Interakcje związków przeciwutleniających występujących w

ISSN 1899-3486Zeszyty NaukoweUniwersytetu

Rolniczego im. Hugona

Kołłątaja w Krakowie

nr 525

Aleksandra Duda-Chodak

Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety

z bakteriami reprezentującymi mikrobiotę jelitową człowieka

Praca wykonana w Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej

Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie

rozprawyzeszyt 402

Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w KrakowieKraków 2015

Badania zostały sfinansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji nr DEC-2011/01/B/NZ9/00226.

Pracę opiniowali: Prof. dr hab. Zbigniew Czarnecki (Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu) Dr hab. inż. Agnieszka Filipiak-Florkiewicz (Uniwersytet Rolniczy w Krakowie)

Redaktor Naczelny Wydawnictwa Prof. dr hab. inż. Józef Bieniek

Redaktor Naukowy Prof. dr hab. Genowefa Bonczar

Wydano za zgodą Rektora Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie

Copyright © Wydawnictwo Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, Kraków 2015

Projekt okładki: Monika Wojtaszek-Dziadusz

Publikacje Wydawnictwa UR w Krakowie można nabyć w siedzibie Wydawnictwa. Prowadzona jest również sprzedaż wysyłkowa (tel.: 12 662 51 60). Księgarnia internetowa: www.wydawnictwo.ur.krakow.pl

Wydawnictwo UR w Krakowie 31-425 Kraków, al. 29 Listopada 46 tel.: (12) 662 51 57, 662 51 59 e-mail: [email protected] www.wydawnictwo.ur.krakow.pl

Ark. wyd. 14. Ark. druk. 11,75. Nakład 120 egz.

Druk i oprawa: DRUKMAR, 32-080 Zabierzów, ul. Rzemieślnicza 10

ISSN 1899-3486

Spis treści

Wykaz skrótów stosowanych w pracy List of symbols used in the work ......................................................................................... 5

1. Wstęp ................................................................................................................................ 7

2. Przegląd literatury ........................................................................................................... 11

3. Materiał i metody ............................................................................................................ 433.1. Materiał badawczy .................................................................................................. 433.2. Przebieg doświadczeń ............................................................................................. 463.3. Metody analityczne ................................................................................................. 50

4. Wyniki i dyskusja ............................................................................................................. 604.1. Potencjał antyoksydacyjny i skład polifenolowy badanych ekstraktów

i suplementów ......................................................................................................... 604.2. Potencjał antyoksydacyjny związków polifenolowych najczęściej pobieranych

z racjami pokarmowymi ......................................................................................... 854.3. Wpływ związków polifenolowych na bakterie jelitowe ....................................... 954.4. Wpływ bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny polifenoli zawartych

w diecie .................................................................................................................... 1274.5. Zmiany związków polifenolowych pod wpływem bakterii jelitowych ............... 151

5. Wnioski ............................................................................................................................. 162

6. Zalecenia dla przemysłu i konsumentów ...................................................................... 164

Literatura .............................................................................................................................. 166

Summary ............................................................................................................................... 187

Wykaz skrótów stosowanych w pracy List of symbols used in the work

AOX – potencjał antyoksydacyjny / antioxidant potential B – ekstrakt z owoców borówki brusznicy / lingonberry fruit extract BAC – Bacteroides galacturonicus BEZ – ekstrakt z owoców czarnego bzu / elderberry fruit extract BF – Bifidobacterium catenulatum CAT – (+)-katechina / (+)-catechin CC – ekstrakt z owoców czerwonej cebuli / red onion extract CCH – ekstrakt z owoców cytryńca chińskiego / Schisandra fruit extract CIT – Citrosept, ekstrakt z pestek i miąższu grejpfruta / grapefruit seed-pulp

extract CN – ekstrakt z ziela czosnku niedźwiedziego / bear’s garlic extract D – ekstrakt z owoców derenia jadalnego / cornelian cherry fruit extract EC – Escherichia coli EN – Enterococcus caccae EUB – Eubacterium cylindroides G – ekstrakt z jagód goji / goji berries extract GT – ekstrakt z zielonej herbaty / green tea extract H – hesperetyna, 3’,5,7-trihydroksy-4’-metoksyflawanon / hesperetin, 3’,5,7-tri-

hydroxy-4’-methoxyflavanone HR – hesperydyna, hesperetyno-7-O-rutynozyd (glikozyd hesperetyny) / hespe-

ridin, hesperetin-7-O-rutinoside (hesperetin glycoside) IM – mikrobiota jelitowa / intestinal microbiota KMP – kemferol / kaempferol LCB – Lactobacillus sp. M – ekstrakt z owoców malin / raspberry fruit extract MIC – minimalne stężenie hamujące / minimum inhibitory concentration N – naringenina, 4’,5,7-trihydroksyflawanon / naringenin, 4’,5,7-trihydroxyfla-

vanone

Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety...6

NO – sok z noni / noni juice NR – naringina, naringenino-7-O-ramnozydoglukozyd (glikozyd naringeniny) /

naringin, 7-O-rhamnoglucoside (naringenin glycoside) P – ekstrakt z owoców pigwowca japońskiego / Japanese quince fruit extract PF – polifenole / polyphenols PHL – florydzyna / phloridzin PO – ekstrakt z ziela pokrzywy / nettle herb extract Q – kwercetyna / quercetin RFT – reaktywne formy tlenu / reactive oxygen speciesRS – rezweratrol / resveratrolRUMI – Ruminococcus gauvreauii RUT – rutyna, kwercetyno-3-O-rutynozyd (glikozyd kwercetyny) / rutin, querce-

tin-3-O-rutinoside (quercetin glycoside) S – ekstrakt z nasion soi / soybean extract SP – ekstrakt z preparatu spirulina / spirulina extract Ż – ekstrakt z owoców żurawiny / cranberry fruit extract

1. Wstęp

Mikrobiota jelitowa (ang. intestinal microbiota, IM) jest wyposażona w bogaty zestaw enzymów odpowiedzialnych za różnorodne przemiany składników pokarmowych, które docierają do jelita. Dzięki temu odgrywa ważną, o ile nie kluczową, rolę w me-tabolizmie substancji chemicznych dostarczanych z pożywieniem. Skład, jak również proporcje poszczególnych gatunków tworzących IM są bardzo różnorodne. Każdy człowiek ma swój własny, niepowtarzalny profil gatunkowy mikrobioty, który porów-nuje się nawet do odcisku palca. Z powodu tej ogromnej różnorodności gatunków tworzących IM u poszczególnych osobników profil powstających metabolitów oraz ich końcowy wpływ na organizm są bardzo zmienne w populacji ludzkiej. Część z tych metabolitów może być wykorzystana jako substancje wzrostowe przez komórki na-błonka jelita gospodarza, ale też przez mikroorganizmy obecne w jelicie. Często zdarza się, że jedynie produkt bakteryjnego metabolizmu danego składnika może zostać wchłonięty w jelicie i wpłynąć korzystnie na zdrowie człowieka. Brak odpo-wiednich gatunków bakterii w mikrobiocie osobnika oznacza, że spożyty związek nie będzie mógł wywrzeć oczekiwanego efektu. Z drugiej strony, zdarza się też, że – na skutek metabolizmu bakteryjnego – z obojętnego składnika obecnego w żywności powstają pochodne niekorzystnie oddziałujące na zdrowie konsumenta. Wykazano, że etiologia licznych chorób (nieswoiste zapalenia jelit, choroba Crohna, nowotwory jelita, alergie, otyłość) jest ściśle powiązana z IM. Równowaga między układem im-munologicznym gospodarza a komensalnymi gatunkami mikrobioty jest niezbędna dla zachowania zdrowia, a jej zaburzenia (dysbioza) powodują rozwój chorób.

Wszystkie wymienione kwestie wchodzą w obszar metabolomiki, będącej sto-sunkowo nową dziedziną nauki. Zgodnie z definicją, metabolomika to systematycz-ne badanie niepowtarzalnych „odcisków palca” pozostawianych przez swoiste pro-cesy komórkowe, czyli jest to badanie profilu metabolitów. W ostatnich dekadach ukazało się wiele publikacji na temat korzystnego wpływu przeciwutleniaczy na zdrowie człowieka, jednak dopiero niedawno wykazano, że znaczenie ma nie ilość antyoksydantów w diecie, ale ich biodostępność. Biodostępność polifenoli w formie, w jakiej zwykle występują w diecie, jest raczej mała. Transformacje, które zachodzą w jelicie pod wpływem enzymów bakteryjnych (np. β-glukozydaz, β-glukuronidaz),


zmieniają zarówno biodostępność, jak i aktywność antyoksydacyjną polifenoli. Z tego też powodu liczne badania z ostatnich lat skupiają się na roli mikrobioty jelitowej w kształtowaniu biodostępności i bioprzyswajalności tych składników diety.

Dość powszechnie spotyka się doniesienia wskazujące na hamowanie przez związki polifenolowe i inne przeciwutleniacze wzrostu różnorodnych patogenów, zarówno występujących w przewodzie pokarmowym człowieka, jak i obecnych w żyw-ności. Ten pożądany efekt działania przeciwutleniaczy, a przede wszystkim wykazy-wany przez nie potencjał antyrodnikowy sprawiły, że znalazły one wielu zwolenników i entuzjastów. Jak wykazały liczne badania, dieta bogata w przeciwutleniacze zmniej-sza ryzyko zachorowań na wiele chorób, w tym nowotwory, choroby serca i układu naczyniowego, alergie, choroby neurodegeneracyjne, cukrzycę i wiele innych. Nadmiar wolnych rodników i reaktywnych form tlenu uważany jest także za przyczynę starze-nia się organizmu. Stąd dość powszechne i niejako modne stało się promowanie „zdrowego” stylu życia rozumianego jako suplementowanie diety przeciwutlenia-czami. W wielu krajach na rynku dostępne są różnorodne preparaty, a ich produ-cenci prześcigają się w reklamowaniu cudownych efektów, jakie może zapewnić ich spożywanie. Rzeczywiście, w wielu przypadkach wzbogacenie diety składnikami antyoksydacyjnymi pozwala uzupełnić ich niedobór i wspomaga organizm w obronie przed zanieczyszczeniami środowiska i skutkami stresu oksydacyjnego. Z drugiej jednak strony, ze względu na brak jakiejkolwiek kontroli nad sprzedażą tych specy-fików istnieje ryzyko ich nadmiernego spożycia lub wystąpienia niebezpiecznych dla zdrowia interakcji, np. z lekami, jakie równocześnie zażywa konsument. Co więcej, standardową procedurą stało się dodawanie do żywności, na różnych etapach jej produkcji, substancji o działaniu antyoksydacyjnym, które mają zapobiec procesom utleniania składników żywności i w ten sposób przedłużyć trwałość produktu. Należy podkreślić, że wykazano także, iż niektóre polifenole lub ich metabolity mogą dzia-łać niekorzystnie na organizm ludzki (np. wywierać wpływ mutagenny, genotoksycz-ny, hamować aktywność topoizomerazy czy syntezę tyroksyny). Oczywiście, jest mało prawdopodobne, aby dawki przeciwutleniaczy przyjmowanych ze zbilansowaną die-tą mogły negatywnie wpływać na zdrowie, jednakże dostępne bez recepty suplemen-ty diety zawierają te związki w stężeniach nawet 20-krotnie wyższych od występują-cych w typowej diecie wegetariańskiej. Jak dotąd nie ma naukowo potwierdzonych danych na temat efektów długotrwałego spożywania zwiększonej ilości polifenoli. Jest to istotna kwestia, gdyż stosowanie suplementów bogatych w mieszaniny zioło-we i polifenole, które są zalecane w dawkach wyrażanych raczej w gramach niż miligramach, może powodować ekspozycję na potencjalnie toksyczne stężenia tych składników. Nie było także badań wyjaśniających, jak składniki przeciwutleniające obecne w diecie czy tych suplementach wpływają na skład jakościowy i ilościowy prawidłowej mikrobioty jelitowej.

Biorąc pod uwagę niedostatek wiedzy z zakresu wspomnianych zagadnień, w pre-zentowanej pracy skoncentrowano się na ocenie wpływu bioaktywnych składników

1. Wstęp 9

żywności o charakterze przeciwutleniaczy na wybrane gatunki bakterii będące przed-stawicielami ludzkiej mikrobioty jelitowej. Do badań wybrano rośliny, których wła-ściwości prozdrowotne, lecznicze czy wspomagające są powszechnie uznane, a także te, które – jako źródło naturalnych antyoksydantów – są dodawane do żywności w celu jej utrwalenia. Ponadto analizowano czyste związki polifenolowe, które są najczęściej spożywane wraz z typową dietą, a mogą się także znaleźć w suplementach diety i preparatach farmaceutycznych. Ostatni etap pracy obejmował ocenę wpływu bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków przeciwutleniających, w tym także składników występujących w badanych surowcach roślinnych i suplementach.

Cel pracy

Głównym celem pracy było poznanie interakcji między przeciwutleniającymi skład-nikami roślin i suplementów diety a bakteriami będącymi przedstawicielami mikro-bioty jelita ludzkiego.

Oprócz celu głównego sformułowano trzy cele szczegółowe:

1) ocena potencjału antyoksydacyjnego oraz składu polifenolowego wybranych surowców roślinnych i suplementów diety o deklarowanym prozdrowotnym dzia-łaniu na organizm człowieka,

2) określenie wpływu związków polifenolowych zawartych w ekstraktach z surowców roślinnych i suplementów diety, a także czystych związków polifenolowych na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej,

3) zbadanie wpływu poszczególnych gatunków bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków przeciwutleniających występu-jących w badanych surowcach.

Hipotezy badawcze

Dostępna literatura przedmiotu wskazuje, że polifenole wywierają hamujący wpływ na różne mikroorganizmy, w tym patogenne gatunki bakterii jelitowych. Z drugiej strony, stosowanie surowców roślinnych bogatych w te składniki do leczenia rozmaitych schorzeń oraz wspomagania funkcjonowania organizmu ludzkiego ma wielowiekowe tradycje, co może przemawiać za ich neutralnością wobec komensalnych gatunków mikrobioty. Opierając się na tych danych, sformułowano dwie hipotezy badawcze:

1) naturalne składniki przeciwutleniające i związki polifenolowe zawarte w surow-cach roślinnych i suplementach diety nie wywierają hamującego wpływu na bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej,


2) gatunki bakterii stanowiących fizjologiczną mikrobiotę jelita ludzkiego zwięk-szają na skutek swojego metabolizmu potencjał antyoksydacyjny składników polifenolowych obecnych w surowcach roślinnych i suplementach diety.

Formułując hipotezy, przyjęto założenie wyjściowe, że badane surowce roślinne oraz suplementy diety zawierają składniki przeciwutleniające, w tym polifenole, w znaczących stężeniach. Aby zweryfikować to założenie oraz poszczególne hipote-zy, na pierwszym etapie badań określono wyjściowy potencjał antyoksydacyjny oraz skład polifenolowy surowców roślinnych i komercyjnie dostępnych suplementów diety o deklarowanym prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka. Jako źródło polifenoli i przeciwutleniaczy wybrano surowce o znanych właściwościach prozdro-wotnych i/lub długoletniej tradycji stosowania w medycynie naturalnej różnych kra-jów: świeże owoce maliny, czarnego bzu, żurawiny, borówki brusznicy, pigwowca japońskiego i derenia, suszone owoce goji i cytryńca chińskiego, czerwoną cebulę, czosnek niedźwiedzi, pokrzywę, spirulinę, zieloną herbatę i nasiona soi, a także suplementy diety Citrosept (ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta) i sok z noni. Wszystkie wymienione surowce i suplementy zawierają antyoksydanty, w tym różne polifenole, i są wykorzystywane (często równocześnie) do leczenia rozmaitych scho-rzeń jako preparaty dostępne bez recepty, a zatem poza wszelką kontrolą. Ponieważ ich dawkowanie, sposób przyrządzania i stosowania zależą od leczonego schorzenia oraz od tradycji w danym regionie świata, postanowiono – w celu ujednolicenia i uproszczenia porównań uzyskanych wyników – przygotować z wszystkich surowców jednakowe ekstrakty etanolowe (nie dotyczyło to gotowych suplementów, tj. soku z noni i Citroseptu). W doświadczeniach zostały także zastosowane, w postaci czy-stych związków, najczęściej spożywane z dietą polifenole: (+)-katechina, kwercety-na, rutyna, naringenina, naringina, hesperydyna, hesperetyna, kemferol i florydzyna, będące przedstawicielami różnych klas flawonoidów, oraz rezweratrol – reprezentant stilbenów.

Drugi etap prac miał na celu określenie wpływu badanych surowców oraz po-szczególnych związków polifenolowych na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej. Ponieważ najważniejsze i najliczniej reprezentowane w jelicie ludzkim rodzaje bak-terii to Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus i Bacteroides, gatunki wybrane do doświadczeń należały przede wszystkim do tych rodzajów i – zgodnie z informa-cją od dostawcy – wszystkie zostały wyizolowane z jelita ludzkiego. W przypadku wykazania działania hamującego rozwój bakterii wyznaczano wartość minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla danego składnika.

Ostatni etap prac dotyczył oceny wpływu bakterii jelitowych na związki polife-nolowe. W tym celu określono potencjał antyoksydacyjny wybranych polifenoli i/lub ekstraktów oraz produktów, które z nich powstały na skutek metabolizmu bakteryj-nego. Zbadano także zmiany stężeń wybranych związków polifenolowych pod wpły-wem ekspozycji na poszczególne gatunki bakterii.

2. Przegląd literatury

Reaktywne formy tlenu, wolne rodniki i stres oksydacyjny

Tlen to jeden z najbardziej na Ziemi rozpowszechnionych pierwiastków, bez którego większość organizmów naszej planety nie mogłaby istnieć. Jest on stosunkowo mało reaktywny w stanie podstawowym, czyli trypletowym (3O2) [Tarko i in. 2007], ale może też występować w innych formach. Na skutek dostarczenia energii do 3O2 powstaje tlen w stanie singletowym (1O2), o znacznie wyższej reaktywności, z łatwością reagu-jący z innymi, rozpowszechnionymi w przyrodzie pierwiastkami w stanie singletowym. Alotropową odmianą tlenu i naturalnym składnikiem atmosfery jest ozon (O3). Powstaje w stratosferze, na wysokości około 30 km, jako wynik działania promieni ultrafiole-towych na tlen w stanie trypletowym. Jest bardziej reaktywny niż 3O2, a w wyniku różnych reakcji tworzy wysoce reaktywne ozonki i nadtlenki oraz rodniki •OH i HO2

•.W komórkach organizmów tlenowych procesy oddychania, czyli utleniania sub-

stancji odżywczych przy udziale tlenu z jego jednoczesną redukcją do wody, są pod-stawowymi przemianami gwarantującymi pozyskanie energii niezbędnej do funkcjo-nowania organizmu. Całkowita redukcja cząsteczki tlenu oznacza przyłączenie do niej czterech elektronów i czterech protonów, w wyniku czego powstają dwie czą-steczki wody. Cząsteczka tlenu, ze względu na rozkład elektronów na swych orbitalach, nie zawsze jednak ulega pełnej redukcji. Podczas niepełnej redukcji tlenu cząstecz-kowego zostają uwolnione reaktywne formy tlenu (RFT), z których większość jest wolnymi rodnikami. Wolny rodnik to zdolna do samodzielnego istnienia cząsteczka zawierająca jeden lub więcej niesparowanych elektronów na orbitalu walencyjnym. Rodniki przeważnie są obojętne elektrycznie i bardzo reaktywne, dzięki czemu szyb-ko wchodzą w reakcje z innymi cząsteczkami, „dążąc” do sparowania elektronów poprzez ich przyłączenie lub oddanie [Beckman i Ames 1998].

W wyniku niepełnej redukcji tlenu (ryc. 1) w komórce (przede wszystkim w mi-tochondriach) powstają wysoce reaktywne pochodne: anionorodnik ponadtlenkowy O2

•– (ang. superoxide radical anion), nadtlenek wodoru H2O2 (ang. hydrogen perox-ide), rodnik wodoronadtlenkowy HO2

• (ang. hydroperoxyl radical) oraz rodnik hy-droksylowy •OH (ang. hydroxyl radical) [Tarko i in. 2007, Burton i Jauniaux 2011].


Powstające w komórce wolne rodniki lub RFT dążą do sparowania elektronów. Jeśli w pobliżu tworzących się rodników znajdują się inne rodniki, to będą one ze sobą reagowały. Zwykle jednak stężenie wolnych rodników w komórce jest bardzo niskie, stąd rodniki reagują z sąsiadującymi cząsteczkami biologicznymi, czyli aminokwasami, białkami, lipidami. O ile anionorodnik ponadtlenkowy jest zbyt słabym utleniaczem, by zainicjować reakcję peroksydacji lipidów, o tyle powstający z niego rodnik wodo-ronadtlenkowy czyni to bez trudu. Nierodnikowa forma tlenu, jaką jest H2O2, charak-teryzuje się mniejszą reaktywnością niż inne RFT, jednak ma duże znaczenie biolo-giczne. Po pierwsze, łatwo przenika przez błony lipidowe, co powoduje, że reaktywne formy tlenu rozprzestrzeniają się po komórce i organizmie. Po drugie, w obecności metali przejściowych (Fe i Cu) ulega – w reakcji Fentona – rozkładowi do rodnika hydroksylowego (•OH) z jednoczesnym utlenieniem jonów żelaza lub miedzi.

Rodnik hydroksylowy, o niezwykle krótkim czasie połowicznego rozkładu (10–9 s), reaguje z większością struktur komórkowych, jakie występują w jego otoczeniu [Sies 1993], inicjuje łańcuchowe reakcje rodnikowe z lipidami i białkami, a także reaguje z kwasami nukleinowymi, co często prowadzi do groźnych mutacji. Oprócz reakcji Fentona, rodnik hydroksylowy może też powstawać w wyniku reakcji Habera-Weissa, w której jednym z substratów również jest nadtlenek wodoru.

Do reaktywnych form tlenu należą też pochodne azotu, takie jak tlenek azotu (NO•) – wytwarzany z L-argininy przez kilka izoform syntazy tlenku azotu (NOS) – oraz jego pochodne [Burton i Jauniaux 2011]. Tlenek azotu jest znakomitym przykładem rodnika, który pełni wiele ważnych funkcji fizjologicznych u ssaków, m.in. odgrywa rolę neuromodulatora i neurotransmitera w układzie nerwowym, reguluje ciśnienie tętnicze i hamuje agregację płytek krwi [Wolin 2009, Kvietys i Granger 2012]. Ze względu na niewielkie rozmiary cząsteczki i lipofilowość, tlenek azotu łatwo przenika przez błony biologiczne, bez pośrednictwa układów transpor-tujących. W niskim stężeniu NO• powoduje zazwyczaj przerwanie wolnorodnikowej reakcji łańcuchowej wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, natomiast w wyższym

Ryc. 1. Powstawanie wolnych rodników i reaktywnych form tlenu w trakcie kolejnych etapów redukcji tlenu [Tarko i in. 2007]

Fig. 1. Generation of free radicals and reactive oxygen metabolites during successive stages of oxygen reduction [Tarko et al. 2007]

2. Przegląd literatury 13

stężeniu przyczynia się do tworzenia rodników nadtlenkowych i alkoksylowych. W reakcji NO• z anionorodnikiem ponadtlenkowym z kolei powstaje nadtlenoazo-tan(III) (nadtlenoazotyn), który charakteryzuje się silnymi właściwościami utlenia-jącymi, może reagować z grupami tiolowymi białek i nienasyconymi resztami kwasów tłuszczowych, a w reakcji z anionem HCO3

– tworzyć rodnik wodorowęglanowy (HCO3

•) [Wolin 2009]. Protonowanie nadtlenoazotynu prowadzi zazwyczaj do po-wstania kwasu nadtlenoazotowego(III) (nadtlenoazotawego), który z kolei ulega rozkładowi do dwóch rodników zdolnych do dalszych reakcji [Guzik i in. 2003].

Do nierodnikowych związków o silnych właściwościach utleniających należą także chlorany(I), bromiany(I), podtiocyjaniany (OSCN–) i podjodany (IO–) [Tarko i in. 2007].

Należy podkreślić, że wolne rodniki i reaktywne formy tlenu są niezmiernie istotne dla prawidłowego funkcjonowania organizmu. Przede wszystkim pełnią rolę przekaźników sygnału [Bartz i Piantadosi 2010, Finkel 2011, Poljsak i in. 2013], a zatem regulują procesy metaboliczne [Dröge 2002] i odpowiadają za niektóre procesy fizjologiczne, jak prawidłowe krążenie krwi [Wolin 2009], za odpowiedź immunologiczną i stan zapalny [Guzik i in. 2003], starzenie się organizmu czy apop-tozę [Beckman i Ames 1998, Tchirkov i Lansdorp 2003].

Z wymienionych względów dla każdego układu (komórki czy całego organizmu) ważne jest wytworzenie stanu równowagi między procesami, w wyniku których są generowane RFT, a mechanizmami antyoksydacyjnymi, tak aby działanie tych ak-tywnych cząstek ograniczało się do funkcji fizjologicznych i nie było destrukcyjne. Stan naruszenia tej subtelnej równowagi na korzyść RFT nazywa się stresem oksy-dacyjnym i może być wywołany zarówno przez osłabienie mechanizmów antyoksy-dacyjnych, jak i przez nadmierną produkcję i/lub wydłużoną ekspozycję na RFT [Burton i Jauniaux 2011, Poljsak i in. 2013].

Z chwilą gdy ilość reaktywnych form tlenu w komórce (tkance, narządzie lub or-ganizmie) staje się zbyt duża, zaczyna się uwidaczniać ich wysoka reaktywność i de-strukcyjny wpływ na inne cząsteczki. Najlepiej poznane są reakcje peroksydacji lipidów [Niki i in. 2005], zarówno obecnych w błonach komórkowych, jak i zawartych w kom-pleksach lipoprotein we krwi. Wolnorodnikowa łańcuchowa reakcja utleniania lipidów tworzących szkielet dwuwarstwy lipidowej prowadzi do upośledzenia funkcji błon, zwiększenia ich przepuszczalności, zahamowania aktywności enzymów błonowych (co jest szczególnie istotne w przypadku błon mitochondriów) oraz rozprzężenia fosfory-lacji oksydacyjnej. W skrajnych przypadkach może nastąpić utrata integralności błony cytoplazmatycznej i błon wewnątrzkomórkowych, liza organelli i komórek oraz wyciek ich zawartości [Poljsak i in. 2013]. Wpływ RFT na lipoproteiny o małej gęstości (LDL) powoduje z kolei modyfikacje apolipoproteiny B (części białkowej), które sprzyjają agregacji lipoprotein i mogą prowadzić do rozwoju miażdżycy [Levitan i in. 2010].

Zmiany powstające pod wpływem RFT w cząsteczkach białek mogą zachodzić zarówno w szkielecie węglowym, jak i w bocznych łańcuchach aminokwasowych [Davies 1987, Davies i Delsignore 1987, Davies i in. 1987a i b, Burton i Jauniaux


2011]. Niektóre z tych zmian są odwracalne, inne trwale zmieniają konformację cząsteczek, powodując utratę właściwości białek (np. enzymów) i zwiększając ich podatność na rozpad proteolityczny [Grune i in. 1997], co w efekcie prowadzi do zaburzenia metabolizmu komórki [Burton i Jauniaux 2011].

Destrukcyjnemu wpływowi RFT ulegają także cząsteczki cukrów. Wolne rodni-ki i RFT uczestniczą w patogenezie m.in. reumatoidalnego zapalenia stawów, gdyż inicjują i przyspieszają reakcję depolimeryzacji kwasu hialuronowego w stawach [McNeil i in. 1985].

Nadmierna ekspozycja na RFT prowadzi do uszkodzeń struktury kwasów nukle-inowych, co sprzyja sieciowaniu i pękaniu nici oraz powstawaniu mutacji [Olinski i in. 2002]. Nagromadzenie się takich zmian, przy zaburzeniach mechanizmów napraw-czych, skutkuje rozwojem nowotworu. Powstające pod wpływem H2O2 produkty, takie jak np. 8-hydroksyguanina, są uważane za biomarkery oksydacyjnego uszko-dzenia DNA i odgrywają znaczącą rolę w procesach skracania telomerów, nowotwo-rzenia i starzenia się komórek [Campisi i in. 2001, Olinski i in. 2002, Tchirkov i Lansdorp 2003, Liou i Storz 2010, Ríos-Arrabal i in. 2013].

Generalnie przyjmuje się, że wolne rodniki i RFT w stężeniach fizjologicznych są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu [Dröge 2002, Bartz i Piantadosi 2010, Burton i Jauniaux 2011, Finkel 2011], jednakże ich nadmiar, wynikający albo ze zbyt dużej produkcji RFT, albo z niedostatku mechanizmów obronnych i antyoksydantów, prowadzi do powstania w komórce lub organizmie stresu oksydacyjnego. Szerokie badania nad wolnymi rodnikami i reaktywnymi for-mami tlenu dostarczyły wyników, na podstawie których od dawna uważa się stres oksydacyjny za przyczynę lub mechanizm pośredniczący w rozwoju licznych chorób i schorzeń. Wśród najważniejszych należy wymienić miażdżycę, cukrzycę, reumato-idalne zapalenie stawów, choroby Alzheimera i Parkinsona, astmę, malarię, choro-bę niedokrwienną serca, zawał, chorobę popromienną, kataraktę, jaskrę, nowotwo-ry, choroby autoimmunologiczne, porfirię, stwardnienie zanikowe boczne, zapalenie jelita grubego i chorobę Crohna, odrzucanie przeszczepu, zespoły przyspieszonego starzenia się i inne choroby cywilizacyjne [Kloner i in. 1989, Beckman i Ames 1998, Xu i Touyz 2006, Maiese i in. 2007, Niki 2011, Grahame i Schlesinger 2012, Jeong i in. 2012, Leuner i in. 2012, Percário i in. 2012, Webster 2012, Alzoghaibi 2013, Ríos-Arrabal i in. 2013, Yan i in. 2013, Miller i in. 2014, Muchová i in. 2014].

Co ciekawe, niebezpieczna może być również nadmierna ekspresja enzymów antyoksydacyjnych. Niektórzy badacze uważają nawet, że w organizmie osoby po-pełniającej błędy dietetyczne i/lub nadużywającej suplementów zawierających związ-ki przeciwutleniające może zaistnieć stres antyoksydacyjny [Poljsak i in. 2013]. W ta-kim przypadku zaburzeniu ulegają mechanizmy i procesy komórkowe będące pod kontrolą lub zależne od RFT (np. ochrona przed patogenami). Ponadto wiele prze-ciwutleniaczy w dużych dawkach działa prooksydacyjnie [Cao i in. 1997, Galati i in. 2002]. Jednym z przykładów zaburzonej równowagi antyoksydacyjnej jest zespół


Downa, związany z trisomią chromosomu 21, który zawiera m.in. gen kodujący dysmutazę ponadtlenkową zależną od miedzi i cynku. U chorych z zespołem Downa następuje 50-procentowy wzrost aktywności tego enzymu, ale bez jednoczesnego wsparcia ze strony katalazy – enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru (geny ko-dujące katalazę znajdują się na innym chromosomie). Nadtlenek wodoru w dużym stężeniu powoduje uszkodzenia nerwowo-mięśniowe, wzmaga peroksydację lipidów w osoczu i mózgu oraz wywołuje objawy typowe dla zespołów przyspieszonego sta-rzenia się organizmu [Lee i in. 2001].

Systemy obronne organizmu przed stresem oksydacyjnym – przeciwutleniacze

Pierwszą linią obrony jest prewencja, czyli zapobieganie powstawaniu wolnych rodników, polegające na hamowaniu reakcji, w których te cząsteczki są generowa-ne [Sies 1993]. Ponieważ część reakcji syntezy wolnych rodników jest katalizowana przez jony metali przejściowych, skutecznym sposobem prewencji jest wiązanie tych metali przez specjalne białka lub związki o zdolności chelatowania, np. polifenole [Duda-Chodak 2007]. Różne organizmy mają własne systemy ochrony przed wytwo-rzeniem nadmiernej ilości RFT; są to przede wszystkim enzymy antyoksydacyjne, ale także niektóre cząsteczki wytwarzane w organizmie [Harris 1992].

Do najważniejszych enzymów antyoksydacyjnych należy dysmutaza ponadtlen-kowa (oksydoreduktaza ponadtlenek: ponadtlenek, EC 1.15.1.1, ang. superoxide dismutase (SOD)), która katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenko-wego do nadtlenku wodoru. SOD ściśle współpracuje z kolejnym enzymem – kata-lazą (oksydoreduktaza nadtlenek wodoru: nadtlenek wodoru, EC 1.11.1.6), który przyspiesza reakcję dysmutacji wytworzonego H2O2, zanim ten przekształci się w bar-dziej reaktywne formy rodnikowe [Duda-Chodak 2007]. Nadtlenek wodoru stanowi substrat również dla peroksydaz – grupy enzymów, które redukują go do wody, utleniając przy okazji różne związki. Wiadomo, że peroksydazy powszechnie wystę-pują u roślin, a w przypadku zwierząt najlepiej poznano peroksydazę glutationową (GPx, oksydoreduktaza glutation: nadtlenek wodoru, EC 1.11.1.9). Jest to enzym selenozależny, który przy udziale glutationu (GSH) usuwa nadtlenek wodoru, zaś sam GSH ulega utlenieniu do dwusiarczku glutationu (GSSG). Peroksydaza gluta-tionu we współpracy z fosfolipazą A2 bierze także udział w unieszkodliwianiu nad-tlenków kwasów tłuszczowych, hamując peroksydację lipidów, m.in. w wątrobie.

Pośrednio, antyoksydacyjne funkcje enzymów obejmują także redukcję GSSG do glutationu przez reduktazę GSSG oraz transport i eliminację związków reaktywnych (w czym uczestniczą S-transferazy glutationu i system transportu S-koniugatów glu-tationu). Jest to o tyle ważny mechanizm, że utleniona forma glutationu (GSSG) może tworzyć mieszane dwusiarczki z grupami tiolowymi w białkach lub utleniać te grupy, co prowadzi do powstawania mostków dwusiarczkowych i unieczynniania białek.


