroforezu provoditi uz konstantnu ikontroliranu temperaturu, to se postie primjernim sustavom hlaenja.


19/186

Teorijske osnove 7

Kao izvori elektrine snage u elektroforezi rabe se elektrine napravekoje omoguuju regulaciju jedne elektrine veliine, i to: ili napona ili

jakosti elektrine struje ili elektrine snage. Koja se elektrina veliinakontrolira, ovisi o elektroforetskim uvjetima, poglavito o imbenicima kojiutjeu na promjenu elektrinih svojstava medija tijekom elektroforeze. Takose, u pravilu, pri separaciji proteina rabe naprave za kontrolu jakostielektrine struje, a pri separaciji nukleinskih kiselina naprave za kontrolunapona. U postupku separacije proteina metodom izoelektrinog sabiranja(vidi poslije) primjenjuju se elektrini izvori koji omoguuju kontroluelektrine snage.

ini li se elektroforeza u otopini koja je stabilizirana na poroznomnosau odnosno matrici (eng. matrix), na brzinu putovanja estica, uzspomenute imbenike, utjeu mnogi dodatni imbenici.

Kao stabilizirajui medij, koji zapravo sprjeava termalnu konvekcijuotopine, rabe se papir, celulozni acetat, fino usitnjena krutina ili gel odpoliakrilamida, agaroze ili kroba. Pod utjecajem elektrinog polja elektrikinabijene estice prisutne u analitu putuju, otopinom na nosau, razliitom

brzinom. Brzina migracije ovisi o njihovoj elektroforetskoj pokretljivosti alii o interakciji (meusobnom djelovanju) putujuih estica s materijalomnosaa. Ovisno o kemijskom sastavu odnosno vrsti nosaa, interakcija semoe ostvariti mehanizmom adsorpcije putujuih estica na povrinumaterijala nosaa, zatim ionskom izmjenoms elektriki nabijenim skupinamana nosivom materijalu. Nehomogenost nosaa takoer utjee na migracijuestica.

Postojanje elektriki nabijenih skupina na povrini vrstog nosaauzrokuje i pojavu elektroosmoze, tj. pojavu putovanja otapala premanegativnoj elektrodi elektroforetske elije. Tako npr. papir kao nosasadrimalu povrinsku koncentraciju karboksilnih skupina, a agaroza sulfonskeskupine. Obje imaju svojstvo slabih kiselina. Kao slabe kiseline one e u

neutralnom ili lunatom mediju ionizirati. Time na vrstom nosau nastajunegativni elektrini naboji, koji su nepokretni. Ionizacijom nastali vodikoviioni u otopini kao hidratizirani H3O

+ioni putuju prema negativnoj elektrodi,povlaei za sobom molekule vode.

Elektroosmotski tok otapala utjee na brzinu migracije elektrikinabijenih estica. Pozitivnima e brzina putovanja porasti, a negativnima ese smanjiti, jer putuju u suprotnom smjeru od toka otopine. Meutim, ielektriki nenabijene estice (npr. molekule uree, saharoze ili deoksiriboze)zajedno s otapalom koje ih povlai putovat e prema negativnoj elektrodi.Elektroosmotski tok otapala u mediju moe se vizualno pratiti s pomouelektriki nenabijenih plavo obojenih molekula dextrana (Bluedextran) kojedodamo otopini u elektroforetskoj eliji.

U elektroforezi u gelu poliakrilamida i agaroze nosa djeluje i kaomolekularno sito. Molekularno sito, veliinom pora, razliito utjee naputovanje estica, ovisno o radijusu (veliini) estica.


20/186

Elektroforeza8

Dakle, mnogi i razliiti imbenici utjeu na migraciju estica uelektroforezi, to je rezultiralo razvojem velikog broja razliitih tehnikaelektroforeze.

Nastoji se iskoristi jedan ili vie imbenika za to bre, to potpunije ibolje razdvajanje molekulskih vrsta sadranih u analitu. Izbor metode ovisi oprirodi analita.

Metode elektroforeze primjenjuju se u kvantitativnoj analizi supstancijaili njihovih smjesa, u kontroli istoe supstancija i u preparativne svrhe.Primjenjuju se u analizi koloida i cijelih biolokih stanica, u analizi proteina,nukleinskih kiselina, peptida, aminokiselina, organskih kiselina i baza, uanalizi lijekova, pesticida i anorganskih aniona i kationa, dakle svihmolekulskih vrsta koje imaju elektrini naboj.

Najvanije tehnike elektroforeze opisane su u nastavku.


21/186

2. ELEKTROFOREZA U SLOBODNOJ OTOPINI

2.1. Elektroforeza pominih granica

Razdvajanje ionskih vrsta iz otopine analita moe se uiniti tako da seuspostavi migracija iona iz otopine analita u drugu otopinu, koja je uizravnom kontaktu s otopinom analita. Putujui razliitim brzinama krozdrugu otopinu ionske vrste iz analita razdvajaju se. Razdvajanje moemo

uoiti praenjem pomicanja granica stupca otopina pojedinih ionskih vrsta.Tu metodu elektroforeze u otopini (eng. moving boundary electrophoresis)razvio je Tiselius1, rabei je u razdvajanju proteina. Nain provedbe metodevidi se na slici 2.1., na kojoj je prikazana skica tz.Tiseliusove elije.

elija, u obliku U cijevi, ima tri sekcije koje se mogu klizati uz ravninex-x i y-y i neovisno puniti elektrolitnom otopinom (otopina pufera) iotopinom analita. Tako se mogu ostvariti otre granice izmeu iste otopinepufera i otopine analita. Presjek U-cijevi kvadrat je (elija je nainjenalijepljenjem staklenih ili kvarcnih ploica). Mala irina kanala elije (3 mm)onemoguava konvekciju otopine, a vea dubina (25 mm) osiguravadovoljno veliki optiki put za detekciju pomicanja granica putujuih esticauzdu sredinjeg, vertikalnog, dijele elije.

U ispitivanju otopina ionskih vrsta, od kojih su neke pozitivnog a drugenegativnog naboja, otopinom analita puni se samo donja sekcija elije. Podutjecajem elektrinog polja pozitivne estice putuju u jednom smjeru, anegativne u drugom, pa se pomicanje njihovih granica moe pratiti u jednojodnosno drugoj vertikalnoj cijevi sredinjega dijela elije. Imaju li sveestice isti naboj, otopinom analita puni se donja sekcija i jedna cijevsredinje sekcije. Na slici je pokazano razdvajanje triju vrsta makromolekula(A, B, C) istovrsnog naboja, od kojih najveu elektrinu pokretljivost imajuestice tvari A, manju tvari B, a najmanju tvari C. Pod uinkom elektrinogpolja najveom brzinom putuju estice tvari A i tako se izdvajaju iz smjesa ulijevoj cijevi centralne sekcije elije. Najsporije migriraju estice tvari C ione se, zaostajanjem, odvoje iz smjese u desnoj cijevi centralne sekcije.

1A. Tiselius, Trans. Faraday Soc.,33 (1937) 524.


22/186

Elektroforeza u slobodnoj otopini10

otopina pufera

CC+B

AA+B

granicerazdvajanja

elektrode

A+B+C

A+B+C

A+B+C

a) b)

Slika 2.1. Shematski prikaz elije za elektroforezu u slobodnoj otopini premaTiseliusu. a) elija napunjena otopinom pufera i otopinom analita, b) isto nakon

elektroforeze

Mjeri se brzina pomicanja granica izmeu otopina razliitog sastava sobzirom na sadrane makromolekulske ione. Izvorno je pomicanje granicapraeno mjerenjem indeksa loma odnosno registracijom gradijenta indeksaloma izmeu iste otopine i otopina s makromolekulama. Mjerenjem brzinapomicanja granica kroz otopinu pufera utvruje se elektroforetskapokretljivost odnosno elektroforetska obiljeja pojedine molekulske vrste.Uz to, meusobno razdvojeni sastojci analita mogu se izvaditi iz elije spomou pipete s kapilarnim vrkom. Tako se u opisanom primjeru iz lijevevertikalne cijevi moe izvaditi otopina u kojoj je tvar A, a iz desne otopina stvari C. Ispod sloja otopine s esticama tvari C nalazi se sloj otopine u kojojsu estice tvari B i C. Iz te otopine ista tvar B moe se dobiti ponovljenimpostupkom elektroforeze s otopinom koja sadri tvari B i C, izvaenompipetom iz elektroforetske elije. Tako se mogu izolirati molekulske vrste islijedno koristiti za odreivanje njihovih fizikalnih i kemijskih svojstava.

