ELEKTROFOREZA Hb MATIŠIĆ - bib.irb.hr · Kapilarna zonska elektroforeza –CZE- Hb. Elektroforeza hemoglobina kapilarnom zonskom elektroforezom D Matišić tečaj trajnog usavršavanja

Elektroforeza hemoglobina kapilarnom zonskom elektroforezomD Matišić

tečaj trajnog usavršavanja medicinskih biokemičaraPrimjena automatiziranih elektroforetskih metoda visoke djelotvornosti u kliničkom laboratorijuZagreb, 09.04.201.1.

1

ELEKTROFOREZA HEMOGLOBINA

KAPILARNOM ZONSKOM ELEKTROFOREZOM

D. Matišić

HEMOGLOBIN

je hemoprotein koji prenosi kisik - tetramerni metaloprotein koji se sastoji od dva para istih globinskih lanaca- 2 alfa i 2 beta

- sadrži četiri hema vezana su kovalentnom vezom za jedan globinski lanac vezom za jedan globinski lanac

za transport kisika specijalizirali su se globini - α i β globini razvili su se prije 1/2 milijarde godina



2

HEMOGLOBINHEMOGLOBIN

Kako se polipeptidni lanci razlikuju u svojoj građi postoje i različite č žvrste Hb. Tako krv zdrava odrasla čovjeka sadrži:

HbA koji se sastoji od 2 i 2 lancaHbA2 koji se sastoji od 2 i 2 lanca (2,3 – 3,4%)HbF koji se sastoji od 2 i 2 lanca (0,5 – 2,0%)

Fetalna krv ima sav Hb u obliku HbF a tek u 20. tjednu fetalnog razvoja počinje se stvarati HbA čiji se udio popne do 90 % tek

razvoja počinje se stvarati HbA čiji se udio popne do 90 % tek nakon 6 mj. života.

Fetalni hemoglobin čvršće veže kisik od hemoglobina odrasla čovjeka

FETALNI HEMOGLOBIN

Fetalni hemoglobin čvršće veže kisik od hemoglobina odrasla čovjeka.

Zbog nižeg pH fetalne krvi (7,28–7,35) i potrebe za “otimanjem”

kisika iz krvi majke tijekom fetalnog razvoja javlja se drugačiji Hb

koji ima veći afinitet za kisik (ζ2ε2).

α2 podjedinice progresivno zamjenjuju ζ2 Podjedinice γ zamjenjuju ε2 podjedinice.

Tako je fetalni hemoglobin predominantno α2γ2

Približno mjesec dana prije poroda javlja se i β podjedinica koja

postepeno zamjenjuje γ podjedinicu tijekom

nekoliko slijedećih mjeseci.



3

FIZIOLOŠKA ULOGA HEMOGLOBINA-je prvenstveno da prenosi O2 iz pluća u tkiva, CO2 iz tkiva u plućakao i pufersko djelovanje u acidobaznoj ravnoteži

-topivost kisika u plazmi je svega 0,0001M dok je u punoj krvi 0,01M-O2 je nužan za život većine org jer je krajnji akceptor H+

vezanjem hemoglobina s kisikom -oksigenacija-nastaje oksihemoglobin

u arterioznoj krvi Hb je 95-98% oksigeniran

O2 je nužan za život većine org. jer je krajnji akceptor H

Hb je 95 98% oksigeniran,a u tkivima dio disocira i

otpušta kisik koji se otapa u limfi i odatle difundira u

tkivo.

OKSIGENACIJA HEMOGLOBINA

VEZANJE KISIKA VEZANJE KISIKA ZA Hb JE

KOOPERATIVNO

Vezanje 1 molekule O2potiče vezanje

ostalih 3 molekula

t k j ć tako je omogućen transport bitno većih količina kisika u tkiva



4

SINTEZA SINTEZA HEMHEMAA

Željezo koje se ugrađuje u protoporfirin

potječe od transferina i feritina.

Nastao hem predstavlja prostetičnuskupinu svih hemoproteina.

Oko 90% ugrađuje se u hemoglobin a oko 10% nalazi se u mioglobinu, dok se manje

od 1% nalazi u citokromima katalazi i od 1% nalazi u citokromima, katalazi i peroksidazi.