Mechanizmy endogenne nie zawsze wystarczają. W takiej sytuacji do organizmu muszą być dostarczone substancje egzogenne, których głównym zadaniem jest prze-chwycenie i/lub ustabilizowanie aktywnej cząsteczki, zanim ta dokona zniszczeń (przeciwutleniacze interwencyjne). Ten proces dezaktywacji polega na oddaniu ato-mu wodoru lub przyjęciu elektronu przez przeciwutleniacz. Do antyutleniaczy in-terwencyjnych zalicza się m.in. witaminę C, tokoferole, karotenoidy, hemoproteiny, polifenole i metaloporfiryny [Duda-Chodak 2007]. Ponieważ w komórce występują dwie fazy: hydrofilowa (cytoplazma i wnętrze organelli) oraz hydrofobowa (dwu-warstwa lipidowa błon komórkowych), antyoksydanty powinny być przystosowane do pełnienia funkcji w obu środowiskach.

Bardzo liczną grupę przeciwutleniaczy tworzą związki polifenolowe, które poprzez grupy funkcyjne mogą tworzyć kompleksy z jonami metali, głównie żelaza i miedzi [Fernandez i in. 2002, Williams i in. 2004, Galleano i in. 2010], hamując w ten spo-sób ich zdolność do katalizowania reakcji Fentona i zapobiegając powstawaniu wolnych rodników. Polifenole działają też na dalszych stadiach ochrony, jako prze-ciwutleniacze interwencyjne. Zmiatając wolne rodniki (O2

•– i •OH), hamują na etapie inicjacji peroksydację lipidów [Galleano i in. 2010]. Mogą też kończyć łańcu-chową reakcję rodnikową, oddając atom wodoru rodnikowi peroksylowemu z wy-tworzeniem rodnika flawonoidowego.

Ze względu na strukturę podstawowego szkieletu węglowego polifenoli wyróżnia się kwasy fenolowe, flawonoidy, lignany i stilbeny. Do kwasów fenolowych należą hydroksylowe pochodne kwasu benzoesowego i kwasu cynamonowego, przy czym te drugie są silniejszymi antyoksydantami. O ile pochodne tych kwasów z jedną grupą –OH nie są przeciwutleniaczami, o tyle pochodne dihydroksylowe wykazują właściwości przeciwutleniające zależne od pozycji grup –OH w pierścieniu, np. kwas rezorcynowy (3,5-dihydroksybensoesowy) ma dwukrotnie większe zdolności prze-ciwutleniające niż pochodne 2,3- i 3,4- [Rice-Evans i in. 1996]. Im większa jest liczba grup hydroksylowych, tym wyższy potencjał antyoksydacyjny. Kwas galusowy, który ma aż trzy grupy –OH (w pozycji 3, 4 i 5), jest bardzo wydajnym przeciwutle-niaczem. Szczególnie bogate źródło kwasu galusowego stanowi herbata, która za-wiera dużą ilość hydrolizujących tanin. Do najważniejszych polifenoli w tej grupie można zaliczyć kwasy kawowy, p-kumarowy, ferulowy i synapinowy oraz ich pochod-ne estrowe lub glikozydowe, np. kwas chlorogenowy.

Obszerną klasą polifenoli są flawonoidy, zawierające w swej cząsteczce układ difenylopropanowy, złożony z dwóch pierścieni benzenowych połączonych łańcuchem trójwęglowym lub pierścieniem heterocyklicznym (ryc. 2). W obrębie tej grupy wy-różniono kilka podklas: flawony, flawonole, flawanony, flawany, antocyjany, izofla-wony i chalkony (jako formę pośrednią), różniących się budową oraz wynikającą z niej aktywnością antyoksydacyjną [Robards i in. 1999]. Wzory najważniejszych przedstawicieli poszczególnych podklas flawonoidów oraz najobfitsze ich źródła zostały przedstawione w tabeli 1.

2. Przegląd literatury 17Ta

bela

1.

Bud

owa

stru

ktur

alna

naj

waż

niej

szyc

h pr

zeds

taw

icie

li po

szcz

egól

nych

pod

klas

fla

won

oidó

w o

raz

najo

bfits

ze ic

h źr

ódła

w ż

ywno

ści

[na

pods

taw

ie: R

ice-

Eva

ns i

in. 1

996,

Rob

ards

i in

. 199

9]

Tabl

e 1.

St

ruct

ure

of m

ajor

rep

rese

ntat

ives

of

flavo

noid

sub

clas

ses

and

thei

r ri

ches

t so

urce

s in

foo

d [b

ased

on:

Ric

e-E

vans

et

al.

1996

, R

obar

ds e

t al

. 199

9]

Podk

lasa

Subc

lass

Wzó

r sz

kiel

etu

Bac

kbon

e st

ruct

ure

Przy

kład

owe

zwią

zki

Exa

mpl

e co

mpo

unds

FlawonyFlavones

R1 =

R3 =

R5 =

R7 =

H, R

2 = R

4 = R

6 = O

H

api

geni

na /

apig

enin

R3 =

R5 =

R7 =

H, R

1 = R

2 = R

4 = R

6 = O

H

lute

olin

a / l

uteo

linR

3 = R

5 = R

7 = H

, R1 =

R4 =

R6 =

OH

, R2 =

OC

H3

dio

smet

yna

/ dio

smet

inR

1 = R

2 = R

3 = R

5 = R

7 = H

, R4 =

R6 =

OH

c

hryz

yna

/ chr

ysin

R1 =

R3 =

OC

H3,

R5 =

R7 =

H, R

2 = R

4 = R

6 = O

H

tryc

yna

/ tri

cin

R1 =

R2 =

R4 =

R5 =

R6 =

OC

H3,

R3 =

R7 =

H

syn

ense

tyna

/ si

nens

etin

R1 =

R2 =

R4 =

R5 =

R6 =

R7 =

OC

H3,

R3 =

H

nob

ilety

na /

nobi

letin

R1 =

R2 =

R3 =

R7 =

H, R

4 = R

5 = R

6 = O

H

baj

kale

ina

/ bai

cale

in

Głó

wne

źró

dła:

pie

trus

zka,

sel

er, n

iekt

óre

zboż

a (s

zcze

góln

ie p

roso

i ps

zeni

ca)

Mai

n so

urce

s: p

arsl

ey, c

eler

y, s

ome

cere

als

(esp

ecia

lly m

illet

and

whe

at)

FlawonoleFlavonols

R1 =

R4 =

R5 =

R7 =

H, R

2 = R

3 = R

6 = O

H

fize

tyna

/ fis

etin

R1 =

R2 =

R4 =

R7 =

H, R

3 = R

5 = R

6 = O

H

kem

fero

l / k

aem

pfer

olR

2 = R

4 = R

7 = H

, R1 =

R3 =

R5 =

R6 =

OH

m

oryn

a / m

orin

R1 =

R2 =

R4 =

H, R

3 = R

5 = R

6 = R

7 = O

H

her

bace

tyna

/ he

rbac

etin

R1 =

R4 =

R7 =

H, R

2 = R

3 = R

5 = R

6 = O

H

kw

erce

tyna

/ qu

erce

tinR

1 = R

5 = R

7 = H

, R2 =

R3 =

R4 =

R6 =

OH

r

obin

etyn

a / r

obin

etin

R1 =

R7 =

H, R

2 = R

3 = R

4 = R

5 = R

6 = O

H

myr

ycet

yna

/ myr

icet

in

Głó

wne

źró

dła:

ceb

ula,

skó

rka

jabł

ek, b

roku

ły, h

erba

taM

ain

sour

ces:

oni

on, a

pple

pee

l, br

occo

li, te

a


Podk

lasa

Subc

lass

Wzó

r sz

kiel

etu

Bac

kbon

e st

ruct

ure

Przy

kład

owe

zwią

zki

Exa

mpl

e co

mpo

unds

FlawanonyFlavanones

R1 =

R3 =

R4 =

R5 =

R6 =

H, R

2 = O

H

nar

inge

nina

/ na

ring

enin

R1 =

R3 =

R4 =

R5 =

H, R

2 = O

H, R

6 = n

eohe

sper

ydoz

yd /

neoh

espe

rido

side

n

arin

gina

/ na

ring

inR

1 = R

3 = R

4 = R

5 = H

, R2 =

OH

, R6 =

ruty

nozy

d / r

utin

osid

e

nar

irut

yna

/ nar

irut

inR

1 = O

H, R

2 = O

CH

3, R

3 = R

4 = R

5 = R

6 = H

h

espe

rety

na /

hesp

eret

inR

1 = O

H, R

2 = O

CH

3, R

3 = R

4 = R

5 = H

, R6 =

ruty

nozy

d / r

utin

osid

e

hes

pery

dyna

/ he

sper

idin

R1 =

R2 =

R4 =

OH

, R3 =

R5 =

R6 =

H

taks

ifolin

a / t

axifo

lin

Głó

wne

źró

dła:

ow

oce

cytr

usow

e, z

ioła

, pom

idor

yM

ain

sour

ces:

citr

us fr

uits

, her

bs, t

omat

oes

IzoflawonyIsoflavones

R1 =

R2 =

H

dai

dzei

na /

daid

zein

R1 =

OH

, R2 =

H

gen

iste

ina

/ gen

iste

inR

1 = O

H, R

2 = O

CH

3 g

licyt

eina

/ gl

ycite

in

Głó

wne

źró

dła:

soj

a, r

oślin

y st

rącz

kow

eM

ain

sour

ces:

soy

bean

, leg

umes

Tabe

la 1

. cd

.Ta

ble

1.

cont

.


AntocyjanyAnthocyanins

R1 =

R2 =

OH

, R3 =

H

cyj

anid

yna

/ cya

nidi

nR

1 = R

3 = H

, R2 =

OH

p

elar

goni

dyna

/ pe

larg

onid

inR

1 = R

2 = R

3 = O

H

del

finid

yna

/ del

phin

idin

R1 =

OC

H3,

R2 =

R3 =

OH

p

etun

idyn

a / p

etun

idin

R1 =

OC

H3,

R2 =

OH

, R3 =

H

peo

nidy

na /

peon

idin

R1 =

OC

H3,

R2 =

OH

, R3 =

OC

H3

mal

wid

yna

/ mal

vidi

n

Głó

wne

źró

dła:

ow

oce,

cze

rwon

e w

ino,

zbo

ża, w

arzy

wa

liści

aste

i ic

h ja

daln

e ko

rzen

ie (f

asol

a, b

akła

żany

, ceb

ula,

kab

aczk

i, rz

odki

ew)

Mai

n so

urce

s: fr

uits

, red

win

e, c

erea

ls, l

eafy

veg

etab

les

and

thei

r ed

ible

roo

ts (

bean

s, e

ggpl

ants

, oni

ons,

squ

ash,

rad

ish)

Flawan-3-oleFlavan-3-ols

R1 =

R2 =

H

(-)

-epi

kate

chin

a / (

-)-e

pica

tech

inR

1 = O

H, R

2 = H

(

-)-e

piga

loka

tech

ina

/ (-)

-epi

gallo

cate

chin

R1 =

H, R

2 = X

g

alus

an (

-)-e

pika

tech

iny

/ (-)

epic

atec

hin

galla

teR

1 = O

H, R

2 = X

g

alus

an (

-)-e

piga

loka

tech

iny

/ (-)

-epi

gallo

cate

chin

gal

late

R3 =

R4 =

H

(-)

-kat

echi

na /

(-)-

cate

chin

R3 =

OH

, R4 =

H

(-)

-gal

okat

echi

na /

(-)-

gallo

cate

chin

R3 =

H, R

4 = X

g

alus

an (

-)-k

atec

hiny

/ (-

)-ca

tech

in g

alla

teR

3 = O

H, R

4 = X

g

alus

an (

-)-g

alok

atec

hiny

/ (-

)-ga

loca

tech

in g

alla

te


Podk

lasa

Subc

lass

Wzó

r sz

kiel

etu

Bac

kbon

e st

ruct

ure

Przy

kład

owe

zwią

zki

Exa

mpl

e co

mpo

unds

Flawan-3-oleFlavan-3-ols

R5 =

H

(+

)-ka

tech

ina

/ (+

)-ca

tech

inR

5 = O

H

(+

)-ga

loka

tech

ina

/ (+

)-ga

lloca

tech

in

(+)-

epik

atec

hina

/ (+

)-ep

icat

echi

n

Głó

wne

źró

dła:

ow

oce

(szc

zegó

lnie

mor

ele,

wiś

nie,

win

ogro

na),

her

bata

, nas

iona

roś

lin s

trąc

zkow

ych

Mai

n so

urce

s: fr

uits

(es

peci

ally

apr

icot

s, c

herr

ies,

gra

pes)

, tea

, leg

ume

seed

s

Tabe

la 1

. cd

.Ta

ble

1.

cont

.


ChalkonyChalcones

Cha

lkon

y / C

halc

ones

:

R =

H

izos

alip

urpo

l / is

osal

ipur

pol

R =

glu

koza

iz

osal

ipur

pozy

d / i

sosa

lipur

posi

de

Dih

ydro

chal

kony

/ D

ihyd

roch

alco

nes:

R =

H

flor

etyn

a / p

hlor

etin

R =

ram

noza

/ rh

amno

se

flor

ydzy

na /

phlo

ridz

in

Głó

wne

źró

dła:

chm

iel,

kwia

tost

any

koca

nek,

nas

iona

jabł

ekM

ain

sour

ces:

hop

, Hel

ichr

ysum

inflo

resc

ence

s, a

pple

see

ds


Lignany to znacząca grupa polifenoli obecnych w nasionach lnu oraz w socze-wicy, czosnku, szparagach, śliwkach i gruszkach [Duda-Chodak i Wojdyło 2007]. Stanowią składnik ścian komórkowych, w związku z czym są zwykle uwalniane do-piero w wyniku działania bakterii jelitowych. Do najważniejszych przedstawicieli tej klasy polifenoli zalicza się enterodiol, pinorezynol, sekoizolarycyrezynol, enterolak-ton, matairezynol, sezaminę, sezaminol, sezamolinę, schizandrynę i schizandrol.

Jeden z najlepiej przebadanych związków przeciwutleniających występujących w winogronach – rezweratrol – należy do grupy stilbenów. Ma on zdolność induko-wania apoptozy w komórkach nowotworowych poprzez regulację ekspresji genów bax i bcl-2, chroni także grupy tiolowe w białkach przed utlenianiem [Shakibaei i in. 2009].

Zastosowanie przeciwutleniaczy

Przeciwutleniacze, jako związki hamujące inicjację lub przerywające już zaczęte reakcje wolnorodnikowe, znalazły zastosowanie w licznych branżach przemysłowych. Jako pierwsze na myśl przychodzą antyoksydanty, wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako substancje konserwujące, ale na znacznie większą skalę stosowane w przemyśle chemicznym. Produkty tej gałęzi przemysłu, takie jak polimery (stabi-lizatory monomerów, kleje, gumy, elastomery, tworzywa sztuczne), smary, biopaliwa czy różnego typu powłoki, są podatne na utlenianie podczas wysokotemperaturowych procesów ich wytwarzania, a później podczas ekspozycji na niekorzystne warunki środowiska w trakcie użytkowania (promieniowanie UV, tlen, światło).

Co roku na świecie wytwarza się ok. 280 mln ton polimerów (dane wg Fundacji PlasticsEurope Polska), z których znakomita większość wymaga stosowania różnych stabilizatorów hamujących ich rozkład w czasie użytkowania. Główną przyczyną degradacji polimerów, w tym wszelkiego rodzaju tworzyw sztucznych oraz klejów, jest wolnorodnikowa reakcja łańcuchowa [Al-Malaika 1989], inicjowana przez tlen, którego działanie może być dodatkowo przyspieszane przez światło słoneczne, wy-

Ryc. 2. Budowa podstawowego szkieletu flawonu wraz z oznaczeniem pierścieni i numeracją atomów węgla [Fernandez i in. 2002, Galleano i in. 2010]

Fig. 2. Structure of the basic flavone backbone with ring symbols and carbon atom numbers [Fernandez et al. 2002, Galleano et al. 2010]


soką temperaturę, naprężenia mechaniczne, jony metali czy pozostałości kataliza-tora lub przez reakcję z zanieczyszczeniami. Zastosowanie antyoksydantów ma tym procesom zapobiegać lub znacząco je spowalniać [Seguchi i in. 2012]. Przeciwutleniacze dodawane są również do kosmetyków na bazie tłuszczu, takich jak szminki i kremy nawilżające, aby zapobiec ich jełczeniu. Zgodnie z raportem IHS Chemicals z 2012 r. (http://www.ihs.com/products/chemical/planning/scup/antioxidants.aspx), aż 53% wytworzonych na świecie przeciwutleniaczy wykorzystuje się w produkcji i przetwór-stwie gumy oraz lateksu, 36% do produkcji tworzyw sztucznych, 8% w technologii żywności i pasz i zaledwie 3% do wytwarzania paliw ropopochodnych. Mimo sto-sunkowo niewielkiego udziału przeciwutleniaczy przeznaczonych dla technologii żywności w światowej produkcji tych związków, ten rodzaj ich wykorzystania jest chyba najlepiej przebadanym obszarem. Zastosowanie antyoksydantów jako kon-serwantów żywności – substancji, które dodane do produktu żywnościowego opóźnią lub całkowicie zahamują utlenianie zawartych w nim związków organicznych – ogra-nicza psucie się produktu i znacząco wydłuża okres jego przydatności do spożycia.

Przeciwutleniacze dopuszczone do stosowania w żywności mogą być naturalne lub syntetyczne. Do pierwszej grupy należy m.in. kwas askorbinowy (E300) oraz tokoferole (E306), a do drugiej galusan propylu (E310), tert-butylohydrochinon (TBHQ, E319), butylowany hydroksyanizol (BHA, E320) i butylowany hydroksyto-luen (BHT, E321) (Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1333/2008 z dnia 16 grudnia 2008 w sprawie dodatków do żywności). W literaturze przedmiotu coraz częściej spotyka się jednak doniesienia, że antyoksydanty synte-tyczne, także te zatwierdzone do stosowania w żywności, mogą niekorzystnie wpływać na zdrowie konsumentów. Dodawanie ich w coraz większej ilości do rosnącej liczby produktów sprawia, że konsumenci są poddani ekspozycji na coraz wyższe dawki tych związków. Wyniki badań naukowych nie zawsze uspokajają. Na przykład, w doświad-czeniach na modelach zwierzęcych obserwowano, że BHT i BHA mają działanie antykancerogenne [Williams i Iatropoulos 1996, Iverson 1999, Bomhard i in. 2002] bądź odwrotnie – kancerogenne [Moch 1986, Cantoreggi i in. 1993, Botterweck i in. 2000]. BHA jest zaangażowany w promowanie nowotworzenia, przypuszczalnie po-przez zwiększanie produkcji H2O2, przy czym efekt ten dotyczy głównie przedżołąd-ka – organu występującego jedynie u gryzoni [Iverson 1999]. Z kolei BHT wywiera efekt kancerogenny na wątrobę u szczurów i myszy [Moch 1986, Botterweck i in. 2000]. Wykazano też, że BHT może zwiększać degranulację komórek tłuszczowych, tym samym jest „uwikłany” w reakcję alergiczną [Yamaki i in. 2007]. Badania z udzia-łem populacji ludzkiej nie wykazały istotnego związku między ryzykiem raka żołądka a spożywaniem zwyczajowych, niskich dawek BHT i BHA [Botterweck i in. 2000]. Niemniej jednak Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) dowiódł, że łączna ekspozycja na BHA – jako dodatku do żywności oraz jako dodatku do materiałów mających kontakt z żywnością – przekracza wartość dopuszczalnego dziennego spożycia (ADI) dla większości badanych populacji na średnim i wysokim


poziomie konsumpcji [Aguilar i in. 2012]. Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem zdobyła wystarczające dowody na potwierdzenie kancerogennego działania BHA wobec zwierząt doświadczalnych, ale w odniesieniu do ludzi takich dowodów nie znalazła. Wszystko to spowodowało, że stosowanie syntetycznych przeciwutle-niaczy zaczęło wzbudzać coraz większy sprzeciw wśród konsumentów. Dlatego też poszukuje się coraz to nowych źródeł naturalnych przeciwutleniaczy poprzez tzw. powrót do korzeni, przeszukiwanie tradycyjnych przepisów medycyny naturalnej oraz wskazówek zielarzy, „szamanów” i uzdrowicieli, a także badanie roślin używa-nych przez nich w celach leczniczych. Okazuje się, że wiele roślin, dotychczas sto-sowanych lokalnie, to prawdziwe „bomby antyoksydacyjne”. Wśród nich są egzo-tyczne jagody açai (euterpy warzywnej), goji (kolcowoju), cytryńca chińskiego czy owoce noni, ale też bardziej swojskie owoce aronii, czarnego bzu, czarnej porzeczki, maliny, pigwowca japońskiego, jak również rozmaite zioła i przyprawy.

W ostatnich latach istotnie zwiększyła się świadomość konsumentów w zakresie negatywnego oddziaływania na zdrowie stosowanych w produkcji żywności syntetycz-nych dodatków, konserwantów, stabilizatorów i innych substancji „wzbogacających”. Ponadto wskutek nadmiernego i często niewłaściwego stosowania antybiotyków na-stąpił znaczący wzrost odporności drobnoustrojów patogennych oraz powodujących psucie się żywności nie tylko na znane i dostępne antybiotyki, ale także na procesy technologiczne do tej pory skuteczne w ich eliminacji. Wszystko to sprawia, że prze-mysł poszukuje nowych źródeł naturalnych składników, które będą miały właściwości stabilizujące żywność, a jednocześnie wzbogacały ją o składniki bioaktywne, korzyst-nie oddziałujące na zdrowie konsumenta.

Typowe techniki stosowane do utrwalania żywności i do zapewniania jej bezpie-czeństwa mikrobiologicznego (pakowanie w zmodyfikowanej atmosferze, pakowanie próżniowe, chłodzenie, wprowadzanie składników antybakteryjnych do opakowań czy powłok ochronnych) są skuteczne zwykle tylko w odniesieniu do powierzchni produktu [Mosqueda-Melgar i in. 2008, Gyawali i Ibrahim 2014]. Połączenie tych technik z dodaniem naturalnych składników przeciwdrobnoustrojowych, czasem we wręcz śladowych dawkach, może znacząco poprawić jakość (smak, zapach, barwę), trwałość przechowalniczą i wartość odżywczą produktu (zwiększona zawartość wi-tamin, polifenoli, cennych mikroelementów), zapewniając jednocześnie jego utrwa-lenie mikrobiologiczne [Mosqueda-Melgar i in. 2008, Ponce i in. 2008, Radha Krishnan i in. 2014].

Przeciwutleniacze w produkcie żywnościowym pełnią niejako podwójną rolę. Przede wszystkim konserwują żywność, zabezpieczając jej składniki przed utlenieniem, a w konsekwencji przed zepsuciem i zmianą walorów smakowo-zapachowych. Wykazują też działanie utrwalające produkt mikrobiologicznie, gdyż hamują rozwój lub inak-tywują drobnoustroje powodujące psucie się produktu oraz mikroorganizmy pato-genne. Ze względu na rosnącą świadomość konsumentów oraz wspomniane już nie-


zbyt przychylne opinie na temat syntetycznych przeciwutleniaczy, zarówno przemysł spożywczy, jak i naukowcy poszukują nowych źródeł antyoksydantów i nieznanych dotąd związków, które mogłyby zostać wykorzystane jako dodatki do żywności o dzia-łaniu przeciwutleniającym, utrwalającym i wzbogacającym. Szacuje się, że istnieje ponad 1300 roślin, które zawierają poznane składniki o działaniu przeciwbakteryjnym. Jak dotąd udało się wyizolować ponad 30 000 składników z bogatych w polifenole roślin oleistych stosowanych w przetwórstwie żywności, ale tylko niektóre z nich zostały scharakteryzowane pod kątem wykorzystania na skalę przemysłową.

Do najwcześniej udokumentowanych i najważniejszych przykładów materiałów roślinnych, których dualne efekty wykorzystano w praktyce przemysłowej, należą olejki eteryczne. Z jednej strony, nadają one żywności niepowtarzalne właściwości sensoryczne, z drugiej zaś zapobiegają namnażaniu się mikroorganizmów odpowie-dzialnych za psucie się żywności oraz mikroorganizmów patogennych [Burt 2004, Gutierrez i in. 2008, Proestos i in. 2008, Weerakkody i in. 2010]. Zastosowanie przypraw i zawartych w nich olejków eterycznych do utrwalania żywności ma na celu wydłużenie czasu jej przechowywania i przydatności do spożycia, zredukowanie liczby lub całkowite wyeliminowanie patogenów oraz polepszenie ogólnej jakości produktów spożywczych [Burt 2004, Gutierrez i in. 2008, Ponce i in. 2008, Radha Krishnan i in. 2014].

Zastosowanie w technologii żywności mogą znaleźć nie tylko olejki eteryczne. Do najważniejszych składników o potencjale antymikrobiologicznym należą polife-nole (głównie flawonoidy), terpenoidy, saponiny, tiosulfiniany i glukozynolany. Szczególną uwagę poświęca się polifenolom. Dzięki swej budowie idealnie nadają się do pełnienia roli przeciwutleniaczy – mogą zarówno hamować powstawanie, jak i wygaszać już powstałe wolne rodniki, hamować inicjację i przerywać rozpoczęte reakcje wolnorodnikowe [Fernandez i in. 2002, Williams i in. 2004, Galleano i in. 2010]. W ten sposób skutecznie hamują peroksydację lipidów, utlenianie białek i cu-krów oraz oksydacyjne uszkadzanie kwasów nukleinowych. Związki te zawierają liczne grupy hydroksylowe, które wywierają działanie hamujące, gdyż mogą reagować ze ścianą komórkową bakterii, uszkadzać strukturę błon komórkowych i powodować wyciek składników komórki. Co więcej, jako przeciwutleniacze, hamują powstawanie i działanie RFT oraz zmiatają wolne rodniki, a w konsekwencji obniżają potencjał oksydacyjno-redukcyjny środowiska czy medium wzrostowego [Gyawali i Ibrahim 2014]. Dzięki temu oprócz aktywności przeciwutleniającej wykazują działanie bakte-riobójcze lub bakteriostatyczne wobec niepożądanych mikroorganizmów.

Wśród wydajnych źródeł naturalnych substancji o działaniu antyoksydacyjnym i/lub przeciwdrobnoustrojowym znajdują się liczne rośliny lecznicze, zioła i przypra-wy (bazylia, goździki, oregano, kolendra, tymianek, cynamon, majeranek, imbir, kurkuma, szałwia, cebula, czosnek, pietruszka, trawa cytrynowa, rozmaryn) [Burt 2004, Lee i in. 2006, Yano i in. 2006, Shan i in. 2007, Tajkarimi i in. 2010, Weerakkody i in. 2010, Gyawali i Ibrahim 2014]. Stosowane są pojedynczo lub w kombinacjach,


działają na bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne, a ich skuteczność zależy m.in. od dawki, pH, temperatury i dostępności tlenu [Burt 2004, Shan i in. 2007, Gutierrez i in. 2008, Proestos i in. 2008, Tajkarimi i in. 2010].

Przyprawy i zioła są już powszechnie dodawane do różnego typu produktów żywnościowych. Można je znaleźć w mięsie i jego przetworach, rybach, produktach przetwórstwa owoców i warzyw, ale także w serach, mleku, jogurtach i maśle [Tajkarimi i in. 2010], gdzie działają hamująco wobec patogenów (m.in. Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Shigella sp., Pseudomonas sp., Vibrio parahaemolyticus) oraz innych mikroorganizmów powodujących psucie się żywności i związane z tym znaczne stra-ty finansowe (np. Botrytis cinerea, Alicyclobacillus acidoterrestris, pleśnie) [Lee i in. 2006, Yano i in. 2006, Proestos i in. 2008, Bevilacqua i in. 2010, Soylu i in. 2010, Tajkarimi i in. 2010, Weerakkody i in. 2010].

Wiele olejków eterycznych i ich składników uznano już w Unii Europejskiej za bezpieczne (m.in. karwakrol, karwon, aldehyd cynamonowy, cytral, eugenol, p-cymen, limonen, mentol, tymol) i nadal poszukuje się nowych źródeł związków o aktywno-ści przeciwutleniającej i/lub antymikrobiologicznej. Wciąż jednak nie wszystkie od-kryte substancje, których dodatek do żywności mógłby przynieść wymierne korzyści, sprawdzono pod kątem oddziaływania na organizm ludzki, chociażby w kwestiach toksyczności i alergenności, nie wyznaczono dla nich wartości MIC ani też nie oce-niono możliwych reakcji synergistycznych lub antagonistycznych z innymi składni-kami żywności. O niezbędności takich badań świadczą wyniki uzyskane przez różnych autorów [Amezouar i in. 2012, Teke i in. 2013, Martins i in. 2014].

Wpływ budowy związków polifenolowych na ich właściwości antyoksydacyjne i przeciwmikrobiologiczne

Dotychczasowe badania nad zależnością między budową flawonoidów a ich aktywno-ścią antyoksydacyjną [Cook i Samman 1996] wykazały, że o właściwościach przeciw-utleniających decyduje kilka elementów strukturalnych (ryc. 3). Umożliwiają one delokalizację elektronów, co powoduje zwiększenie stabilności powstających rodników aryloksylowych [Rice-Evans i in. 1997]. Uważa się, że polifenole mają budowę che-miczną wręcz idealną do pełnienia przez nie roli wygaszaczy wolnych rodników.

Jak wykazano, do elementów kluczowych w zmiataniu wolnych rodników i ha-mowaniu reakcji peroksydacji lipidów można zaliczyć:

1) obecność wolnej grupy hydroksylowej przyłączonej do atomu węgla C3 w pier-ścieniu C; aglikony, które mają wolną grupę C3–OH (np. fisetyna, (+)-katechina, kwercetyna, myrycetyna, moryna), są silniejszymi przeciwutleniaczami i wydajniej hamują reakcje peroksydacji lipidów w porównaniu z tymi, które mają grupę C3–OH podstawioną cukrem (jak diosmetyna, apigenina, hesperydyna, naringina),


2) podwójne wiązanie między atomami węgla C2 i C3 (C2=C3); redukcja tego wiązania osłabia działanie antyoksydacyjne,

3) grupę karbonylową (C=O) przy atomie węgla C4, 4) liczbę grup hydroksylowych; im więcej tych grup, tym większe zdolności prze-

ciwutleniające, 5) rozmieszczenie grup hydroksylowych, czyli tzw. wzór hydroksylacji; przyłączone

grupy –OH w pozycji C5 i C7 w pierścieniu A oraz w pozycji C3’ i C4’ w pier-ścieniu B, jak również przy atomie węgla C3 w pierścieniu C uczestniczą w ha-mowaniu peroksydacji lipidów,

6) jednoczesne występowanie w cząsteczce grupy karbonylowej w pozycji C4 oraz grup hydroksylowych w pozycji C3 i C5; umożliwia to tworzenie chelatów z jo-nami żelaza i hamuje powstawanie wolnych rodników w reakcji Fentona [Cook i Samman 1996, Rice-Evans i in. 1996, 1997].

Ryc. 3. Elementy struktury szkieletu flawonoidów (na przykładzie kwercetyny reprezentującej flawonole), szczególnie istotne dla ich klasycznej aktywności antyoksydacyjnej: katechol, tj. o-dihydroksybenzen (pierścień B z przyłączonymi dwiema grupami –OH) – najważniej-szy element – zaznaczony kropkowanym okręgiem; nienasycone wiązanie w pierścieniu C, między węglem C2 a C3 – zaznaczone pustą elipsą; grupa ketonowa C=O przy węglu C4 – zaznaczona szarym kołem. Układ katecholu wraz z innymi elementami struktury (w tym grupami –OH przyłączonymi do pierścienia A) – zaznaczone zakreskowanymi elipsami – uczestniczy także w chelatowaniu jonów metali przejściowych (Fe, Cu), dzięki czemu flawonoidy hamują reakcję Fentona [na podstawie: Williams i in. 2004]

Fig. 3. Elements in the backbone structure of flavonoids (with quercetin representing flavonols as an example), particularly relevant to their classical antioxidant activity: catechol, i.e. o-dihy-droxybenzene (ring B with two –OH groups attached) – the most important element – marked with a dotted circle; unsaturated bonds in ring C, between carbons C2 and C3 – marked with an empty ellipse; keto group C=O at carbon C4 – marked with a grey disk. Catechol along with other elements of the structure (including –OH groups attached to ring A) – marked with hatched ellipses – participates also in the chelation of transition metal ions (Fe, Cu), so flavonoids inhibit the Fenton reaction [based on: Williams et al. 2004]


Dowiedziono ponadto, że przyłączenie cząsteczki cukrów zmniejsza potencjał antyoksydacyjny cząsteczki flawonoidu (aglikony, czyli cząsteczki flawonoidów po-zbawione cukrów, są bardziej wydajne w hamowaniu wytwarzania aldehydu malo-nowego niż ich glikozydowe pochodne). Podobnie jest w przypadku obecności grup karboksylowych, które obniżają właściwości antyperoksydacyjne z powodu przeszkód sterycznych.

W wyniku reakcji cząsteczki flawonoidu z wolnym rodnikiem powstaje rodnik flawonoidowy, który – ze względu na występowanie elektronów π uczestniczących w delokalizacji elektronów – jest cząsteczką znacznie bardziej stabilną, a co za tym idzie mniej reaktywną niż wyjściowy wolny rodnik.