Bolje razdvajanje granica otopina, u opisanoj eliji, moe se uiniti takoda tijekom elektroforeze kroz eliju kontinuirano protjee ista otopinapufera, prikladnom brzinom. Tok otopine pufera utjee na brzinu pomicanjagranica. Uinak usporavanja putovanja molekulskih iona, protjecanjemotopine pufera, vei je za estice manje brzine nego za estice vee brzine.

Tako se poveavaju podru

ja otopina s razdvojenim makromolekulskimionima. Elektrino polje kroz eliju uspostavljeno je s pomou dviju

elektroda srebro - srebrov klorid. Pri uporabi kovinske elektrode drugog redane dolazi do elektrolize vode i razvijanja plinova koji mogu dodatno


23/186

Elektroforeza u protonoj otopini 11

poveati konvekciju otopine u eliji. U veini metoda rabe se kovinskeinertne elektrode, najee od platine.

Opisana metoda elektroforeze u slobodnoj otopini, primijenjena uispitivanju bjelanevina znatno je pridonijela razvoju biokemije. (Za taj radA. Tiselius 1948. g. dobio je Nobelovu nagradu.) Meutim, zbogeksperimentalnih problema, koji nastaju zbog mijeanja otopine u stupcu, tametoda ima ogranienu primjenu. Zbog termalne konvekcije mijeaju segranice otopina u kojima su razdvojene molekulske vrste. Konvekcijanastaje zbog zagrijavanja otopine u eliji. Naime, zbog elektrinog otporaotopine kroz koju protjee elektrina struja dio elektrine energije pretvarase u toplinu. Zato u stupcu otopine, koji nije ravnomjerno hlaen, nastajetemperaturni gradijent i gradijent gustoe, to uzrokuje mijeanje otopine ueliji. Mijeanje nastaje i zbog mehanike vibracije elektroforetske elije.Sve to onemoguuje detekciju granica otopina pojedine vrste estica ustupcu otopine, napose kad analit sadri velik broj razliitih vrstamolekulskih iona. Uz probleme mijeanja, za detekciju pominih granicapotreban je sloeni optiki detektor, ime se dodatno ograniava ira

primjena te metode elektroforeze u slobodnoj otopini.

2.2. Elektroforeza u protonoj otopini

Drugi nain razdvajanja elektriki nabijenih estica u slobodnoj otopinijest postupak u kojem se razdvajanje provodi u otopini pufera kojikontinuirano protjee izmeu elektroda elije2. Mlaz elektrolitne otopine,laminarno, u tankom sloju, protjee izmeu dviju, hlaenih, staklenih ploa

(500 mm 100 mm), razmaknutih meusobno 0,5 do 1 mm. Okomito nasmjer protoka otopine uspostavlja se elektrino polje jakosti od 100 do 150V cm1 kojim se, temeljem razlika u elektrinom naboju, razdvajajuelektriki nabijene estice analita. Otopina odnosno suspenzija analitautrcava se kontinuirano tankim mlazom u protonu otopinu, i to na straniulaska elektrolitne otopine (najee je to otopina pufera) u eliju. Tokelektrolitne otopine pokree se s pomou crpke.

Elektriki nabijene estice iz analita nosi struja elektrolitne otopineprema drugoj strani elije. Meutim, tijekom prolaza kroz eliju na esticedjeluje i elektrina sila, i to okomito na smjer toka otopine.

2K. Hannig,Electrophoresis,3 (1982) 235H. Wagner, R. Kuhn, S. Hofstetter, u: H. Wagner, E. Blasius, Ed. Praxis derelektrophoretischen Trennmethoden, Springer Verlag, Heidelberg (1989) 223.


24/186

Elektroforeza u slobodnoj otopini12

Budui da su smjer i jakost elektrine sile ovisni o predznaku i koliininaboja, elektriki nabijene estice analita tijekom protoka razdvajaju se itako razdvojene izlaze iz elije. Prostorni oblik koji zauzimaju estice,tijekom razdvajanja, u sloju protone otopine, ima zbog 1difuzije esticaoblik uske piramide s bazom na izlazu iz elije (slika 2.2.).

Primjenom te metode mogu se uiniti razdvajanja topljivih ionskihvrsta, ali i razdvajanja vrstih odnosno poluvrstih, netopljivih, mikroesticaodnosno koloida. Rabi se u identifikaciji, proiavanju i izolaciji organela imembrana biolokih stanica, u razdvajanju cijelih biolokih stanica, kao tosu eritrociti, leukociti, stanice tkiva. Naime, prisutnost karboksilnih,sulfatnih, fosfatnih, amino i drugih elektriki nabijenih skupina uzrokujeelektrini naboj na povrini bioloke stanici, a time i odreeni zeta (.)potencijal koji uzrokuje migraciju u elektrinom polju. Budui da se inajmanje razlike u povrinskom elektrinom naboju estica mogu iskoristitiza razdvajanje estica, ta metoda vrlo je uinkovita.

analit

elektrolitna otopina

Slika 2.2. Shematski prikaz elijeza elektroforezu u protonoj otopini

Elektroforetske elije za razdvajanje u protonoj otopini mogu bitirazliitih dimenzija. Za razdvajanje biolokih stanica rabe se elije odkvarcnog stakla (30 18 0,35 mm), u kojima se tok razdvajanja moepratiti promatranjem s pomou mikroskopa.

Elektroforeza u kapilari ispunjenoj istom otopinom elektrolita samo jejedna od metoda elektroforeze u kapilari. S obzirom na raznovrsnost ibrojnost te posebnosti u nainu izvoenja, metode elektroforeze u kapilariopisane su u posebnom poglavlju (vidi poglavlje 12.).


25/186

3. ELEKTROFOREZA U OTOPINI NA NOSAU

3.1. Elektroforeza na vrstom nosau

Nedostatci u metodama elektroforeze u slobodnoj otopini potjeupoglavito od konvekcije otopine u kojoj se ini elektroforetsko razdvajanjeelektriki nabijenih estica. Taj uinak moe se znatno smanjiti ako otopinustabiliziramo na vrstom ili poluvrstom (elatinoznom) nosau. Kao

stabilizirajui mediji rabe se papir, celulozni acetat, fino usitnjena krutina iligel od poliakrilamida, agaroze ili kroba. Papir kao nosa otopine uelektroforezi, premda prije rabljen u separaciji proteina i drugihmakromolekula, danas se rijetko rabi. Papir nema jednolinu veliinu pora, amnoge makromolekule, osobito proteini, adsorbiraju se na povrinu papira.Relativno mala mo upijanja otopine uzrokuje i mali kapacitet prijemaanalita. Danas se jo rabi u separaciji manjih molekula, kao to suaminokiseline, peptidi i nukleotidi. Membrana celuloznog acetata ima veuhomogenost pora nego papir i na njoj se proteini slabije adsorbiraju. Zbogtoga se postie bolja rezolucija razdvajanja od one na papiru. Celulozniacetat ima velike pore i u separaciji makromolekula nema ulogumolekularnog sita. Tako se razdvajanje makromolekulskih iona temelji

iskljuivo na gustoi elektrinog naboja iona.Postupak razdvajanja provodi se tako da se vrpca membrane poloi na

horizontalni nosa izmeu dvije posudice s otopinom pufera u koje suuronjeni krajevi vrpce. Na vrpcu se nanese mali volumen otopina analita i spomou kovinskih elektroda uronjenih u otopine pufera uspostavlja seelektrino polje i ini elektroseparacija. Tijekom razdvajanja nije potrebnohladiti membranu. Ta metoda rutinski se rabi u klinikoj analizi, npr. uanalizi seruma i izoenzima. Budui da membrana celuloznog acetata imavelike pore koje omoguuju difuziju makromolekula, u razdvajanju sepostie slabija rezolucija i manja osjetljivost detekcije nego napoliakrilamidnom gelu.

Silikagel kao vrsti nosau elektroforezi rabi se u obliku tankog sloja uplitici elektrolitski povezanoj s posudicama s puferom. Rabi se u analizipolisaharida velike molekulske mase i lipopolisaharida, koji zbog veliineestica mogu zaepiti pore u poliakrilamidnom gelu.


