Aislamiento purificacin y fusin de protoplastos de babaco y jigachoResumen

En una primera fase se estandarizo protocolos de desinfeccin, induccin a callos friables y hojas in vitro de babaco y jigacho, material vegetal necesario para el aislamiento, purificacin y fusin de protoplastos. En la fase de aislamiento se valor la accin de tres soluciones enzimticas que contenan celulasa Onozuka R-10 (1,5 2,25 y 3% p/v), macerozima R-10 (1,5 2,25 y 3% p/v) y pectoliasa Y-23 (0,2 0,3 y 0,4% p/v) sobre callos y hojas de las dos especies; dando los mejores resultados en nmero de protoplastos y tiempo de digestin el coctel que llevo las concentraciones 3% celulasa-macerozima y 0,4% pectoliasa, incubadas a 26-28oC por un periodo de 33 horas para hoja y 7 horas para callo. Los protoplastos aislados fueron exitosamente purificados usando la tcnica de Jadan (2000) que consisti en la aplicacin de tres tipos de purificacin (filtracin, centrifugacin directa y diferencia de gradientes en dos fases), en esta etapa se us el medio BH3 adems de sacarosa y manitol como estandarizadores osmticos. Los protoplastos purificados de callo de babaco y hoja de jigacho fueron fusionados utilizando una solucin de PEG (poli etilenglicol) como agente fusionante y la solucin para estabilizar la membrana de los protoplastos obtenidos, el medio BH3 fue usado posteriormente para realizar una serie de lavados con el fin de eliminar los restos de PEG, finalmente luego de culminado el proceso de fusin se observ clulas fusionadas de las dos especies. El siguiente paso sera estandarizar un protocolo para la regeneracin de plantas a partir de fusionantes.

1. Introduccin

El Babaco (Vasconcellea x heilbornii) es un hbrido natural entre V. pubescens y V. stipulata, es la papayuela de mayor difusin comercial, especialmente en Ecuador y sur de Colombia, introducida a Nueva Zelanda, Australia, lsrael, ltalia, Califomia, Grecia y Brasil (Falcn y Brito, 2006). En el pas se cultiva babaco, sin embargo, el problema principal es la forma de reproduccin de las plantas. El fruto es partenocarpo, (no produce semillas) lo que reduce su propagacin a una forma asexual es decir a la obtencin de clones por estacas en otras plantas del mismo gnero, lo cual ha repercutido en la falta de diversidad gentica y la contaminacin masiva del babaco con varias enfermedades.El Jigacho Vasconcellea stipulata es una planta que tiene su origen en Amrica, en pases como: Panam, Bolivia, Colombia y Ecuador. Se la conoce con diferentes nombres: Chilhualcn en Per, Papayito de los Andes en Venezuela, Papaya Arequipina en Bolivia, Papaya tierna en Colombia, Papayo en Chile; en el Ecuador la conocemos como Jigacho, Chichaln, Chiglacn o Tronche. Es una especie muy utilizada como porta injerto para la produccin de babaco y presenta mayor resistencia a varias enfermedades La fusin de protoplastos, es una tcnica muy utilizada en la actualidad para el estudio de varias tcnicas moleculares como transporte y divisin celular, mutagnesis, morfognesis, variacin somaclonal y en especial transformacin gentica mediante hibridacin somtica o fusin, dicha tcnica consiste en fusionar dos clulas de Babaco y Jigacho respectivamente para obtener un genotipo con caractersticas de los dos progenitores. Los protoplastos son clulas vegetales que han sido separadas de su pared celular mediante un tratamiento enzimtico o mecnico y adoptan forma esfrica en el medio de cultivo Clula vegetal desprovista de pared celular, por proceso mecnico o enzimtico. Membrana plasmtica completamente expuesta

DIAGRAMA DE LA OBTENCIN DE UN PROTOPLASTO

Tiene propiedades y aplicaciones interesantes Pueden multiplicarse y desarrollar estructuras similares a embriones Permite clulas en vez de plantas enteras para seleccionar Las clulas vegetales se pueden hacer crecer en un medio liquido en el laboratorio o en grandes biorreactores Pueden fusionarse con protoplastos de otros tipos o especies, obteniendo hbridos somticos.

1. .-AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOSMtodo mecnico: Consiste bsicamente en un choque osmtico para producir plasmlisis celular y ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las clulas rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmtico.

Mtodo enzimtico: Es la incubacin de las clulas en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular.