Spośród składników pochodzenia roślinnego związki polifenolowe charaktery-zują się chyba największą różnorodnością i zmiennością strukturalną, dlatego ist-nieje szeroki wachlarz mechanizmów odpowiadających za ich właściwości antyoksy-dacyjne, ale też antymikrobiologiczne. Ze względu na szlaki syntezy flawonoidów grupy hydroksylowe w tych związkach występują zwykle przy atomach węgla C2’, C3’, C4’, C5’ w pierścieniu B lub przy atomach C5 i C7 w pierścieniu A, a zatem w pozycjach zwiększających zdolności antyoksydacyjne. Dzięki obecności licznych grup hydroksylowych polifenole mają także działanie hamujące wzrost bakterii, gdyż grupy te mogą oddziaływać ze ścianą i błonami komórkowymi, powodując uszko-dzenia i wyciek składników z komórki [Gyawali i Ibrahim 2014]. Należy jednak podkreślić, że każda, nawet pojedyncza, zmiana ilości bądź rozmieszczenia grup hydroksylowych i innych grup funkcjonalnych czy podstawienia tych grup lub zmia-na konfiguracji cis/trans powoduje, że związki mają odmienne właściwości, w tym inną skuteczność przeciwbakteryjną. Aktywne grupy w cząsteczce zwiększają bowiem szanse na delokalizację elektronów, uczestniczą w wymianie protonów i zaburzają gradient w poprzek błony cytoplazmatycznej [Ultee i in. 2002]. To prowadzi do zahamowania przepływu protonów, wyczerpania puli ATP i ostatecznie do śmierci komórki. Podobnie jak w przypadku potencjału antyoksydacyjnego, również dla właściwości przeciwdrobnoustrojowych duże znaczenie ma położenie grup hydrok-sylowych. Tymol (2-izopropylo-5-metylofenol) i karwakrol (5-izopropylo-2-metylo-fenol) są izomerami (ryc. 4), mają podobną strukturę cząsteczki, jednak grupy –OH w tymolu są zlokalizowane w pozycji meta, a w karwakrolu w pozycji para. Dorman i Deans [2000] wykazali, że ma to istotny wpływ na efektywność działania wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, przy czym tymol wykazuje silniejsze działanie inhibitorowe. Obecność grupy –OH przy atomie węgla C5 ma istotne znaczenie także dla aktywności flawanonów i flawonów wobec szczepów MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus) [Gyawali i Ibrahim 2014]. Estryfikacja grupy hydroksylowej (np. w estrze metylowym karwakrolu) powoduje zmiany w chmu-rze elektronów zdelokalizowanych. Taki związek traci zdolność hamowania wzrostu Bacillus cereus [Ultee i in. 2002], a jego działanie wobec innych bakterii jest zniko-me w porównaniu z działaniem karwakrolu [Dorman i Deans 2000]. Istotne jest


tutaj współwystępowanie grup –OH oraz układu delokalizującego elektrony (w po-staci wiązań podwójnych w pierścieniu). Brak tego drugiego „elementu” struktury cząsteczki, jak w mentolu, zapobiega oderwaniu protonu z grupy –OH i sprawia, że aktywność antymikrobiologiczna jest znacznie mniejsza. Także rozerwanie pierście-nia powoduje osłabienie potencjału antybakteryjnego, dlatego geraniol i nerol są znacznie słabszymi inhibitorami wzrostu bakterii niż karwakrol czy tymol [Dorman i Deans 2000, Gyawali i Ibrahim 2014].

Dla aktywności przeciwbakteryjnej ważna jest też liczba i konfiguracja wiązań podwójnych. Cytronelol z jednym wiązaniem podwójnym jest mniej efektywny wobec B. cereus, E. coli i S. aureus oraz Candida albicans niż pokrewne mu geraniol i ne-rol z dwoma takimi wiązaniami [Gyawali i Ibrahim 2014]. Z kolei nerol, z konfigu-racją cis, jest silniejszym związkiem antybakteryjnym niż geraniol o konfiguracji trans (ryc. 5) [Dorman i Deans 2000].

Kwas kawowy wykazuje wyższą aktywność przeciwdrobnoustrojową niż kwas p-kumarowy z powodu dodatkowej grupy –OH przyłączonej do pierścienia fenolo-wego w cząsteczce [Stojković i in. 2013]. Podobnych obserwacji dokonali Figueiredo i inni [2008], którzy zademonstrowali, że dodanie dwóch lub więcej grup –OH zwięk-sza aktywność przeciwbakteryjną pochodnych aldehydu benzoesowego, gdyż mogą one wtedy skuteczniej działać na powierzchni komórek, łącząc się z grupami sulfhy-drylowymi białek [Friedman i in. 2003]. Gyawali i Ibrahim [2014] uważają z kolei, że wolne grupy –OH mogą się łatwo wiązać do miejsc aktywnych w enzymach, przez co zmieniają metabolizm drobnoustrojów.

Wysoka aktywność składników fenolowych zależy również od wielkości przyłą-czonych grup alkilowych lub alkenylowych. Większy wpływ na aktywność związku wywiera obecność grup alkenylowych niż alkilowych [Dorman i Deans 2000], ze względu na wiązanie podwójne. W obu jednak przypadkach im dłuższe podstawni-ki, tym większy potencjał antymikrobiologiczny całego związku [Gyawali i Ibrahim

Ryc. 4. Aktywność antymikrobiologiczna pierścieniowych olejków eterycznych w zależności od budowy cząsteczki [Ultee i in. 2002]

Fig. 4. Antimicrobial activity of aromatic essential oils as dependent on the structure of their molecule [Ultee et al. 2002]


2014]. Grupa aldehydowa sprzężona z wiązaniem podwójnym C=C ma wysoką elektroujemność, co zwiększa potencjał antybakteryjny. Takie ujemnie naładowane składniki zakłócają transport elektronów w komórce, a także reagują z białkami i kwasami nukleinowymi, hamując wzrost mikroorganizmów [Dorman i Deans 2000]. Również reszta kwasu octowego, dołączona do cząsteczki, zwiększa aktywność przeciwdrobnoustrojową. Octan geranylu jest silniejszym inhibitorem wobec bak-terii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych niż sam geraniol. Jest to spowodowane zwiększoną lipofilnością tego związku, łatwiejszym przenikaniem przez błony ko-mórkowe i wydajniejszym ich uszkadzaniem na skutek hamowania transportu elek-tronów, translokacji białek, fosforylacji czy innej aktywności enzymatycznej. Podobnie długość łańcucha alkilowego odgrywa rolę w hamowaniu drobnoustrojów; przypusz-czalnie także i w tym przypadku znaczenie ma hydrofobowość cząsteczki [Dorman i Deans 2000].

Ryc. 5. Aktywność antymikrobiologiczna łańcuchowych olejków eterycznych w zależności od budowy cząsteczki oraz liczby i konfiguracji wiązań podwójnych [na podstawie: Gyawali i Ibrahim 2014]

Fig. 5. Antimicrobial activity of chain essential oils as dependent on the structure of their mol-ecule and the number and configuration of double bonds [based on: Gyawali and Ibrahim 2014]

Należy podkreślić, że aktywność antymikrobiologiczna może zależeć także od czynników niezwiązanych z budową badanych związków, takich jak skład medium hodowlanego, wielkość inokulum czy typ drobnoustroju [Tajkarimi i in. 2010].

Podsumowując można stwierdzić, że naturalne związki polifenolowe izolowane z roślin zapewniają szeroki, wciąż nie do końca poznany, wachlarz zastosowań. Obecnie liczne ośrodki badawcze koncentrują się na intensywnym poszukiwaniu kolejnych, nowych substancji i opracowywaniu wydajniejszych metod izolacji tych składników. Empirycznie wykazano, że nawet niewielkie modyfikacje strukturalne cząsteczek (podstawniki) bądź zmiana parametrów środowiska (pH, polarność) mogą skutkować istotnymi zmianami siły lub mechanizmów oddziaływania tych związków na organizmy żywe.


Wpływ bioaktywnych składników roślin, szczególnie polifenoli, na mikroorganizmy patogenne i/lub powodujące psucie się żywności

Rośliny odgrywają istotną, wielowymiarową rolę w funkcjonowaniu człowieka. Przede wszystkim dostarczają one naszym organizmom wszystkich niezbędnych do życia składników, które pełnią rolę budulcową, energetyczną i regulatorową. Ostatnio jednak coraz większe zainteresowanie wzbudzają bioaktywne składniki roślin, które jako ich wtórne metabolity występują w tkankach roślinnych w mniej-szych stężeniach, ale mają istotny wpływ na zdrowie i funkcjonowanie człowieka. W medycynie ludowej na całym świecie znane są gatunki roślin o specjalnym zna-czeniu dla przetrwania organizmu, szczególnie w sytuacji choroby zakaźnej, osła-bienia, poważnego skaleczenia czy zatrucia. Przez wiele lat medycyna starała się wyizolować te składniki, oczyścić je i odtworzyć w laboratorium, aby wytworzyć medykamenty przeciw różnym chorobom. Bioaktywne składniki, w tym polifenole i przeciwutleniacze, stosowane są od wielu lat zarówno w formie oczyszczonej (jako czyste związki), jak i w postaci naparów, wywarów, soków, napojów bądź ekstrak-tów z roślin leczniczych. Możliwości ich zastosowania są ogromne, począwszy od użycia profilaktycznego [Pandey i Rizvi 2009], poprzez leczenie konkretnych jed-nostek chorobowych, m.in. zespołu jelita nadwrażliwego [Shapiro i in. 2007], oty-łości [Meydani i Hasan 2010], cukrzycy [Bahadoran i in. 2013], choroby popro-miennej [Okunieff i in. 2008], chorób układu naczyniowego [Maxwell i Lip 1997], wątroby [Singal i in. 2011], trzustki [Esrefoglu 2012] i nerek [Palipoch 2013], nad-ciśnienia [Kizhakekuttu i Widlansky 2010], astmy [Grieger i in. 2013], malarii [Sannella i in. 2007], nowotworów [Chen i in. 2014], stanów zapalnych [Shapiro i in. 2007] czy alergii [Chirumbolo 2011], aż po wykorzystanie w leczeniu chorób neurologicznych i psychicznych [Gomez-Pinilla i Nguyen 2012]. Substancje te dzia-łają także przeciw wirusom grypy [Droebner i in. 2007] i HIV [Yamaguchi i in. 2002], antybakteryjnie [Lee i in. 2006, Tajkarimi i in. 2010] i przeciwgrzybiczo [Herrera i in. 2010]. Do gatunków patogennych dla człowieka, o potwierdzonej doświadczalnie wrażliwości na hamujące działanie kwasów fenolowych, flawono-idów, tanin i antocyjanów, należą bakterie Gram-dodatnie (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis, Clostridium botulinum, Bacillus subtilis) i Gram-ujemne (Escherichia coli, Salmonella Typhimu-rium, S. enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolityca, Shigella dysenteriae i S. flex-neri, Pseudomonas fluorescens i P. aeruginosa, Vibrio cholerae) oraz grzyb chorobo-twórczy Candida albicans [Friedman i in. 2003, Lee i in. 2006, Tajkarimi i in. 2010, Gyawali i Ibrahim 2014].

Wzrastająca świadomość współczesnego konsumenta powoduje odwrót od syn-tetycznych preparatów w kierunku naturalnych źródeł związków bioaktywnych. Prowadzi także do zwiększenia popytu na żywność funkcjonalną oraz suplementy diety bogate w składniki o charakterze przeciwutleniającym. Obserwuje się „wysyp”


producentów, dystrybutorów, sklepów z tzw. „zdrową żywnością”, ekologiczną i/lub naturalną czy witryn internetowych oferujących „cudowne” środki na niemal wszyst-kie bolączki rodzaju ludzkiego.

Bogate w przeciwutleniacze preparaty i surowce o znanych właściwościach prozdrowotnych

Jak już wspomniano wcześniej, źródłem przeciwutleniaczy w diecie są nie tylko spożywane owoce i warzywa oraz związki dodane do żywności jako konserwanty. Coraz szybszy tryb życia, stres, zapracowanie i zabieganie, a jednocześnie moda na bycie zdrowym, młodym, sprawnym powoduje, że wielu ludzi ucieka się do wspo-magania swojego organizmu i zdrowia rozmaitymi preparatami, specyfikami czy suplementami diety. W dobie Internetu zakupienie dowolnego preparatu nie sta-nowi większego problemu. Co więcej, konsumenci są nieustannie bombardowani ulotkami i reklamami „cudownych” specyfików na nadwagę, stres, zmęczenie, prze-ciw zmarszczkom, chorobom cywilizacyjnym itp. Wybór tych preparatów jest ogrom-ny – wystarczy wejść na stronę internetową dowolnego sklepu ze „zdrową żywnością”, z żywnością ekologiczną czy naturalną bądź sklepu oferującego „prozdrowotne” zioła, suplementy diety czy specyfiki regionalne, nie wspominając o aptekach on--line z równie bogatą ofertą.

Poniżej zaprezentowano w dużym skrócie właściwości i zastosowania, deklaro-wane przez producentów i/lub dystrybutorów, jedynie kilkunastu takich surowców roślinnych i suplementów diety – tych, które zostały wykorzystane w niniejszej pra-cy do doświadczeń ze względu na ich powszechne stosowanie w zapobieganiu różnym schorzeniom, leczeniu lub wspomaganiu terapii tych schorzeń. Wszystkie one są w Polsce ogólnie dostępne, pochodzą z przydomowych ogródków lub są sprzedawa-ne na placach targowych, w sklepach z żywnością naturalną i ekologiczną bądź w aptekach (bez recepty).

Spośród suplementów (preparatów farmaceutycznych) wybrano Citrosept, spi-rulinę oraz sok z noni. Produkty uznawane za żywność o działaniu prozdrowotnym reprezentują suszone jagody goji i cytryńca chińskiego oraz zielona herbata. Z owo-ców o uznanych właściwościach prozdrowotnych lub leczniczych wybrano czarny bez, borówkę brusznicę, żurawinę, malinę oraz mniej popularne, ale uprawiane w Polsce, pigwowiec japoński i dereń jadalny, z warzyw – soję i czerwoną cebulę, a z ziół – czosnek niedźwiedzi oraz ziele pokrzywy.

Suplement diety Citrosept Organic to znany z aktywności antymikrobiologicznej ekstrakt z pestek i miąższu grejpfruta wzbogacony witaminą C. Liczne prace wyka-zują, że składniki grejpfruta działają hamująco na bakterie i grzyby [Xu i in. 2007], zawiera on też cenne przeciwutleniacze, w tym naringinę, narirutynę i hesperydynę oraz witaminę C [Wu i in. 2007, Kelebek 2010].


Sok z noni to świeży sok wyciskany z dojrzałych owoców morwy indyjskiej (Morinda citrifolia L.; noni). Owoce i liście tej rośliny są od stuleci stosowane na wyspach Polinezji, a stosunkowo niedawno sok z noni zaczął podbijać rynki za-chodnie. Zgodnie z deklaracjami dystrybutorów i producentów, związki bioaktyw-ne zawarte w owocach noni dobroczynnie działają na organizm człowieka, wspo-magają pracę układu immunologicznego, zwiększając jego skuteczność w walce z chorobami wirusowymi, bakteryjnymi i grzybiczymi, ograniczają przyczyny i osła-biają objawy alergii, zalecane są w chorobach nowotworowych i ich profilaktyce, w stanach depresyjnych i pobudzenia nerwowego, przy zwiększonym stresie, regu-lują ciśnienie krwi i poziom cholesterolu, pomagają utrzymać prawidłową wagę [Basar i in. 2010, Singh 2012]. Zainteresowanie tą rośliną wiąże się z jej bogatym składem fitochemicznym, który jest zróżnicowany w zależności od organu rośliny. Dotychczas w noni zidentyfikowano około 200 związków. Są to głównie mikroele-menty, związki fenolowe i alkaloidy [Pawlus i Kinghorn 2007, Potterat i Hamburger 2007, Singh 2012]. Do najważniejszych składników tej rośliny należą damnakantal, kseronina, prokseronina i prokseronaza. Choć na temat noni pojawiło się mnóstwo publikacji, to źródeł stricte naukowych, potwierdzających te wszystkie właściwości, nie ma zbyt wiele. Mimo to sok z noni uzyskał akceptację Unii Europejskiej jako tzw. nowa żywność (ang. novel food). Obawy budziły ewentualne skutki uboczne, jakie mogłyby wywierać działające genotoksycznie antrachinony występujące w ko-rzeniu tej rośliny. Udowodniono jednak, że w owocach noni substancje te nie występują i w soku z tych owoców nie ma żadnych toksycznych związków. Dzięki temu produkt handlowy został uznany za bezpieczny i dopuszczono go do obrotu rynkowego. W obrocie najczęściej spotykany jest jako suplement diety lub składnik dodatkowy (sproszkowany sok z owoców noni). Nieliczne badania naukowe po-twierdziły jak dotąd, że wyciąg z owoców noni zmniejsza wrażliwość na ból, dzię-ki czemu może znaleźć zastosowanie w łagodzeniu bolesnych stanów zapalnych w stawach [Basar i in. 2010].

Wiele spośród wybranych do badań roślin to sprawdzone środki stosowane w me-dycynie ludowej na różne dolegliwości, w tym na grypę i przeziębienia. Z pewnością należy tu wymienić maliny, czarny bez, czosnek i cebulę, za których wykorzystaniem przemawia nie tylko tradycja, ale i argumenty naukowe. Cebula (szczególnie jej odmiany czerwone) jest bardzo bogatym źródłem kwercetyny i jej pochodnych o bu-dowie odmiennej niż w innych owocach i warzywach [Beesk i in. 2010]. Cebula czerwona zawiera liczne witaminy, m.in. witaminy z grupy B, A, PP i K, a także wapń, potas, sód, pektyny oraz śluzy [Lanzotti 2006, Singh i in. 2009]. Dzięki zawar-tości licznych substancji cebula czerwona wykazuje działanie antyseptyczne, poza tym korzystnie wpływa na pracę żołądka, wzmagając procesy trawienne, zmniejsza stężenie we krwi lipoprotein o niskiej gęstości i cukru, przyczynia się do spadku ciśnienia krwi, a także działa wzmacniająco na organizm człowieka [Corzo-Martínez i in. 2007].


Czosnek niedźwiedzi wybrano jako występującą naturalnie roślinę stosowaną od wieków jako przyprawa, ale także „remedium” na wszelkie dolegliwości, począwszy od pozbywania się pasożytów, grzybic i chorób bakteryjnych, przez wspomaganie leczenia anemii, łagodzenie kłopotów z trawieniem, zbyt wysokim ciśnieniem, nad-miernym poziomem cholesterolu czy zakrzepami krwi, aż po zapobieganie niektórym nowotworom [Reuter 1995, Rahman 2001, Omar i Al-Wabel 2010, Bagiu i in. 2012]. Czosnek niedźwiedzi zawiera mnóstwo witamin (C, E, A), dużo selenu i żelaza, zwiększa wydzielanie śluzu w oskrzelach, oczyszczając drogi oddechowe (istotne dla palaczy), oraz pobudza wydzielanie żółci i soku żołądkowego. Jest rośliną najbogat-szą na świecie w aktywne związki siarki – zawiera ich siedem razy więcej niż czosnek pospolity [Sendl 1995, Carotenuto i in. 1996, Błażewicz-Woźniak i Michowska 2011]. Aktywuje wiele enzymów odpowiedzialnych za odtruwanie organizmu z metali cięż-kich, chemikaliów, pestycydów i innych związków toksycznych, słusznie więc jest promowany w sklepach z tzw. zdrową żywnością, szczególnie w krajach wysoko uprzemysłowionych. W 1992 r. został uznany za „roślinę roku” ze względu na swo-je właściwości lecznicze i możliwości zastosowania w kuchni. Czosnek niedźwiedzi staje się coraz bardziej popularny nie tylko z powodu niezwykłych właściwości i skła-du, ale także z powodu braku charakterystycznego czosnkowego zapachu. Uważa się, że ma silne działanie bakteriobójcze, a także jest jednym z najskuteczniejszych środków stosowanych w zwalczaniu drożdżaka (Candida albicans). Co ciekawe, w Niemczech wykorzystuje się go zwyczajowo do regeneracji flory bakteryjnej jelit po kuracjach antybiotykowych [Reuter 1995, Sendl 1995]. Stąd pojawił się pomysł sprawdzenia, jak czosnek niedźwiedzi wpływa na mikrobiotę jelitową, czyli nauko-wego zweryfikowania, czy wspomniany zwyczaj jest uzasadniony.

Sok z malin to kolejny „domowy” środek na zimowe przeziębienia. Jego dzia-łanie z pewnością ma związek z dużą zawartością witaminy C i polifenoli. Stężenie witaminy C w malinach zależy od odmiany i wynosi od 16,8–32,4 mg [Pantelidis i in. 2007] do nawet ponad 92 mg [de Souza i in. 2014] na 100 g świeżych owoców. Elagotaniny stanowią aż 57% oznaczonych w tych owocach związków polifenolowych, a na drugim miejscu plasują się antocyjany (42%), z dominującym cyjanidyno-3-O--soforozydem (61% antocyjanów) [Mazur i in. 2014]. To właśnie dużej zawartości elagotanin, a także produktom ich metabolizmu, przypisuje się znaczącą rolę w utrzy-maniu prawidłowego stanu naczyń krwionośnych [Larrosa i in. 2010]. Spore zainte-resowanie wzbudza też ostatnio olej z pestek (nasion) malin, gdyż stanowią one bardzo obfity objętościowo odpad z przetwórstwa tych owoców. Olej ten jest boga-ty w witaminę E, szczególnie γ-tokoferol, oraz w kwasy: linolowy (54,5%), α-linolenowy (29,1%), oleinowy (12%) i palmitynowy (2,7%) [Oomah i in. 2000].

Owoce żurawiny, czarnego bzu i brusznicy zaliczane są zwykle do dużej grupy owoców jagodowych, choć z botanicznego punktu widzenia bez czarny, podobnie jak dereń, jest pestkowcem. Wszystkie te rośliny jednak należą do kladu astrowych, a ich owoce wyglądają jak wielobarwne jagody i mają walory prozdrowotne zysku-


jące coraz większe uznanie. Z jagód różnych gatunków roślin izoluje się składniki wspomagające funkcjonowanie narządu wzroku, a bogactwo flawonoidów, antocy-janów i luteiny sprawia, że słowo „jagoda” kojarzy się z wyjątkowo zdrowym owocem. Potwierdzają to też liczne badania dotyczące owoców jagodowych [Matsumoto i in. 2003, Nohynek i in. 2006, Nile i Park 2014]. Bez czarny znajduje zastosowanie za-równo w postaci kwiatów, jak i owoców, wykazuje działanie moczopędne, przeciw-bólowe i napotne oraz wzmacniające naczynia. Z owoców czarnego bzu izoluje się związki działające antywirusowo, są to m.in. flawonoidy i antocyjany. Składniki te powodują, że syropy i preparaty z tego owocu skracają czas potrzebny na powrót do zdrowia, zwiększając odporność organizmu w okresie przeziębień i w sezonie gry-powym. Między innymi, poprzez stymulację wydzielania cytokin prozapalnych (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) aktywują układ immunologiczny do walki z patogenem [Barak i in. 2001]. Proces ekstrakcji bioaktywnych składników z owoców czarnego bzu został nawet opatentowany (Patent 1976543. Use of elderberry extract: The Sambucol® preparation (Razei Bar Industries, Israel)), głównie ze względu na sposób izolacji związku o nazwie Antivirin®, który wykazuje szczególnie silne działanie antywiruso-we, blokuje hemaglutyninę i uniemożliwia wirusowi grypy wnikanie do komórek i namnażanie się w nich [Zakay-Rones i in. 1995].

W przypadku borówki brusznicy głównym surowcem leczniczym są wprawdzie liście, ale jej owoce są wyśmienitym materiałem do przyrządzania konfitur oraz służą jako dodatek do mięs. Liście i owoce zawierają liczne flawonoidy, przede wszystkim glikozydy (hiperozyd, pochodne kwercetyny), arbutynę, metyloarbutynę, hydrochinon (produkt rozpadu arbutyny o silnym działaniu odkażającym drogi mo-czowe), garbniki katechinowe (o działaniu ściągającym i przeciwbiegunkowym), antocyjany, a także witaminy (C, PP, B1, B2), garbniki, sole potasu, wapnia, żelaza, fosforu i magnezu, kwasy jabłkowy, octowy i cytrynowy [Mane i in. 2011]. Taki skład zapewnia działanie moczopędne, rozkurczowe i przeciwzapalne. Liście borówki brusznicy znajdują zastosowanie przede wszystkim w leczeniu chorób przewodu pokarmowego i moczowego, a owoce także w preparatach odchudzających, gdyż wspomagają proces trawienia. Wykazano, że bogate w polifenole ekstrakty z owoców Vaccinium vitis-idaea charakteryzują się znacznym potencjałem inhibitorowym wobec lipazy trzustkowej [McDougall i in. 2009]. Dzięki temu spowalniają trawienie tłusz-czów, zwiększając ich wydalanie z organizmu, zaś mniejsza ilość wolnych kwasów tłuszczowych powoduje, że mniej ich ulega wchłonięciu i zmagazynowaniu w posta-ci tkanki tłuszczowej. Arbutyna, oprócz działania wykorzystywanego w leczeniu układu moczowego, wykazuje działanie antyoksydacyjne, a także rozjaśnia przebar-wienia skóry poprzez zahamowanie enzymu tyrozynazy i w efekcie zahamowanie syntezy melaniny, dzięki czemu znalazła też zastosowanie w dermokosmetykach [Chakraborty i in. 1998].

Żurawina, zarówno w formie suszonych owoców, soku, jak i gotowych prepara-tów zawierających ekstrakt z owoców, jest powszechnie stosowana do wspomagania


funkcji układu moczowego i zapobiegania infekcjom w jego obrębie, a nawet ich leczenia [Raz i in. 2009]. Zakażenia dróg moczowych są wywoływane najczęściej przez E. coli, a zawarte w owocach żurawiny związki hamują adhezję tej bakterii do komórek nabłonka moczowodów, zarówno tę zależną, jak i niezależną od reszt mannanu [Rahbar i Diba 2010]. Do składników odpowiedzialnych za ten efekt ochronny wobec uroepitelium zalicza się kwas hipurowy. Jest to wydzielany z moczem metabolit polifenoli (m.in. kwasu chlorogenowego [Gonthier i in. 2003], epikatechi-ny, epigalokatechiny i galusanu epigalokatechiny [Mulder i in. 2005]) zawartych w żurawinie, ale także w czarnej i zielonej herbacie. Kwas hipurowy działa silnie bakteriostatycznie i zakwasza mocz [Mulder i in. 2005, Raz i in. 2009, Rahbar i Diba 2010]. Istnieją także badania sugerujące, że kwas hipurowy może rozpuszczać ka-mienie szczawianów wapnia w moczu [Atanassova i Gutzow 2013].

Opisując specyfiki stosowane do wspomagania funkcjonowania układu moczo-wego, nie można pominąć pokrzywy, która od wieków używana jest w medycynie ludowej jako lek wzmagający diurezę wodną, co wykorzystuje się np. w trakcie za-każeń bakteryjnych układu moczowego [Pieszak i Mikołajczak 2010]. Wśród innych zastosowań ziela pokrzywy należy wymienić wspomaganie leczenia stanów zapalnych, m.in. w chorobach reumatycznych [Randall i in. 1999], obniżanie ciśnienia krwi, rozszerzanie naczyń krwionośnych, łagodzenie objawów łagodnego przerostu gru-czołu krokowego [Safarinejad 2005], działanie wspomagające przy leczeniu różnego rodzaju krwawień, działanie przeciwbólowe [Randall i in. 1999] i przeciwalergiczne [Mittman 1990]. Zwyczajowo używa się jej także w celu przyspieszenia gojenia ran i ograniczenia wypadania włosów.

Pigwowiec i dereń jadalny wybrano jako rośliny jak dotąd niszowe, choć o wie-loletniej tradycji upraw w przydomowych ogródkach. Pigwowiec zwany jest polską cytryną, ze względu na dużą zawartość witaminy C i podobny smak. Jego owoce charakteryzują się dość małą zawartością cukrów prostych, ale bardzo wysokim, w porównaniu z innymi znanymi owocami, potencjałem antyoksydacyjnym [Tarko i in. 2014].

Herbata i kawa (napoje przyrządzone odpowiednio z liści krzewu herbacianego i palonych nasion kawowca) są najpopularniejszymi ciepłymi napojami pitymi w Polsce. Do badań wybrano herbatę, ponieważ napój ten jest bardzo popularny i spożywany już od najmłodszych lat, a więc także przez osoby, u których mikrobio-ta jelitowa nie jest jeszcze ostatecznie ukształtowana, czyli jest bardziej podatna na wpływy zewnętrzne. Ponadto herbata zawiera składniki niespotykane raczej w tak dużej ilości w innych składnikach diety. Dotyczy to szczególnie herbat zielonych zawierających taniny, flawanole, flawonoidy i kwasy fenolowe. Około 70% polife-noli w zielonej herbacie stanowią katechiny, wśród których dominują (+)-katechina, (-)-epikatechina, galusan (-)-epikatechiny (ECG), (-)-epigalokatechina (EGC), ga-lusan (-)-epigalokatechiny (EGCG) oraz kwas galusowy [Gramza i in. 2005, Sang i in. 2005, Longo i in. 2008, Bansal i in. 2013]. To właśnie ze względu na wysokie


stężenie EGCG zieloną herbatę wybrano jako przedstawiciela napojów. Polifenole zielonej herbaty, z uwagi na swoje właściwości antyoksydacyjne, antybakteryjne, antywirusowe i przeciwzapalne, znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle spożyw-czym, farmaceutycznym i kosmetycznym. Wykazano także, że zmniejszają ryzyko zachorowania na choroby układu krążenia i różne nowotwory oraz wspomagają odchudzanie [Gramza i in. 2005, Hodgson 2008, Chacko i in. 2010, Henning i in. 2011, Bansal i in. 2013].

Jednym z najlepiej przebadanych warzyw o działaniu prozdrowotnym jest soja, a rynek preparatów sojowych i wyizolowanych z nich fitoestrogenów wciąż rośnie. Soja jest najbogatszym znanym źródłem izoflawonów (głównie daidzeiny i genisteiny), których metabolity (przede wszystkim ekwol) wykazują wysokie powinowactwo do receptorów dla estrogenu [Setchell i in. 2005, Setchell i Clerici 2010b], w związku z czym w organizmie człowieka działają jak te hormony [Atkinson i in. 2005]. Z tego też powodu wykorzystywane są w niehormonalnych terapiach mających na celu złagodzenie objawów menopauzy [Setchell i Clerici 2010a], ale także w celu zmniej-szenia zagrożenia osteoporozą [Chang i in. 1995], miażdżycą i niektórymi nowotwo-rami [Yuan i in. 2007, Atkinson i in. 2005].

Spirulina to kolejne odkrycie ostatnich lat w krajach wysoko rozwiniętych. Nazwą tą obejmuje się preparaty – w postaci tabletek lub ekstraktów – zawiera-jące biomasę różnych gatunków sinic z rodzaju Arthrospira. Oprócz funkcji żywie-niowej, co jest istotne w ubogich krajach borykających się z problemem głodu i niedożywienia, spirulina pełni również rolę farmaceutyku o bardzo szerokim spektrum działania [Belay 2002]. W licznych badaniach wykazano, że przyjmowa-nie preparatów sporządzonych na bazie tych bakterii pomaga zahamować rozwój istniejących nowotworów i zapobiec powstawaniu nowych, przeciwdziała zakażeniu i wzrostowi pasożytów, działa przeciwbakteryjnie, przeciwwirusowo i antyalergicz-nie, jest też przydatne w leczeniu anemii i wrzodów [Mathew i in. 1995, Ayehunie i in. 1998, Kim i in. 1998, Romay i in. 1998]. Farmaceutyki na bazie spiruliny wykazują zdolność pochłaniania z organizmu metali ciężkich oraz pierwiastków promieniotwórczych. Dowiedziono również, że skutecznie zmniejszają genotok-syczność mitomycyny, cyklofosfamidu i uretanu oraz ograniczają wywoływane przez nie uszkodzenia chromosomów [Premkumar i in. 2001, Chamorro-Cevallos i in. 2008]. Preparaty zawierające spirulinę są dostępne i szczególnie polecane w skle-pach z tzw. zdrową żywnością, ale także w aptekach czy sklepach internetowych.

Cytryniec chiński jest stosowany w ziołolecznictwie już od wieków, choć do Europy dotarł dopiero pod koniec lat 50. XIX wieku. Chińczycy uważają go za drugą, zaraz po żeń-szeniu, spośród najbardziej wartościowych roślin leczniczych, a oprócz owoców wykorzystują także nasiona, pędy i liście. Owoce cytryńca elimi-nują zmęczenie fizyczne i psychiczne, wspomagają koncentrację, wykazują działanie wzmacniające, przeciwszkorbutowe, antyoksydacyjne i przeciwbakteryjne, wspoma-gają leczenie chorób nerek, wątroby i płuc, działają przeciwnowotworowo [Ip i in.


1996, Hancke i in. 1999, Lamer-Zarawska 2001]. Ze względu na swoje wszechstron-ne działanie często zaliczane są do tzw. superowoców. Do tej elitarnej grupy owo-ców z pewnością należą też jagody goji, czyli owoce kolcowoju chińskiego i pospo-litego (Lycium chinense i L. barbarum), znane także jako jagody tybetańskie lub jagody długowieczności, od ponad 2000 lat wykorzystywane w medycynie ludowej Tybetu i Chin. W jagodach wykryto m.in. skopoletynę o działaniu przeciwzakrze-powym [Potterat 2010], sitosterol obniżający stężenie cholesterolu we krwi, cyperon o korzystnym wpływie na pracę serca i ciśnienie tętnicze krwi i zastosowaniu w le-czeniu raka szyjki macicy [Cieślik i Gębusia 2012], kryptoksantynę, która obniża zachorowalność na stwardnienie rozsiane, oraz fizalinę wykorzystywaną w walce z nowotworami. Za najcenniejszy i najbardziej charakterystyczny składnik owoców goji uważa się jednak specyficzny kompleks polisacharydowy, zwany w skrócie LBP (Lycium barbarum Polysaccharides), którego zawartość w suszonych owocach sięga 5–8% s.m. Jest to kompleks bioaktywny, o działaniu wspomagającym układ immu-nologiczny, stymulujący makrofagi i limfocyty [Gan i Zhang 2002], aktywujący splenocyty i limfocyty B [Peng i in. 2001]. Jego potencjał przeciwnowotworowy jest przypuszczalnie efektem zwiększania ekspresji mRNA dla interleukiny-2 i czynni-ka martwicy nowotworów TNF-α [Gan i Zhang 2002]. Wykazano także zdolność LBP do ochrony neuronów przed β-amyloidem [Chang i So 2008] oraz do polep-szania funkcji poznawczych poprzez stymulację hipokampu [Peng i in. 2002]. Ze względu na skład, ogromny potencjał antyoksydacyjny oraz walory smakowe jago-dy goji cieszą się dużym zainteresowaniem konsumentów oraz producentów żyw-ności prozdrowotnej.

Rola mikrobioty jelitowej w funkcjonowaniu organizmu

Analiza wyników dotychczas przeprowadzonych badań wskazuje, że definitywnie potwierdzono wysoki potencjał antyoksydacyjny omówionych powyżej surowców i preparatów. Wykazano też, że z właściwościami przeciwutleniającymi powiązane jest działanie bójcze lub hamujące w stosunku do różnorodnych patogennych bak-terii i grzybów, w tym gatunków jelitowych. Do rzadkości jednak należą (a przeważ-nie w ogóle nie były prowadzone) doświadczenia oceniające wpływ bioaktywnych składników o właściwościach antyoksydacyjnych, obecnych w tych preparatach, na mikroorganizmy stanowiące fizjologiczną, prawidłową, a zatem pożądaną i potrzeb-ną mikrobiotę jelitową.