26/186

Elektroforeza u otopini na nosau14

Budui da su spomenute nosae otopine u elektroforezi danas praktinopotpuno istisnuli nosai sa strukturom gela, naini provoenja elektroforeze,detekcija razdvojenih makromolekulskih vrsta te njihova izolacija bit eopisani u primjerima elektroforeze u gelu.

3.2. Elektroforeza u gelu

Uporabom gela kao nosaa elektrolitne otopine omoguena je kontrolaveliine pora kroz koje migriraju molekulski ioni i na taj nain kontrolauinaka molekularnog sita u razdvajanju makromolekula u elektroforezi.

Gel zapravo ini prostorno umreene molekule u kojem su upljine,pore, ispunjene elektrolitnom otopinom, najee otopinom pufera.

Danas se najee rabi poliakrilamidni gel, manje gel od agaroze i vrlorijetko gel od kroba.

Analit se u gel unosi tako da se mali volumen otopine analita,mikropipetom, unese nadsvodno na tap gela ili u jaice na ploi gela.U ploi gela moe se uiniti vei broj jaica i tako istovremeno

razdvajati vei broj uzoraka istog analita ili vei broj razliitih analita.Makromolekulski ioni iz otopine analita pod uinkom elektrinog polja

migriraju kroz gel razliitim brzinama i tako se razdvajaju.Ako su pore gela velike u odnosu na veliinu makromolekula u analitu,

molekulski ioni putovati e kroz gel bez zapreke, kao u slobodnoj otopini. Utom sluaju makromolekulski ioni analita putuju kao paketii istovrsnihestica. Prostorni geometrijski oblik putujuih paketia preslika jegeometrijskog oblika otopine analita. U gelu u obliku tapa to su valjcivisine jednake visini sloja otopine u cijevi u kojoj se nalazi gel. U ploi gela

to se kocke ili kvadri ili valjci ako su jaice na horizontalnoj ploi gelauinjene u obliku valjka. Promatrano bono ti volumeni razdvojenihmakromolekula izgledaju kao uske zone, odnosno vrpce. Govorimo, stoga, oelektroforezi putujuihzona, odnosno vrpci. Budui da je migracijski putogranien (obino 10 cm), bolja rezolucija razdvajanja ostvaruje se, osobitoako analit sadri velik broj razliitih molekulskih vrsta, kada su te zone uskepa se meusobno ne preklapaju. irina zona ovisi o visini sloja otopine u

jaici. to je sloj otopine analita u jaici manji, to su zone razdvajanja ue.Dakle, poeljno je elektroforezu initi malim volumenom tokoncentriranijeg analita. Meutim, to se esto, zbog slabe topljivostimakromolekula, ne moe uiniti.

Zato se, da bi se ostvarile vrlo uske zone separacije, primjenjuje

postupak u kojem se makromolekule iz analita prije ulaska u separacijiskigel nagomilavaju(eng. stacking) u vrlo tanki (uski) sloj. Tako koncentriraneulaze u separcijski gel (vidi poslije).


27/186

Agarozni gel 15

Na slici 3.1. pokazani se geometrijski oblici gela rabljeni uelektroforetskoj separaciji.

c)b)a)

analit

analit

jaice

Slika 3.1. Geometrijski oblici gela u elektroforezi: a) gel u obliku tapa (cilindrinigel), b) gel u obliku vertikalne ploe, c) horizontalna ploa gela na staklenoj ploi ili

plastinoj foliji

Uz reeno, na irinu zona utjee i difuzija makromolekula iz zone ususjedni prostor, zbog difuzije zone postaju ire to je trajanje razdvajanjadulje. U gelu sa svojstvom molekularnog sita i taj e uinak utjecati na irinusepariranih zona.

Jaice na horizontalnoj ploi gela mogu se uiniti na jednom kraju gela(kao na slici) ili u sredini ploe gela. Iz analita u jaici u sredini ploe gelamoe se uiniti razdvajanje i elektriki pozitivnih i negativnih sastojaka jerkroz separacijski gel mogu putovati i prema anodi i prema katodi. U gelu uobliku valjka i vertikalne ploe mogu se u jednom pokusu razdvajati samosastojci istog elektrinog naboja. Sastojci suprotnog naboja razdvajaju se u

drugom nezavisnom pokusu.Budui da je veina makromolekulskih vrsta koje razdvajamo u

elektroforezi bezbojna, njihovo putovanje kroz gel ne moe se vizualnoizravno pratiti. Da bi se odredilo trajanje separacije, u otopinu analita dodajese bojilo kojem je elektroforetska pokretljivost vea od elektroforetskepokretljivosti sastojaka analita. Bojilo putuje kroz gel u vlastitoj zoni ispredzona sastojaka analita. Budui da putovanje bojila kroz gel moemo vizualnopratiti, postupak elektroforeze prekidamo kad zona bojila dostigne(suprotnu) granicu separacijskoga gela. Na taj nain odreuje se trajanjeelektroforeze.

U razdvajanju proteina koji imaju negativni naboj i migriraju premapozitivnoj elektrodi kao bojila rabe se bromfenol plavo, ksilencianol inaranasto G. U razdvajanju elektriki pozitivnih makromolekula koje uelektroforezi putuju prema negativnoj elektrodi kao pokazno bojilo rabe sebromkrezol zeleno, pironin Y ili metilensko plavo.


28/186


3.2.1. krobni gel

krobni gel ini se od hidrolizata kroba krumpira1, koji se otapa uvruoj vodi i lijeva u ploe debljine 5 do 10 mm. Hlaenjem otopine nastajegel. Veliina pora moe se mijenjati promjenom koncentracije kroba uotopini.

Meutim krob, kao prirodni (nativni) produkt, ima nestalni omjerkoliine amilaze i amilopektina od kojih je graen. To uzrokuje slabuponovljivost svojstava gela. Gel ima slaba mehanika svojstva.

Uporabom krobnoga gela uinjen je veliki napredak u rezolucijirazdvajanja makromolekula u odnosu na elektroforezu na papiru. Meutim,danas se praktino malo rabi zbog neusporedivih prednosti koje prua gel odpoliakrilamida.

3.2.2. Agarozni gel

Agaroza je visoko proieni prirodni polisaharid koji se dobiva izagara.

Agar, dobiven iz morskih trava, prva je rabljena tvar kojom sesprjeavala konvekcija otopine u elektroforezi. Uporabom gela od agaraostvarena je bolja separacija proteina od separacije uinjene u slobodnojotopini. Meutim, agar uz agarozu sadri i druge komponente, koje imajusulfatne i karboksilne skupine, koje u neutralnom i lunatom medijudisociraju i tako uzrokuju elektroosmotski tok otapala prema negativnoj

elektrodi. Osim toga, neki proteini veu se na agar.Proiavanjem agara, navlastito uklanjanjem agaropektina, dobiva se

agaroza. Na tritu je vie vrsta agaroze razliite istoe. Razlikuju se utemperaturi talita (od 35 oC do 95 oC), razini elektroosmoze, vrstoi ioptikoj prozirnosti gela. Za primjenu u elektroforezi agaroza treba imati toniu razinu elektroosmoze i visoku optiku prozirnost gela.

Gel od agaroze nastaje hlaenjem vodene otopine agaroze uinjeneotapanjem agaroze (bijeli prah) u kipuoj vodi. Pri hlaenju na odreenimdijelovima jedinica agaroze nastaju odsjeci s dvostrukom uzvojnicom.Time se umreavaju molekule i nastaju vlaknaste polimerne strukture.Izmeu polimernih vlakana, u porama, zadrava se voda odnosno otopinaelektrolita i tako nastaje gel. Veliina pora u gelu ovisi o koncentracijiagaroze.

1O. Smithies,Biochem. J.,61 (1955) 629.


29/186

Agarozni gel 17

OO

O

HOCH

OOH

OOH

CH2 2

OH

O

Slika 3.2. Kemijska struktura jedinica agaroze i struktura polimera u gelu

Premda je primjena gela od agaroze potisnuta uporabompoliakrilamidnog gela, u dva je podruja gel od agaroze nezamjenjiv. To suprimjena u imunoeletroforezi (vidi kasnije) i u separaciji vrlo velikihmolekula kojima je hidrodinamiki radijus vei od 10 nm.

3.2.3. Poliakrilamidni gel

U elektroforezi se danas najee rabi gel od poliakrilamida. Prvi je putprimijenjen1 1960. g. Kemijski je inertan, ima jednolinu strukturu ihomogena svojstva i moe se brzo i jednostavno prirediti.