POREMEĆAJI SINTEZPOREMEĆAJI SINTEZEE HEMAHEMA

najčešće nastaju zbog:nemogućnosti pretvorbe piridoksina u piridoksal fosfat, nedostatka ili suviška i t t ALK ili d t tk i t t hsintetaze -ALK ili nedostatka sintetaze hema

Kao posljedica javljaju se:Porfirije: nasljedne bolesti;uzrok: deficit uroporfirinogen-kosintetaze; posljedica: fotosenzitivitet te odlaganje uroporfirina ikoproporfirina i u zubima i kostima

Porfirinurije: bolesti koje mogu pratiti jetrene bolesti, aplastične anemije te najčešće trovanje olovom

Porfirinemije: bolesti koje prati povećana koncentracija porfirina u krvi; npr. kod deficita željeza kad se iz protoporfirina ne stvara dovoljno hema



5

SINTEZA GLOBINA

PROTEINSKI DIO HEMOGLOBINA GLOBIN SINTETIZIRA SE PROTEINSKI DIO HEMOGLOBINA, GLOBIN, SINTETIZIRA SE

U STANIČNIM RIBOSOMIMA I OVISI O SEKVENCI

NUKLEOTIDA KROMOSOMSKE DNA.

AKO DOĐE DO GREŠKE U SEKVENCI, STVARA SE GLOBIN S

IZMJENJENIM SASTAVOM AMINOKISELINA ŠTO IMA Za

POSLJEDICU: HEMOGLOBINOPATIJE

HbS, HbF, HbA2

MUTACIJE GENA ZA Hb



6

MUTACIJE MUTACIJE GENA GENA ZA ZA HbHb

POREMEĆAJI SINTEZE GLOBINA

HEMOGLOBINOPATIJE se mogu podijeliti na:KVANTITATIVNE -TALASEMIJE- s nedovoljnim

stvaranjem pojedinih globinskih lanacaj p j g

I KVALITATIVNE sa stvaranjem lanaca nenormalne građe

TALASEMIJE-nasljedne bolesti u kojima je zbog različitih genskih poremećaja poremećena sinteza pojedinih globinskih

lanaca (nedovoljno stvaranje -lanaca- talasemije nedovoljno stvaranje lanaca talasemije)nedovoljno stvaranje -lanaca- talasemije)

KVALITATIVNI poremećaji se javljaju kada se jedna aminokiselina zamijeni s drugom ili kada dođe do

zamjene većeg dijela globinske molekule (molekularne bolesti)



7

POSTUPNIK LABORATORIJSKEPOSTUPNIK LABORATORIJSKEDIJAGNOSTIKE HEMOGLOBINOPATIJA

+

VIZUALNI PREGLED ELEKTROFOREZE

Elektroforeza Hb u alkalnom mediju pH = 9,2(acetat-celuloza, agaroza)

KKS: Hb,MCV,MCH, MCHC,RDW

HbAHbA2

HbF

Prisutan abnormalni Hb?HbF,Hb Lepore, HbS

HbC ..?

Kvantitativno određivanjeHbA2: kromatograf.-ionski izmjenjivač HbF: I. Radijalna imunodifuzijaII.Spektralna fotometrija - test alkalne deaturac.

Hb: m: 138-175g/Lž: 119-157g/L

MCV: 86-100 fLMCH: 27-34 pgMCHC: 320-350 g/LRDW: 8,5 -11,3%

Elektroforeza Hb u kiselom mediju pH 6,0 – 6,2

(citratni agar):

Jasno razdvajanje HbF od HbA i HbS. Također se dobro razdvajaju

HbS i HbC

Ako je potrebno: IEF Hb na agarozi

HbA = 95- 97 %HbA2 = 1,8 - 3,5 %HbF < 2%

j p gili PAG

Potvrdni testovi na nestabilne Hbs varijante:vizualne metode: 1. test zagrijavanja:negativan ili + precipitacija unutar 5 min2. test precipitacije s izopropanolom: + flokulacija unutar 20 minuta