2. .-CULTIVO DE PROTOPLASTOS

HIBRIDACIN SOMTICA DE PROTOPLASTOS

Este estudio es el inicio de una investigacin cientfica para la obtencin de nuevos genotipos de Vasconcellea.En la ltima dcada cientos de estudios de aislamiento y purificacin de protoplastos en varias especies han sido publicadas y evaluadas por varios investigadores, sin embargo la mayora coinciden en que el aislamiento depende de varios factores, entre ellos la complejidad del tejido utilizado para el aislamiento, su edad, la historia ambiental de la planta, el estado fsico y sobre todo la composicin de la pared (Hui-Yin,et al., 2007).Varios estudios reportados en ctricos como la naranja, maracuy y en tubrculos como la papa, muestran excelentes resultados, aunque no se reportan resultados en Vasconcelleas son varias tcnicas por las cuales se pueden aislar, purificar y fusionar protoplastos. La metodologa ms utilizada para la obtencin de clulas desprovistas de pared es la aplicacin de enzimas digestivas que actan sobre la celulosa y pectinas existentes en la pared celular, los protoplastos aislados mediante esta tcnica pueden ser purificados y fusionados creando hbridos somticos, en este artculo se detalla las tcnicas estandarizadas para el aislamiento, purificacin y fusin de protoplastos en clulas obtenidas de callos friables y hojas in vitro babaco y jigacho.

2. Materiales y mtodos

Material vegetal

Plantas saludables de babaco y jigacho fueron obtenidas de Patate-Tungurahua y llevadas a condiciones de invernadero en la Facultad de Ingeniera en Biotecnologa en la Escuela Politcnica del Ejrcito. Se las someti a una desinfeccin que consisti en la aplicacin de un fungicida con principio activo carbendazim (0.5%) y sulfato de cobre pentahidratado (0.24%) en una solucin al 1% durante 7 das, con lo cual se asegur plantas sanas y viables para la toma de muestras de yemas y hojas, las mismas que posteriormente fueron inducidas a la formacin de hojas in vitro y callos de las dos especies.

Tanto hojas como yemas de las dos especies fueron desinfectadas utilizando la tcnica estandarizada por Rivera y Freire, (2007). Debido a que las dos especies son muy parecidas fenotpicamente el protocolo estandarizado fue el mismo para babaco y jigacho.

Las yemas desinfectadas fueron colocadas sobre un medio lquido M&S (1962) con vitaminas y el regulador de crecimiento Brasinolida para la obtencin de hojas in vitro, mientras que las hojas desinfectadas se cortaron en pedazos de 5mm y fueron sembradas en un medio M&S semislido con los reguladores de crecimiento BAP (bencil-amino -purina) y AIA (cido-indl-actico) en concentraciones 3 mgL-1 y 2 mgL-1 respectivamente..

Despus de 15 das de siembra, se observ la elongacin de las yemas y el inicio de la formacin de hojas in vitro (Figura 1a). Para callo se observ crecimiento 25 das despus de la siembra (Figura 1b).

Figura 1 a). Obtencin de hojas in vitro a partir de jigacho (V. stipulata).

Figura 1 b). Obtencin de callo friable a partir de babaco (V. Herlbornii).

3. Aislamiento y purificacin de protoplastos

Los callos friables como las hojas fueron sometidas a un proceso de aislamiento de protoplastos, que consisti para hoja: se mezcl 3g de hoja finamente picada con 8 ml de medio BH3 y 5 ml de solucin enzimtica segn la tcnica aplicada por Jadn, se evalu nmero de protoplastos mediante conteo en una cmara de Neubauer desde la hora 24 hasta la hora 34. Para callo, la tcnica consisti en realizar una mezcla de 1g de callo con 2 ml de solucin enzimtica y 3 ml de medio BH3, la mezcla fue incubada y evaluada desde 1 hora hasta las 10 horas. Las concentraciones evaluadas en el coctel se muestran en el tabla 1.

Tabla 1. Cantidad de enzimas digestivas colocadas en cada uno de los tratamientos probados para la digestin de protoplastos de hoja.

Una vez estandarizados tiempos y las mejores concentraciones se procedi a purificar las soluciones que contenan protoplastos liberados, para lo cual se filtr las soluciones a travs de una malla de acero de 50 m mesh, para remover el material indigerido, la solucin filtrada que contena protoplastos se re suspendi en medio BH3 (especfico para protoplastos ) y se centrifug durante 8 minutos a 500 rpm, el precipitado, fase en donde se encuentran los protoplastos. Fue sometido a una purificacin en un sistema acuoso en dos fases, con la aplicacin de 5 ml de solucin de sacarosa al 25% con sales CPW y una 2 ml de solucin de manitol al 13% con sales CPW, aplicada gota a gota, finalmente se obtuvo un halo de protoplastos en el medio de las dos fases. Los protoplastos ya purificados fueron resuspendidos en medio BH3 equivalente a 10 por el volumen de protoplastos.