Prostorna struktura poliakrilamidnog gela moe se kontroliranomodificirati i tako prilagoditi eljenoj primjeni. Poliakrilamidni gel nastaje

vinilnom polimerizacijom u otopini, akrilamidnog monomera CH2=CH -CO -NH2, u duge poliakrilamidne lance i umreivanjem tih lanaca s pomouotopine bifunkcijskog komonomera. Kao umreivalo najee se rabi N,N'-metilen-bis-akrilamid (akronim: Bis) CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2. Umreivalo reagira s funkcijskim skupinama u prostorunepravilno orijentiranih polimerizacijom nastalih lanaca poliakrilamida,meusobno ih kovalentno povezuje pa nastaje trodimenzijska struktura gela,kao to pokazuje slika 3.3.

Koncentracija akrilamida odreuje duljinu polimernih lanaca, akoncentracija umreivala stupanj kovalentne umreenosti.

Oba ta imbenika odreuju fizika svojstva nastalog gela, tj. njegovugustou, elastinost, vrstou i veliinu pora unutar gela.

1S. Raymond , V. J. Wang,Anal. Biochem. 1 (1960) 39.


30/186


CH

C O

NH2 +

CH2

CH2 CH

C O

NH2

CH

C O

NH2

CH

C O

CH

C O

NH2

CH2

CH2 CH2

CH2 CH

C O

NH2

CH2 CH

C O

NH

CH

C ONH2

CH2

CH

NH

C O

CH

NH

CH2

C O

CHCH2

CH2

CH

C O

NH2

CH2

[CH2 CH

C O

NH2

]xCH2 CH

C O

NH

CH2

CH

C O

NH2

CH2 CH

C O

NH2

CH2

NH

C O

CH CH2

CH

C O

NH2

CH2 CH

C O

NH2

CH2

CH2

CH

C O

NH

NH

C O

CHCH2

CH2

CH2

CH2 CH

C O

NH2

Slika 3.3. Kemijska struktura poliakrilamidnoga gela nastalog kopolimerizacijommonomera akrilamida s N,N'-metilen-bis-akrilamidom kao umreivalom i prostorni

raspored polimernih niti kovalentno vezanih umreivalom

Uobiajen nain opisivanja svojstava gela predloio je Hjertn2, u kojem

se ukupan sadraj krutine, tj. monomera i komonomera, tj. akrilamida iumreivala (Bis) iskazuje veliinom T3, tj. u gramima krutine u 100 mLotopine, a veliinom C maseni udio umreivala u odnosu na ukupnu masumonomera i komonomera, tj. u masenim postotcima.

2S. Hjertn,Arch. Biochem. Biophys. Suppl. 1(1962) 147.3Veliina Tiskazana je kao ukupna masena koncentracija (g/100 mL), i u literaturi oelektroforezi gotovo uvijek iskazuje se kao T% (w/V), to nije korektno, jer sumaseni ili volumni udjeli iskazani kao postotci bezdimenzijske veliine. Zato e seveliina T iskazivati u g/100 mL, a ne u postotcima.


31/186

Poliakrilamidni gel 19

[ ]( ) x100 x100

%a b b

T CV a b

+= =

+

gdje su: a - masa akrilamida u gramima, b - masa metilen-bis-akrilamida u g

i V - volumen otopine u mL.

Kao umreivala za poliakrilamidni gel rabe se i drugi bifunkcijskikomonomeri, kao to su etilendiakrilat (EDIA), N,N'-dialiltartardiamid(DATD), N,N'-bisakrilcisteamin (BAC) i N,N'-(1,2-dihidroksietilen)bisakrilamid (DHEBA), koji se rabe u specifinim primjenama. Tako N,N'-bisakrilcisteamin (BAC) sadri disulfidne veze koje se mogu tiolnimreagensima cijepati. Zato se poliakrilamidni gel umreen s BAC-om moenakon elektroforeze prevesti u topljivi oblik i na taj se nain mogurazdvojene molekulske vrste kvalitativno i kvantitativno analizirati.

Vinilna polimerizacija akrilamida u vodenoj otopini tee mehanizmomslobodnog radikala i mora se inicirati (pobuditi) kemijski ili fotokemijski.Dodatkom katalizatora ubrzava se reakcija polimerizacije. Kao peroksidniinicijator (pobudnik) rabi se najee amonij-persulfat, iz kojeghomolitikim cijepanjem nastaju slobodni radikali kisika koji inicirajureakciju polimerizacije. Reakcija polimerizacije ubrzava se katalitikimdjelovanjem baze. Kao katalizator primjenjuje se kvarterni amin; N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin (TEMED).

Pri fotokemijskoj polimerizaciji kao inicijator se rabi riboflavin uzdjelovanje ultravioletnog svjetla veih valnih duljina. Fotokemijskapolimerizacija odvija se fotodekompozicijom riboflavina na leukoflavin,koji se reoksidira tragovima kisika u vodenoj otopini, pri emu se stvarajukisikovi slobodni radikali, koji iniciraju reakciju polimerizacije. Kao

katalizator i pri fotokemijskoj polimerizaciji rabi se TEMED.Za razliku od kemijske inicijacije amonijevim persulfatom prifotokemijskoj polimerizaciji u otopini moraju biti prisutni tragovi iz zrakaotopljenog kisika. Otopljeni atmosferski kisik istaje slobodnih radikala injegova prevelika prisutnost u otopinama za pripravu gela inhibira reakcijupolimerizacije, kako uz kemijsku tako i uz fotokemijsku inicijaciju. Zato seotopinama monomera prije mijeanja i polimerizacije mora smanjiti koliinaotopljenog kisika. To se ini provoenjem inertnog plina kroz otopine ilisnienjem tlaka zraka iznad otopine vakuumiranjem odnosno radom uinertnoj atmosferi.

Fotokemijska polimerizacija rabi se u pripravi gela s elektrolitom maleionske jakosti poto je gelu dodaju vrlo male koliine riboflavina (0,5 mg na

100 mL otopine) i takoer u ispitivanju proteina osjetljivih na amonijevpersulfat odnosno produkte peroksidnog inicijatora.Polimerizacija monomera moe se inicirati i svjetlom, zato otopinu

monomera treba drati u tamnim bocama podalje od izvora svjetla.


32/186


Veliina pora poliakrilamidnog gela odreena je veliinama T i C.Utvreno je da, uz konstantnu vrijednost C, veliina pora obratno jerazmjerna ukupnoj koncentraciji monomera, tj. vrijednosti T. Takoer jepokazano da se za bilo koju vrijednost T minimalna veliina pora postie uzC = 5 %, a uz manju i veu vrijednost C veliina pora raste. Za tipinevrijednosti T= 5 g/100 mL i C= 5 % veliina pora poliakrilamidnog gela

jest oko 20 nm. Uz velike vrijednosti C (30-50 %) brzina polimerizacijesmanjuje se, nastali gel grudast je i veliina mu je pora od 500-600 nm.Grudice gela dovoljno su velike te rasipaju svjetlost, stoga je takav gelneproziran.

Optimalna temperatura pripreme gela jest 25-30 oC.Budui da se polimerizacijom oslobaa toplina, zbog posljedine

konvekcije mogu nastati nepravilnosti u strukturi gela. Mogu i popucaticijevi odnosno ploe kalupa u kojima se stvara gel. Pretjerano zagrijavanjemoe se izbjei prikladnom koncentracijom inicijatora i katalizatora, takvomda vrijeme polimerizacije bude od 20 do 60 minuta.

Monomeri su toksini. Apsorpcijom kroz kou iritiraju kou odnosno

udisanjemestica akrilamidne praine uzrokuje poreme

aje centralnogivanog sustava. Formirani poliakrilni gel relativno je netoksian i siguran

za rukovanje. Ipak se preporuuje uporaba zatitnih rukavica i izbjegavanjepretjerano dugog kontakta.


33/186

4. ELEKTROFOREZA U HOMOGENOMPOLIAKRILAMIDNOM GELU UZ HOMOGENI PUFER

Elektroforeza uz uporabu poliakrilamidnog gela (akronim PAGE,polyacrylamide gel electrophoresis) provodi se na vie razliitih naina sobzirom na strukturu (homogenost pora) gela, vrste rabljenog pufera,prethodnu obradu analita itd. Jedna od metoda jest elektroforeza shomogenim poliakrilamidnim gelom i homogenim puferom. U toj metodirabi se gel s homogenom, jednolinom, veliinom pora i uz primjenu jednog

pufera. Primjenjuje se za separaciju makromolekula iz smjesa: proteina,lipoproteina, glikoproteina, mukopolisaharida, peptida, nukleinskih kiselina idrugih. Pri tom je potrebno vrlo malo, samo nekoliko mikrolitara analita.