Za definitivnu dijagnozu ponekad su potrebne i metode molekularne

dijagnostike

Nalaz: patološke varijante hemoglobina nisu nađene



8

Elektroforeza Hb u alkalnom mediju

A) acetat-celuloza uz bojenje s Ponceau S

HbA

HbS

B) agaroza - bojenje amido black bojom

Anoda - Katoda +

HbA

HbF

HbA2

Katoda +Anoda -

ELEKTROFOREZA Hb u alkalnom mediju na acetat-celulozi i agarozi

Anoda (+)( )

A2 C ES L DF A

Katoda (-)

(+) (-)



9

KVANTITATIVNO određivanje HbA2 pomoću mikrokolona te HbF metodom RID

Mik k l Radijalna imunodifuzija -RIDMikrokolone

Elektroforeza Hb u alkalnom i kiselom mediju

ALKALNI MEDIJ KISELI MEDIJ



10

IZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE Hb

U slučaju da prethodnim koracima nije moguće definirati patološki hemoglobin, potrebno je izvesti još i IZOELEKTRIČNO

FOKUSIRANJE Hb na poliakrilamidnom gelu

Izoelektrično fokusiranje Hb kod pH=6,2

KAPILARNA ZONSKA ELEKTROFOREZA

Uvedena oko 1980 god. elektroforeza visoke rezolucijske moći; brza izvedba-elektroforeza visoke rezolucijske moći; brza izvedbalaka za izvođenje; potpuno automatizirana; jeftina-primjenjuje se za analizu velikog broja analita i

to od iona do makromolekula -brojne metode CZE su razvijene za

potrebe farmacije, biologije ....



11

CZE je shematski sastavljena od

kapilare koja se sastoji od posebno silaniziranog stakla i završava s oba kraja u kadicama s puferom

Dužina kapilara kreće se od 20 do 100 cm d 15 d 5 promjera od 15 do 75 μm

Naboj koji se dovodi na krajeve kapilara uronjenih u otopine elektrolita može se kretati do 30 kV

Vodene otopine pufera imaju precizno određeni pH i ionsku jakost te razne aditive: ciklodekstrine, surfaktante..- koji pojačavaju razdvajanje uzorakapojačavaju razdvajanje uzoraka

Posebno je važna kontrola temperature

Elektroforetski razdvojene komponente detektiraju se UV detektorima ili fluorimetrima pozicioniranim na katodonom kraju kapilare

+

Kapilarna zonska elektroforeza –CZE- Hb



12

Kapilarna zonska elektroforeza –CZE- Hb

+

VIZUALNI PREGLED ELEKTROFOREZE

Elektroforeza Hb u alkalnom mediju pH = 9,2kapilarna zonska elektroforeza

KKS: Hb,MCV,MCH, MCHC,RDW

HbAHbA2

HbFIzdati nalaz dobiven kapilarnom zonskom

Kvantitativno određivanjeHbA2: kromatograf.-ionski izmjenjivač HbF: I. Radijalna imunodifuzijaII.Spektralna fotometrija - test alkalne deaturac.

Hb: m: 138-175g/Lž: 119-157g/L

MCV: 86-100 fLMCH: 27-34 pgMCHC: 320-350 g/LRDW: 8,5 -11,3%

Za definitivnu dijagnozu ponekad su potrebne i metode molekularne

dijagnostike

elektroforezom

HbA = 95- 97 %HbA2 = 1,8 - 3,5 %HbF < 2%

Nalaz: patološke varijante hemoglobina nisu nađene



13

APT test: razlikovanje adultnog od fetalnog hemoglobina tj. HbA od HbF

Primjer mekonijuma gdje je Primjer mekonijuma gdje je nađen samo

APT test: razlikovanje adultnog od fetalnog hemoglobina tj. HbA od HbF

Albumin

j j g j jnađen samo HbF

Albumin

HbA

HbF

gdje je nađen samo HbA – tj. adultni Hb

HbA2



14

SPEKTROFOTOMETRIJSKO SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE HbODREĐIVANJE Hb

Documents

ELEKTROFOREZA Hb MATIŠIĆ - bib.irb.hr · Kapilarna zonska elektroforeza –CZE- Hb. Elektroforeza hemoglobina kapilarnom zonskom elektroforezom D Matišić tečaj trajnog usavršavanja