4. Fusin de protoplastos

Previo a la fusin, los protoplastos purificados fueron mezclados en un tubo falcom en proporcin 3:1 protoplastos de hoja y callo; se centrifug la solucin durante 5 minutos a 500 rpm y se desech el sobrante. Se coloc de 2-3 gotas de protoplastos de callo y hoja sobre el centro de una caja petri con 2 gotas de solucin PEG y se esper durante 8 minutos , a continuacin se coloc 2 gotas ms de PEG y 2 gotas de la solucin A+B encargada de aumentar la resistencia de las membranas de los protoplastos para que resistan el proceso de fusin, despus de 15 minutos se aadi 12 gotas de medio BH3 con el fin mantener hmedos los protoplastos y eliminar los restos de PEG, al cabo de 10 minutos con la ayuda de una micropipeta se retir el medio de la periferia y se volvi a colocar durante 10 minutos ms el medio BH3. Finalmente se retir nuevamente el medio de la periferia y se repiti el proceso desde la solucin A+B durante 3 veces. Al cabo de todo el proceso se observ en un microscopio ptico las clulas fusionadas.

5. Resultados y discusin

Aislamiento y purificacin de protoplastos.Los mejores parmetros en el aislamiento de protoplastos fueron evaluados de acuerdo al mayor rendimiento de protoplastos (Figura 2a y b) en tiempo de incubacin con cada concentracin de enzimas en la solucin, para lo cual se realiz una ANOVA y las respectivas pruebas de Tukey en los casos de significancia.

En clulas desprovistas de pared a partir de hoja, la primera solucin que contena las concentraciones ms bajas de enzimas en combinacin 1,5% celulasa-macerozima y 0,2% pectoliasa no dio buenos resultados, debido a que no se observ disgregacin celular ni protoplastos hasta la hora 25; con la segunda solucin que contena 2,25% celulasa-macerozima y 0,3 pectoliasa se observ protoplastos desde la hora 24, teniendo el mejor rendimeinto con estas concentraciones a la hora 33 con nmero aproximado de 15*106 protoplastos por ml de solucin; sin embargo los mejores resultados fueron obtenidos con la solucin enzimtica 3 con 3% celulasa-macerozima y 0,4% pectoliasa, solucin con la que se obtuvo a las 33 horas de incubacin un nmero de 18*106 protoplastos por ml de solucin (Figura 3a) . En el aislamento de protoplstos a partir de callo se obtuvo protoplastos con todas las concentraciones, la figura 3b muestra los mejores resultados en el caso de callo, los mismos que se obtuvieron con la solucin enzimtica 3 a las 6 horas de incubacin con un nmero de 1*108 protoplastos por ml (Fig. 3 b)

Fusin de protoplastosLas condiciones en las que se fusionaron los protoplastos aislados y purificados fue exitosa, obtenindose un porcentaje de fusin aproximado del 30-35%, varios heterocariontes fueron observados y distinguidos debido a que los protoplastos de hoja presentan una coloracin verde y los protoplastos de callo presentan una apariencia translcida. De esta forma se observ clulas en proceso de fusin y clulas ya fusionadas (Fig. 4 a y b).

6. ConclusionesSe logr estandarizar un exitoso protocolo para el aislamiento de protoplastos con una solucin que contiene una combinacin de enzimas de 3% celulasa-macerozima y 0,4% de pectoliasa, esta concentracin mostr los mejores resultados tanto para el aislamiento de protoplastos a partir de hoja de jigacho as como de callos friables de babaco. La purificacin de protoplastos mostr buenos resultados al aplicar la tcnica usada por Jadn (2000), la misma que se corrobor al dar altos porcentajes de purificacin usando una malla con tamao de poro de 50 m mesh para la filtracin, y las soluciones de sacarosa al 25% y manitol al 13% con sales CPW para la purificacin en un sistema acuoso en dos fases, seguido de la centrifugacin directa.La fusin de protoplastos entre clulas de callo y hoja mostr excelentes resultados obtenindose de un 30 a 35% de clulas fusionadas, entre homocariontes y heterocariontes. Por lo cual se puede concluir que el mtodo de fusin mediante la aplicacin de una solucin de PEG es una alternativa viable para la obtencin de nuevas clulas con variabilidad gentica en estas especies.