4.1. Elektrini naboj elektroforetskih jedinki

Proteini su amfoterne molekulske vrste, zapravo zwitter ioni kojesadravaju kationska i anionska sredita, odnosno kisele i bazne funkcijskeskupine, pa ionizacijom u otopini postiu pozitivni ili negativni elektrini

naboj. Elektrini naboj proteina posljedica je ionizacije karboksilnih skupina(-COOH COO + H+) odnosno amino skupina (-NH2 + H

+ NH3

+)pokrajnih lanaca bjelanevina.

Te ionizacije ovise o pH okolne otopine pa e naboj estice proteinaovisiti o pH okolnog elektrolita te o broju i tipu aminokiselina koje nosekarboksilne odnosno amino skupine. Naboj im ovisi i o sadraju elektrikinabijenih i nenabijenih eera, sulfohidrilnom umreavanju i blokiranjuamino skupina i karboksilnih skupina.

Pojedina vrsta proteina ima, pri odreenom pH, neto elektrini nabojnula. Pri tom pH na estici proteina postoji jednaki broj ionizacijomstvorenih pozitivnih i negativnih naboja pa je efektivni elektrini naboj nula.To je tz. izoelektrina toka proteina, pI, karakteristina za svaki protein.Tako je pI humanog hemoglobina pri pH = 7,07, a -laktoglobina pri pH =5,34. U otopini kojoj je pH vei od pI, estica proteina ima neto negativnielektrini naboj i putovat e prema pozitivnoj elektrodi elektroforetske


34/186


elije, a pri pH manjem od pI imat e pozitivni naboj i putovat e premanegativnoj elektrodi elije.

Nukleinske kiseline nisu amfoterne. Imaju negativni elektrini naboj prisvim pH vrijednostima rabljenim u elektroforezi, i to zbog jakog kiselogobiljeja fosfatnih skupina na estici nukleinske kiseline.

4.2. Kontrola elektrinog naboja elektroforetskih jedinki

Budui da elektrini naboj amfoternih molekulskih vrsta izravno ovisi opH elektrolitne otopine u kojoj se ini razdvajanje makromolekulskih iona,prijeko je potrebno odravati stabilni pH otopine u separacijskom gelu. To seini uporabom otopine pufera u kojem se ini i polimerizacija gela. Uelektroforezi u poliakrilamidnom gelu primjenjuju se puferi kojima je pH od2,0 do 11,0.

Za svaku pojedinu vrstu analita treba obaviti ispitivanje elektroforetskeseparacije pri razliitim vrijednostima pH i tako odabrati optimalni pH zauinkovito elektroforetsko razdvajanje. Potrebno je utvrditi raspadaju li se ilitaloe, pri odreenom pH, neki sastojci ispitivanog analita.

Budui da pri pH < 3 odnosno pH >10 moe doi do deamidacije ihidrolize proteina, i taj imbenik treba uzeti u obzir pri izboru pH zaelektroforetsko razdvajanje. Budui da se na elektrodama elektroforetskeelije zbog elektrolize vode generiraju H+ odnosno OH- ioni, i otopine ukomorama za elektrode odnosno kontaktne vrpce moraju sadravati pufer. Upreliminarnom ispitivanju nepoznatih analita poeljno je najprije raditi privisokim pH-vrijednostima, pri kojima sve estice ispitivanog uzorka imajunegativni elektrini naboj te sve putuju u jednom smjeru, tj. prema pozitivnoj

elektrodi. Nakon toga se pri manjim pH vrijednostima utvrde uvjetinajboljeg razdvajanja. Bazni proteini, npr. histoni, najbolje se razdvajaju priniim pH-vrijednostima.

Veina proteina, koji su slabe kiseline, i kojima su izoelektrine toke ugranicama pH od 4 do 7,5, najbolje e se razdvajati u lunatom mediju pripH od 8 do 9.

Stabilnost pH poliakrilamidnog gela postie se odgovarajuimkapacitetom rabljenog pufera. Pri tom ionska jakost pufera ne smije bitiprevelika.

Tijekom elektroforeze ioni pufera migriraju kroz gel, ovisno o naboju,prema pozitivnoj ili negativnoj elektrodi i tako sudjeluju u prijenosuelektrine struje, a time i zagrijavanju gela. Zato ionska jakost pufera morabiti to je mogue manja ali ipak dovoljna da osigura stabilnost pH u gelutijekom migracije ionskih vrsta analita. Osim toga velika koncentracija iona,mehanizmom isoljavanja, smanjuje topljivost molekulskih vrsta u analitu.


35/186

Uinak naboja elektroforetskih jedinki 23

Meutim, uz viu ionsku jakost smanjuje se brzina difuzije estica pa setako poveava rezolucija razdvajanja. Vea ionska jakost uzrokuje manjuelektrinu otpornost gela a time, i uz odreeni radni napon, jau elektrinustruju kroz gel. Uz jau struju kroz gel oslobaa se vie topline. Meutim,uklanja li se osloboena toplina na adekvatan nain, tj. ako se sprijeipregrijavanje gela tijekom razdvajanja, uz viu ionsku jakost medija postiese bolja rezolucija razdvajanja s otrijim (uim) zonama razdvojenihmolekulskih vrsta.

Ako se ne moe postii adekvatno hlaenje gela, da se gel ne bipregrijao, treba primijeniti nii radni napon. Meutim, uz nii napon vrijemeelektroforeze dulje je. Predugo vrijeme elektroforeze uzrokuje vii stupanjdenaturacije makromolekula analita i uz to irenje vrpci zbog duljegvremena difuzije estica. Zato se u preliminarnim ispitivanjima morajuutvrditi optimalni uvjeti elektroforeze za svaku vrstu analita.

U elektroforezi s poliakrilamidnim gelom s homogenim pH kao osnovnesupstancije za pripravu pufera rabe se slabe kiseline odnosno slabe baze.

Za podruje 2,6 pH 3,6 rabi se limunska kiselina kojoj je pKa =3,13,

dakle, otopina koja sadri limunsku kiselinu i njezinu konjugiranu bazu, tj.citrat ion u jednakoj mnoinskoj koncentraciji ima pH 3,13. Promjenomodnosa koncentracije kiseline i njezine konjugirane baze neutralizacijomotopine limunske kiseline s otopinom NaOH ostvaruje se potreban pHpufera. to je vea koncentracija kiseline i njezine konjugirane baze, to jevei kapacitet pufera.

Mravlja (metan) kiselina s pKa = 3,75, i dijelom neutralizirana otopinomNaOH, rabi se za pufere s pH od 3,0 do 4,3.

Octena (etan) kiselina s pKa = 4,76, dijelom neutralizirana s NaOH ili stris-(hidroksimetil)-aminometan (akronim; tris), rabi se za pufere s pH od 4,0do 5,5.

Malonska kiselina, pKa = 5.68, dijelom neutralizirana s NaOH ili trisom,

rabi se za pufere pH od 5,2 do 7,0.Za pufere s pH od 6,0 do 8,0 primjenjuje se KH2PO4 ili NaH2PO4odnosno H2PO4

ion kao kiselina s pKa = 7 uz dodatak NaOH. Za isto pHpodruje rabi se Na-dietilbarbiturat (veronal)1uz dodatak otopine HCl.

Tris, dijelom neutraliziran otopinom HCl ili 2-aminooctenom kiselinom(glicin) rabi se za pufere s pH od 7,2 do 9,0.

Boraks (Na 2B4O7) uz dodatak HCl ili NaOH rabi se za pufere s pH od8,5 do 10.

Glicin, dijelom neutraliziran s NaOH, rabi se za pufere s pH od 9,0 do10,5. NaHCO3,tj. HCO3

kiselina s pKa=10,3 uz dodatak NaOH rabi se zapufere s pH od 9,0 do 11,0.

1Uporaba barbiturne kiseline danas se, iz medicinskih razloga, ne preporuuje.


36/186


Najee su rabljene koncentracije pufera od 0,05 do 0,1 mol/L.Primjenjuju se i koncentracije pufera do 1 mol/L odnosno manje od 0,025mol/L. Koncentracije pufera iznad 0,5 mol/L rabe se za pripravu jako kiselihpufera. Za pripremu pufera rabe se kiseline koje su slabo ionizirane. Priniskim pH ravnotena koncentracija rabljene kiseline malena je. Stoga, da bise postigla zadovoljavajua ionska jakost pa time i kapacitet pufera,koncentracija pufera mora biti dovoljno velika.