Wydaje się oczywiste, że mikrobiota jelitowa (IM) pełni ważną, jeśli nie kluczo-wą, rolę w metabolizmie substancji dostarczanych z żywnością. Przez wiele lat jednak sądzono, że funkcja jelita grubego i zasiedlających go mikroorganizmów ogranicza się jedynie do resorpcji wody i soli oraz usuwania niewykorzystanych resztek poży-wienia. Obecnie przyjmuje się, że ogromna liczba bakterii zajmujących to miejsce


tworzy bardzo złożony ekosystem, zwany mikrobiomem jelitowym (ang. intestinal microbiome). Pojęcie ‘mikrobiom’ zostało wprowadzone po raz pierwszy w 2001 r. na określenie zbiorowego genomu mikrobioty. Jak się ocenia, mikrobiota jelitowa dorosłego człowieka składa się z ok. 1014 komórek bakterii, co 10-krotnie przewyż-sza całkowitą liczbę komórek w ciele człowieka [Dicksved 2008, Zhu i in. 2010, Hakansson i Molin 2011, Possemiers i in. 2011]. Pojemność metaboliczna IM jest blisko 100-krotnie większa niż ludzkiej wątroby. Jest to efekt ogromnej różnorod-ności gatunków bakterii, które wchodzą w skład populacji, a co za tym idzie ogrom-nej liczby genów, które zawierają [Zhu i in. 2010]. Przez wielu badaczy IM jest traktowana jak niezależny, samodzielny wielokomórkowy organ, który silnie oddzia-łuje na zasiedlany organizm gospodarza i z nim współdziała [Possemiers i in. 2011].

Proces kolonizacji przewodu pokarmowego zaczyna się natychmiast po urodze-niu (u płodu jelito jest jałowe) [Sakata i in. 1985, Fanaro i in. 2003]. Mikrobiota dziecka początkowo wykazuje sporą niestabilność i małe zróżnicowanie, ale rozwija się i wzbogaca w ciągu kilku pierwszych lat życia. Ostateczny profil mikrobioty jeli-towej dorosłego człowieka zależy od wielu czynników środowiskowych na kolejnych etapach życia. Kluczowe znaczenie zdaje się mieć rodzaj porodu (naturalny, cesar-skie cięcie), w okresie niemowlęcym – sposób karmienia (sztuczne, naturalne), a później – wiek, pochodzenie, nawyki żywieniowe, ekspozycja na ksenobiotyki i antybiotyki, tryb życia, narażenie na stres, przebyte infekcje, poziom higieny czy region geograficzny [Sakata i in. 1985, Fanaro i in. 2003, Penders i in. 2006, Turnbaugh i in. 2009]. Wszystkie te czynniki powodują powstanie u każdego osobnika unikalnej, pod względem składu gatunkowego i proporcji pomiędzy poszczególnymi przedsta-wicielami, mikrobioty jelitowej. To ogromne zróżnicowanie osobnicze porównuje się nawet do odcisku palca, nie ma bowiem dwóch osób o identycznym składzie mikro-organizmów tworzących ten złożony ekosystem [Dicksved 2008, Brown i in. 2012]. W zależności od rodzaju techniki badawczej przyjmuje się, że w skład mikrobioty jelita ludzkiego wchodzi od 500 do 1200 różnych gatunków bakterii. Mimo ogrom-nej różnorodności wykrywanych gatunków bakterii, naukowcy zgadzają się, że zna-komita większość z nich (98%) należy do czterech typów: Firmicutes (64%), Bacteroidetes (23%), Proteobacteria (8%) i Actinobacteria (3%) [Zhu i in. 2010, Hakansson i Molin 2011]. Proporcje między tymi grupami zależą zarówno od od-cinka przewodu pokarmowego, jak i od ludzkiej rasy. O ile w jelicie grubym domi-nują Firmicutes i Bacteroidetes, o tyle w jelicie czczym Proteobacteria są liczebniejsze niż Bacteroidetes [Hakansson i Molin 2011]. W jelicie krętym dorosłych Japończyków nie wykrywa się Bacteroidetes, podczas gdy w mikrobiocie zdrowych kobiet ze Szwecji bakterie te dominują [Hayashi i in. 2005].

Ze względu na liczne, pośrednie i bezpośrednie, interakcje z organizmem go-spodarza mikrobiota jelitowa ma istotny wpływ na stan jego zdrowia [Saarela i in. 2002, Hakansson i Molin 2011, Del Rio i in. 2013]. Bardzo ważne dla utrzymania zdrowia jest zachowanie równowagi między układem immunologicznym gospodarza


a komensalną mikrobiotą przewodu pokarmowego. Każde zaburzenie tej równowa-gi (dysbioza) może prowadzić do rozwoju choroby [Dicksved 2008]. Dysbioza może być zależna od diety [Turnbaugh i in. 2009, Brown i in. 2012]. Wynika to z faktu, że gatunki zamieszkujące przewód pokarmowy są wrażliwe na ilość i jakość składników dostarczanych wraz z dietą, w szczególności na cukry, które stanowią główne źródło węgla i energii. Każda nieprawidłowa lub wykluczająca dieta będzie prowadziła do nadmiernego wzrostu jednych gatunków, a zahamowania lub wyeliminowania innych. W konsekwencji może dojść do nadmiernego namnożenia gatunków oportunistycz-nych lub patogennych i osłabienia mechanizmów obronnych gospodarza [Brown i in. 2012]. Wykazano, że u osób przestrzegających rygorystycznej diety bezgluteno-wej (np. chorych z celiakią) znacząco zwiększa się liczba potencjalnie patogennych E. coli, Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Clostridium i Bacteroides, a maleje licz-ba Bifidobacterium i Lactobacillus, w porównaniu do osób stosujących tradycyjną dietę mieszaną [Sanz 2010]. W mikrobiocie jelitowej dzieci z Burkina Faso zanoto-wano znacząco większą liczebność Bacteroidetes a niższą Firmicutes w porównaniu z mikrobiotą dzieci europejskich oraz unikatową obecność bakterii z rodzajów Prevotella, Treponema i Xylanibacter. Są to gatunki zawierające zestawy genów po-trzebnych do przeprowadzenia hydrolizy celulozy i ksylanu, a ich występowania nie stwierdzono w jelicie dzieci z Włoch. Może to świadczyć o koewolucji IM w czasie długotrwałego stosowania diety bogatej w polisacharydy przez dzieci afrykańskie, dzięki czemu IM przystosowała się do maksymalnego wykorzystania energii dostar-czanej z tą ubogą w składniki energetyczne dietą [De Filippo i in. 2011]. Podobną adaptację składu mikrobioty jelitowej zaobserwowano u mieszkańców Japonii, któ-rzy jako jedyni mają geny kodujące porfyranazę – enzym zaangażowany w szlak metaboliczny porfyranu, węglowodanu z czerwonych glonów morskich, stanowiących pożywienie niektórych ludów Azji. Hehemann i inni [2010] wysunęli przypuszczenie, że enzym ten został pozyskany przez mikrobiom jelitowy w tej populacji na drodze transferu horyzontalnego genów od mikroorganizmów morskich, stąd nie jest on obecny w mikrobiomie Amerykanów, a jedynie Japończyków [Hehemann i in. 2010]. Długotrwałe stosowanie tzw. diety zachodniej, czyli bogatej w cukry i tłuszcze, pro-wadzi do zwiększenia populacji Clostridium innocuum, Eubacterium dolichum, Catenibacterium mitsuokai oraz Enterococcus spp., a zmniejszenia liczebności w ob-rębie Bifidobacteria i Bacteroidetes [Turnbaugh i in. 2009, Brown i in. 2012]. Wu i inni [2011] wykazali, że enterotyp typu Bacteroides ma istotny związek z dietą bo-gatą w białka zwierzęce, różne aminokwasy i nasycone tłuszcze (co jest typowe dla diety zachodniej), podczas gdy enterotyp typu Prevotella jest związany raczej z wyso-ką zawartością węglowodanów i cukrów prostych, typową dla diety populacji agrarnych. U osobników otyłych przedstawiciele Firmicutes i Bacteroidetes są istotnie liczniejsi niż u osobników o prawidłowej masie ciała [Ismail i in. 2011], przy czym wykazano dodatnią korelację między wysokim spożyciem tłuszczów a obecnością Firmicutes, jak również między wysokim spożyciem węglowodanów a obecnością Bacteroidetes


i Firmicutes. Stosunek liczebności Firmicutes do Bacteroidetes jest wyższy u osób otyłych niż u szczupłych i zmniejsza się po zastosowaniu niskokalorycznej diety [Ley i in. 2006, De Filippo i in. 2011]. Wzbogacenie składu mikrobioty jelitowej w Prevotella w stosunku do Bacteroidetes obserwowano również u wegetarian, potwierdzono również u nich znacząco mniejszą liczbę bakterii z rodzaju Bifidobacterium niż u osób stosujących dietę mieszaną [Wu i in. 2011, Jeffery i O’Toole 2013]. Dieta wegeta-riańska powoduje zwiększenie produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), co z kolei wywołuje obniżenie wartości pH w jelicie. Takie środowisko zapobiega wzrostowi potencjalnie patogennych bakterii, jak E. coli czy inne gatun-ki z rodziny Enterobacteriaceae [Zimmer i in. 2012].

Mikrobiota jelitowa jest wyposażona w ogromny zestaw różnorodnych enzymów, którymi nie dysponuje organizm ludzki [Zhu i in. 2010, Possemiers i in. 2011]. Dzięki temu możliwe są reakcje biotransformacji licznych związków dostarczanych z dietą, które w przeciwnym razie byłyby biologicznie niedostępne. Enzymy bakterii wcho-dzących w skład IM, takie jak α-ramnozydazy, β-glukuronidazy, β-glukozydazy, sulfatazy i esterazy, mogą hydrolizować glikozydy, glukuroniany, siarczany, amidy, estry i laktony. Inne reakcje z udziałem enzymów mikroorganizmów jelitowych obejmują rozkład pierścienia aromatycznego oraz procesy katalizowane przez re-duktazy, hydrogenazy, dekarboksylazy, demetylazę, izomerazę i dehydroksylazę [Hervert-Hernández i Goñi 2011, Possemiers i in. 2011].

Dzięki tak różnorodnej i dużej pojemności enzymatycznej bakterie generują liczne metabolity, które mogą być korzystne bądź szkodliwe dla organizmu gospo-darza. Brak odpowiedniego gatunku w składzie IM może spowodować, że dostar-czony do organizmu składnik diety nie będzie przez niego wykorzystany. Najbardziej spektakularny przykład takiej sytuacji dotyczy sojowych izoflawonów, których me-tabolity działają jak estrogeny, zmniejszając dyskomfort i negatywne objawy meno-pauzy, jednak samo dostarczenie ich z dietą czy preparatami farmaceutycznymi nie gwarantuje efektów medycznych. Dzieje się tak dlatego, że tylko nieliczne gatunki bakterii (np. Eggerthella sp. szczep YY7918, Eggerthella sp. Julong 732, Enterococcus faecium, Adlercreutzia equolifaciens, Slackia equolifaciens, Lactobacillus mucosae, Bifidobacterium sp., Slackia isoflavoniconvertens, Bacteroides ovatus) [Yokoyama i Suzuki 2008, Setchell i Clerici 2010a, b] są zdolne do biotransformacji sojowego izoflawonu daidzeiny do aktywnych biologicznie metabolitów: ekwolu i/lub O-desmetylangolensyny (O-DMA). Częstość występowania bakterii zdolnych do wytworzenia ekwolu i O-DMA w IM szacuje się odpowiednio na 30–50% i 80–90% populacji ludzkiej [Setchell i Clerici 2010a, b], a efektywność wytwarzania ekwolu zależy m.in. od nawyków dietetycznych, matrycy żywności, stopnia fermentacji jeli-towej, czasu tranzytu jelitowego, a przede wszystkim od składu gatunkowego IM [Yuan i in. 2007]. Brak odpowiednich gatunków bakterii w jelicie powoduje, że izoflawony nie zostają przekształcone w aktywne biologicznie cząsteczki i nie ma oczekiwanych efektów zastosowanej diety czy preparatów.


Jak wskazują przytoczone przykłady, w organizmie człowieka mikrobiota jelito-wa odgrywa ochronną rolę nie tylko z powodu zajmowania miejsc, które mogłyby być wykorzystane przez patogeny, oraz wytwarzania środowiska hamującego ich inwazję (np. poprzez produkcję bakteriocyn czy innych składników antymikrobiolo-gicznych). Dzięki metabolizmowi bakteryjnemu dochodzi do rozpadu składników, które nie są trawione przez enzymy ludzkie (np. skrobia oporna, roślinne polisacha-rydy), i wytworzenia SCFA. Bakterie komensalne produkują także witaminy i ami-nokwasy [Dicksved 2008] oraz umożliwiają metabolizm wielu „nieprzyswajalnych” składników diety. Powstałe metabolity mogą być następnie wykorzystane zarówno przez komórki epitelium gospodarza, jak i przez inne mikroorganizmy jelitowe. Z drugiej strony, stwierdzono, że etiologia licznych chorób jest mocno powiązana z mikrobiomem jelitowym lub niektórymi jego członkami. Niedawne badania wyka-zały, że konkretne gatunki mikroorganizmów wchodzących w skład IM odgrywają ważną rolę w rozwoju takich chorób, jak nieswoiste stany zapalne jelit (IBD, ang. inflammatory bowel disease), choroba Crohna, nowotwory okrężnicy, alergie czy otyłość, co może znaleźć zastosowanie kliniczne [Björksten i in. 1999, Saarela i in. 2002, Ley i in. 2006, Dicksved 2008, Zhu i in. 2010, Possemiers i in. 2011].

Wysoce zróżnicowana mikrobiota o ustalonych proporcjach między poszczegól-nymi jej gatunkami decyduje o przebiegu metabolizmu i efektywnym wykorzystaniu składników diety, a co za tym idzie o zdrowiu i prawidłowym funkcjonowaniu orga-nizmu. Każde jej zaburzenie może być brzemienne w skutkach. Dlatego też w ni-niejszej pracy skoncentrowano się na określeniu, jak powszechnie stosowane rośliny i suplementy diety o uznanych właściwościach prozdrowotnych, bogate w związki bioaktywne, w tym przeciwutleniacze i polifenole, często stosowane w profilaktyce oraz do wspomagania leczenia różnych chorób, wpływają na gatunki bakterii będą-cych przedstawicielami komensalnej mikrobioty jelita.

3. Materiał i metody

3.1. Materiał badawczy

Bakterie

Do doświadczeń wykorzystano czyste kultury siedmiu różnych gatunków, będących przedstawicielami najważniejszych rodzajów bakterii tworzących fizjologiczną mi-krobiotę jelitową człowieka. Wszystkie badane szczepy zakupiono w niemieckiej kolekcji czystych kultur mikroorganizmów i linii komórkowych DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Zgodnie z kartami charakterystyk, zostały one wyizolowane z jelita ludzkiego. W tabeli 2 scharaktery-zowano bakterie użyte w doświadczeniach.

Tabela 2. Charakterystyka bakterii wykorzystanych w badaniach Table 2. Characteristics of bacteria used in the study

Gatunek / SpeciesNr szczepuStrain No.

Charakterystyka / Characteristics

Bacteroides galacturonicus DSM 3978Gram-ujemna, beztlenowa, pałeczkaGram-negative, anaerobe, rod

Eubacterium cylindroides DSM 3983Gram-dodatnia, beztlenowa, pałeczkaGram-positive, anaerobe, rod

Bifidobacterium catenulatum DSM 16992Gram-dodatnia, beztlenowa, pałeczkaGram-positive, anaerobe, rod

Enterococcus caccae DSM 19114Gram-dodatnia, względnie beztlenowa, ziarniakGram-positive, facultative anaerobe, coccus

Escherichia coli DSM 1116Gram-ujemna, względnie beztlenowa, pałeczkaGram-negative, facultative anaerobe, rod

Lactobacillus sp. DSM 20059Gram-dodatnia, względnie tlenowa, laseczkaGram-positive, facultative aerobe, rod

Ruminococcus gauvreauii DSM 19829Gram-dodatnia, beztlenowa, ziarniakGram-positive, anaerobe, coccus


Czyste kultury bakteryjne, zakupione w formie zliofilizowanej, rozbankowano w odpowiednim podłożu (zalecanym przez DSMZ dla danego rodzaju bakterii), a następnie namnożono w tym samym podłożu lub podłożu specjalnie dobranym do potrzeb doświadczeń (zob. rozdział 3.3) w temperaturze 37°C, w warunkach mikro-aerofilowych (Enterococcus caccae, Escherichia coli, Lactobacillus sp.) lub beztle-nowych (Bacteroides galacturonicus, Bifidobacterium catenulatum, Ruminococcus gauvreauii, Eubacterium cylindroides).

Surowce roślinne oraz suplementy

Materiał biologiczny stanowiły świeże owoce: – derenia jadalnego (Cornus mas L.), – borówki brusznicy (Vaccinium vitis-idaea L.), – pigwowca japońskiego (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach.), – maliny właściwej (Rubus idaeus L.), – czarnego bzu (Sambucus nigra L.), – żurawiny drobnoowocowej (Oxycoccus microcarpus (Turcz. ex Rupr.) Schmalh.).

Owoce pochodziły z sadu pomologicznego Uniwersytetu Rolniczego w Garlicy Murowanej k. Krakowa lub zostały pozyskane od bezpośrednich producentów, z te-renów ekologicznych i upraw prowadzonych na terenach Małopolski i Podkarpacia.

W sklepach z tzw. zdrową żywnością i suplementami diety lub w aptece zaku-piono: – suszone jagody goji, czyli kolcowoju pospolitego (Lycium barbarum Mill.) – sklep

internetowy Natura24 Medycyna naturalna i ekologia, producent: Hanoju NL, deklarowane pochodzenie: Tybet,

– suszone owoce cytryńca chińskiego (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) – sklep internetowy Natura24 Medycyna naturalna i ekologia, producent: Hanoju NL,

– czerwoną cebulę BIO – sklep internetowy z żywnością ekologiczną; dostawca deklaruje, że warzywa były uprawiane i przechowywane bez użycia środków chemicznych, pestycydów itp.,

– zieloną herbatę BIO – sklep internetowy Natura24 Medycyna naturalna i eko-logia,

– nasiona soi BIO – sklep internetowy BogutynMłyn, producent: BioPlanet, Polska,

– czosnek niedźwiedzi BIO – sklep internetowy BogutynMłyn, producent: Lebensbaum, Niemcy,

– biomasę sinic (Spirulina platensis) w tabletkach BIO (Certyfikat Organiczny UK5) – sklep internetowy BogutynMłyn, producent: Cyanotech Corporation, deklarowane pochodzenie: Hawaje, USA,

3. Materiał i metody 45

– liście pokrzywy (Urticae folium), – apteka, producent: Herbapol, Polska, – Citrosept Organic (preparat zawierający 84% ekstraktu z miąższu i pestek grejp-

fruta z upraw ekologicznych oraz witaminę C) – apteka, producent: Cintamani, Polska, Łódź,

– BIO NONI, Fiji Island (oryginalny 100% sok z indyjskiego drzewa morwowego (Noni) z Fiji) – sklep internetowy Natura24 Medycyna naturalna i ekologia, producent Hanoju B.V.

Materiał do badań został wybrany na podstawie dostępnej literatury (zob. roz-dział 2, s. 32–38) jako surowce roślinne oraz suplementy diety (preparaty) o znanym działaniu prozdrowotnym, wspomagającym lub leczniczym, z długą tradycją stoso-wania w terapii ludowej i medycynie naturalnej różnych stron świata.

Starano się pozyskać surowce z terenów ekologicznych i upraw organicznych, aby do minimum ograniczyć ewentualny wpływ na bakterie związków chemicznych, jakie mogły pozostać na roślinach.

Polifenole

W badaniach wykorzystano czyste związki polifenolowe: – naringeninę – 4’,5,7-trihydroksyflawanon, – naringinę – naringenino-7-O-ramnozydoglukozyd, glikozyd naringeniny, – hesperetynę – 3’,5,7-trihydroksy-4’-metoksyflawanon, – hesperydynę – hesperetyno-7-O-rutynozyd, glikozyd hesperetyny, – kwercetynę, – rutynę – kwercetyno-3-O-rutynozyd, glikozyd kwercetyny, – (+)-katechinę, – rezweratrol, – florydzynę, – kemferol.

Wszystkie związki zostały zakupione w firmie SIGMA (Niemcy). Czyste polife-nole rozpuszczono w sterylnym dimetylosulfotlenku (DMSO) do uzyskania roztwo-ru wyjściowego o stężeniu 25 mg/ml. Wyjątek stanowiły kwercetyna, która w takim stężeniu hamowała całkowicie wzrost niektórych bakterii, oraz kemferol, który w tym stężeniu nie rozpuszczał się całkowicie. W tych dwóch przypadkach sporządzono roztwór wyjściowy o stężeniu 5 mg/ml. Roztwory wysterylizowano poprzez filtrację (filtr strzykawkowy PROFILL, ø 0,45 µm, z membraną nylonową), a do czasu ana-liz przechowywano w warunkach chłodniczych (+4°C).


3.2. Przebieg doświadczeń

Ocena potencjału antyoksydacyjnego oraz składu polifenolowego surowców roślinnych i suplementów diety

Z uwagi na zróżnicowanie materiału badawczego, w doświadczeniach stosowano 10-procentowe ekstrakty etanolowe sporządzone z badanych surowców, z wyjątkiem gotowych suplementów diety, tj. soku z noni i Citroseptu, które były wykorzystywane bezpośrednio. W uzyskanych ekstraktach oraz gotowych suplementach określono profil oraz stężenia związków polifenolowych metodą HPLC. Ponadto w ekstraktach, suplementach, a także roztworach czystych związków polifenolowych oznaczono zawartość polifenoli ogółem metodą Folina-Ciocalteu oraz oznaczono potencjał antyoksydacyjny metodą z rodnikiem ABTS•+.

Przygotowanie ekstraktów

Do ekstrakcji związków polifenolowych z badanych surowców użyto 80-procento-wego etanolu (EtOH), jako najwydajniejszego rozpuszczalnika (co potwierdzono we wcześniejszych badaniach własnych). W tym celu 10 ± 0,001 g surowca zalano 90 ml 80% EtOH, po czym za pomocą homogenizacji wysokoobrotowej (homoge-nizator wysokoobrotowy T25 Ultra-Turrax, IKA, 5 min, 19 000 obr./min) rozdrob-niono materiał w rozpuszczalniku. Homogenizaty przesączono i uzupełniono 80-pro-centowym etanolem do 100 ml. Preparaty farmaceutyczne (sok z noni i Citrosept) były stosowane w doświadczeniach bezpośrednio.

Wszystkie przygotowane ekstrakty roślinne, a także gotowe preparaty poddano sterylizacji poprzez mikrofiltrację (filtr strzykawkowy, membrana nylonowa, ø 0,45 µm) do jałowych butelek, które szczelnie zamknięte przechowywano w warunkach chłod-niczych (+4°C) do czasu analiz.

Ocena wpływu składników bioaktywnych, mających prozdrowotne działanie, na bakterie jelitowe

Przygotowanie gęstwy bakteryjnej 0,5 MF

Hodowle bakterii (12-godzinne) rozcieńczono odpowiednim medium do uzyskania gęstwy o mętności większej o 0,5 jednostki McFarlanda (0,5 MF) – co odpowiada liczebności komórek ok. 1,5 · 108 jtk/ml – od mętności czystego medium dla danej bakterii.


Wpływ ekstraktów z surowców roślinnych i spiruliny na bakterie jelitowe

Zmiany liczebności populacji bakterii pod wpływem związków bioaktywnych zawar-tych w badanych ekstraktach określono na podstawie pomiarów zmętnienia zawie-siny przy użyciu densytometru wyskalowanego w jednostkach McFarlanda po 24-go-dzinnej inkubacji (37°C) poszczególnych bakterii z ekstraktami dodanymi do medium w różnym stężeniu, przeprowadzonej w warunkach anaerobowych (Bifidobacterium catenulatum, Eubacterium cylindroides, Bacteroides galacturonicus oraz Ruminococcus gauvreauii) lub mikroaerofilowych (Enterococcus caccae, Escherichia coli, Lactobacillus sp.). W tym celu wykonano posiewy mikrobiologiczne gęstwy bakteryjnej 0,5 MF do płynnego, sterylnego medium, odpowiedniego dla danego gatunku bakterii, z dodatkiem badanego ekstraktu (stężenie końcowe 1,0, 2,5 lub 5,0%). Liczba zaszczepionych komórek bakterii wynosiła 3 · 106 jtk/ml. Posiewy bakterii tlenowych wykonano w warunkach jałowych, pod komorą laminarną. Wszelkie czynności z bak-teriami gatunków beztlenowych (posiew, przygotowanie gęstwy, pomiary mętności) przeprowadzono w specjalnie zaprojektowanej do tego celu sterylnej komorze wypełnionej CO2 doprowadzonym poprzez filtr wyjaławiający.

W przypadku inokulacji bakteriami anaerobowymi kontrolowano beztlenowość pożywki poprzez ocenę zmian zabarwienia podłoża z resazuryną. Przed zakręceniem probówek i umieszczeniem ich w anaerostatach przedmuchiwano je dodatkowo CO2. Natychmiast po dodaniu bakterii oraz po 24 h inkubacji zmierzono mętność medium. Aby ułatwić porównanie wpływu badanych ekstraktów na poszczególne bakterie, wyniki przedstawiono w procentach wartości otrzymanych dla kontroli pozytywnej, którą stanowiły hodowle danego gatunku bakterii w medium bez dodatku ekstrak-tu, inkubowane dokładnie w tych samych warunkach (czas, temperatura, ten sam anaerostat). Kontrole negatywne przygotowywano identycznie jak próby właściwe, z tym że nie zaszczepiano ich bakteriami, a wartość odczytu mętności po 24-godzin-nej inkubacji każdorazowo odejmowano od uzyskanego wyniku, z uwzględnieniem rodzaju i stężenia dodanego ekstraktu. Dzięki temu zniwelowano wpływ ewentual-nych zmian barwy medium z dodatkiem badanego ekstraktu w zależności od czasu i temperatury. Wykonano także kontrole podwójnie negatywne (blank), tzn. czyste pożywki bez bakterii i bez ekstraktu, inkubowane w tych samych warunkach, co próby właściwe. W żadnym przypadku nie wykazano zmian zabarwienia ani mętno-ści, które mogłyby wpłynąć na wynik.

Aby zweryfikować toksyczność rozpuszczalnika użytego do przygotowania eks-traktów, wykonano kontrolę rozpuszczalnikową, którą stanowiły hodowle bakterii inkubowane w odpowiednim medium w obecności czystego ekstrahenta (etanolu) o stężeniu końcowym identycznym jak jego zawartość w próbach właściwych. Ponieważ okazało się, że ten rozpuszczalnik ma działanie inhibitorowe, różne w zależności od gatunku bakterii i stężenia (zob. rozdział 4.3), wykonano odpowiednie obliczenia mające na celu wykazanie, jak składniki bioaktywne obecne w ekstrakcie wpływają


na dany gatunek bakterii. W tym celu, dla każdego stężenia badanego ekstraktu i dla każdego gatunku bakterii, jako kontrolę pozytywną (100%) przyjęto liczebność populacji tego drobnoustroju po 24 h hodowli w medium zawierającym jedynie sam etanol, w stężeniu równym jego zawartości w pożywce z danym stężeniem ekstraktu. Dla większej czytelności wyników i zaznaczenia, że wyniki uwzględniają już wpływ rozpuszczalnika, wartość tę oznaczono w tabelach jako KEtOH (kontrolę etanolową).

Wpływ preparatów farmaceutycznych na bakterie jelitowe

W celu określenia wpływu gotowych preparatów farmaceutycznych – suplementów diety: soku z noni i Citroseptu – wykonano doświadczenie o przebiegu podobnym do przedstawionego w poprzednim punkcie. Do odpowiedniego dla danej bakterii sterylnego medium dodano sok z noni lub Citrosept (bezpośrednio, w takiej posta-ci, w jakiej je zakupiono) w stężeniu końcowym 1,0, 2,5 lub 5,0%. Określenia zmian liczebności bakterii pod wpływem różnych stężeń związków polifenolowych obecnych w suplementach dokonano na podstawie pomiarów zmętnienia zawiesiny w jednost-kach McFarlanda po 24-godzinnej inkubacji poszczególnych bakterii (37°C, warun-ki anaerobowe lub mikroaerofilowe). Kontrolę pozytywną stanowiła odpowiednia pożywka bez dodatku preparatu, zaszczepiona taką samą ilością bakterii i inkubo-wana w tych samych warunkach. Kontrolą negatywną były podłoża z odpowiednimi stężeniami danego preparatu bez dodatku bakterii. Odczyty uzyskane z tych prób każdorazowo odejmowano od wartości zmętnienia próbki właściwej. Aby łatwiej było porównywać wyniki uzyskane dla różnych mikroorganizmów, wyrażono je jako procent wartości otrzymanych dla kontroli pozytywnej (%Kpoz).

Wpływ czystych związków polifenolowych na bakterie jelitowe

W celu określenia wpływu najczęściej spotykanych w diecie związków polifenolowych wykonano doświadczenie o przebiegu podobnym do przedstawionego powyżej. Do odpowiedniego dla danego gatunku bakterii sterylnego medium dodano roztwory pojedynczych polifenoli w stężeniu końcowym 20, 100 lub 250 µg/ml. Z uwagi na wytrącanie się rezweratrolu i kwercetyny z roztworu przy wyższych stężeniach oraz na całkowite zahamowanie wzrostu niektórych mikroorganizmów przy zastosowaniu takich stężeń, do doświadczeń z tymi polifenolami zastosowano 5-krotnie niższe stę-żenia: 4, 20 oraz 50 µg/ml. Określenia zmian liczebności bakterii pod wpływem różnych stężeń związków polifenolowych dokonano na podstawie pomiarów zmętnienia za-wiesiny w jednostkach McFarlanda po 24-godzinnej inkubacji poszczególnych bakte-rii (37°C, warunki anaerobowe lub mikroaerofilowe). Kontrolę pozytywną stanowiła odpowiednia pożywka bez dodatku polifenolu, zaszczepiona taką samą ilością bakte-rii i inkubowana w tych samych warunkach. Kontrolą negatywną były podłoża z od-powiednimi stężeniami danego polifenolu bez dodatku bakterii. Odczyty uzyskane


z tych prób każdorazowo odejmowano od wartości zmętnienia próbki właściwej. Aby ułatwić porównywanie wyników uzyskanych dla różnych mikroorganizmów, wyrażono je jako procent wartości otrzymanych dla kontroli pozytywnej (%Kpoz).

W celu kontroli toksyczności rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia flawo-noidów dokonano oceny wpływu czystego DMSO (w stężeniu 0,08–1,0%) na po-szczególne gatunki bakterii.

Ocena wpływu bakterii jelitowych na związki polifenolowe i ich potencjał antyoksydacyjny

Wiele składników diety podczas procesu trawienia dociera do jelita grubego, gdzie natrafia na bakterie stanowiące fizjologiczną mikrobiotę jelitową. Tam związki te mogą oddziaływać na poszczególne gatunki bakterii, ale też mogą ulegać różnorod-nym reakcjom biotransformacji na skutek działania enzymów bakteryjnych. Aby ocenić, jak przedstawiciele mikrobioty jelita ludzkiego wpływają na składniki prze-ciwutleniające obecne w diecie, oznaczono zmiany potencjału antyoksydacyjnego (AOX) w podłożach z dodatkiem polifenoli, ekstraktów roślinnych i suplementów diety po inkubacji z poszczególnymi gatunkami bakterii jelitowych.

W tym celu pożywki z dodatkiem roztworów badanych ekstraktów, suplementów lub polifenoli w różnym stężeniu zaszczepiano bakteriami danego gatunku i inku-bowano w odpowiednich warunkach w temperaturze 37°C. Po 24 h zawartość ho-dowli w probówkach wirowano (15 min, 5000 obr./min), a supernatant rozporcjo-wywano do dwóch probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrażano (–20°C) w celu zahamowania reakcji, które mogłyby spowodować rozpad lub przemiany obecnych tam związków i/lub straty potencjału antyoksydacyjnego.

W jednej porcji supernatantu oznaczono potencjał antyoksydacyjny metodą z rodnikiem ABTS•+. Wykonano także odpowiednie próby kontrolne, tzn. określo-no potencjał antyoksydacyjny czystych podłoży (tj. bez dodatków) z bakteriami i bez bakterii oraz podłoży z dodatkiem różnych stężeń ekstraktów/preparatów/polifeno-li, ale bez bakterii.

Dla ułatwienia porównań między poszczególnymi drobnoustrojami oraz bada-nymi substancjami wprowadzono pojęcie współczynnika interakcji (WI), wyznaczo-nego według wzoru:

WI AOX mediumz bakteriamiAOX medium bez bakterii

=

Stosunek potencjału antyoksydacyjnego medium z bakteriami do potencjału AOX takiego samego medium (tzn. ta sama pożywka, takie samo stężenie związ-ku polifenolowego/ekstraktu, takie same warunki inkubacji), ale bez dodatku


bakterii jest równy 1, jeśli bakterie w żaden sposób nie wpływają na zdolność zmiatania rodnika ABTS•+ przez obecne w tej pożywce związki. Wartości WI > 1 oznaczają, że pod wpływem dodanego gatunku baterii doszło do zmian w składzie pożywki, które zwiększyły zdolność wygaszania rodnika przez zawarte w niej związ-ki, a wartości WI < 1 – zmiany pod wpływem bakterii zmniejszyły tę zdolność.

Aby ustalić, czy wykazane zmiany potencjału antyoksydacyjnego zależą od prze-mian związków polifenolowych obecnych w badanych próbach, zachodzących pod wpływem bakterii jelitowych, w drugiej porcji supernatantu (z doświadczenia opisa-nego powyżej) określono metodą HPLC stężenia najważniejszych związków polife-nolowych. Zawartość polifenoli wyrażono w µg/ml supernatantu.