Treba naglasiti da je ionska jakost pufera veliina koja odreuje njegovuelektrinu vodljivost, to jest ionizirani dio pufera, a ne njegova ukupnakoliinska koncentracija iskazana u mol/L. Slabo ionizirani puferi, premdavie koncentracije, ne uzrokuju prevelike struje elektroforeze pa se tako nepregrijava gel.

4.3.Uinak veliine pora

Veliina pora poliakrilamidnog gela utjee, uinkom molekularnog sita,na brzinu migracije molekulskih iona kroz gel, a time i na njihovorazdvajanje.

Svojstva analita upuuju na izbor uvjeta za dobru separaciju. Tako senpr. u ispitivanju visokomolekularnih virusnih proteina i nukleinskih kiselinarabi gel s velikim porama, a to e biti poliakrilamidni gel u kojem je T < 5g/100 mL. Uz velike pore uinak molekularnog sita vrlo je malen. Uispitivanju niskomolekularnih polipeptida ili histona rabi se poliakrilamidnigel u kojem je Tod 15 do 20 g/100 mL i vii. Uporabom gela malih pora,zbog uinka molekularnog sita, jae su izraene male razlike u molekulskojmasi ispitivanih estica. elimo li da se razdvajanje ini iskljuivo na razlici

u naboju estica, primijenit emo gel velikih pora i u razdvajanju malihmolekula.

Pretpostavimo razdvajanje dviju molekulskih vrsta od kojih vrsta manjemolekulske mase ima i manji neto elektrini naboj. Primijenimo li gelvelikih pora (manji T), vee molekule, koje imaju i vei naboj, putovat ebre i tako se razdvajati od manjih. Uporabom gela manjih pora (vei T)uinak molekularnog sita bit e vei za velike molekule, koje e putovatisporije. Taj uinak moe biti toliki da iznad odreene vrijednosti T veemolekule, bez obzira na vei naboj, putuju sporije od manjih molekula smanjim nabojem. Pri odreenoj vrijednosti T brzina putovanja i manjih iveih estica bit e jednaka pa e u elektroseparaciji nastati samo jedna zonaodnosno vrpca. Dakle postojanje jedne zone odnosno vrpce nije sigurandokaz da u ispitivanom uzorku postoji samo jedna molekulska vrsta. Akomanja estica ima vei elektrini naboj, ona e putovati bre od velike ipoveanjem koncentracije gela (vei T) poveavat e se razlika u brzini,


37/186

Uinak naboja elektroforetskih jedinki 25

zbog jaeg uinka molekularnog sita na vee estice, i tako prielektroseparaciji nastaju dvije dobro razdvojene zone.

Uporabom poliakrilamidnog gela s vrijednou Tod 3 do 5 g/100 mLpostie se optimalna separacija estica relativne molekulske mase vee od100 000, uz Tod 5 do 12 g/100 mL za estice relativne molekulske mase od20 000 do 150 000, uz T od 10 do 15 g/100 mL za separaciju esticarelativne molekulske mase od 10 000 do 80 000 odnosno s Tod 15 g/100 mLi vie za separaciju estica relativne molekulske mase manje od 15 000.

Vrijednost veliine C odreuje fizika svojstva gela. Ako je Cvei od10 %, gel je krt i neproziran, a uz C manji od 1 %, gel je ljepljiv i takoneprikladan za manipulaciju. Za postizanje gela optimalnih manipulativnihsvojstva preporuuje2 se vrijednost C izraunata prema relaciji; C = 6,5 -0,3 T.

Oito je da mnogi imbenici utjeu na elektroforetsko razdvajanjemolekulskih iona. Meutim, odreeni stupanj razdvajanja moe se postii uirokom rasponu pH vrijednosti elektrolita, uz razliite vrijednosti T i Cpoliakrilamidnog gela, razliitu ionsku jakost i razliite elektrine uvjete

elektroforeze te razliito trajanje razdvajanja. Optimalni uvjeti razdvajanjautvruju se nizom preliminarnih mjerenja uz promjenu imbenika koji utjeu

na razdvajanje. Svojstva analita odreuju optimalne uvjete razdvajanjasastojaka.

4.4. Naprave za elektroforezu

U elektroforezi s poliakrilamidnim gelom rabe se tri geometrijska oblikagela, i to u obliku horizontalne ploe, vertikalne ploe odnosno vertikalnog

valjaka (cilindara). Za elektroforezu u gelu razliitog geometrijskog oblikarabe se i razliite naprave. Na tritu se nalaze razliite tvorniki izraenenaprave za elektroforezu, a mnoge se izrauju u laboratorijima za specifinuprimjenu. Na slici 4.1. pokazane su skice naprava za elektroforezu u gelu.Svaka od rabljenih naprava odnosno tehnika elektroforeze ima odreeneprednosti i mane.

Najjednostavnije su naprave za rad s horizontalnom ploom gela. Gel sepolae na hlaenu horizontalnu staklenu ili keramiku plou. Elektrinikontakt izmeu elektroda i otopine u gelu uspostavlja se s pomoukontaktnih vrpca (vrlo isti filtrirni papir), koje su jednim krajem uronjene uotopine pufera u komorama za elektrode a drugim krajem poloene nakrajeve gela (kao na slici 4.1.c), ili samo polaganjem, na krajeve ploe gela,

uskih kontaktnih vrpci namoenih u otopinu pufera, na koje se polau

2E. G. Richards, J. A. Coll, W. B. Gratzer, Anal. Biochem. 12 (1965) 452.


38/186


metalne elektrode. Imaju prednost i zbog toga to se iste naprave moguprimijeniti u elektroforezi s drugim nosaima medija (krob, gel agara, papirili celulozni acetat) i u drugim metodama elektroforeze (vidi kasnije).

otopine puferastaklena cijev

staklene ploe

gel

gel

analit

a) b)

c)

d)

otopinapufera

gelanalit

gelanalit

otopine pufera

analit

kontaktne vrpce (papir)

Slika 4.1. Skice naprava za elektroforezu u gelu: a) aparatura s gelom u obliku

valjka, b) s vertikalnom ploom, c) s horizontalnom ploom, d) s horizontalomploom gela uronjenom u pufer

Pri uporabi horizontalne ploe otopina analita unosi se u gelpipetiranjem u urezanu jaicu u gelu ili s pomou komadia filtrirnogapapira na koji se nakapa izmjereni volumen analita. Papiri natopljenotopinom analita stavlja se na povrinu (lice) gela. Prednost je horizontalneploe to se analit moe unijeti na bilo koje mjesto na ploi. Unoenjemispitivanog uzorka u sredinu ploe moe se pratiti migracija prema jednoj idrugoj elektrodi u jednom eksperimentu. Na horizontalnoj ploi moe senapraviti vei broj slijednih jaica u koje se mogu unijeti razliiti uzorci,ispitati i usporediti pri jednakim elektroforetskim uvjetima. Obavlja li se

ispitivanje s istom vrstom uzoraka, nastale jednake vrpce separiranih esticamogu se ispitati odnosno detektirati razliitim tehnikama detekcije.


39/186

Naprave za elektroforezu 27

Pri uporabi tehnike s vertikalnom ploom ili valjkom, elektrini kontaktuspostavlja se preko otopina pufera u gornjoj i donjoj komori za elektrode.Otopina analita nanosi se na jedan kraj ploe ili valjka. Tako se u jednomeksperimentu moe odrediti migracija estica prema samo jednoj odelektroda. Migracija prema drugoj elektrodi moe se ispitati u drugompokusu s obratnim polaritetom elektroda. Kao vertikalne ploe ili valjci lakese pripremaju gelovi s viefaznim puferima (vidi kasnije). Rezolucija koja sepostie na ploi ili valjku jednaka je. U radu s ploom moe se primijenitivea koliina uzorka, zato se ta tehnika rabi u preparativnoj elektroforezi.Primjenjuju se valjci odnosno ploe poliakrilamidnog gela razliitihdimenzija (veliina), ovisno o eljenom razmaku razdvajanja zona i koliiniispitivanog uzorka.

4.5. Priprava gela

Ploe odnosno valjci gela ine se lijevanjem smjese otopina monomeraakrilamida i bis-akrilamida, pufera, TEMED-a i amonijeva persulfata ukalupe u kojima se ini polimerizacija. Tako za pripravu 100 ml otopine zapolimerizaciju, u kojoj je T = 10 g/100 mL a C 5 %, treba 9,5 g akrilamida,0,5 g bisakrilamida, 0,05 ml TEMED-a i 0,0,5 g amonijeva persulfata.Najprije se pomijeaju potrebni volumeni izvornih otopina monomera ipufera. Deaeriranjem se u otopini smanji sadraj otopljenog kisika i tada sedodaju potrebni volumeni otopine amonijeva persulfata i TEMED-a. Smjesase odmah zatim lijeva u kalup.

Za vertikalnu plou gela smjesa se ulijeva izmeu dvije staklene ploemeusobno odijeljene umetnutim razmaknicama. (slika 4.2.). U gornjem

dijelu jedne od ploa urezan je utor koji omoguava elektrolitni kontakt sotopinom pufera gornje komore elektroforetske elije. Danas se sve vie kao

jedna od ploa kalupa rabi keramika ploa. Naime vrste keramika temeljenena aluminijevu oksidu provode toplinu mnogo bolje nego staklo. Na tajnain uinkovitije se odvodi toplina, koja se oslobaa pri polimerizacijiodnosno elektroforezi, u okolinu. Veliina staklenih ploa odnosnopripravljenog gela moe biti od nekoliko kvadratnih centimetara (lijevanihizmeu mikroskopskih stakala) do nekoliko stotina centimetara kvadratnih.Razmak izmeu staklenih ploa moe biti manji od 0,05 mm pa do vie od 5mm. Najee se rabe razmaknice (od lucita) debljine od 0,5 do 1,5 mm.Bone strane i donja strana staklenog kalupa (sendvi) vodonepropusno sezalijepe, obino rastezljivom folijom parafinskog voska (Parafilm) ilirastaljenom 1,5 %-tnom otopinom agara.


40/186


Nakon ulijevanja otopina za polimerizaciju u gornji dio kalupa umee seplastini (teflon) ealj kojim se u poliakrilamidnom gelu oblikuju pravilne

jaice ravnoga dna.

ealj za formiranje jaica

staklena ili keramika ploa

razmaknice

staklena ploa

stege

a) b)

Slika 4.2. Kalup za lijevanje i polimerizaciju ploe gela za vertikalnu elektroforezu:

a) sastavnice kalupa, b) sastavnice kalupa formirana sa stegama u kalup, navertikalnom nosau

Nakon polimerizacije uklanja se ljepljiva vrpca s donje strane staklenogsendvia i ploa s gelom pripremljena je za elektroforezu. Obino se gellijeva 24 sata prije uporabe i u meuvremenu se uva u vlanoj komori ili uplastinoj vreici u kojoj je i nekoliko mL otopine pufera. Valjakpoliakrilamidnog gela pripravlja se lijevanjem smjese za polimerizaciju ustaklenu cijev duljine 5 do 25 cm i unutarnjeg radijusa od 1 do 5 mm, koja jena jednom kraju zaepljena (parafilm). U preparativnoj elektroforezi rabe sevaljci radijusa i do 10 cm.

U elektroforezi vrlo malih koliina uzorka, za brzu separaciju i velikurezoluciju, rabe se kapilarne cijevi duljina 30 do 100 cm i unutarnjegdijametra od 50 do 100 :m. Najee se rabe staklene cijevi unutarnjegradijusa 4 do 5 mm. Smjesa za polimerizaciju ulijeva se do visine od 10 do15 mm od visine cijevi. Da bi se dobila ravna povrina gela, na otopinumonomera nadsvodno se dodaje 5 mm debeli sloj vode ili 5 %-tne otopineetanola ili izobutanola. Time se sprjeava nastajanje meniska na povrinigela, to bi za posljedicu imalo zakrivljene vrpce u forezogramu. Tajpostupak primjenjuje se i u pripravi vertikalne ploe gela ako se ne rabiplastini ealj za formiranje jaica. Ploa poliakrilamidnog gela za

horizontalnu napravuini se kao i za vertikalnu napravu, polimerizacijomizmeu para staklenih ploa. Time se iskljuuje uinak kisika iz zraka koji

inhibira polimerizaciju.


41/186

Priprava gela 29

otopina monomera

sloj vode

Slika 4.3. Slojem vode na otopini za polimerizaciju sprjeava se nastajanje meniska itako stvara ravna povrina na koju se nanosi otopina analita

Nakon polimerizacije jedna se staklena ploa uklanja i tako otvara licegela na kojem se ine (buenjem) jaice. Povrina staklene ploe na kojojostaje gel hidrofilna je, a ona koja se uklanja hidrofobna, to se postie

nanoenjem tankog sloja silana (Repel Silane

). Danas se sve vie lijeva gelna plastinu foliju (Gel Bond Page Film), na koju se poliakrilamidni gelkovalentno vee. Tako se mogu uiniti vrlo tanki gelovi koji bi inaenevezani na plastinu foliju bili lomljivi i neprikladni za manipulaciju. Nastaklenu plou koja se uklanja mogu se nalijepiti komadii ljepljive plastinefolije (parafilm) za formiranje jaica, kao to se vidi na slici 4.4. Uporabomvrlo tankih ploa gela moe se postii bolja kontrola temperature,uinkovitije ispiranje, bojenje, eventualno suenje i rehidratacija (vidiposlije). Rabe se horizontale ploe gela razliitih dimenzija od 2,5 5 cm2

do 20 30 cm2 i debljine od 0,05 do 10 mm.U metodama vertikalne elektroforeze ploe odnosno valjci s

pripremljenim gelom u staklenoj cijevi ili izmeu staklenih ploa umeu se u

vertikalnu aparaturu za elektroforezu tako da je donji kraj ploe odnosnovaljka uroni u donju komoru s puferom u kojoj je jedna elektroda. Gornjikraj ploe odnosno valjka u elektrolitnom je kontaktu s otopinom pufera ugornjoj komori aparature preko sloja otopine pufera u gornjoj komori zaelektrodu.

Otopina analita unosi se u jaice ploe odnosno na povrinu gela uvaljku s pomou mikroprice (eng. microsyringe) ili mikropipete kroz slojpufera koji prekriva povrinu gela.

Gustoa otopine analita mora biti vea od gustoe pufera tako se otopinaanalita zadri na dnu jaice, tj. uz povrinu gela. Poveanje gustoe otopineuzorka postie se dodatkom saharoze (2-10 %) ili glicerola (5-10 %).Otopina analita ne smije sadravati suspendirane vrste estice niti nakupinemasnoe koje bi zaepile pore u matrici gela. One se prije elektroforezeuklanjaju iz otopine analita centrifugiranjem. U otopinu analita unosi se,redovito, i bojilo kojim se prati tok migracije kroz gel.


42/186


staklene ploe plastina folija

razmaknice

umetci za formiranje jaica

a) b)

Slika 4.4. Lijevanje gela na plastinu foliju za horizontalnu aparaturu: a) sastavnicekalupa za lijevanje, b) sendvi za lijevanje uvren tipaljkama i unoenje

otopine za polimerizaciju

Kada vrpca bojila dospije do oko 5 mm od dna gela, proceselektroforeze treba zaustaviti. esto se vrpca pokaznog bojila rabi kaoreferentna toka za iskazivanje brzina migracije makromolekula krozseparacijski gel. Odmah nakon unoenja otopine analita poinjeelektroforeza, da bi se smanjilo vrijeme difuzije i tako gubitak sastojakaanalita u otopinu pufera u gornjoj komori aparature.

Najpovoljniji elektrini i ostali uvjeti separacije utvruju seeksperimentalno. Obino je napon separacije uz uporabu valjkastog gela od30 do 50 volta po centimetru duljine valjka, to uz radijus od 5 mm rezultira

jakou struje od 1-3 mA. Uz duljinu valjka gela od 7 cm proces separacije

traje od 40 do 120 min. Uz uporabu gela u obliku ploe duljine 20 cmprimjenjuju se naponi od 3 do 5 volta po centimetru duljine uz vrijeme

separacije od 15 i vie sati (preko noi).Odrava li se temperatura gela konstantnom, vrijeme separacije

proporcionalno je gradijentu uspostavljenog napona. Separacija se provodiuz konstantan napon. Nastaje li znatno zagrijavanje odnosno porasttemperature gela zbog omskog zagrijavanja, smanjuje se viskoznost medija ipoveava brzina migracije i difuzije estica. Tada je bolje raditi uzkonstantnu struju separacije.