3.3. Metody analityczne

Namnażanie i hodowla bakterii

Bakterie zakupiono w postaci zliofilizowanej. Do rozbankowania i wstępnego na-mnożenia zastosowano odpowiednie dla danego organizmu podłoża, zalecane przez DSMZ. Jak się jednak okazało, niektóre z tych podłoży, ze względu na swój skład, uniemożliwiały pomiar gęstości optycznej hodowli. W przypadku Bacteroides galac-turonicus podłoże sugerowane jako optymalne (medium 1265, zob. tab. 6, s. 53/54) było bardzo mętne, a podłoże dla Ruminococcus gauvreauii (medium 104, zob. tab. 7, s. 54) i Eubacterium cylindroides (medium 78, zob. tab. 8, s. 55) zawierało nieroz-puszczalne, zawieszone w objętości medium drobiny (przypuszczalnie heminy), któ-re fałszowały odczyt. W tych przypadkach ocena liczebności populacji metodą den-sytometryczną była niemożliwa lub obarczona bardzo dużym błędem. Dlatego też sprawdzono możliwość hodowli poszczególnych gatunków w innych podłożach. Ostatecznie do doświadczeń z Enterococcus caccae, Eubacterium cylindroides oraz Ruminococcus gauvreauii wykorzystano podłoże TSYEM (Trypticase Soy Yeast Extract Medium), które pozwoliło na względnie dobry wzrost tych gatunków, przy jednoczesnej możliwości obserwacji zmian liczebności populacji bakterii za pomocą densytometru. Ponieważ Bacteroides galacturonicus słabo rósł w TSYEM, do do-świadczeń z tą bakterią wybrano podłoże ST (zob. tab. 3, s. 51). Pożywką zalecaną przez DSMZ do namnażania Lactobacillus sp. było podłoże MRS (de Man-Rogosa- -Sharpe, zob. tab. 4, s. 52) i takie też podłoże zastosowano w doświadczeniach. W przypadku Escherichia coli stosowanym podłożem był bulion odżywczy, a do namnażania i doświadczeń z Bifidobacterium catenulatum wykorzystano medium 58 (zob. tab. 5, s. 53) – obydwa podłoża sugerowane przez DSMZ.

Wszystkie pożywki poddawano sterylizacji poprzez autoklawowanie (15 min, 121°C). Pożywki przeznaczone do hodowli w warunkach beztlenowych natychmiast


po wyjęciu z autoklawu umieszczano w anaerostatach wypełnionych CO2, gdzie pozostawiano je do ostygnięcia. Dzięki temu zachowano beztlenowość pożywek do czasu przeprowadzenia doświadczeń.

Podłoże ST

Po dokładnym rozpuszczeniu składników (tab. 3) w wodzie destylowanej podłoże sterylizowano w autoklawie.

Tabela 3. Skład podłoża ST (pH 7,0) Table 3. Composition of ST medium (pH 7.0)

Składnik / ComponentIlość (na 1 l)

Amount (per l )ProducentSupplier

Pepton mięsny (produkt trawienia trypsyną)Meat-derived peptone (tryptic digest)

9,0 g FLUKA

Glukoza / Glucose 6,0 g Chempur

Ekstrakt drożdżowy / Yeast extract 4,0 g Biocorp

Ekstrakt mięsny / Meat extract 3,0 g Biocorp

NaCl 3,0 g Chempur

Na2HPO4 2,0 g Chempur

Pepton proteozowy / Proteose peptone 1,0 g Biocorp

L-cystyna / L-cystine 0,25 g SIGMA

L-cysteina · HCl · H2O / L-cystein · HCl · H2O 0,25 g SIGMA

MgSO4 · 7H2O 0,10 g Chempur

FeSO4 · 7H2O 5 mg POCh Gliwice

MnSO4 · 2H2O 3,4 mg POCh Gliwice

Tween 80 0,5 ml SIGMA

Podłoże MRS (de Man-Rogosa-Sharpe)

Podczas badań użyto gotowej pożywki MRS Broth firmy Biocorp Polska Sp. z o.o. (nr katalogowy PS 60) o składzie przedstawionym w tabeli 4.


Tabela 4. Skład podłoża MRS (pH 6,2–6,5) Table 4. Composition of MRS medium (pH 6.2–6.5)


Amount (per l)

Glukoza / Glucose 20,0 g

Pepton kazeinowy (produkt trawienia trypsyną)Casein peptone (tryptic digest)

10,0 g

Ekstrakt wołowy / Beef extract 10,0 g

Octan sodu / Sodium acetate 5,0 g

Ekstrakt drożdżowy / Yeast extract 5,0 g

Cytrynian amonu / Ammonium citrate 2,0 g

K2HPO4 2,0 g

Tween 80 1,0 g

MgSO4 · 7H2O 0,20 g

MnSO4 · H2O 0,05 g

Podłoże TSYEM (Trypticase Soy Yeast Extract Medium)

Podłoże przygotowano poprzez rozpuszczenie 3 g ekstraktu drożdżowego (Biocorp Polska Sp. z o.o., nr kat. PB06) oraz 30 g bulionu tryptonowo-sojowego (TSB, Biocorp Polska Sp. z o.o., nr kat. PS23) w 1 litrze wody destylowanej (pH 7,0–7,2).

Bulion odżywczy

Użyto gotowej pożywki firmy Biocorp Polska Sp. z o.o. (nr kat. PS 90) o składzie: 5 g/l peptonu i 3 g/l ekstraktu mięsnego (pH 7,0).

Medium 58

W celu sporządzenia pożywki (skład podany w tabeli 5) wszystkie składniki podłoża, oprócz cysteiny, rozpuszczono w wodzie destylowanej i całość zagotowano do zmia-ny barwy. Następnie roztwór schłodzono pod ciekłym azotem, dodano cysteinę, ponownie zaazotowano i poddano sterylizacji.


Tabela 5. Skład medium 58 (pH 6,8) Table 5. Composition of medium 58 (pH 6.8)


Amount (per l)ProducentSupplier

Pepton kazeinowy (produkt trawienia trypsyną) Casein peptone (tryptic digest)

10,0 g FLUKA



Ekstrakt wołowy / Beef extract 5,0 g Biocorp

Pepton sojowy / Soy peptone 5,0 g Biocorp

NaCl 5,0 g Chempur

K2HPO4 2,0 g Chempur

L-cysteina · HCl · H2O / L-cysteine · HCl · H2O 0,50 g SIGMA


MnSO4 · H2O 0,05 g Chempur


Roztwór soli SL-4 / Salt solution SL-4 40,0 ml –

Resazuryna (25 mg/100 ml) / Resazurin (25 mg/100 ml) 4,0 ml SIGMA

Medium 1265

Skład pożywki przedstawiono w tabeli 6. NaHCO3 przygotowano jako roztwór o stę-żeniu 5% (w/v), który poddano sterylizacji przez filtrację (filtr strzykawkowy PROFILL, ø 0,45 µm, z membraną nylonową) i dodano do medium po autoklawowaniu.




Produkt trawienia kazeiny pankreatynąTrypticase peptone

5,0 g FLUKA

Poligalakturonian sodu / Sodium polygalacturonate 4,0 g SIGMA






NaHCO3 2,0 g Chempur

CaCl2 · 2H2O 0,15 g Chempur

FeSO4 · 7H2O 20 mg POCh Gliwice

(NH4)2SO4 1,40 g POCh Gliwice



Medium 104

Skład pożywki przedstawiono w tabeli 7. Wszystkie składniki (z wyjątkiem witami-ny K1, heminy i L-cysteiny) rozpuszczono w wodzie destylowanej. Całość zagotowa-no i schłodzono pod ciekłym azotem. Dodano pozostałe składniki, ponownie zaazo-towano i poddano sterylizacji.





5,0 g FLUKA



Pepton / Peptone 5,0 g Biocorp





Roztwór soli SL-4 / Salt solution SL-4 40,0 ml –


Roztwór heminy / Haemin solution 10,0 ml SIGMA

Roztwór witaminy K1 / Vitamin K1 solution 0,2 ml SIGMA

Tabela 6.cd.Table 6. cont.


Medium 78

Skład pożywki przedstawiono w tabeli 8. Zmieszano składniki (oprócz cysteiny), zagotowano, schłodzono pod ciekłym azotem, po czym dodano L-cysteinę. Po ste-rylizacji dodano 0,2 ml roztworu witaminy K1 (stężenie końcowe 0,1 mg/l).







30,0 g FLUKA




Roztwór witaminy K1 / Vitamin K1 solution 0,2 ml SIGMA

Roztwór soli SL-4

Przygotowany roztwór soli SL-4 (skład podany w tabeli 9) przechowywano w wa-runkach chłodniczych (+4°C).

Tabela 9. Roztwór soli SL-4 Table 9. Salt solution SL-4



CaCl2 · 2H2O 0,25 g Chempur



KH2PO4 1,0 g Chempur

NaHCO3 10,0 g Chempur

NaCl 2,0 g Chempur


Roztwór heminy

Rozpuszczono 50 mg heminy w 1 ml 1 M NaOH, po czym rozcieńczono wodą de-stylowaną do 100 ml. Do czasu doświadczeń roztwór przechowywano w szczelnej butelce, w temperaturze +4°C.

Roztwór witaminy K1

Rozpuszczono 0,1 ml witaminy K1 w 20 ml 95% etanolu, po czym poddano stery-lizacji poprzez mikrofiltrację (filtr strzykawkowy, ø 0,45 µm). Do czasu doświadczeń roztwór przechowywano w szczelnej butelce z ciemnego szkła, w temperaturze +4°C.

Pomiar liczebności komórek bakterii

Liczebność komórek bakteryjnych w medium określono na podstawie pomiaru jego mętności za pomocą densytometru (DEN-1B, Biosan, Łotwa) wyskalowanego w jed-nostkach McFarlanda i przeliczeniu według skali.

Oznaczanie potencjału antyoksydacyjnego

Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów, suplementów i roztworów polifenoli oraz podłoży bakteryjnych określono z wykorzystaniem syntetycznego wolnego rodnika ABTS•+ zgodnie z protokołem opisanym w innej publikacji [Duda-Chodak i in. 2011]. Potencjał antyoksydacyjny badanych prób odniesiono do zdolności wygasza-nia rodnika ABTS•+ przez troloks (kwas (±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochro-mano-2-karboksylowy, SIGMA) i wyrażono w milimolach równoważników troloksu (TEAC, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) na 100 ml lub 100 g wyjściowej próbki lub związku (mmol TE/100 ml lub mmol TE/100 g).

Oznaczanie zawartości polifenoli ogółem w ekstraktach

Zawartość polifenoli ogółem w badanych ekstraktach oznaczono metodą Folina- -Ciocalteu zgodnie z protokołem opisanym w innej publikacji [Duda-Chodak i in. 2011]. Ogólną zawartość polifenoli wyrażono w mg katechiny/100 ml w oparciu o wykreśloną uprzednio krzywą wzorcową.


Analiza profilu najważniejszych polifenoli w badanych próbach metodą HPLC

Do analizy profilu związków polifenolowych w próbach wykorzystano chromatograf cieczowy FLEXAR (Perkin-Elmer, USA) wyposażony w detektor UV-Vis. Rozdział przeprowadzono na kolumnie Synergi Fusion RP-80A 200 × 4,6 mm (4 µm) Phenomenex (Torrance, CA, USA), termostatowanej w temperaturze 30°C. Fazę ruchomą stanowił kwas octowy o stężeniu 2,5% (roztwór A) oraz acetonitryl (roz-twór B).

Program elucji podczas analizy kwasu galusowego, procyjanidyny B1, procyja-nidyny B2, (+)-katechiny, (-)-epikatechiny, (-)-epigalokatechiny, galusanu (-)-epi-galokatechiny, florydzyny, naringiny, naringeniny, hesperetyny oraz hesperydyny (detekcja przy λ = 280 nm) był następujący: liniowy wzrost stężenia roztworu B od 5% do 20% w ciągu 30 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B od 20% do 100% w ciągu 3 minut, izokratyczna elucja 100% roztworem B przez 7 minut i liniowy spadek stężenia roztworu B do 5% w ciągu 4 minut (przepływ 0,5 ml/min). Na koniec programu każdorazowo płukano kolumnę roztworem B o stężeniu 5% (4 min).

Program elucji zastosowanej do oznaczania kwasu kawowego, p-kumarowego, chlorogenowego, ferulowego, witeksyny, izowiteksyny, apigeniny i rezweratrolu (de-tekcja przy λ = 325 nm, przepływ 0,5 ml/min) był następujący: izokratyczna elucja roztworem B o stężeniu 20% przez 15 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B od 20% do 100% w ciągu 30 minut, izokratyczna elucja 100% roztworem B przez 4 minuty, liniowy spadek stężenia roztworu B do 20% w czasie 3 minut. Na zakoń-czenie kolumnę przemyto roztworem B o stężeniu 20%.

W przypadku kwercetyny, glukozydu kwercetyny, rutyny i kemferolu (detekcja przy λ = 360 nm) oraz kwasu hipurowego, protokatechowego, elagowego, daidzyny, daidzeiny i genisteiny (detekcja przy λ = 250 nm) zastosowano przepływ 1 ml/min oraz program elucji: liniowy wzrost stężenia roztworu B od 5% do 20% w ciągu 20 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B od 20% do 100% w ciągu 10 minut, izokratyczna elucja 100% roztworem B przez 3 minuty i liniowy spadek stężenia roztworu B do 5% w ciągu 4 minut. Na zakończenie płukano kolumnę 5% roztwo-rem B.

Do analizy antocyjanów zastosowano detekcję przy λ = 520 nm, przepływ 0,5 ml/min oraz program elucji: liniowy wzrost stężenia roztworu B od 5% do 20% w ciągu 30 minut, liniowy wzrost stężenia roztworu B od 20% do 100% w ciągu 3 mi-nut, izokratyczna elucja 100% roztworem B przez 4 minuty i liniowy spadek stężenia roztworu B do 5% w ciągu 4 minut. Na koniec płukano kolumnę 5% roztworem B.

Do jakościowego i ilościowego oznaczenia wykrytych polifenoli wykorzystano czasy retencji i krzywe wzorcowe wyznaczone dla odpowiednich standardów.

Wzorce kwasów fenolowych (ferulowego, hipurowego, kawowego, p-kumarowe-go, galusowego, chlorogenowego), (+)-katechiny, kwercetyny, izokwercytryny (kwer-cetyno-3-O-glukozyd), rutyny (kwercetyno-3-O-rutynozyd), hesperetyny, hesperydy-


ny (hesperetyno-7-O-rutynozyd), naringiny (naringenino-7-O-ramnoglukozyd) oraz naringeniny zakupiono w firmie SIGMA.

Wzorce kwasu protokatechowego, kwasu elagowego, florydzyny (floretyno- -2’-O-glukozyd), (-)-epikatechiny, (-)-epigalokatechiny, galusanu (-)-epigalokatechi-ny, witeksyny (apigenino-8-C-glukozyd), izowiteksyny (apigenino-6-C-glukozyd), apigeniny (4’,5,7-trihydroksyflawon), kemferolu (3,4’,5,7-tetrahydroksyflawon), rez-weratrolu (3,4’,5-trihydroksystilben), daidzeiny (4’,7-dihydroksyizoflawon), daidzyny (daidzeino-7-O-glukozyd), genisteiny (4’,5,7-trihydroksyizoflawon), procyjanidyny B1 i B2, myrtyliny (delfinidyno-3-O-glukozyd), cyjaniny (cyjanidyno-3,5-di-O-glukozyd), ideainy (cyjanidyno-3-O-galaktozyd), kuromaniny (cyjanidyno-3-O-glukozyd), kera-cyjaniny (cyjanidyno-3-O-rutynozyd), cyjanidyno-3-O-arabinozydu, kalistefiny (pelar-gonidyno-3-O-glukozyd) oraz peonidyno-3-O-glukozydu zakupiono w firmie Extrasyn-t hese (Francja).

Zawartość antocyjanów (zidentyfikowanych na podstawie czasu retencji dla wzorców) przedstawiono w równoważnikach (mg) cyjanidyno-3-O-glukozydu.

Wyznaczenie MIC dla preparatów o działaniu hamującym

W przypadku polifenoli, ekstraktów i preparatów, dla których wykazano działanie hamujące wzrost bakterii, wyznaczono wartość minimalnego stężenia hamującego (ang. minimum inhibitory concentration; MIC) metodą seryjnych rozcieńczeń skład-nika hamującego w podłożu płynnym. Za wartość MIC uważa się najniższe stężenie badanego preparatu, które powoduje zahamowanie widocznego gołym okiem wzro-stu bakterii po inkubacji [Mazzola i in. 2009]. W praktyce oznaczało to całkowite zahamowanie wzrostu (tzn. po 24 h mętność hodowli w podłożu ze składnikiem o tym stężeniu była równa mętności podłoża z taką samą ilością preparatu, ale bez bakterii) lub ograniczenie wzrostu drobnoustroju o więcej niż 90% (tj. liczebność populacji, wyznaczona poprzez pomiar densytometryczny, była w tej próbie mniejsza niż 10% kontroli, czyli populacji inkubowanej w medium bez żadnych dodatków).

W tabelach przyjęto m.in. następujące oznaczenia: wartość ze znakiem „>” – nie wyznaczono dokładnej wartości MIC, ale dla danego stężenia obserwowano ogra-niczenie wzrostu bakterii o 10–90% w stosunku do kontroli pozytywnej (słabe ha-mowanie); wartość ze znakiem „>>” – jak poprzednio, z tym że obserwowano ograniczenie liczebności populacji bakterii o mniej niż 10% w stosunku do kontro-li pozytywnej (bardzo słabe hamowanie); „NI” – nie było możliwości wyznaczenia MIC (brak hamowania lub nawet stymulacja wzrostu).

Wyniki wyrażono w µg/ml dla polifenoli lub w % dla pozostałych preparatów. Dla porównania, określono także siłę hamującą antybiotyku – chloramfenikolu A – w różnym stężeniu.


Analiza statystyczna

Każde oznaczenie w tej pracy wykonano co najmniej w 3 powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe (SD). W celu oceny istotności statystycznej różnic przeprowadzono test jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya-Kramera, zaś rozkład normalności określono za pomocą testu Kołgomorowa-Smirnowa [Łomnicki 2013]. Wszystkie obliczenia statystyczne zostały wykonane przy użyciu programu GraphPad InStat, wersja 3.01 dla Windows (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA).

Układ niektórych doświadczeń i sposób prezentacji wyników wskazywałyby na zasadność zastosowania dwuczynnikowej analizy wariancji, uznano jednak, że ba-dane czynniki (zmienne niezależne) są zbyt zróżnicowane, by miało sens ich po-równywanie. Przykładowo, w tabeli prezentującej wpływ etanolu na bakterie oce-niano jedynie istotność wpływu stężenia alkoholu na dany gatunek bakterii, nie analizowano natomiast, czy na liczebność populacji przy tym samym stężeniu eta-nolu miał wpływ także gatunek bakterii. Wynika to z faktu, że do badań celowo wybrano mikroorganizmy reprezentujące różne grupy bakterii, zarówno przedsta-wicieli gatunków Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, a także typowe beztle-nowce lub mikroaerofile. Takie zróżnicowanie implikowało konieczność zastoso-wania odmiennych podłoży i warunków doświadczenia, co bez wątpienia miało istotny wpływ na uzyskane wyniki. Dlatego też uznano, że porównywanie między sobą wyników w zależności od badanego gatunku bakterii byłoby w wielu przypad-kach bezzasadne. Podobnie, trudno porównywać między sobą poszczególne surow-ce roślinne czy preparaty, w sytuacji gdy jedne były stosowane w postaci „gotowej”, a z innych wykonywano ekstrakty etanolowe; różna była też postać wyjściowa (owo-ce świeże lub suszone, liście, nasiona czy też suszona biomasa). Dlatego do oceny statystycznej wykorzystano test jednoczynnikowej analizy wariancji, a nie dwuczyn-nikowej – jak sugerowałby to układ prezentowanych wyników. Wyniki uzyskane dla różnych mikroorganizmów czy różnych surowców łączono w zbiorcze tabele – przede wszystkim w celu zmniejszenia rozmiarów materiału graficznego i ułatwienia czy-tania pracy.

4. Wyniki i dyskusja

4.1. Potencjał antyoksydacyjny i skład polifenolowy badanych ekstraktów i suplementów

W prezentowanej pracy wybrano do badań surowce roślinne o długoletniej tradycji stosowania w medycynie naturalnej i o uznanych właściwościach prozdrowotnych: świeże owoce maliny, czarnego bzu, żurawiny, borówki brusznicy, pigwowca japoń-skiego i derenia, suszone owoce goji i cytryńca chińskiego, czerwoną cebulę, czosnek niedźwiedzi, ziele pokrzywy, zieloną herbatę i nasiona soi, a także suplementy diety, tj. spirulinę, sok z noni i Citrosept. Wszystkie one są bogatym źródłem przeciwutle-niaczy, w tym różnych związków polifenolowych, i są wykorzystywane do leczenia rozmaitych schorzeń jako preparaty kupowane bez recepty, a zatem pozostające poza wszelką kontrolą.

Wśród analizowanych surowców na szczególną uwagę zasługuje Citrosept, czy-li gotowy, komercyjny ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta. Bardzo wysoka ak-tywność antyoksydacyjna (21269,7 ± 3601,1 mg troloksu/100 ml ekstraktu) kore-sponduje z dużą zawartością polifenoli ogółem (2577,2 ± 14,7 mg katechiny/100 ml) (tab. 10). Uzyskane wartości są kilkukrotnie wyższe niż w przypadku pozostałych badanych ekstraktów. Z jednej strony, może to wynikać z faktu, że Citrosept, po-dobnie jak sok z noni, wykorzystywano w badaniach bezpośrednio, w formie, w ja-kiej został nabyty w aptece, podczas gdy pozostałe surowce były stosowane w po-staci 10-procentowych ekstraktów. Jeśli jednak porówna się sok z noni i Citrosept, dominacja tego drugiego będzie oczywista, co potwierdza, że ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta jest bardzo bogatym źródłem polifenoli o wysokim potencjale antyoksydacyjnym.

Jak już wspomniano wcześniej, Citrosept – zgodnie z deklaracją producenta – to liofilizowany ekstrakt z miąższu, skórek i pestek grejpfruta, zawierający flawonoidy, głównie flawanony, flawony i flawonole, glicerol, witaminę C oraz SiO2. Za poten-cjał antyoksydacyjny Citroseptu odpowiadają zatem nie tylko polifenole, ale także witamina C, która wykazuje właściwości przeciwrodnikowe. Do najważniejszych polifenoli w owocach grejpfruta należy naringina, której stężenie w 1 litrze soku

4. Wyniki i dyskusja 61

Tabela 10. Potencjał antyoksydacyjny i zawartość polifenoli ogółem w badanych ekstraktach i preparatach (średnia ± SD)

Table 10. Antioxidant potential and total polyphenol content of extracts and preparations under study (mean ± SD)

Ekstrakt (Preparat)Extract (Preparation)

TEACABTS*[mmol TE/100 g

materiału wyjściowego]TEACABTS*

[mmol TE/100 g of initial material]

Aktywność antyoksydacyjna

[mg troloksu/100 ml ekstraktu]

Antioxidant activity[mg Trolox/100 ml

of extract]

Zawartość polifenoli ogółem

[mg katechiny/100 g materiału wyjściowego]

Total polyphenol content[mg catechin/100 g of initial material]

Pokrzywa / Nettle 4,28 ± 0,07 107,1 ± 1,8 618,9 ± 42,6

Spirulina / Spirulina 0,96 ± 0,05 24,1 ± 1,2 157,4 ± 10,9

Sok z noni / Noni juice 1,70 ± 0,16** 424,5 ± 39,5** 108,8 ± 6,4**

Citrosept / Citrosept 84,98 ± 14,39** 21269,7 ± 3601,1** 2577,2 ± 14,7**

Żurawina / Cranberry 7,87 ± 1,51 197,0 ± 37,9 169,4 ± 13,0

Borówka brzusznicaLingonberry

6,84 ± 1,86 171,2 ± 46,5 392,3 ± 23,1

DereńCornelian cherry

11,3 ± 2,58 283,0 ± 64,5 426,4 ± 67,2

Czarny bezElderberry

11,15 ± 0,52 279,0 ± 13,0 883,1 ± 119,0

Malina / Raspberry 4,66 ± 1,91 116,6 ± 47,7 157,1 ± 3,9

Jagody gojiGoji berries

7,88 ± 0,11 197,2 ± 2,7 810,6 ± 224,1

PigwowiecJapanese quince

11,29 ± 0,08 282,4 ± 2,1 474,1 ± 6,3

Cytryniec chińskiSchisandra

2,16 ± 0,16 54,0 ± 4,1 237,3 ± 23,1

Czerwona cebulaRed onion

1,73 ± 0,12 43,2 ± 2,9 90,5 ± 9,0

Czosnek niedźwiedziBear’s garlic

10,35 ± 0,41 259,0 ± 10,2 744,6 ± 15,0

Soja / Soybean 2,64 ± 0,36 66,0 ± 9,0 118,6 ± 12,0

Zielona herbata Green tea

439,4 ± 11,3 10998,3 ± 282,3 9549,0 ± 46,0

TEAC – Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (metoda / method ABTS)

* wartości wyliczone z założeniem 100% wydajności ekstrakcji składników przeciwutleniających values calculated with the assumption of a 100% efficiency of extraction of antioxidant compounds ** w przeliczeniu na 100 ml gotowego preparatu / per 100 ml of the preparation


wyciśniętego z grejpfrutów kształtuje się w szerokim zakresie od kilkudziesięciu do kilkuset miligramów, przez różnych autorów określanym jako: 45–602 mg [Gattuso i in. 2007], 270–464 mg [Kelebek 2010], 235–372 mg [Vanamala i in. 2006] i 145,6– –638 mg [Ross i in. 2000], w zależności od odmiany owocu. W mniejszych ilościach występują pozostałe flawanony (mg/l soku): narirutyna (22,5–170), naringenina (9,8–80), hesperydyna (0–17,9), neohesperydyna (6,7–24,2), didymina (2,7–12,8) i poncyryna (8,5–26,0) [Ross i in. 2000, Vanamala i in. 2006, Gattuso i in. 2007, Kelebek 2010]. Sok zawarty w owocach jest jednak znacznie uboższy w bioaktywne składniki niż cały owoc, stąd do ekstraktu przechodzą zwykle znacznie większe ilości polifenoli. Co więcej, zawartość polifenoli w ekstrakcie zależy od proporcji, w jakich zostały wykorzystane poszczególne części owocu. Jeśli ekstrakt jest wytwa-rzany z odpadów po produkcji soku grejpfrutowego, to będzie się składał prawie wyłącznie ze skórek, flawedo i albedo. Nogata i inni [2006] wykazali istotne różni-ce w zawartości najważniejszych flawonoidów w zależności od części owocu. Najmniej badanych związków wykryto w tkance łączącej segmenty owocu: 1130 mg naringiny, 118 mg narirutyny, 16,2 mg neohesperydyny, 301 mg poncyryny i 13,6 mg eriocy-tryny w 100 g świeżej masy. Nieco więcej poszczególnych składników zawierał oczyszczony miąższ, a szczególnie bogata we flawanony okazała się wewnętrzna część skórki grejpfruta, czyli albedo: w 100 g ś.m. zawierała ona 2700 mg naringiny, 2321 mg narirutyny, 15,2 mg neohesperydyny i 638 mg poncyryny. Co ciekawe, eriocytryna w albedo nie występowała w ogóle [Nogata i in. 2006]. Duża zawartość polifenoli ogółem oznaczona w Citrosepcie może zatem wynikać ze znacznej za-wartości albedo.

W tabelach 11 i 12 przedstawiono profil polifenolowy Citroseptu, oznaczony metodą HPLC w badanym preparacie. Producent preparatu nie podał sposobu przy-rządzenia ekstraktu ani odmiany owocu do tego celu wykorzystanej. Trudno więc odnieść uzyskane rezultaty do wyników z dostępnej literatury. Niemniej jednak po-twierdzenie znajduje występowanie naringiny (1018,0 ± 131,1 mg/l) oraz jej aglikonu – naringeniny (19,8 ± 12,3), które są składnikami charakterystycznymi dla grejpfrutów. Na uwagę zasługuje natomiast duże stężenie hesperydyny (463,0 ± 96,9 mg/l) i obec-ność jej aglikonu – hesperetyny (19,9 ± 1,07). Aglikon mógł powstać na skutek samoistnej hydrolizy podczas przechowywania preparatu lub nawet wcześniej – na etapie produkcji (przygotowywania ekstraktu). Wiadomo bowiem, że w pewnych warunkach, np. w środowisku kwaśnym, hesperydyna hydrolizuje do hesperetyny oraz cząsteczek glukozy i ramnozy [Garg i in. 2001]. Obecność hesperydyny w pre-paracie z grejpfruta, i to w tak dużym stężeniu, jest jednak trudniejsza do wyja-śnienia. Hesperydynę w sokach grejpfrutowych, w ilości 8,5–10,3 mg/l w zależności od odmiany wyjściowego owocu, wykrył Kelebek [2010]; nieco szerszy zakres, tj. 2,5–17,9 mg/l soku, podają Gattuso i inni [2007]. Wartości uzyskane w tej pracy dla preparatu Citrosept są kilkadziesiąt razy wyższe, nawet jeśli się uwzględni, że do ekstraktu przechodzi więcej hesperydyny niż do soku. Może to świadczyć o za-


fałszowaniu produktu, a dokładniej o wykorzystaniu do jego produkcji także skład-ników pomarańczy (np. ich skórek) lub cytryn, dla których ten polifenol jest cha-rakterystyczny [Nogata i in. 2006, Gattuso i in. 2007]. Nie znaleziono informacji o obecności lub braku hesperydyny i hesperetyny w pestkach grejpfrutów, co mo-głoby ewentualnie tłumaczyć wysokie stężenie tych związków w Citrosepcie. W pest-kach pomarańczy natomiast są one obecne, choć w mniejszych ilościach niż w skór-ce [Garg i in. 2001]. Hesperydynę, a także eriocytrynę i mniejszą ilość naringiny wykryto w pestkach cytryny, istotnym źródłem naringiny i neohesperydyny są pest-ki bergamotki, zaś naringiny – pestki mandarynek [Tripoli i in. 2007].

Tabela 11. Budowa chemiczna oraz stężenie flawanonów wykrytych w Citrosepcie metodą HPLC (średnia ± SD)

Table 11. Chemical structure and concentration of flavanones detected in Citrosept by HPLC method (mean ± SD)

FlawanonFlavanone

Budowa / StructureStężenie

Concentration [mg/l]

NaringinaNaringin

naringenino-7-O-neohesperydozydnaringenin-7-O-neohesperidoside

1018,0 ± 131,1

NaringeninaNaringenin

aglikonaglycone

19,8 ± 12,3

HesperydynaHesperidin

hesperetyno-7-O-rutynozydhesperetin-7-O-rutinoside

463,0 ± 96,9

HesperetynaHesperetin

aglikonaglycone

19,9 ± 1,07

Naringina / Naringin: R1 = O-neohesperydoza / O-neohesperidose, R2 = H, R3 = OH Naringenina / Naringenin: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH Hesperydyna / Hesperidin: R1 = O-rutynoza / O-rutinose, R2 = OH, R3 = OMe Hesperetyna / Hesperetin: R1 = OH, R2 = OH, R3 = OMe


Tabela 12. Profil związków polifenolowych w gotowych preparatach farmaceutycznych: soku z noni (NO) i Citrosepcie (CIT) (średnia ± SD)

Table 12. Profile of polyphenol compounds in ready-to-use pharmaceutical preparations: noni juice (NO) and Citrosept (CIT) (mean ± SD)

Związek / Compound NO CIT

Kwas protokatechowy / Protocatechuic acid

[mg/

l]

0,74 ± 0,69 n.d.

Kwas chlorogenowy / Chlorogenic acid 0,44 ± 0,07 0,17 ± 0,02

Kwas kawowy / Caffeic acid 0,05 ± 0,00 n.d.

Kwas p-kumarowy / p-Coumaric acid n.d. 37,4 ± 5,12

Kwas galusowy / Gallic acid 3,93 ± 0,01 15,78 ± 2,58

Kwas elagowy / Ellagic acid 0,35 ± 0,05 n.d.

Apigenina / Apigenin n.d. 0,65 ± 0,04

Apigenino-6-C-glukozyd / Apigenin-6-C-glucoside n.d. n.d.

Apigenino-8-C-glukozyd / Apigenin-8-C-glucoside n.d. 0,03 ± 0,00

Florydzyna / Phloridzin 1,06 ± 0,10 1,37 ± 0,09

Daidzeino-7-O-glukozyd / Daidzein-7-O-glucoside n.d. n.d.

Daidzeina / Daidzein n.d. n.d.

Genisteina / Genistein 0,03 ± 0,01 n.d.

Rezweratrol / Resveratrol n.d. 5,29 ± 0,31

Procyjanidyna B1 / Procyanidin B1 2,14 ± 0,64 n.d.

Kwercetyno-3-O-rutynozydQuercetin-3-O-rutinoside

3,87 ± 1,08 90,36 ± 11,99

Kwercetyna / Quercetin n.d. 5,71 ± 0,38

Kemferol / Kaempferol n.d. 0,02 ± 0,02

Delfinidyno-3-O-glukozyd*Delphinidin-3-O-glucoside

n.d. 21,56 ± 5,67

Cyjanidyno-3-O-glukozydCyanidin-3-O-glucoside

n.d. 30,95 ± 9,68

n.d. – stężenie poniżej progu detekcji / not detected * w przeliczeniu na cyjanidyno-3-O-glukozyd / expressed as cyanidin-3-O-glucoside equivalents


Oprócz omówionych powyżej flawanonów i ich 7-O-glikozydów, w skład grejp-frutów wchodzą także inne związki o wysokim potencjale antyoksydacyjnym, jak kwercetyna [Vanamala i in. 2006] i kwasy fenolowe (głównie ferulowy, p-kumarowy, chlorogenowy i galusowy) [Gorinstein i in. 2001, Kelebek 2010]. Uzyskane wyniki (tab. 12) potwierdzają obecność tych związków (z wyjątkiem kwasu ferulowego) także w Citrosepcie. Brak kwasu ferulowego może wynikać z faktu, że w grejpfrutach występuje on głównie w postaci związanej i przede wszystkim we flawedo [Peleg i in. 1991]. Z kolei wykrycie kwercetyno-3-O-rutynozydu (w ilości 90,36 ± 11,99 mg/l) potwierdza przypuszczenia, że do produkcji preparatu wykorzystano także składni-ki pomarańczy lub innych owoców cytrusowych, bowiem rutyna w grejpfrutach wy-stępuje raczej w niewielkiej ilości (5,1 mg/100 g skórki i 5,4 mg/100 g miąższu [Nogata i in. 2006]), jest natomiast powszechna w albedo i flawedo kwaśnych pomarańczy (odpowiednio 31,1 i 63,7 mg/100 g ś.m.) [Nogata i in. 2006]. Znaczna różnica między sumą stężeń poszczególnych polifenoli oznaczonych metodą HPLC (tab. 11 i 12) a zawartością polifenoli ogółem w tym preparacie (oznaczoną metodą Folina- -Ciocalteu (tab. 10) może sugerować, że w Citrosepcie są obecne także inne, nie-oznaczane w tej pracy polifenole, jak np. narirutyna, didymina, poncyryna czy neo-hesperydyna.

Na tle badanych surowców wyróżnia się ekstrakt z zielonej herbaty, o bardzo wysokiej aktywności antyoksydacyjnej wynoszącej 10 998,3 ± 282,3 mg trolok-su/100 ml, co – przy założeniu 100-procentowej wydajności ekstrakcji składników przeciwutleniających – odpowiadałoby 439,4 ± 11,3 mmol TE/100 g wyjściowego surowca (tab. 10). Biorąc pod uwagę potencjał antyoksydacyjny materiału wyjścio-wego, można byłoby uznać, że zielona herbata stanowiła najsilniejszy przeciwutleniacz wśród badanych surowców. Należy jednak podkreślić, że porównywanie wyników w takiej postaci jest niemiarodajne, gdyż wykorzystywany w badaniach surowiec wyjściowy był bardzo różnorodny (świeże lub suszone warzywa, biomasa sinic, zioła, owoce, sok z owoców lub ekstrakt), a do dalszych badań brano jednakowe objętości przygotowanych ekstraktów lub gotowych preparatów. Dlatego bardziej uzasadnio-ne wydaje się porównywanie potencjału antyoksydacyjnego w danej objętości koń-cowego ekstraktu czy preparatu. Wynik uzyskany dla zielonej herbaty jest z pewno-ścią wyższy od wartości podanych przez takich autorów, jak Rusaczonek i inni [2010] (142–219 mmol troloksu/100 g liści herbaty) czy Henning i inni [2003] (124–169 mmol troloksu/100 g), ale znacząco niższy od potencjału antyoksydacyjnego liści herbaty zbieranych w prowincji Boseong w Korei, wynoszącego 4293–4688 mmol troloksu/g liści, w zależności od czasu ich zbioru [Lee i in. 2014]. Różnice między właściwo-ściami antyoksydacyjnymi herbat wynikają przede wszystkim z odmiennego kraju i regionu pochodzenia rośliny, a zatem ze związanych z tym odmiennych warunków glebowo-klimatycznych.

Całkowita zawartość antyoksydantów (CCA), którą Yashin i inni [2011] oznaczy-li metodą amperometryczną, była ogromnie zróżnicowana w zależności od kraju


pochodzenia i producenta herbaty. Najniższą CCA miała herbata z Bali (31,2 mg/g) oraz kilkanaście herbat pochodzących od chińskich producentów (43–60 mg/g). Największym potencjałem antyoksydacyjnym (190 mg/g w przeliczeniu na kwercety-nę) odznaczały się herbaty ze Sri Lanki. Wysoką zawartością antyoksydantów (CCA ponad 130 mg/g) charakteryzowały się także herbaty z Japonii [Yashin i in. 2011]. Herbaty chińskie pod względem zawartości polifenoli ogółem (11–18 g/100 g s.m.) plasują się za herbatami z Japonii (19 g/100 g s.m.) czy z Kenii (25–27 g/100 g s.m.) [Karori i in. 2007]. Co ciekawe, analogiczne wyniki dotyczące herbat czarnych uzy-skali Dmowski i inni [2013] – również w tym przypadku herbaty pochodzące z Chin miały najniższą zawartość polifenoli ogółem i aktywność antyoksydacyjną, a herbaty ze Sri Lanki cechowały się wyższymi wartościami tych wskaźników.

Potencjał przeciwutleniający herbaty zależy także od parametrów procesu ob-róbki liści, warunków transportu i przechowywania czy nawet stopnia rozdrobnienia liści [Gramza i in. 2005]. Bardzo wysokie wartości uzyskane przez Lee i innych [2014] mogą wynikać z faktu, że skład polifenolowy i potencjał antyoksydacyjny liści Camelia sinensis był analizowany natychmiast po ich poddaniu minimalnej obróbce techno-logicznej w celu wytworzenia produktu „herbata zielona”. Nie były one dalej prze-twarzane, pakowane, transportowane ani przechowywane, a zatem nie dochodziło do utraty cennych właściwości. Shrestha i inni [2010] wykazali, że obróbka typu CTC (cut-tear-curl – ciąć-rozrywać-zwijać) powoduje utratę prawie połowy polifenoli i aktywności antyoksydacyjnej herbaty, w porównaniu z metodą klasyczną. Komercyjnie dostępne w Polsce herbaty zielone mają bardzo zróżnicowany potencjał antyoksy-dacyjny (w zakresie 392,5–1034 mg troloksu/g herbaty, w zależności od producenta i kraju pochodzenia), który istotnie maleje w trakcie przechowywania [Duda-Chodak i in. 2008]. Wynik uzyskany dla herbaty użytej w niniejszej pracy (1099,8 mg trolok-su/g herbaty) świadczy o jej wysokiej jakości. Jest to herbata „w 100% organiczna”, z certyfikatem (Bio-Siegel, Demeter). Została zakupiona w sklepie z żywnością ekologiczną, co potwierdza przekonanie, że zakupu tego typu surowców należy dokonywać w sklepach specjalizujących się w tej materii, które nie tylko dbają o wy-soką jakość oferowanych produktów, ale też zapewniają odpowiednie warunki ich przechowywania.

Herbata jest jednym z najczęściej spożywanych napojów na świecie. W roku 2010 roczna produkcja herbaty sięgnęła prawie 4,5 mln ton, z czego 20% było przetwo-rzone na herbatę zieloną, spożywaną przede wszystkim w Azji, północnej Afryce, Stanach Zjednoczonych oraz Europie [Chacko i in. 2010, Bansal i in. 2013]. Ponieważ aż do 30–40% suchej masy liści herbaty stanowią polifenole, głównie katechiny, to właśnie herbata stanowi podstawowe źródło takich związków, jak (-)-epikatechina, (-)-epigalokatechina, galusan (-)-epikatechiny i galusan (-)-epigalokatechiny [Bansal i in. 2013, Gadkari i Balaraman 2014]. Wysokiej jakości herbaty wykorzystanej w ba-daniach dowodzą także wyniki dotyczące ogólnej zawartości polifenoli – 9549,0 ± 46,0 mg (w przeliczeniu na katechinę) w 100 g liści herbaty (tab. 10).


Zawartość katechin w herbatach zielonych jest bardzo zróżnicowana i – po-dobnie jak zawartość polifenoli ogółem i potencjał antyoksydacyjny – zależy od wielu czynników. Należy podkreślić, że z wyjściowej ogromnej zawartości polife-noli w liściu krzewu herbacianego, na skutek obróbki technologicznej prowadzącej do uzyskania komercyjnej herbaty pozostaje w produkcie tylko nieznaczna jej część. O tym, jak duże są to różnice, świadczy wysokie stężenie katechin ogółem w liściach zebranych z 22 odmian krzewu herbacianego rosnącego w różnych regionach Chin, wynoszące od 1245,9 do 2965,8 mg/g suchej masy liścia, w zależności od odmiany i regionu [Wang i in. 2008a]. W przypadku katechin analizowanych w cytowanej pracy najwyższe stężenia zanotowano dla galusanu (-)-epigalokatechiny (EGCG) oraz (-)-epigalokatechiny (EGC) (odpowiednio 677,3–2198,2 i 94,3–524,6 mg/g s.m.). Pozostałe katechiny występowały w znacznie mniejszych ilościach. Peterson i inni [2005] przeanalizowali 90 publikacji naukowych (które spełniały wyznaczone kry-teria, m.in. zawierały wiarygodne dane na temat zawartości poszczególnych związ-ków określonej uznanymi metodami badawczymi), oceniających poziom poszcze-gólnych polifenoli w różnych komercyjnych herbatach, i podali wartości średnie uzyskane na podstawie analizy statystycznej tych wyników. Zawartość EGCG w komercyjnych herbatach zielonych kształtowała się w szerokim zakresie 11,8– –188 mg/g s.m., a EGC – w granicach 1–54,4 mg/g, co oznacza aż kilkudziesięcio-krotny spadek zawartości tych substancji w suchej masie liścia na skutek obróbki technologicznej. Podobną prawidłowość wykazano dla innych ważnych polifenoli – ich stężenie w produkcie znacząco odbiegało od wartości ustalonej dla wyjścio-wego surowca, jakim jest liść krzewu C. sinensis. Stężenie katechiny mieściło się w zakresie 0–0,8 mg/g suszu herbacianego wobec 0–12,0 mg/g w liściu wyjściowym, zaś epikatechiny – w granicach 1,9–20 mg/g wobec 21,3–110 mg/g [Henning i in. 2003, Peterson i in. 2005].

Zawartość polifenoli, a co za tym idzie potencjał antyoksydacyjny herbaty, za-leży nie tylko od technologii obróbki liści i rodzaju uzyskanej na końcu herbaty (czarna, oolong, zielona, czerwona, Pu-Erh), ale także od parametrów charaktery-zujących wyjściowy surowiec roślinny, stopnia jego rozdrobnienia, warunków trans-portu i przechowywania, czasu i krotności zaparzania czy temperatury użytej do tego wody [Astill i in. 2001, Henning i in. 2003, Labbe i in. 2006, Duda-Chodak i in. 2008, Dmowski i in. 2013, Pal i in. 2013]. Wang i inni [2008a] wykazali, że dla zawartości polifenoli i aktywności antyoksydacyjnej ważny jest nie tylko kraj, ale też konkretny region, ze względu na swoiste warunki glebowe, stopień nasłonecznienia czy ilość opadów. Co więcej, herbata wyprodukowana z surowca pochodzącego z tego same-go miejsca może charakteryzować się odmiennymi właściwościami antyoksydacyjny-mi w zależności od pory zbioru liści [Longo i in. 2008, Lee i in. 2014]. Także sposób suszenia liści może istotnie wpłynąć na potencjał antyoksydacyjny surowca. Longo i inni [2008] wykazali, że liście herbaty pochodzące z tego samego regionu, z tej samej odmiany krzewu Camellia sinensis i zbierane w tym samym czasie mogą mieć


kilkukrotnie mniej EGCG i galusanu epikatechiny (ECG), jeśli będą suszone na słońcu zamiast w specjalnym piecu.

Stężenie (+)-katechiny (CAT) wyznaczone metodą HPLC wynosiło 49,39 ± 9,80 mg/l ekstraktu (tab. 13), co – przy założeniu całkowitego przejścia tego związku z surowca do ekstraktu – odpowiada maksymalnie 0,49 mg/g s.m. liści zielonej herbaty. W porównaniu do wyników innych autorów są to zatem wartości przeciętne. Lee i inni [2014] określili zawartość CAT na poziomie 0,99– –2,48 mg/g liści, natomiast Henning i inni [2003] w niektórych zielonych herbatach w ogóle nie wykryli katechiny, podobnie jak Peterson i inni (0–0,8 mg/g s.m.) [2005]. Stężenie (-)-epigalokatechiny (EGC) w herbacie użytej do badań było dość duże i wynosiło 50,22 mg w przeliczeniu na 1 g s.m. liści, (-)-epikatechiny (ECAT) – 11,16 mg/g, a EGCG – 28,76 mg/g (w sumie wykryto 90,63 mg flawanoli/g her-baty). W analizowanej zielonej herbacie wykryto ponadto obecność takich związ-ków polifenolowych, jak kwas galusowy (w ilości 2,91 mg/g s.m.), apigenina (0,13), kemferol (0,25), rutyna (0,31), glukozyd kwercetyny (0,39) i kwercetyna (0,22) (tab. 13).

Wyniki większości badań wskazują, że dominującym polifenolem zielonej her-baty jest EGCG, a zaraz po nim EGC, choć w przypadku niektórych gatunków herbat ta kolejność jest odwrotna [Yashin i in. 2011]. Także w herbacie badanej w niniejszej pracy galusan (-)-epigalokatechiny występował w stężeniu mniejszym niż (-)-epigalokatechina, co może mieć kilka przyczyn niezależnych od odmiany i pochodzenia liści herbacianych. Po pierwsze, wynik taki może świadczyć o hydro-lizie związku i uwolnieniu kwasu galusowego. Kwas galusowy z łatwością odłącza się od cząsteczek galusanu (-)-epikatechiny i EGCG w reakcjach enzymatycznych katalizowanych przez tannazę, β-glukuronidazę typu H-2 lub sulfatazy bądź w reak-cjach nieswoistej hydrolizy wiązania estrowego w galusowych pochodnych katechin [Narumi i in. 2014]. Najbardziej prawdopodobnym źródłem tanazy jest zanieczysz-czenie liścia herbacianego mikroorganizmami wytwarzającymi ten enzym. Do naj-ważniejszych należą liczne gatunki pleśni z rodzajów Aspergillus i Penicillium oraz pojedyncze gatunki z rodzajów Trichoderma i Fusarium, drożdże, np. Candida sp. i Pichia sp. oraz bakterie, głównie jelitowe z rodzajów Lactobacillus i Bacillus [Belur i Mugeraya 2011, Lal i Gardner 2012, Mehta i in. 2013].

Katechiny w zielonej herbacie występują w postaci (-)-epiform (2R, 3R): galusanu (-)-epigalokatechiny (EGCG), galusanu (-)-epikatechiny (ECG) oraz (-)-epikatechiny (ECAT). Powszechnie wiadomo, że w wysokiej temperaturze oraz w warunkach beztlenowych zachodzi reakcja epimeryzacji do (-)-epiform (2S, 3R): galusanu (-)-galokatechiny (GCG), galusanu (-)-katechiny (CG) oraz (-)-ka-techiny (CAT) [Mika i in. 2009]. Choć ekstrakt użyty w doświadczeniach nie był poddawany działaniu wysokiej temperatury, to takiej reakcji nie można wykluczyć. Jednoczesny rozpad i epimeryzację EGCG w zakresie temperatur 25–100°C wy-kryli Wang i inni [2008b]. Poniżej 44°C dominował rozpad (przypuszczalnie przez


utlenienie) EGCG i galusanu galokatechiny (GCG), podczas gdy powyżej tej temperatury przeważała reakcja epimeryzacji GCG do EGCG, z kolei powyżej 98°C epimeryzacja EGCG do GCG była szybsza niż degradacja. Oznacza to, że w stosowanym w tej pracy ekstrakcie mogło dojść do samoistnego rozpadu EGCG i GCG.

Potwierdzenia, że katechiny obecne w zielonej herbacie ulegają także przemia-nom samoistnym, bez udziału mikroorganizmów i ich enzymów, dostarczają wyniki Friedmana i innych [2009]. Zanotowali oni, że już po 1-miesięcznym przechowywa-niu komercyjnych herbat, nawet w korzystnych warunkach (w ciemności, w tempe-raturze pokojowej), istotnie zmniejszał się poziom katechin, szczególnie najważniej-szych pochodnych: EGCG oraz ECG, i malał dalej w trakcie 6-miesięcznego doświadczenia. Z wcześniejszych badań wiadomo także, że EGCG w buforze TRIS o pH 7,2 ulega samoistnemu rozpadowi z wytworzeniem różnych pochodnych, m.in. chinonu EGCG czy dimeru EGCG [Sang i in. 2005]. Prawdopodobny mechanizm tej reakcji polega na utlenianiu EGCG przez tlen cząsteczkowy z wytworzeniem rodnika EGCG• oraz O2

•– w reakcji katalizowanej przez śladowe ilości jonów Cu2+ i Fe3+. Powstały rodnik reaguje z kolejną cząsteczką EGCG, wytwarzając następne rodniki i reaktywne formy tlenu (H2O2), co uruchamia reakcję łańcuchową. W jej efekcie powstają chinon EGCG, chinon dimeru EGCG oraz dimer EGCG. O udzia-le rodnika ponadtlenkowego w tej reakcji świadczy zahamowanie reakcji w obecno-ści dysmutazy ponadtlenkowej [Sang i in. 2007]. Ponieważ liście zielonej herbaty zawierają też jony metali, w tym miedzi (11,28–37,6 mg/kg) i żelaza (140–436 mg/kg) [Street i in. 2006], wydaje się dość prawdopodobne, że reakcja opisana przez Sanga i innych [2007] zaszła także w badanym ekstrakcie, co tłumaczyłoby stosunkowo małą zawartość EGCG.

Liczne badania wykazały, że galusowe pochodne katechin (ECG, GCG, EGCG) mają większą zdolność do zmiatania wolnych rodników niż pochodne niezawierają-ce reszty kwasu galusowego (EGC, GC, ECAT) [Henning i in. 2003, Wang i in. 2008b, Lee i in. 2014], co dowodzi, jak istotną rolę pełni ta grupa w pozycji C3 pierścienia C, w połączeniu z aktywnością grupy hydroksylowej przy C5’ pierście-nia B. Można byłoby zatem przyjąć, że – pod względem siły zmiatania rodników – ECG > ECAT oraz EGCG > EGC. Ustawiając występujące w herbacie katechiny zgodnie z malejącym potencjałem antyoksydacyjnym, Henning i inni [2003] otrzy-mali szereg: ECG > EGCG > ECAT = CAT > EGC. Z drugiej strony wykazano, że trans-katechiny (GCG, GC i CAT) mają wyższy potencjał zmiatania tlenu single-towego (1O2) niż cis-katechiny (EGCG, EGC i ECAT). Oznacza to, że potencjał antyoksydacyjny danego związku zależy od cząsteczki, z którą przyjdzie mu reagować [Wang i in. 2008b]. Również w tej sytuacji kolejność ta może się nieznacznie zmie-niać, w zależności od środowiska reakcji (warunki hydrofobowe czy hydrofilowe) oraz od metody badawczej użytej do ocenienia właściwości antyoksydacyjnych [Gramza i in. 2005, Wang i in. 2008b].

Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach diety...70Ta

bela

13.

Pro

fil z

wią

zków

pol

ifeno

low

ych

w e

kstr

akta

ch e

tano

low

ych

z cz

erw

onej

ceb

uli (

CC

), s

oi (

S), c

zosn

ku n

iedź

wie

dzie

go (

CN

), z

iela

po

krzy

wy

(PO

), o

woc

ów c

ytry

ńca

chiń

skie

go (

CC

H),

zie

lone

j her

baty

(G

T)

i spi

rulin

y (S

P) (

śred

nia

± S

D)

Tabl

e 13

. Pr

ofile

of

poly

phen

ol c

ompo

unds

in

etha

nolic

ext

ract

s fr

om r

ed o

nion

(C

C),

soy

bean

(S)

, be

ar’s

gar

lic (

CN

), n

ettle

her

b (P

O),

Sc

hisa

ndra

fru

its (

CC

H),

gre

en t

ea (

GT

), a

nd s

piru

lina

(SP)

(m

ean

± S

D)

Zw

iąze

k / C

ompo

und

CC

SC

NPO

CC

HG

TSP

Kw

as p

roto

kate

chow

yPr

otoc

atec

huic

aci

d

[mg/l

n.d.

0,72

± 0

,01

94,2

3 ±

11,

172,

49 ±

1,0

80,

65 ±

0,0

73,

35 ±

2,5

8n.

d.

Kw

as c

hlor

ogen

owy

Chl

orog

enic

aci

dn.

d.n.

d.24

,96±

1,59

1,58

± 0

,09

0,10

± 0

,05

n.d.

n.d.

Kw

as k

awow

y / C

affe

ic a

cid

10,1

2 ±

1,0

5n.

d.11

,61

± 0

,96

n.d.

0,49

± 0

,31

23,4

8 ±

3,5

4n.

d.

Kw

as p

-kum

arow

yp-

Cou

mar

ic a

cid

n.d.

4,58

± 0

,97

6,51

± 2

,14

0,18

± 0

,01

1,15

± 0

,71

n.d.

n.d.

Kw

as fe

rulo

wy

/ Fer

ulic

aci

d9,

08 ±

1,0

9n.

d.9,

30 ±

0,9

80,

17 ±

0,0

9n.

d.n.

d.n.

d.

Kw

as g

alus

owy

/ Gal

lic a

cid

5,08

± 0

,65

16,2

7 ±

3,2

284

,65

± 6

,59

12,5

4 ±

0,4

593

,67

± 1

1,10

291,

1 ±

36,

91,

28 ±

0,0

5

Kw

as e

lago

wy

/ Ella

gic

acid

0,85

± 0

,04

4,25

± 0

,52

20,1

5 ±

3,4

7n.

d.1,

05 ±

0,7

2n.

d.0,

24 ±

0,0

4

Api

geni

na /

Api

geni

nn.

d.0,

40 ±

0,2

30,

28 ±

0,0

10,

09 ±

0,0

1n.

d.12

,84

± 3

,39

0,66

± 0

,00

Api

geni

no-6

-C-g

luko

zyd

Api

geni

n-6-

C-g

luco

side

n.d.

n.d.

14,0

5 ±

1,6

924

,97

± 1

,79

n.d.

1,57

± 0

,69

0,49

± 0

,04

Api

geni

no-8

-C-g

luko

zyd

Api

geni

n-8-

C-g

luco

side

n.d.

2,19

± 0

,07

13,7

2 ±

3,2

233

,50

± 2

,87

n.d.

2,87

± 0

,99

4,38

± 0

,67

Flo

rydz

yna

/ Phl

orid

zin

9,17

± 2

,64

11,2

1 ±

1,9

694

,65

± 8

,43

98,2

0 ±

11,

506,

56 ±

3,2

4n.

d.29

,62

± 4

,66

Dai

dzei

no-7

-O-g

luko

zyd

Dai

dzei

n-7-

O-g

luco

side

n.d.

46,1

9 ±

8,1

4n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.

Dai

dzei

na

Dai

dzei

nn.

d.3,

52 ±

2,4

10,

02 ±

0,0

00,

04 ±

0,0

0n.

d.n.

d.n.

d.

4. Wyniki i dyskusja 71G

enis

tein

a / G

enis

tein

[mg/l

1,83

± 0

,39

2,29

± 1

,89

0,19

± 0

,02

0,24

± 0

,00

0,07

± 0

,05

0,94

± 0

,99

0,02

± 0

,00

Rez

wer

atro

l / R

esve

ratr

oln.

d.0,

05 ±

0,0

00,

66 ±

0,0

60,

25 ±

0,0

20,

07 ±

0,0

64,

42 ±

0,0

50,

57 ±

0,0

6

Proc

yjan

idyn

a B

1Pr

ocya

nidi

n B

1n.

d.1,

86 ±

0,0

940

3,9

± 2

9,9

73,2

0 ±

3,6

7n.

d.n.

d.26

,43

± 4

,28

Proc

yjan

idyn

a B

2Pr

ocya

nidi

n B

2n.

d.n.

d.13

4,8

± 8

,69

3,36

± 0

,69

n.d.

n.d.

11,9

1 ±

1,9

9

(-)-

Epi

galo

kate

chin

a(-

)-E

piga

lloca

tech

inn.

d.1,

00 ±

0,0

310

96 ±

152

,325

,46

± 1

,17

n.d.

5022

,3 ±

125

,0n.

d.

(+)-

Kat

echi

na(+

)-C

atec

hin

n.d.

n.d.

377,

0 ±

35,

23,

95 ±

0,6

8n.

d.49

,39

± 9

,80

n.d.

(-)-

Epi

kate

chin

a(-

)-E

pica

tech

inn.

d.n.

d.55

,15

± 3

,69

n.d.

n.d.

1116

,5 ±

167

,8n.

d.

Gal

usan

(-)

-epi

galo

kate

chin

y(-

)-E

piga

lloca

tech

in g

alla

ten.

d.n.

d.24

,52

± 1

,78

n.d.

n.d.

2876

,1 ±

156

,1n.

d.

Kw

erce

tyno

-3-O

-rut

ynoz

ydQ

uerc

etin

-3-O

-rut

inos

ide

n.d.

n.d.

138,

4 ±

8,8

747

,60

± 5

,28

0,92

± 0

,77

31,0

3 ±

9,1

4n.

d.

Kw

erce

tyno

-3-O

-glu

kozy

dQ

uerc

etin

-3-O

-glu

cosi

de0,

50 ±

0,2

29,

34 ±

1,0

950

,44

± 7

,85

n.d.

1,00

± 0

,37

39,3

6 ±

8,2

n.d.

Kw

erce

tyna

/ Q

uerc

etin

0,

08 ±

0,0

50,

05 ±

0,0

00,

07 ±

0,0

01,

28 ±

0,0

00,

41 ±

0,1

722

,16

± 4

,99

0,61

± 0

,37

Kem

fero

l / K

aem

pfer

oln.

d.0,

12 ±

0,0

31,

33 ±

0,3

91,

06 ±

0,0

10,

04 ±

0,0

224

,75

± 7

,33

3,81

± 0

,68

Del

finid

yno-

3-O

-glu

kozy

d*D

elph

inid

in-3

-O-g

luco

side

n.d.

n.d.

6,06

± 0

,56

2,98

± 0

,09

n.d.

n.d.

n.d.

Cyj

anid

yno-

3-O

-glu

kozy

dC

yani

din-

3-O

-glu

cosi

de8,

68 ±

0,4

9n.

d.n.

d.n.

d.6,

74 ±

0,0

9n.

d.n.

d.

Peon

idyn

o-3-

O-g

luko

zyd*

Peon

idin

-3-O

-glu

cosi

den.

d.n.

d.5,

23 ±

0,1

6n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.

n.d.

– s

tęże

nie

poni

żej p

rogu

det

ekcj

i / n

ot d

etec

ted

* w

prz

elic

zeni

u na

cyj

anid

yno-

3-O

-glu

kozy

d / e

xpre

ssed

as

cyan

idin

-3-O

-glu

cosi

de e

quiv

alen

ts


W prezentowanej pracy oznaczono bardzo wysokie wartości potencjału antyok-sydacyjnego, co można wyjaśnić wysokim stężeniem EGC i EGCG, a także obecno-ścią innych związków o aktywności przeciwutleniającej. Do polifenoli występujących w zielonej herbacie należą bowiem również nieoznaczane w tej pracy galusan epi-katechiny (ECG), o wysokim potencjale przeciwrodnikowym, oraz galusan katechi-ny (CG) i galusan galokatechiny (GCG).

Podsumowując uzyskane wyniki można stwierdzić, że zarówno Citrosept, jak i zielona herbata są szczególnie bogatymi źródłami związków polifenolowych o wy-sokim potencjale antyoksydacyjnym.

Jako stosunkowo bogate źródło przeciwutleniaczy na uwagę zasługują także sok z noni (424,5 ± 39,5 mg troloksu/100 ml) oraz ekstrakty z derenia, pigwowca, czar-nego bzu i czosnku niedźwiedziego (259–283 mg troloksu/100 ml) (tab. 10). Bardzo niską aktywnością przeciwrodnikową charakteryzowały się natomiast ekstrakty ze spiruliny (24,1 ± 1,2), czerwonej cebuli (43,2 ± 2,9), cytryńca chińskiego (54,0 ± 4,1) i soi (66,0 ± 9,0). Generalnie, siła zmiatania rodnika ABTS była dodatnio skorelo-wana z ilością polifenoli ogółem (R = 0,9904). Poza zieloną herbatą i Citroseptem, bardzo dużą zawartością polifenoli odznaczał się ekstrakt z czarnego bzu (883,1 ± 119 mg katechiny/100 g ś.m.), czemu odpowiadał znaczący potencjał AOX. W przypadku ekstraktu z jagód goji i ziela pokrzywy duża zawartość polifenoli (od-powiednio 810,6 i 618,9 mg katechiny/100 g) nie korespondowała z aktywnością antyoksydacyjną (197,2 i 107,1 mg troloksu/100 ml), co sugeruje dominację związków polifenolowych o niskim potencjale AOX. Z kolei w soku z noni zawartość polife-noli była stosunkowo niewielka, jednak jego potencjał antyoksydacyjny był wysoki, co – podobnie jak w przypadku derenia i pigwowca – wskazuje na obecność innych niż polifenole substancji o zdolności zmiatania rodnika ABTS, np. witaminy C, karotenoidów czy tokoferoli.

W soku z noni zidentyfikowano jedynie nieznaczne ilości kwasów fenolowych, głównie galusowego i protokatechowego, a także rutynę i procyjanidynę B1 (tab. 12). Pozostałe polifenole występowały w ilościach śladowych (lub poniżej możliwości detekcji zastosowanej metody). Zgodnie z danymi literaturowymi, owoce noni zawierają blisko 200 aktywnych składników, przy czym najważniejsze z nich to rzadko spotykane w innych roślinach związki fenolowe, przede wszystkim z grupy antrachinonów (damnakantal, morindon, morindina, aukubina, asperulozyd, sko-poletyna, rubiadyna, alizaryna), glikozydy antrachinonów, lignany oraz flawonoidy i ich glikozydy (głównie kemferol, kwercetyna i rutyna) [Pawlus i Kinghorn 2007, Singh 2012]. Ponadto noni zawiera kwasy tłuszczowe (głównie ursolowy, linolowy, kaprylowy i kapronowy) i ich pochodne oraz alkaloidy, irydoidy, sporo białka (ok. 11% suchej masy) i minerałów (8,4% s.m., głównie potas, siarkę, wapń, fosfor), witaminę C, E, karotenoidy oraz składniki lotne [Potterat i Hamburger 2007, Singh 2012].


Bogactwo związków bioaktywnych przekłada się na duży potencjał antyoksyda-cyjny. Co ważne, noni zawiera w swym składzie przeciwutleniacze zarówno lipofilo-we (antrachinony, karotenoidy, witamina E), jak i hydrofilowe. Może więc oddzia-ływać na organizm i komórki niejako kompleksowo. W skład owoców noni wchodzą także enzymy antyoksydacyjne, takie jak SOD, katalaza, peroksydaza czy reduktaza glutationowa [Srinivasahan i Dubairaj 2014]. Bramorski i inni [2010] oceniali po-tencjał antyoksydacyjny i zawartość polifenoli ogółem w komercyjnym preparacie soku z noni, zawierającym w swoim składzie także 5% soku z borówek i winogron, i stwierdzili, że sok z noni zawiera znacznie mniej polifenoli ogółem (i ma niższy potencjał antyoksydacyjny) niż czysty sok z borówek i mniej więcej tyle samo, co czysty sok winogronowy. Z kolei Elizabeth i Murugesan [2012] wykazali, że meta-nolowe ekstrakty z korzeni noni mają zdolność neutralizacji H2O2 oraz zmiatania rodników O2

•– i NO•. Owoce noni mają przeciętny potencjał antyoksydacyjny, po-równywalny z potencjałem pomarańczy lub mandarynek, lecz możliwość ich działa-nia zarówno w fazie hydrofobowej, jak i hydrofilowej komórki jest bezcenna. Właściwości te próbuje się wykorzystać m.in. w leczeniu nowotworów [Gupta i Patel 2013]. Etanolowy ekstrakt z owoców noni (50%) charakteryzuje się zdolnością zmia-tania rodnika ABTS porównywalną ze zdolnością witaminy C (w takim samym stężeniu), ale ma blisko 4-krotnie większy potencjał redukujący [Srinivasahan i Dubairaj 2014]. Zdolność do redukcji Fe(III), zależna od możliwości oddania atomów wodoru, jest znacznie większa w przypadku ekstraktu zawierającego różne polifenole niż czystego kwasu askorbinowego.

Bramorski i inni [2010] określili zawartość polifenoli ogółem w soku z noni na poziomie 91 mg (w przeliczeniu na kwas galusowy)/100 ml soku. W prezentowanej pracy sumaryczna zawartość związków polifenolowych wynosiła prawie 109 mg (w przeliczeniu na katechinę)/100 ml soku i była wyższa o ok. 20–30% od zawarto-ści polifenoli w ekstraktach z owoców czarnego bzu oraz jagód goji (tab. 10). Należy przy tym zaznaczyć, że sok z noni, stosowany w badaniach, był gotowym produktem komercyjnym (zgodnie z deklaracją producenta, był to 100-procentowy sok wyciska-ny bezpośrednio z owoców, a zatem nierozcieńczany i nieodtwarzany z koncentratu). Ekstrakty z czarnego bzu i jagód goji natomiast były przygotowywane zgodnie z pro-porcją 10 g owoców w formie „konsumpcyjnej” (świeży owoc bzu i suszone jagody goji) na końcową objętość 100 ml ekstraktu. Biorąc te fakty pod uwagę, można wysnuć wniosek, że zawartość polifenoli w noni była jednak mniejsza niż w jagodach goji. Zawartość 81 mg polifenoli w 100 ml ekstraktu z suszonych jagód goji odpo-wiada 8,1 mg polifenoli (w przeliczeniu na katechinę) na 1 g suchej masy. Otrzymany wynik jest niższy od wartości podanej przez Tarkę i innych [2013], czyli 14,31 mg katechiny/g s.m., dotyczącej jednak ekstrakcji metanolem. Wpływ rozpuszczalnika na wydajność ekstrakcji związków polifenolowych z owoców goji opisano już wcześ-niej [Ionică i in. 2012]. Stwierdzono wówczas, że zawartość polifenoli ogółem w 1 g suszonych jagód goji wynosi między 0,18 a 4,14 równoważników kwasu galusowego


(GAE), w zależności od rozpuszczalnika użytego do ekstrakcji, przy czym najmniej polifenoli wyekstrahowano acetonem, a najwięcej przy użyciu 2-procentowego HCl. Co ciekawe, inaczej niż w przypadku owoców suszonych, dla świeżych jagód goji najwydajniejszym rozpuszczalnikiem był 80-procentowy etanol, a zawartość polife-noli ogółem oznaczona w takim ekstrakcie wynosiła 1,74 GAE/g, podczas gdy przy użyciu acetonu uzyskano 0,09 GAE/g. Widać zatem wyraźnie, że porównywanie wyników otrzymanych w różnych laboratoriach jest trudne, gdyż (podobnie jak w przypadku herbaty zielonej) zawartość polifenoli zależy nie tylko od miejsca po-chodzenia owoców i sposobu ich przetworzenia (świeże, suszone), ale przede wszyst-kim od zastosowanej metody ekstrakcji związków polifenolowych. W zależności od użytego ekstrahenta, do roztworu przechodzą różne związki, co ma wpływ na ich profil, a co za tym idzie także na ogólną ilość polifenoli oraz na ich aktywność an-tyoksydacyjną, gdyż każdy związek inaczej reaguje z odczynnikiem Folina-Ciocalteu i ma inne właściwości przeciwrodnikowe. Świetnie to widać na przykładzie badań przeprowadzonych przez takie zespoły, jak Chao i inni [2014] oraz Lin i inni [2013]. Ci pierwsi określili zawartość polifenoli ogółem w owocach goji na poziomie 9,24 mg GAE/g s.m., z kwercetyną jako dominującym flawonolem (12,3 mg/g s.m.) oraz brakiem myrycetyny, kemferolu i moryny. Drugi zespół wykazał natomiast nie tylko znacznie wyższą zawartość polifenoli ogółem (25 mg GAE/g liofilizowanych owoców goji), ale także brak kwercetyny, kemferolu i moryny, za to obecność myrycetyny w ilości 0,32 mg/g s.m. W suszonych jagodach goji, ocenianych w niniejszej pracy, wykryto kilkadziesiąt związków, z których zidentyfikowano kilkanaście, głównie rutynę, glukozyd kwercetyny, procyjanidynę B1, florydzynę i glukozyd apigeniny oraz kwasy galusowy, chlorogenowy, elagowy, protokatechowy i p-kumarowy (tab. 14). Inni autorzy stwierdzili, że głównymi polifenolami owoców goji w ekstrakcie wodnym są rutyna i kwas chlorogenowy, w ekstrakcie uzyskanym za pomocą 50-procentowe-go etanolu – rutyna i kwas protokatechowy, zaś w 95-procentowym etanolu – ruty-na [Qian i in. 2004]. Ilość flawonoidów w tych ekstraktach wynosiła odpowiednio 1154, 1207 i 1497 µg/g. Wspomniani autorzy wykazali także wzrost zdolności zmia-tania rodnika DPPH wraz z rosnącą zawartością etanolu. W innym doświadczeniu uzyskano przeciwne wyniki. Jednym z bardziej popularnych sposobów konsumpcji jagód goji w Chinach jest jej moczenie w alkoholu; wykazano, że zastosowanie wyż-szych stężeń alkoholu (55 i 65%) niekoniecznie zwiększa potencjał antyoksydacyjny uzyskanych nalewów, promuje bowiem przechodzenie do maceratu flawonoidów, podczas gdy przy niższych stężeniach alkoholu (15 i 25%) przechodzi do niego głównie betaina (metabolit choliny) [Song i Xu 2012]. Wynik ten może jednak być efektem zastosowania do oceny potencjału antyoksydacyjnego rodnika DPPH, któ-ry pozwala na ocenę jedynie przeciwutleniaczy hydrofobowych, w przeciwieństwie do rodnika ABTS, który reaguje zarówno z przeciwutleniaczami hydrofobowymi, jak i hydrofilowymi. Dominująca w nalewach o niskim stężeniu etanolu betaina może ze względu na swoją strukturę zachowywać się zarówno jak związek hydrofobowy,


jak i hydrofilowy, dlatego będzie sztucznie zawyżać wynik. Z kolei flawonoidy, w więk-szości hydrofilowe, nie będą reagowały z DPPH.

Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów metanolowych z suszonych owoców goji, określony przez Tarkę i innych [2013], wynosił 43,73 mg troloksu/g s.m. owocu, co było wynikiem ponad dwukrotnie wyższym niż uzyskano w tej pracy dla ekstraktu etanolowego (19,72 mg troloksu/g) (tab. 10). Luo i inni [2004] natomiast otrzymali inne wyniki i wykazali odwrotną prawidłowość: aktywność antyoksydacyjna ekstrak-tów metanolowych z suszonych jagód goji wynosiła 1,00 mg troloksu/g s.m. i była niższa o 25% niż w przypadku ekstraktów etanolowych. Wyraźnie zatem widać, że trudno jest porównywać wyniki, które uzyskano przy zastosowaniu odmiennych metod ekstrakcji.

Należy podkreślić, że za potencjał antyoksydacyjny owoców goji odpowiadają nie tylko polifenole. Jednym z ważniejszych przeciwutleniaczy, obecnych w tych owocach, jest witamina C, której zawartość w suszonych jagodach goji Ionică i inni [2012] szacują na 460 µg/g. Badacze ci zanotowali, że etanolowe ekstrakty z suszo-nych jagód goji zmiatały w ciągu 10 minut ponad 40% rodnika DPPH, natomiast ekstrakty przygotowane za pomocą 2-procentowego kwasu solnego – aż 90%, co wskazuje na duże znaczenie witaminy C (która w roztworach etanolowych ulega szybszemu rozkładowi) dla właściwości antyoksydacyjnych goji. W skład jagód goji wchodzą także liczne polisacharydy (L. barbarum polysaccharides – LBP), o istot-nej aktywności antyoksydacyjnej, radioprotekcyjnej, antynowotworowej, immuno-modulującej, przeciwcukrzycowej czy ochronnej względem wątroby, serca i układu nerwowego [He i in. 2012, Jin i in. 2013]. Do najważniejszych monocukrów budu-jących LBP należą D-mannoza, L-ramnoza, kwas D-glukuronowy, kwas D-galakturonowy, D-glukoza, D-ksyloza, D-galaktoza i L-arabinoza, przy czym ilościowo dominują kwas D-galakturonowy, D-galaktoza i L-arabinoza [He i in. 2012]. Wykazano, że większość z poznanych LBP, w stężeniach w zakresie 500– –1000 µg/ml, wydajnie zmiata rodniki ponadtlenkowy, hydroksylowy oraz DPPH i ABTS [Lin i in. 2009, Amagase i Farnsworth 2011, He i in. 2012]. LBP hamuje także reakcję peroksydacji lipidów i ma znaczący potencjał redukujący [He i in. 2012]. Kolejne ważne składniki bioaktywne w jagodach goji to karotenoidy (głów-nie dipalmitynian zeaksantyny w stężeniu 1,1 mg/g [Amagase i Farnsworth 2011]), aminokwasy (głównie glutamina i asparagina), witaminy i minerały (K, Ca, Zn, Fe, Co, Mn, Se, Mg) [Amagase i Farnsworth 2011, Jin i in. 2013], z których część dzia-ła także jako przeciwutleniacze.

Wykazano, że frakcja flawonoidów wyizolowanych z goji jest bardziej wydajna w zmiataniu rodników DPPH i ABTS oraz chelatowaniu jonów metali, a także wykazuje silniejszy potencjał redukujący niż frakcje karotenoidów czy polisacharydów, natomiast frakcje zeaksantynowa oraz polisacharydowa są efektywniejsze w zmiata-niu wolnych rodników, odpowiednio hydroksylowego i ponadtlenkowego [Wang i in. 2010].


bela

14.

Pr

ofil

zwią

zków

pol

ifeno

low

ych

w e

kstr

akta

ch e

tano

low

ych

z ow

oców

żur

awin

y (Ż

), b

orów

ki b

rusz

nicy

(B

), d

eren

ia ja

daln

ego

(D),

cz

arne

go b

zu (

BE

Z),

mal

in (

M),

goj

i (G

) or

az p

igw

owca

japo

ński

ego

(P)

(śre

dnia

± S

D)

Tabl

e 14

. Pr

ofile

of

poly

phen

ol c

ompo

unds

in

etha

nolic

ext

ract

s fr

om c

ranb

erry

(Ż

), l

ingo

nber

ry (

B),

cor

nelia

n ch

erry

(D

), e

lder

berr

y (B

EZ

), r

aspb

erry

(M

), g

oji (

G),

and

Jap

anes

e qu

ince

(P)

fru

its (

mea

n ±

SD

)

Zw

iąze

k / C

ompo

und

ŻB

DB

EZ

MG

P

Kw

as p

roto

kate

chow

yPr

otoc

atec

huic

aci

d

[mg/l]

0,49

± 0

,11

3,60

± 0

,31

n.d.

0,26

± 0

,80

n.d.

2,87

± 0

,31

0,09

± 0

,02

Kw

as c

hlor

ogen

owy

Chl

orog

enic

aci

d0,

05 ±

0,0

10,

27 ±

0,1

10,

04 ±

0,1

03,

41 ±

2,4

10,

08 ±

0,0

34,

69 ±

0,0

20,

40 ±

0,1

0

Kw

as k

awow

y / C

affe

ic a

cid

5,05

± 0

,76

0,03

± 0

,02

0,61

± 0

,31

n.d.

n.d.

n.d.

0,47

± 0

,36

Kw

as p

-kum

arow

yp-

Cou

mar

ic a

cid

0,76

± 0

,31

n.d.

n.d.

3,91

± 2

,71

n.d.

0,55

± 0

,02

0,24

± 0

,00

Kw

as fe

rulo

wy

/ Fer

ulic

aci

d0,

34 ±

0,1

30,

66 ±

0,1

20,

02 ±

0,4

50,

43 ±

0,2

9n.

d.n.

d.0,

01 ±

0,0

6

Kw

as g

alus

owy

/ Gal

lic a

cid

1,32

± 0

,36

22,7

3 ±

3,6

918

,19

± 6

,88

11,0

2 ±

1,8

129

,9 ±

4,0

877

,51

± 9

,87

13,7

2 ±

3,3

3

Kw

as e

lago

wy

/ Ella

gic

acid

3,02

± 0

,09

0,12

± 0

,02

0,38

± 0

,08

3,55

± 4

,24

8,90

± 1

,44

2,32

± 0

,00

0,74

± 0

,19

Api

geni

na /

Api

geni

nn.

d.0,

09 ±

0,0

30,

09 ±

0,0

2n.

d.n.

d.0,

08 ±

0,0

0n.

d.

Api

geni

no-6

-C-g

luko

zyd

Api

geni

n-6-

C-g

luco

side

0,24

± 0

,05

1,07

± 0

,33

0,08

± 0

,89

2,70

± 1

,32

0,37

± 0

,17

4,98

± 1

,66

3,68

± 0

,03

Api

geni

no-8

-C-g

luko

zyd

Api

geni

n-8-

C-g

luco

side

1,04

± 0

,69

1,06

± 0

,47

0,78

± 0

,06

0,21

± 0

,24

n.d.

n.d.

0,01

± 0

,08

Flo

rydz

yna

/ Phl

orid

zin

20,8

8 ±

2,4

519

,53

± 3

,58

14,2

± 6

,45

13,4

6 ±

8,4

415

,68

± 3

,65

18,2

6 ±

3,9

722

,78

± 3

,54

Rez

wer

atro

l / R

esve

ratr

ol0,

02 ±

0,0

20,

10 ±

0,0

10,

09 ±

0,1

00,

76 ±

0,5

60,

12 ±

0,0

80,

28 ±

0,0

1n.

d.

Proc

yjan

idyn

a B

1Pr

ocya

nidi

n B

1n.

d.n.

d.31

,24

± 7

,44

26,6

1 ±

12,

51n.

d.20

,17

± 6

,69

n.d.

4. Wyniki i dyskusja 77Pr

ocyj

anid

yna

B2

Proc

yani

din

B2

[mg/l]

n.d.

13,7

7 ±

4,1

5n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.

(+)-

Kat

echi

na(+

)-C

atec

hin

2,7

± 1

,24

64,7

2 ±

5,6

80,

02 ±

2,6

0n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.

Gal

usan

(-)

-epi

galo

kate

chin

y(-

)-E

piga

lloca

tech

in g

alla

ten.

d.n.

d.n.

d.1,

95 ±

0,9

8n.

d.n.

d.n.

d.

Kw

erce

tyno

-3-O

-rut

ynoz

ydQ

uerc

etin

-3-O

-rut

inos

ide

n.d.

1,62

± 0

,66

n.d.

89,3

2 ±

30,

143,

19 ±

0,8

220

,82

± 2

,85

0,02

± 0

,12

Kw

erce

tyno

-3-O

-glu

kozy

dQ

uerc

etin

-3-O

-glu

cosi

den.

d.n.

d.3,

17 ±

23,

0010

,29

± 2

,32

1,44

± 0

,23

7,71

± 0

,79

12,2

1 ±

5,9

3

Kw

erce

tyna

/ Q

uerc

etin

n.

d.0,

18 ±

0,0

30,

14 ±

0,0

92,

32 ±

1,5

60,

07 ±

0,0

00,

04 ±

0,0

10,

06 ±

0,6

8

Kem

fero

l / K

aem

pfer

oln.

d.0,

03 ±

0,0

10,

23 ±

0,0

30,

12 ±

0,0

50,

08 ±

0,0

20,

05 ±

0,0

1n.

d.

Cyj

anid

yno-

3-O

-sam

bubi

ozyd

*C

yani

din-

3-O

-sam

bubi

osid

en.

d.n.

d.n.

d.68

4,3

± 3

8,90

n.d.

n.d.

n.d.

Cyj

anid

yno-

3-O

-glu

kozy

dC

yani

din-

3-O

-glu

cosi

de16

,17

± 0

,98

16,4

2 ±

2,5

122

,6 ±

1,6

940

4,4

± 2

5,10

56,1

1 ±

3,1

1n.

d.n.

d.

Cyj

anid

yno-

3,5-

di-O

-glu

kozy

d*C

yani

din-

3,5-

di-O

-glu

cosi

de0,

01 ±

0,0

10,

02 ±

0,0

0n.

d.21

8,0

± 2

1,10

n.d.

n.d.

n.d.

Pela

rgon

idyn

o-3-

O-g

luko

zyd*

Pela

rgon

idin

-3-O

-glu

cosi

den.

d.n.

d.n.

d.7,

64 ±

2,1

6n.

d.n.

d.n.

d.

Peon

idyn

o-3-

O-g

luko

zyd*

Peon

idin

-3-O

-glu

cosi

den.

d.1,

80 ±

0,5

9n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.n.

d.

n.d.

– s

tęże

nie

poni

żej p

rogu

det

ekcj

i / n

ot d

etec

ted

* w

prz

elic

zeni

u na

cyj

anid

yno-

3-O

-glu

kozy

d / e

xpre

ssed

as

cyan

idin

-3-O

-glu

cosi

de e

quiv

alen

ts


Ogólna zawartość polifenoli w owocach czarnego bzu, oznaczona w tej pracy, wyniosła 883,1 ± 119 mg katechiny/100 g ś.m. owocu. Dla gatunku Sambucus nigra wykazano bardzo dużą sezonową zmienność w obrębie tego parametru [Lee i Finn 2007]. W kolejnych dwóch latach zawartość polifenoli ogółem wahała się w zakresie 387–582 mg GAE/100 g ś.m. dla odmiany Korsør oraz 364–510 mg GAE/100 g ś.m. dla odmiany Haschberg. Poziom polifenoli jest zatem znacznie mniej zależny od odmiany rośliny niż od warunków klimatycznych sezonu, w którym dojrzewały owo-ce [Lee i Finn 2007].

W prezentowanej pracy wykazano, że owoce czarnego bzu były bardzo bogatym źródłem flawonoidów, w szczególności rutyny (89,32 ± 30,14 mg/l 10% ekstraktu, co odpowiada 89,32 ± 30,14 mg/100 g ś.m. wyjściowego surowca), procyjanidyny B1 (ok. 26,6), florydzyny (ok. 13,5) i izokwercetyny (ok. 10,3), jak również kwasów fe-nolowych, przede wszystkim kwasu galusowego (ok. 11 mg/100 g ś.m.) oraz kwasów p-kumarowego, chlorogenowegoi elagowego (każdy na poziomie 3–4 mg/100 g ś.m.) (tab. 14). Lee i Finn [2007] stwierdzili, że do polifenoli dominujących w pokrewnym gatunku amerykańskiego bzu (S. canadensis) należą kwasy neochlorogenowy i chlo-rogenowy oraz rutyna i izoramnetyno-3-O-rutynozyd, natomiast w bzie europejskim (S. nigra) dominują kwas chlorogenowy (ok. 26–36 mg/100 g ś.m.) i rutyna (43– –96 mg/100 g ś.m., w zależności od odmiany i sezonu). Wyniki te nieznacznie się różnią od uzyskanych w tej pracy, co może wynikać z zastosowania innego rozpusz-czalnika (kwaśny metanol wobec 80-procentowego etanolu), a także innej odmiany owocu oraz odmiennych warunków klimatycznych i agrotechnicznych. W owocach czarnego bzu występują również, nieoznaczane w tej pracy, oligomeryczne proanto-cyjanidyny (w ilości 1–5 mg/100 g ś.m.) [Määttä-Riihinen i in. 2004], nie spotyka się w nich natomiast (w przeciwieństwie do innych ciemnych jagód) proantocyjanidyn wysoko spolimeryzowanych, o zawartości powyżej 7 monomerów [Wu i in. 2004]. Do ważnych składników przeciwutleniających w tych owocach niewątpliwie należą antocyjany. W niniejszej pracy niektóre z nich zostały zidentyfikowane (na podstawie czasu retencji), a ich stężenie wyrażono w równoważnikach cyjanidyno-3-O-gluko-zydu (cy-3-glc). Główne antocyjany wykryte w owocach wykorzystanego do badań czarnego bzu to cyjanidyno-3-O-glukozyd (występujący w stężeniu 404,4 mg/100 g ś.m.), cyjanidyno-3-O-sambubiozyd (684,3 mg cy-3-glc/100 g ś.m.), cyjanidyno-3,5-di-O--glukozyd (218,0) i pelargonidyno-3-O-glukozyd (7,64) (tab. 14). Uzyskane wartości znajdują się w zakresach podawanych we wcześniejszych doniesieniach innych au-torów, co więcej, potwierdzają, że wykorzystane w tej pracy owoce należały do S. nigra, tj. bzu europejskiego. Lee i Finn [2007] wykazali bowiem, że różne odmia-ny S. nigra charakteryzują się znacznie większym stężeniem cyjanidyno-3-O-sambu-biozydu (122–269 mg cy-3-glc/100 g ś.m.) i cyjanidyno-3-O-glukozydu (205–481 mg cy-3-glc/100 g ś.m.) niż każda z ośmiu badanych przez nich odmian bzu amerykań-skiego (S. canadensis) (odpowiednio 1,7–39,4 i 0,3–63 mg cy-3-glc/100 g ś.m.). Oprócz związków zidentyfikowanych w tej pracy, w odmianach europejskich wykryli oni


także cyjanidyno-3-O-rutynozyd, cyjanidyno-3-O-sambubiozyd-5-O-glukozyd oraz śladowe ilości pelargonidyno-3-O-glukozydu i cyjanidyno-3-O-rutynozydu [Lee i Finn 2007]. Te dwa ostatnie związki nie występowały natomiast w bzie amerykańskim (S. canadensis), w którym z kolei obecne były acylowane glukozydy antocyjanin, m.in. cyjanidyno-3-(Z)-p-kumarylo-glukozyd, cyjanidyno-3-p-kumarylo-sambubiozyd, cyjanidyno-3-(E)-p-kumarylo-sambubiozyd-5-glukozyd [Lee i Finn 2007]. Wyraźnie więc widać, że rodzaj i stężenie antocyjanów zależą od gatunku i odmiany czarnego bzu. Wu i inni [2004] stwierdzili, że stężenie cyjanidyno-3-O-glukozydu w S. nigra jest wyższe niż cyjanidyno-3-O-sambubiozydu i wynosi 740 wobec 546 mg cy-3- -glc/100 g ś.m. Ponadto w owocach zidentyfikowali oni nieznaczne ilości cyjanidyno--3-O-rutynozydu, pelargonidyno-3-O-glukozydu i pelargonidyno-3-O-sambubiozydu.

Czarny bez jest jednym z najskuteczniejszych „domowych” farmaceutyków sto-sowanych w infekcjach grypowych. Metoda wydajnej ekstrakcji aktywnych składników o działaniu przeciwwirusowym została opatentowana, a gotowy preparat jest sprze-dawany pod nazwą Sambucol®. Oprócz właściwości antywirusowych, składniki te – zarówno flawonoidy i kwasy fenolowe, jak i antocyjany – mają znaczący potencjał przeciwrodnikowy. Spośród 14 antocyjanów, które analizowali Wang i inni [1997], najwyższym potencjałem antyoksydacyjnym charakteryzował się cyjanidyno-3-O--glukozyd, wykazując 3,5-krotnie silniejsze działanie przeciwrodnikowe od analogu witaminy E. W prezentowanej pracy potencjał antyoksydacyjny etanolowego eks-traktu z owoców czarnego bzu wynosił 279,0 ± 13,0 mg troloksu/100 ml (co odpo-wiada 11,15 ± 0,52 mmol równoważników troloksu w 100 g ś.m. owoców) i był porównywalny z potencjałem ekstraktów z derenia i pigwowca (tab. 10). Wu i inni [2004] oznaczyli potencjał antyoksydacyjny przeciwutleniaczy hydrofilowych i hydro-fobowych obecnych w czarnym bzie. Ten pierwszy wynosił 14,5 mmol TE/100 g ś.m. i był porównywalny z potencjałem oznaczonym dla aronii (15,82), natomiast poten-cjał antyoksydacyjny związków hydrofobowych był znacznie niższy (0,197 i 0,242 mmol TE/100 g, odpowiednio dla bzu i aronii), przy czym i tak była to jedna z największych wartości spośród wyznaczonych przez autorów dla badanych przez nich ciemnych jagód [Wu i in. 2004].

Jak już wspomniano powyżej, potencjał antyoksydacyjny bzu czarnego był po-równywalny do potencjału derenia (283,0 ± 64,5 mg troloksu/100 ml) i pigwowca (282,4 ± 2,1 mg troloksu/100 ml), jednak zawartość polifenoli w tych owocach była dwukrotnie mniejsza niż w bzie (odpowiednio 426,4 i 474,1 wobec 883,1 mg kate-chiny/100 g ś.m.). Owoce te znacząco się też różniły składem polifenolowym. Spo - śród fenolokwasów jedynie kwas galusowy występował w znacznym stężeniu (18,19 ± 6,88 mg/100 g ś.m. w dereniu i 13,72 ± 3,33 mg/100 g ś.m. w pigwowcu), natomiast pozostałe kwasy wykrywano w śladowych ilościach (< 1 mg/100 g ś.m.) lub wcale ich nie wykryto (tab. 14). W grupie flawonoidów, rutyna dominowała w czarnym bzie, wcale nie występowała w dereniu, a jedynie w śladowej ilości była obecna w pigwowcu. W dereniu, podobnie jak w czarnym bzie, wykryto znaczną ilość


procyjanidyny B1 (31,24 ± 7,44 mg/100 g ś.m.) oraz cyjanidyno-3-O-glukozydu (22,6 ± 1,69), podczas gdy w pigwowcu nie stwierdzono obecności tych związków. W obydwu owocach natomiast zidentyfikowano florydzynę i izokwercetynę, w stę-żeniach odpowiednio około 14,2 i 3,2 mg/100 g ś.m. (dereń) oraz 22,8 i 12,2 mg/100 g ś.m. (pigwowiec).

Najmniej polifenoli ogółem oznaczono w ekstrakcie z czerwonej cebuli (Allium cepa), który miał także jedną z najniższych spośród badanych surowców aktywność antyoksydacyjną (tab. 10), wynoszącą zaledwie 43,2 ± 2,9 mg troloksu/100 ml (co odpowiadałoby 1,73 mmol TE/100 g ś.m. przy założeniu 100-procentowej wydajno-ści ekstrakcji przeciwutleniaczy z surowca). Wartość ta była też niższa od podawanych w literaturze. Lu i inni [2011] wyznaczyli wartość TEAC czerwonej cebuli na pozio-mie 2,82 mmol TE/100 g ś.m. Również zawartość polifenoli na poziomie 90,5 mg katechiny/100 g ś.m. jest wynikiem zaskakującym. Lu i inni [2011] wykazali, że za-wartość polifenoli ogółem w cebuli czerwonej wynosi 428 mg GAE/100 g ś.m. Generalnie, cebula jest uznawana za bardzo bogate źródło polifenoli. Lanzotti [2006] stwierdził, że w najwyższych stężeniach występują w niej kwercetyna (149,7 mg/100 g), kemferol (83,2) i luteolina (39,1). W czerwonej cebuli (zwłaszcza jej zewnętrznych łuskach) wykrywano też antocyjany. Pochodne cyjanidyny stanowiły zwykle ponad 50% obecnych w cebuli antocyjanów, jednak podczas przechowywania dochodziło do znacznej straty zawartości tych związków [Gennaro i in. 2002]. Na uwagę zasłu-guje przede wszystkim brak wykrywalnych ilości antocyjanów w cebuli użytej do analiz w tej pracy; jedynie w przypadku cyjanidyno-3-O-glukozydu ilość związku przekroczyła próg detekcji (tab. 13).

Kwercetyna w cebuli występuje głównie w postaci glikozydów, przy czym są to zwykle niespotykane w innych owocach i warzywach glikozydy kwercetyny. Występowanie flawonoidów w formie glikozydów może tłumaczyć dość niski poten-cjał antyoksydacyjny, gdyż powszechnie wiadomo, że glikozydy są słabszymi prze-ciwutleniaczami niż odpowiadające im aglikony. Ponad 80% flawonoli w cebuli stanowi kwercetyno-4’-O-glukozyd oraz kwercetyno-3,4’-di-O-glukozyd; w nieznacz-nych lub śladowych ilościach wykrywano także kwercetyno-3-O-glukozyd, kwercety-no-7,4’-di-O-glukozyd, kwercetyno-3,7,4’-tri-O-glukozyd oraz izoramnetyno-4’-O--glukozyd i izoramnetyno-3,4’-di-O-glukozyd [Rhodes i Price 1996, Lanzotti 2006, Beesk i in. 2010]. W prezentowanej pracy nie dysponowano standardami pozwala-jącymi na identyfikację tych flawonoli, niemniej jednak podczas analizy HPLC i de-tekcji przy λ = 360 nm wykryto kilka związków, których stężenia (w kolejności wymywania z kolumny) wyrażone w równoważnikach kwercetyny (QE) wynosiły: 18,2, 0,38, 0,22, 28,9, 1,62 i 0,08 mg QE/100 g ś.m. Na podstawie dostępnej litera-tury [Rhodes i Price 1996, Beesk i in. 2010] można przyjąć, że najwyższe stężenia reprezentują prawdopodobnie kwercetyno-3,4’-di-O-glukozyd i kwercetyno-4’-O--glukozyd, zaś w niższych stężeniach występują kwercetyno-7,4’-di-O-glukozyd, kwer-cetyno-3-O-glukozyd, kwercetyna i kemferol. Łączna zawartość flawonoli wynosiła


prawie 50 mg QE/100 g ś.m. Beesk i inni [2010] stwierdzili, że w skórce cebuli do-minuje monoglukozyd kwercetyny, a w warstwach wewnętrznych głównym flawono-idem jest diglukozyd kwercetyny. Wykazali także duże zróżnicowanie stężeń mono- i diglukozydów kwercetyny w zależności od odmiany. W wewnętrznych warstwach cebuli czerwonej stężenie monoglukozydu kształtowało się w zakresie od niewykry-walnego (w odmianie ‘Vaugirad’) do 560 mg/100 g s.m. (‘Red Baron Eco’), zaś di-glukozydu – od 20 (‘Vaugirad’) do 740 mg/100 g s.m. (‘Red Baron’) [Beesk i in. 2010].

W czerwonej cebuli użytej do doświadczeń w tej pracy zidentyfikowano także kwasy fenolowe, głównie kawowy, ferulowy i galusowy (tab. 13). Nie stwierdzono natomiast obecności, często wykazywanych w tym warzywie, kwasów protokatecho-wego i p-kumarowego. Singh i inni [2009] udowodnili, że detekcja i stężenie po-szczególnych polifenoli w suchych ekstraktach z cebuli zależy od użytego rozpusz-czalnika. Frakcja uzyskana za pomocą dichlorometanu zawierała kwas ferulowy, kwercetynę i kemferol, podczas gdy we frakcji wodnej wykrywano kwas galusowy, za to nie wykrywano kwasu ferulowego i protokatechowego ani Q i KMP. Różnice między wynikami uzyskanymi w tej pracy a przedstawionymi w dostępnych pozycjach literatury mogą wynikać także z faktu, że przed sporządzeniem ekstraktów z cebuli usunięto z niej najbardziej wierzchnie łuski. Jak wykazano w innych badaniach, to właśnie skórka cebuli jest najbogatszym źródłem flawonoidów, zawiera ich 3–5 razy więcej niż części jadalne [Škerget i in. 2009]. W materiale, który badali Prakash i inni [2007], wśród flawonoidów obecnych w skórce dominowała kwercetyna, której było prawie 5-krotnie więcej niż w warstwach wewnętrznych, a kemferolu było aż 74 razy więcej. Z kolei kwas ferulowy występował w skórce w ilości 4-krotnie mniejszej niż w częściach wewnętrznych. Wykryte w tej pracy znaczne stężenia kwasów ferulowe-go i galusowego, przy braku protokatechowego, oraz niskie stężenie Q i KMP po-twierdzają, że do ekstraktu wybrano środkowe i wewnętrzne warstwy cebuli. Również mała zawartość antocyjanów, ze zidentyfikowanym jedynie cyjanidyno-3-O-glukozy-dem, potwierdza, że bogate w te związki skórki cebuli zostały w większości usunię-te przed ekstrakcją. Tłumaczy to także wyjątkowo niską aktywność antyoksydacyjną i małą zawartość polifenoli ogółem (tab. 10) w otrzymanym ekstrakcie. Prakash i inni [2007] udowodnili, że aktywność antyoksydacyjna zewnętrznych warstw cebu-li jest wyższa prawie 6-krotnie, zaś zawartość polifenoli – ponad 13-krotnie niż warstw wewnętrznych. Z kolei Gennaro i inni [2002] wykazali, że 6-tygodniowe przechowy-wanie cebuli w warunkach „domowych” powoduje utratę blisko 3/4 obecnych w tym warzywie antocyjanów i spadek potencjału antyoksydacyjnego o ponad 30%. Co więcej, obranie cebuli z zewnętrznych łusek usuwało także ok. 20% obecnego tam kwercetyno-4’-O-glukozydu oraz aż 83% antocyjanów.

Blisko spokrewniony z cebulą czosnek niedźwiedzi (Allium ursinum) miał ponad 6-krotnie więcej polifenoli i wyższy potencjał antyoksydacyjny (tab. 10). Wyniki te są zaskakujące i mogą być efektem niezbyt wysokiej jakości cebuli wykorzystanej w badaniach. Othman i inni [2011] wykazali bowiem mniejszą zawartość polifenoli


w czosnku niedźwiedzim niż w czerwonej cebuli (37,6 wobec 53,4 mg GAE/100 g). Aktywność antyoksydacyjna analizowanego ziela była wyższa od wyznaczonej przez Ivanišovą i innych [2009] oraz Mihaylovą i innych [2014]. Pierwszy zespół ustalił zdolność zmiatania rodnika ABTS na poziomie 3,88 mmol TE/100 g ś.m. (co moż-na jednak wyjaśnić wykorzystaniem ekstraktów wodnych), zaś w drugiej pracy wy-niki były jeszcze niższe: 0,265 mmol TE/100 g ś.m. Nawet jeśli się uwzględni, że za potencjał przeciwrodnikowy czosnku odpowiadają także obecne w jego liściach enzymy antyoksydacyjne (katalaza, peroksydaza glutationowa i SOD [Štajner i in. 2008]), to i tak uzyskany w tej pracy wynik będzie wyjątkowo wysoki.

W ekstrakcie z czosnku niedźwiedziego wykryto znaczne ilości rutyny i izokwer-cetyny (tab. 13). Carotenuto i inni [1996] oraz Vlase i inni [2013b] wykazali, że w czosnku niedźwiedzim flawonole to przede wszystkim pochodne glikozydowe kemferolu. Kwercetyna i jej pochodne, takie jak izokwercetyna i kwercytryna, są natomiast typowe dla innych gatunków z rodzaju Allium, np. A. obliquum i A. schoe-noprasum, zaś rutyna – dla A. senescens subsp. montanum i A. schoenoprasum [Carotenuto i in. 1996, Vlase i in. 2013a]. W prezentowanych tutaj badaniach kem-ferol wykryto w bardzo niskim stężeniu, a kwercetynę w ilościach śladowych. Rozdział chromatograficzny i detekcja przy λ = 360 nm ujawniły jednak obecność blisko 40 różnych związków, z których część może być pochodnymi glikozydowymi tych fla-wonoli. Brak aglikonu kemferolu może świadczyć o dobrej jakości surowca, w którym nie doszło do rozkładu glikozydów kemferolu [Carotenuto i in. 1996]. Dominującymi w badanym ekstrakcie związkami polifenolowymi były procyjanidyna B1 i katechina. Oznaczono także znaczące ilości procyjanidyny B2, florydzyny, kwasu galusowego, protokatechowego i chlorogenowego (tab. 13). Na uwagę zasługuje związek ziden-tyfikowany na podstawie czasu retencji jako (-)-epigalokatechina (EGC) i występu-jący w bardzo dużym stężeniu. Ze względu na brak dostępu do detektora masowe-go nie udało się potwierdzić identyfikacji, gdyby jednak ją potwierdzono, byłoby to pierwsze wykrycie tej substancji w liściach czosnku niedźwiedziego. Jak dotąd EGC, poza zieloną herbatą, wykryto jedynie w zielu dziurawca [Wei i in. 2009]. Innym wyjaśnieniem obecności (-)-epigalokatechiny w czosnku niedźwiedzim, i niestety bardziej prawdopodobnym, jest nieuczciwość sprzedawcy, który do bardzo drogiego i trudno dostępnego surowca zielarskiego, jakim są liście czosnku niedźwiedziego, mógł dodać tańszy, a podobny w wyglądzie zewnętrznym substytut, czyli liście zie-lonej herbaty. Tę hipotezę potwierdzałaby także wyższa od oczekiwanej aktywność antyoksydacyjna, stosunkowo wysoka zawartość EGCG (składnika typowego dla zielonej herbaty) oraz znaczne ilości rutyny, katechiny i kwasu galusowego (tab. 13).