Suvremeni komercijalni elektrini izvori za elektroforezu imajumogunost regulacije napona, jakosti elektrine struje odnosno kontrolesnage.

Naela rada elektrinih izvora za elektroforezu opisana su u poglavlju 13.


43/186

Prijenos makromolekula iz gela na povrinu membrane 31

4.6. Detekcija i kvantifikacija razdvojenih molekulskih vrsta

Nakon zavretka elektroforetskog razdvajanja makromolekulskih ionagel se vadi iz cijevi odnosno skida sa staklene ploe za kvalitativnu odnosnokvantitativnu analizu sastavnica analita. Detekcija i kvantifikacijarazdvojenih vrpci ini se mjerenjem odreenog fizikalno-kemijskog svojstvamolekula u vrpci. Najee se to ini mjerenjem apsorpcijeelektromagnetskog zraenja u vidljivom i ultravioletnom dijelu spektra.

Budui da su veina proteina i sve nukleinske kiseline bezbojne i nisuizravno vidljive u gelu, vizualnost zona pojedine makromolekulske vrste ugelu postie se bojenjem. To se ini vezanjem organskih bojila namakromolekule u gelu ili nanoenjem fino dispergiranih estica srebra,

slino fotografskom razvijanju. ini li se bojenje pod kontroliranimuvjetima, koliina vezanog bojila proporcionalna je koliini molekulskevrste u vrpci. Usporedbom rasporeda zona na forezogramu analita srasporedom zona na forezogramu uinjenom sa smjesom poznatihmolekulskih vrsta (standardi) ini se kvalitativna analiza analita. Mjerenjemodreenog fizikalno-kemijskog svojstva (npr. apsorpcije svjetla) molekulskevrste u zoni ini se kvantitativna analiza sastojaka analita, uvijekusporedbom sa standardom.

4.6.1. Bojenje makromolekula

U literaturi su opisana razliita bojila i postupci bojenja makromolekulaorganskim bojilima. Neka bojila primjenjiva su za velik broj razliitihmolekulskih vrsta, a neka specifino samo za odreenu molekulsku vrstu.Makromolekule u gelu boje se uranjanjem gela u otopinu bojila.

Nakon bojenja obavlja se odbojivanjeodnosno ispiranje bojila s matricesamog gela. Na taj nain gel na kojem nema vrpci makromolekula postajeprozirnim i na smeta u optikoj detekciji vrpci. Meutim zbog difuzijemakromolekula iz vrpci u gelu u otopinu za bojenje i odbojivanje nastajugubitci makromolekula u vrpcama, a time se smanjuje i tonostkvantitativnog odreivanja.

Da bi se ti gubitci smanjili, makromolekule u vrpcama uvruju se(fiksiraju). To se postie tako da se uvriva (npr. trikloroctena kiselina,uvruje taloenjem) dodaje u otopinu za bojenje te se proces uvrivanja i


44/186


bojenja odvija istovremeno ili se gel prije bojenja uranja u otopinuuvrivaa, to se ini pri bojenju srebrom, ali i pri bojenju organskimbojilima, osobito ako gel sadri nisko molekularne vrste koje lakodifundiraju i tako se gube. Njihovo uvrivanje obavlja se prije bojenja.Uvjeti bojenja, tj. sastav otopine za bojenje, vrijeme bojenja, temperatura idr. moraju biti kontrolirani i jednaki u ponovljenim postupcima, napose zakvantitativno odreivanje. Isto vrijedi i za postupak odbojivanja. Danas senajee postupak bojenja obavlja na automatskim ureajima, u kojima susvi imbenici postupka strogo kontrolirani, automatski voeni. To je osobitovano u bojenju srebrom, koje se ini stupnjevito u veem broju slijednih(dionih) procesa.

Sadri li gel bioloki aktivne molekulske vrste (enzime), tijekomuvrivanja i bojenja obino se gubi bioloka aktivnost tih makromolekula.eli li se sauvati bioloka aktivnost makromolekula u vrpci, primjenjuju seposebni postupci bojenja kojima se vizualizira pojedina molekulska vrsta iliutvrdi tip ili vrsta enzimatske aktivnosti.

Bioloka aktivnost makromolekula u vrpci moe se utvrditi i postupkom

kontaktnog preslikavanja. Na list papira ili tanki sloj agaroze ili poliamida nastaklenoj ploi prenese se dio aktivne molekulske vrsta iz vrpce na gelu. Tose ini tako da se list prisloni uz gel i dri odreeno vrijeme na prikladnojtemperaturi. Na listu ili sloju gela na staklenoj ploi vee se diomakromolekula iz vrpci gela. Zatim se list (odnosno staklena ploa) odvoji ina njemu zadrane molekulske vrste ispitaju na enzimatsku aktivnostuobiajenim postupkom za dotinu vrstu enzima. Utvrivanje prisutnostibioloki aktivne tvari u vrpci moe se odrediti i tako da se gel razree nadijelove. Dijelovi gela zatim se homogeniziraju u prikladnom puferu ianaliziraju na bioloku aktivnost sadranih makromolekula.

Bjelanevine se najee boje modrim bojilom (Coomassie Blue R250). Bojilo se vee na molekule proteina na gelu, tvorei elektrostatsku

vezu s NH3+

grupama i (nekovalentnu) Van der Waalsovu vezu s nepolarnimdijelovima proteinske molekule.Uvrivanje makromolekula na gelu provodi se taloenjem otopinom

trikloroctene ili sulfosalicilne kiseline odnosno imobilizacijom i kemijskimvezanjem na gel s pomou formaldehida. Metoda vezanja s formaldehidomnaroito je prikladna za vezanje peptida, glikopeptida i jako bazinihproteina, koji se slabije uvruju taloenjem kiselinama. Uz normalnooblikovanu vrpcu na gelu, bojenjem tim bojilom postie se osjetljivostdetekcije od 1 :g po vrpci.

Za bojenje bjelanevina rabe se mnoga bojila, a najranije je rabljenoamido crno 10B koje se i danas rabi napose za kvalitativno odreivanje.Jednaka osjetljivost postie se bojenjem s Xylene Cyanine Brilliant G uz

simultano uvrivanje s metanolnom otopinom trikloroctene kiseline, priemu nastaje jaka denaturacija i uvrivanje makromolekula. U kiselommediju to je bojilo u leuko-obliku i potpuno je bezbojno. Uranjanjem gela u


45/186

Detekcija i kvantifikacije sastojaka analita 33

otopinu, bojilo se vee na proteine u gelu i postaje plavo, zbog promjenekonstante disocijacije (pK). Ostali dio gela na kojem nema bjelanevinaostaje bezbojan. Gel zbog toga ne treba odbojivati za kvantitativno mjerenjeinteziteta obojenosti. Manja osjetljivost u kvantitativnom odreivanjubjelanevina (20 g po vrpci) postie se obiljeavanjem fluorescentnimtvarima.

gel na nosivom filmu

poklopac

mreasti nosa

kada za bojenje

grijai magnetski mijea

a) b)

Slika 4.5. Naprava za bojenje (a) i obezbojivanje (b) gela

To su molekulske vrste koje apsorbiraju ultravioletno zraenje i slijednoemitiraju elektromagnetsko zraenje u vidljivom dijelu spektra. Emitiranozraenje iz prisutnih vrpci na gelu, na koje se vezala fluorescentna tvar, vidise i tako otkriva mjesto pojedine vrpce. Emitirano svjetlo moe se registriratifotografski ili s pomou fotodetektora i tako kvantificirati. Kao fluorescentniobiljeivai rabe se anilinonaftalen sulfonat (ANS) ili o-ftaldialdehid (OPA).Postupak detekcije brz je jer venakon nekoliko minuta uranjanja u otopinuobiljeivaa gel se moe ispitati pod UV-lampom i tako otkriti vrpcemakromolekula. Pri tom postupku obiljeivanja fluorescentnim tvarima nenastaje denaturacija makromolekula i tako se odri njihova bioloka odnosnoenzimatska ili antigenetska aktivnost. One se slijedno mogu ekstrahirati izgela i ispitati na bioloku aktivnost.

Bojenjem makromolekula u gelu srebrom1postie se i stotinu puta veaosjetljivost od osjetljivosti uz bojenje organskim bojilima.

Opisani se m

Documents

Ivan Piljac - Elektroforeza