Całkowita zawartość polifenoli wyniosła 744,6 ± 15,0 mg katechiny/100 g świe-żej masy (co w tym przypadku odpowiada suszonym liściom czosnku niedźwiedzie-go). Trzeba jednak wziąć pod uwagę, że podczas wykonywania oznaczenia docho-dziło do wytrącania się związków obecnych w próbce, co uniemożliwiało wiarygodny pomiar. Jedną z przyczyn mógł być spadek rozpuszczalności niektórych


związków, wywołany zmianą środowiska reakcji podczas wykonywania oznaczenia (na bardziej alkaliczne). W konsekwencji doszło do wytrącenia się z roztworu sub-stancji, które w takim środowisku słabiej się rozpuszczają, a przez to ich stężenie zostało zaniżone. Dlatego też wynik ten z pewnością jest obarczony dużym błędem. Potwierdza to także wynik uzyskany ze zsumowania stężeń zidentyfikowanych związ-ków polifenolowych – 1670,48 mg polifenoli w 100 g ś.m. Przypuszczalnie istotny wpływ na wynik pomiaru metodą Folina-Ciocalteu miała jednoczesna obecność w czosnku, i to w dużym stężeniu, związków siarki oraz jonów metali. W czosnku występują znaczne ilości magnezu (8 mg/100 g ś.m.), żelaza (2,2, mg), manganu (1,3 mg), cynku (0,9 mg) i kobaltu (0,9 µg) [Sendl 1995]. Dodanie niezbędnego do reakcji Na2CO3 powoduje alkalizację środowiska; mogło to spowodować wytrącanie się siarczków, najpierw kationów grupy II (do których zalicza się Hg2+, Pb2+, Bi3+, Cu2+, Cd2+, As3+, As5+, Sb3+, Sb5+, Sn2+, Sn4+), a potem kationów grupy III (obej-mującej Zn2+, Fe2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Fe3+, Al3+ oraz Cr3+). Siarczki kationów gru-py II mają niskie iloczyny rozpuszczalności i wytrącają się już w środowisku kwaśnym. Kationy trzeciej grupy analitycznej tworzą siarczki nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w kwasach. Dlatego ich strącanie nastąpiło dopiero na skutek alka-lizacji środowiska, a do tej doszło podczas reakcji z odczynnikiem Folina-Ciocalteu. Żeby mogły powstać siarczki metali, w roztworze muszą być obecne odpowiednie związki siarki. Dla czosnku najbardziej charakterystyczne są takie składniki siarko-we, jak sulfotlenki i inne pochodne cysteiny (alliina, allicyna, γ-glutamylocysteina). Sulfotlenki łatwo ulegają rozpadowi i przemianom do tiosulfinianów (R-S(O)S-R), które z kolei dalej przekształcają się w wielosiarczki i ajoeny [Bagiu i in. 2012]. Czyste tiosulfiniany mają bardzo niski potencjał przeciwrodnikowy, gdyż niezwykle trudno oddać im atom wodoru, łatwo jednak reagują ze związkami redukującymi (np. polifenolami), dając stabilne pochodne, które nadal są wysoce reaktywne. Sulfotlenki (R-S(O)-R) łatwo redukują się także do sulfidów (organicznych siarczków; R-S-R) i wielosiarczków (R-S-S-R), które wychwytują protony. Obecność w czosnku znaczących ilości siarkowych pochodnych przypuszczalnie spowodowała, że polife-nole – także obecne w tej roślinie – oddały swoje protony i nie reagowały z odczyn-nikiem Folina-Ciocalteu, zaniżając wynik. Co więcej, obecne w czosnku jony meta-li wytworzyły z sulfidami siarczki metali, które wytrąciły się po alkalizacji środowiska (w trakcie reakcji oznaczania zawartości polifenoli ogółem).

Należy zatem uznać, że badany czosnek niedźwiedzi zawierał znaczące ilości związków polifenolowych, co potwierdza wysoki potencjał antyoksydacyjny, jednak metoda ich oznaczania w oparciu o protokół Folina-Ciocalteu jest nieodpowiednia. Zawartość polifenoli zidentyfikowanych za pomocą HPLC wynosiła 1670 mg/100 g suszonych liści czosnku niedźwiedziego, co było jednym z wyższych wyników uzy-skanych dla surowców wykorzystanych do badań w tej pracy.

Spośród pozostałych badanych surowców znaczną zawartością polifenoli cha-rakteryzowała się także pokrzywa (618,9 ± 42,6 mg katechiny/100 g ś.m.), jednakże


w roślinie tej dominowały związki o niskim potencjale antyoksydacyjnym (tab. 10 i 13). Do najważniejszych flawonoidów zidentyfikowanych w pokrzywie należały procyjanidyna B1, florydzyna, glikozydy apigeniny i rutyna.

Spokrewnione ze sobą żurawina i borówka brusznica mają podobną zdolność zmiatania rodnika ABTS (tab. 10), ale różnią się składem i zawartością polifenoli. Żurawina zawierała ich niecałe 170 mg (w przeliczeniu na katechinę)/100 g świeżych owoców, podczas gdy w brusznicy polifenoli ogółem było prawie dwukrotnie więcej. Do najważniejszych polifenoli zidentyfikowanych w żurawinie należą florydzyna i cyanidyno-3-O-glukozyd oraz kwasy fenolowe z dominującymi kwasami kawowym, elagowym i galusowym. Borówka brusznica zawierała natomiast znaczne ilości (+)-ka-techiny, procyjanidyny B2, florydzyny, cyjanidyno-3-O-glukozydu, a z fenolokwasów głównie kwasu galusowego i protokatechowego; wykryto też peonidyno-3-O-gluko-zyd (tab. 14). W żurawinie nie wykryto procyjanidyny B1 ani B2. Należy jednak zaznaczyć, że żurawina zawiera znaczne ilości witamin oraz proantocyjanidyny o spe-cyficznym dla tego owocu wiązaniu typu A, w odróżnieniu do wiązania typu B obec-nego w proantocyjanidynach z innych owoców. Za potencjał antyoksydacyjny żura-winy i borówki brusznicy odpowiadają także, nieoznaczane w tej pracy, witaminy antyoksydacyjne i karotenoidy.

Ekstrakt ze spiruliny był porównywalny z ekstraktem z malin pod względem ilości polifenoli (zawierał ich 157 mg/100 g ś.m.), przy czym miał prawie 5-krotnie niższy potencjał antyoksydacyjny (tab. 10), jednak tylko nieliczne z tych związków udało się zidentyfikować. Spirulina jest wysuszoną biomasą komórek cyjanobakterii, które zawierają inne związki niż typowe tkanki roślinne. Do najważniejszych prze-ciwutleniaczy w cyjanobakteriach należą fikocyjaniny, karotenoidy i inne barwniki fotosyntetyczne. W malinach natomiast dominowały cyjanidyno-3-O-glukozyd, kwa-sy fenolowe (głównie galusowy i elagowy), florydzyna i rutyna (tab. 14), które są stosunkowo silnymi przeciwutleniaczami.

Bardzo interesującym owocem jest cytryniec chiński, który w tej pracy został wykorzystany w postaci suszonych jagód. Nie wykryto w nim katechin, wykazano natomiast obecność licznych flawonoli, przy czym zidentyfikowano tylko niektóre (kwercetynę i jej glikozydy). Spośród fenolokwasów większym stężeniem odznaczał się tylko kwas galusowy (tab. 13), a w grupie antocyjanów zidentyfikowano jedynie cyjanidyno-3-O-glukozyd oraz śladowe ilości cyjaniny. Obecne w cytryńcu polifeno-le charakteryzują się jednak dość niskim potencjałem przeciwrodnikowym, na po-ziomie 54 mg troloksu/100 ml ekstraktu z suszonych jagód (tab. 10). Jest to poziom zbliżony do potencjału antyoksydacyjnego ekstraktu z nasion soi (ok. 66 mg trolok-su/100 ml), w którym wykryto obecność fenolokwasów (głównie galusowego, elago-wego i p-kumarowego), izoflawonów (daidzyny, daidzeiny i genisteiny) oraz – w mniejszym stężeniu – glukozydu kwercetyny (tab. 13).

Podsumowując wyniki można stwierdzić, że wybrane do doświadczeń surowce prezentowały bardzo zróżnicowany potencjał antyoksydacyjny oraz skład polifeno-


lowy. Na uwagę zasługują stosunkowo małe stężenia antocyjanów w badanych roz-tworach, świadczące o tym, że ekstrakcja etanolem nie była najkorzystniejsza dla tej grupy związków. Zgodnie z danymi literaturowymi, znacznie wydajniejsze byłoby zastosowanie mieszanin zawierających kwas oraz aceton lub metanol. Takie rozwią-zanie nie mogło jednak być brane pod uwagę ze względu na toksyczne działanie takich mieszanin w stosunku do bakterii, których użycie zaplanowano w dalszej części badań.

4.2. Potencjał antyoksydacyjny związków polifenolowych najczęściej pobieranych z racjami pokarmowymi

Na podstawie wyników przedstawionych powyżej oraz znajomości struktury diety typowego mieszkańca naszego kraju, wytypowano związki, będące przedstawiciela-mi różnych grup polifenoli, które najczęściej są wprowadzane do organizmu wraz z dietą. Jednym z najważniejszych związków jest (+)-katechina (CAT). Ten flawan--3-ol jest powszechny w kakao, herbacie zielonej i oolong, owocach (jabłka, morele, gruszki, śliwki, brzoskwinie, maliny, jeżyny, a zatem typowo polskie gatunki), warzy-wach (cebula, bób, rabarbar, kapary, szczaw, koper) oraz czerwonym winie. Przed-stawicielem kolejnej ważnej grupy – flawonoli – jest kwercetyna (Q) i jej glikozydo-we pochodne. Kwercetyna, rutyna (RUT) i kemferol (KMP) to najczęściej dostarczane z dietą flawonole, a ich najobfitszymi źródłami są owoce (w tym jabłka, winogrona, truskawki, aronia, żurawina), warzywa (głównie cebula, brokuł, kapusta, koper, fasola, cykoria, pomidory, brukselka) i herbata.

Flawanony są szeroko rozpowszechnione szczególnie wśród roślin z rodzin Compositae i Leguminosae oraz obejmującej owoce cytrusowe rodziny Rutaceae. Aglikony naringenina (N) i hesperetyna (H) oraz ich glikozydy wzbudzają szczególne zainteresowanie ze względu na ich dominację w żywności, zwłaszcza w cytrusach. Naringenina występuje przede wszystkim w grejpfrutach i kwaśnych pomarańczach, przy czym jej stężenie jest znacznie większe w skórkach niż w świeżym miąższu owo-ców cytrusowych [Nogata i in. 2006]. W mniejszych ilościach znajduje się także w ty-mianku, pomidorach i ich przetworach, co czyni ją jednym z ważniejszych flawanonów w naszej diecie [Khan i in. 2014]. Do najczęściej spotykanych w żywności glikozydów naringeniny należą naringina (NR) i narirutyna. Narirutyna występuje szczególnie obficie w grejpfrutach, ale także w słodkich pomarańczach, choć w mniejszym stężeniu niż naringina [Khan i in. 2014]. Hesperetyna i jej glikozydy również obficie występują w cytrusach; rutynozyd hesperetyny – hesperydyna (HR) – obecna jest głównie w cy-trynach, limonkach, słodkich pomarańczach i mandarynkach, zaś neohesperydyna – w kwaśnych pomarańczach oraz tangelo (hybryda mandarynki i grejpfruta). Aglikon hesperetyna znajduje się głównie w grejpfrutach [Khan i in. 2014].


Ze względu na odmienną strukturę szkieletu, do badań wybrano także florydzy-nę (PHL), która jest flawonoidem, ale ma niezamknięty pierścień C, oraz rezwera-trol (RS), będący najpowszechniejszym przedstawicielem stilbenów.

Aktywność antyoksydacyjną roztworów polifenoli wykorzystywanych w doświad-czeniach przedstawiono w tabeli 15. Spośród badanych związków polifenolowych najwyższy potencjał antyoksydacyjny wykazały kemferol, naringenina i rezweratrol (wszystkie powyżej 4000 mmol TE/100 g substancji). Nieco słabszymi zmiataczami rodnika ABTS okazały się kwercetyna i (+)-katechina. Najniższy potencjał przeciw-rodnikowy miały glikozydy: hesperydyna (578,0 ± 3,5 mmol TE/100 g) i naringina (881,0 ± 12,1 mmol TE/100 g). W tych dwóch przypadkach wyraźnie widać, jak zablokowanie wolnej grupy –OH, poprzez jej połączenie z cząsteczką cukru, zmniej-sza możliwość wygaszania wolnego rodnika. Hesperydyna, będąca rutynozydem hesperetyny, dwukrotnie słabiej niż aglikon inaktywowała rodnik ABTS, a w przy-padku naringiny (neohesperydozydu naringeniny) zmniejszenie potencjału było

Tabela 15. Aktywność antyoksydacyjna roztworów polifenoli Table 15. Antioxidant activity of polyphenol solutions

ZwiązekCompound

Stężenie roztworuSolution concentration

[mg/ml]

Aktywność antyoksydacyjna[mmol TE/100 ml roztworu]

Antioxidant activity[mmol TE/100 ml of solution]

TEACABTS*[mmol TE/100 g]

KemferolKaempferol

5 21,83 ± 1,74 4365,9 ± 248,1

KwercetynaQuercetin

5 19,23 ± 1,45 3864,6 ± 290,9


25 101,01 ± 20,93 4040,4 ± 837,4

NaringinaNaringin

25 22,02 ± 0,30 881,0 ± 12,1


25 30,19 ± 0,88 1207,7 ± 35,2


25 14,45 ± 0,09 578,0 ± 3,5

FlorydzynaPhloridzin

25 55,96 ± 8,21 2238,5 ± 328,5

RezweratrolResveratrol

25 100,95 ± 9,96 4038,2 ± 398,3

RutynaRutin

25 52,2 ± 5,09 2090,4 ± 203,7

(+)-Katechina(+)-Catechin

25 83,57 ± 0,05 3343,4 ± 2,2

* wartości wyliczone z założeniem 100% wydajności ekstrakcji składników przeciwutleniających values calculated with the assumption of a 100% efficiency of extraction of antioxidant compounds


prawie 5-krotne w stosunku do odpowiedniego aglikonu. W doświadczeniach sto-sowano jednak nie czyste substancje w postaci stałej, ale ich roztwory, które różni-ły się stężeniem, m.in. ze względu na różnice rozpuszczalności poszczególnych związ-ków (zob. rozdz. 3.1). Dlatego też przygotowane roztwory kemferolu i kwercetyny miały najniższy potencjał antyrodnikowy wśród roztworów wykorzystywanych do badań. Potencjał antyoksydacyjny roztworu rutyny (rutynozyd kwercetyny) okazał się blisko 3-krotnie wyższy niż roztworu kwercetyny, należy jednak podkreślić, że aglikon był stosowany w 5-krotnie mniejszym stężeniu. Gdy przeliczono potencjał antyoksydacyjny na 100 gramów wyjściowego flawonoidu, ponownie aglikon (kwer-cetyna) wykazał silniejszy potencjał antyrodnikowy niż rutynozyd (3864,6 ± 290,9 wobec 2090,4 ± 203,7 mmol TE/100 g). Wyniki te są zgodne z podawanymi przez innych autorów, którzy także stwierdzali niższy potencjał antyoksydacyjny po O-glikozydacji flawonoidów, co wskazuje na udział w reakcji zmiatania rodnika grupy –OH uczestniczącej w tworzeniu wiązania glikozydowego [Khan i in. 2014].

Obecność dodatkowej grupy –OH może znacząco zwiększyć aktywność przeciw-rodnikową. Ye i inni [2009] dowiedli, że pochodna naringeniny z dodatkową grupą –OH przy C3’ (w konfiguracji orto w pierścieniu B) ma blisko 70-krotnie większą zdolność zmiatania wolnych rodników niż naringenina. Dodanie kolejnej grupy –OH (3’,5’-dihydroksynaringina) dodatkowo zwiększa potencjał antyoksydacyjny, choć zaledwie o 13,5% [Ye i in. 2009]. Analizując budowę chemiczną badanych w tej pracy polifenoli (ryc. 6), można zauważyć, że obecność w pierścieniu B dodatkowej grupy –OH nie zawsze skutkowała zwiększeniem potencjału antyoksydacyjnego. Dla hesperetyny oznaczono blisko 4-krotnie słabszą zdolność zmiatania rodnika ABTS niż dla naringeniny, mimo obecności dodatkowej grupy hydroksylowej. Było to wywołane sąsiadującą z nią grupą metoksylową (–OCH3), co skutkowało zaburzeniem układu odpowiedzialnego za oddawanie atomu wodoru i delokalizację wolnego elektronu. Analogiczna sytuacja miała miejsce w przypadku glikozydów tych flawa-nonów: hesperydyny i naringiny – ten drugi związek, niezawierający grupy metoksy-lowej w pierścieniu B, miał większy potencjał przeciwrodnikowy. Nie zawsze jednak grupa metoksylowa zmniejszała potencjał antyoksydacyjny. Glukozyd i rutynozyd izoramnetyny, która od kwercetyny różni się jedynie obecnością przy C3’ grupy me-toksylowej (–OCH3) zamiast –OH, charakteryzowały się silniejszym potencjałem zmiatania nadtlenku wodoru niż glukozyd i rutynozyd kwercetyny, jak również glu-kozyd i rutynozyd kemferolu [Fiorentino i in. 2007]. Kiedy jednak analizowano po-tencjał zmiatania anionorodnika ponadtlenkowego, potencjał glikozydów izoramne-tyny okazał się znacznie mniejszy niż pochodnych kwercetyny i kemferolu. Wyniki te wskazują na odmienne mechanizmy zmiatania poszczególnych rodników i udział w nich innych struktur w cząsteczkach przeciwutleniaczy.

Na aktywność antyoksydacyjną związku istotny wpływ może mieć także rodzaj cząsteczki cukru połączonej z aglikonem. Na przykład, glikozylacja grupy –OH w hesperetynie przy atomie węgla C7 przez neohesperydozę (neohesperydyna)


Hesperydyna / Hesperidin

578,0 ± 3,5 (3529,0 ± 21,2)

Hesperetyna / Hesperetin

1207,7 ± 35,2 (3650,6 ± 106,5)

Naringina / Naringin

881,0 ± 12,1 (5114,9 ± 70,5)

Naringenina / Naringein

4040,4 ± 837,4 (11000,3 ± 2240,7)

Katechina / Catechin

3343,4 ± 2,2 (9705,0 ± 6,4)

Florydzyna / Phloridzin

2238,5 ± 328,5 (9769,1 ± 1433,8)

Rezweratrol / Resveratrol

4038,2 ± 398,3 (9216,8 ± 909,2)

Kemferol / Kaempferol

4365,9 ± 248,1 (12496,9 ± 996,3)

Ryc. 6. / Fig. 6.


zmniejsza potencjał antyoksydacyjny znacznie silniej niż przyłączenie do tej grupy rutynozy (hesperydyna) [Di Majo i in. 2005]. Podobną prawidłowość zaobserwowa-no w tej pracy. Rutynozydy (rutyna i hesperydyna) były około dwukrotnie słabszymi zmiataczami rodnika ABTS niż odpowiadające im aglikony, podczas gdy neohespe-rydozyd (naringina) – ponad 4-krotnie słabszym. Jak już wspomniano wcześniej, rutynozyd (wiązanie w cukrze α-1,6) i neohesperydozyd (wiązanie α-1,2) różnią się jedynie konfiguracją przestrzenną dwucukru, co kolejny raz potwierdza, że prze-strzenne ułożenie nie tylko grup –OH, ale i ich podstawników może mieć istotny wpływ na potencjał antyoksydacyjny związku. Cząsteczka cukru przyłączona do atomu węgla C7 może – ze względu na zawadę steryczną – zaburzać płaską konfi-gurację flawanonu i zdolność do delokalizacji elektronu w jego cząsteczce. Cząsteczka rutynozy w mniejszym stopniu wpływa na destabilizację płaskiej konfiguracji niż cząsteczka neohesperydozy [Di Majo i in. 2005].

Kolejny czynnik wpływający na potencjał antyoksydacyjny flawanonów to śro-dowisko. W warunkach hydrofilowych flawanony są silnymi przeciwutleniaczami, natomiast w środowisku lipofilowym niektóre z nich tracą swoje właściwości (neo-hesperydyna, hesperetyna), a inne zaczynają działać nawet prooksydacyjnie (narin-gina, narirutyna, naringenina, eriodyktiol) [Khan i in. 2014].

Antyoksydant musi mieć budowę odpowiednią nie tylko do zmiatania rodników (i delokalizacji elektronu w powstałym rodniku flawonoidowym), ale także do che-latowania metali. Przyjmuje się, że flawonoidy są silnymi przeciwutleniaczami przede wszystkim ze względu na ich właściwości przeciwrodnikowe. Aktywność ta jest kon-sekwencją zdolności do oddawania atomu wodoru. Rzeczywiście, fenolowe grupy

Ryc. 6. cd. Budowa chemiczna polifenoli stosowanych w badaniach [na podstawie: Rice-Evans i in. 1996, Robards i in. 1999] oraz ich aktywność antyoksydacyjna wyrażona w mmol TE/100 g i mmol TE/mol (w nawiasie)

Fig. 6. cont. Chemical structure of polyphenols used in the study [based on: Rice-Evans et al. 1996, Robards et al. 1999], and their antioxidant activity expressed in mmol TE/100 g and mmol TE/mol (in parentheses)

Kwercetyna / Quercetin

3864,6 ± 290,9 (11680,5 ± 879,3)

Rutyna / Rutin

2090,4 ± 203,7 (12762,2 ± 1243,8)


flawonoidów służą jako łatwo dostępne źródło atomów wodoru, a powstający w efek-cie ich oddania rodnik ma stabilny, zdelokalizowany w strukturze pierścieni flawo-noidu, elektron [Burda i Oleszek 2001]. Większość naukowców uważa, iż szczególnie istotne znaczenie ma katecholowa struktura w pierścieniu B (grupy –OH w pozycji C3’ i C4’), która odpowiada za zwiększenie stabilności rodnika aroksylowego, a tak-że podwójne wiązanie między C2 a C3 oraz grupa 4-okso (grupa ketonowa przy C4), uczestniczące w delokalizacji elektronu. Potencjał antyoksydacyjny może się także zwiększyć na skutek obecności grup hydroksylowych w położeniu C3 i C5 w pierście-niu A. Przyjmując takie założenia, dla związków badanych w tej pracy należałoby oczekiwać wysokiego potencjału antyoksydacyjnego flawonoli, które w swoim szkie-lecie węglowym łączą wspomniane elementy, tj. wiązanie podwójne między atomami węgla C2 i C3 oraz grupę C=O przy atomie węgla C4. Rzeczywiście, wśród badanych związków kwercetyna i kemferol charakteryzują się jedną z najwyższych zdolności wygaszania rodnika ABTS. Obydwa związki mają też grupy –OH w pierścieniu A na pozycjach C3 i C5. Interesujące jest jednak, że kemferol, zawierający sumarycznie mniej grup hydroksylowych (o jedną grupę –OH mniej w pierścieniu B, brak struk-tury katecholowej) niż kwercetyna, okazał się silniejszym od niej zmiataczem rodni-ka ABTS. Podobny wynik uzyskali Kirakosyan i inni [2010]. Badając interakcje mię-dzy poszczególnymi polifenolami, wykazali, że kemferol ma wyższy TEAC niż kwercetyna. Otrzymane wyniki wskazują, że dla zdolności wygaszania rodnika ABTS obecność struktury katecholowej w pierścieniu B nie jest istotna.

Porządkując polifenole analizowane w tej pracy w kolejności rosnącego poten-cjału przeciwrodnikowego (w mmol TE/100 g), uzyskuje się szereg: HR < NR < H < RUT ≤ PHL < CAT < Q < RS ≤ N ≤ KMP (przy czym ≤ oznacza, że uzyska-na wartość średnia była niższa, choć nieistotnie statystycznie przy p < 0,05). Związki te mają jednak bardzo zróżnicowaną masę molową. Różnice są szczególnie duże w przypadku glikozydów, co sprawia, że ta sama ilość (wagowo) substancji oznacza znacznie mniejszą liczbę cząsteczek, które mogą uczestniczyć w reakcji. Przeliczając zatem potencjał antyoksydacyjny na mol badanego polifenolu (wartości podane w nawiasach na ryc. 6), otrzymujemy szereg, który różni się od poprzedniego, ale w sposób bardziej adekwatny przedstawia zdolność danej cząsteczki do wygasza-nia rodnika ABTS: HR < H < NR < RS ≤ CAT < PHL < N ≤ Q ≤ KMP ≤ RUT. Najbardziej spektakularna wydaje się zmiana pozycji rutyny w tym szeregu. Rutyna jest glikozydem z resztą dwucukru podstawioną do grupy –OH przy atomie węgla C3, podczas gdy w przypadku glikozydów flawanonów są to 7-O-pochodne. Na tej podstawie można wnioskować, że dla zdolności zmiatania rodnika ABTS najważ-niejsze są trzy elementy: (1) wolna grupa –OH przy atomie węgla C4’, (2) wolne grupy hydroksylowe przy C5 i C7 oraz (3) grupa ketonowa przy C4. Elementy te występują w rutynie, kemferolu, kwercetynie i naringeninie – i właśnie te związki miały niemal identyczny potencjał antyoksydacyjny w przeliczeniu na 1 mol substan-cji (ryc. 6). Wbrew oczekiwaniom, wolna grupa –OH przy C3 wydaje się nie mieć


tak istotnego znaczenia dla zdolności zmiatania rodnika ABTS. Ani jej brak w na-ringeninie, ani podstawienie w rutynie nie zmniejszyły zdolności tych cząsteczek do wygaszania ABTS. Spośród badanych związków najwyższy potencjał przeciwrodni-kowy (w przeliczeniu na 1 mol substancji) wykazuje rutyna, która ma tę grupę O-glikozylowaną. Wydaje się wręcz, że cząsteczka rutynozy zwiększa możliwości oddania atomu wodoru, dzięki czemu rutyna wydajnie redukuje kationorodnik ABTS (ryc. 7). Przypuszczalnie grupa ta jest istotna w reakcjach chelatowania jonów me-tali, co postulują niektórzy autorzy [Williams i in. 2004].

Kemferol różni się od kwercetyny brakiem grupy –OH przy atomie węgla C3’, nie zawiera zatem struktury katecholu w swej cząsteczce. Wiele badań wskazuje, że z tego powodu ma on mniejszy potencjał antyoksydacyjny niż kwercetyna. Nie jest to jednak oczywiste. Wartość TEAC wyznaczona dla kemferolu w prezentowanej pracy była wyższa niż dla kwercetyny. Fiorentino i inni [2007] z kolei stwierdzili, że aktywność rutynozydu i glukozydu kemferolu w zakresie zmiatania nadtlenku wo-doru jest silniejsza niż rutynozydu kwercetyny, ale słabsza niż glukozydu kwercetyny. Wydaje się zatem, że do zapewnienia zdolności zmiatania nadtlenku wodoru grupa katecholowa nie jest potrzebna. Potwierdzają to także inne wyniki wspomnianych autorów. Izoramnetyna od kwercetyny różni się podstawieniem grupy –OH przy C3’ przez resztę metylową, tymczasem jej glukozyd i rutynozyd wydajniej inaktywują H2O2 niż glukozyd i rutynozyd kwercetyny, jak również glukozyd i rutynozyd kem-ferolu [Fiorentino i in. 2007].

Kwercetyna, mimo obecności pięciu grup –OH, ma charakter lipofilowy [Materska 2008]. Pochodne kwercetyny mogą być zarówno hydrofilowe, jak i lipofilowe, w za-leżności od podstawników w cząsteczce. Generalnie, O-metylo- oraz C-metylo-pochodne flawonoidów są lipofilowe (stąd lepiej się je izoluje przy użyciu np. ace-tonu). Glikozylacja przynajmniej jednej grupy hydroksylowej w kwercetynie zwięk-sza hydrofilowość pochodnej, a tym samym skuteczność związku w środowisku cytoplazmy komórkowej. W warunkach in vitro, jakie najczęściej są wykorzystywane do oceny aktywności antyoksydacyjnej, te właściwości niekoniecznie znajdą odzwier-ciedlenie w wynikach.

Udział poszczególnych struktur w kształtowaniu potencjału antyrodnikowego zależy od rodzaju rodnika, z którym przeciwutleniacz ma reagować. Burda i Oleszek [2001] wykazali, że dla zmiatania rodnika DPPH kluczowe znaczenie ma obecność ugrupowania katecholowego (w pierścieniu B). W reakcji z DPPH kwercetyna od-daje dwa atomy wodoru [Materska 2008] i przekształca się w chinon (ryc. 8). Obecność grupy –OH przy atomie węgla C3 umożliwia regenerację ugrupowania katecholo-wego, poprzez dodanie protonu z roztworu, pod warunkiem że reakcja zachodzi w rozpuszczalniku protycznym. W przypadku wygaszania rodnika ABTS grupa ka-techolowa nie odgrywa tak ważnej roli, a decydujące znaczenie zdają się mieć wol-ne grupy –OH przy C4’, C5 i C7 oraz grupa ketonowa C=O przy C4. Nie wykazano w tej pracy istotnej roli grupy –OH przy C3, natomiast metoksypochodne w pozycji


Ryc

. 7.

Akt

ywac

ja (

utle

nian

ie)

AB

TS

pod

wpł

ywem

nad

siar

czan

u po

tasu

(K

2S2O

8) p

row

adzą

ca d

o po

wst

ania

kat

iono

rodn

ika

AB

TS•+

i je

go

wyg

asza

nie

w r

eakc

ji ze

zw

iązk

ami p

rzec

iwut

leni

ając

ymi (

AO

H)

[na

pods

taw

ie: D

e O

livei

ra i

in. 2

014]

F

ig. 7

. A

ctiv

atio

n (o

xida

tion)

of A

BT

S by

pot

assi

um p

ersu

lfate

(K

2S2O

8) to

gen

erat

e ca

tion-

radi

cal A

BT

S•+ a

nd it

s sc

aven

ging

in th

e re

actio

n w

ith a

ntio

xida

nt c

ompo

unds

(A

OH

) [b

ased

on:

De

Oliv

eira

et

al. 2

014]


C4’ (hesperetyna i hesperydyna) miały istotnie niższy potencjał przeciwrodnikowy niż niepodstawione naringenina i naringina.

Podwójne wiązanie C2=C3 również nie wydaje się niezbędne dla wydajnego wygaszania rodnika ABTS. Naringenina, mająca to wiązanie uwodornione, wykazy-wała znaczną efektywność zmiatania ABTS. Katechina także nie zawiera wiązania podwójnego, a rezweratrol i florydzyna nie mają nawet pierścienia C. Mimo to rozmieszczenie grup –OH w tych cząsteczkach umożliwia im wydajne zmiatanie rodnika ABTS, co jeszcze raz potwierdza szczególnie istotną rolę trzech grup –OH w pozycji C4’, C5 i C7. Wyniki te są podobne do obserwacji Wanga i innych [2006], którzy badali zdolność wygaszania anionorodnika ponadtlenkowego przez flawono-idy. Wykazali oni, że największy potencjał redukujący zapewnia obecność grupy hydroksylowej przy C4’ w pierścieniu B. Jednak, odwrotnie niż w prezentowanych tutaj wynikach, sama obecność wolnej grupy hydroksylowej nie wystarczała. Jak zauważyła Materska [2008], w sytuacji podstawienia grupy –OH w pozycji C3 (ru-tyna, izokwercetyna) potencjał zmiatania rodnika ponadtlenkowego generowanego w układzie ksantyna/oksydaza ksantynowa znacząco maleje. Możliwe, że występuje tu typowa zawada steryczna powodująca blokowanie wolnej grupy –OH przez czą-steczkę cukru lub podstawnik alkoksylowy i związany z tym brak możliwości reakcji z O2

•–. Ponadto zwiększona przez podstawienie hydrofilowość pochodnych kwerce-tyny zmienia współczynniki rozdziału między fazami wodną i lipidową, a to z kolei ma znaczenie w przebiegu reakcji oznaczania potencjału antyoksydacyjnego [Burda i Oleszek 2001]. Także Cos i inni [1998] stwierdzili, że do wydajnego zmiatania anionorodnika ponadtlenkowego niezbędne są wolna grupa hydroksylowa przy C3 oraz grupa –OH przy C3’ w pierścieniu B, tworząca strukturę katecholu. Do podob-nych wniosków doszli Sichel i inni [1991], którzy podkreślili również rolę podwój-nego wiązania C2=C3 w wygaszaniu anionorodnika ponadtlenkowego przez flawa-nony i flawony. Jego obecność czyni strukturę flawonoidu bardziej reaktywną, dlatego apigenina jest przeciętnym antyoksydantem, podczas gdy naringenina nie wykazuje aktywności wobec O2

•–. Dla wygaszania rodnika ABTS jednak obecność podwójnego wiązania nie miała aż tak istotnego znaczenia.

Ryc. 8. Przebieg zmian oksydacyjnych w kwercetynie podczas jej reakcji z rodnikiem DPPH• w rozpuszczalniku protycznym [na podstawie: Materska 2008]

Fig. 8. Pathway of oxidative changes in quercetin during its reaction with DPPH• radical in protic solvent [based on: Materska 2008]


O przestrzennych oddziaływaniach cząsteczek cukrów w glikozydach świadczą również wyniki innych badaczy [Fiorentino i in. 2007]. Zademonstrowali oni, że glukozyd kwercetyny ma większy potencjał wygaszający – zarówno wobec O2

•–, jak i H2O2 – niż jej rutynozyd. Wskazuje to, że znaczenie ma tutaj nie tylko podstawienie grupy –OH przy C3, ale także długość glikozydu (jedna cząsteczka cukru czy dwie).

Oczywiście, aktywność antyoksydacyjna związku to nie tylko jego zdolność do wygaszania rodników, lecz również do zapobiegania ich powstawaniu poprzez che-latowanie jonów metali. Wydaje się, że proces ten wymaga obecności struktury katecholu oraz wolnej grupy –OH przy C3 [Fernandez i in. 2002, Williams i in. 2004]. Na podstawie dostępnej literatury można przyjąć, że do wiązania jonów metali niezbędne jest równoczesne występowanie wolnych grup –OH w pozycji C4’ i C3’ (katechol), C3 oraz C5, a także obecność grupy C4=O (ryc. 3) [Cook i Samman 1996, Rice-Evans i in. 1996, Williams i in. 2004]. Jak widać, część z tych elementów to te same struktury, które są kluczowe dla zdolności wygaszania rodnika ABTS, jak to przestawiono w tej pracy.

Przeciwutleniacze mogą też wykazywać potencjał antyoksydacyjny dzięki hamo-waniu wytwarzania wolnych rodników w organizmie w procesach zależnych od en-zymów. Cos i inni [1998] wykazali, że grupy hydroksylowe przy C5 i C7 oraz po-dwójne wiązanie C2=C3 są elementami kluczowymi dla zdolności związku do zahamowania aktywności oksydazy ksantynowej – enzymu wytwarzającego aniono-rodnik ponadtlenkowy. Hämäläinen i inni [2007] z kolei udowodnili, że niektóre polifenole mogą blokować produkcję rodnika NO• dzięki hamowaniu przez nie ekspresji enzymu indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS). W ich badaniach ge-nisteina, kemferol, kwercetyna i daidzeina hamowały indukowaną LPS-em aktywa-cję STAT-1 i NF-κB oraz ekspresję iNOS, natomiast izoramnetyna, naringenina i pelargonidyna hamowały aktywację NF-κB i ekspresję iNOS, ale nie miały wpływu na STAT-1. Autorzy wysnuli więc wniosek, że przeciwutleniacze te działają na etapie kontroli transkrypcji genów dla enzymu odpowiedzialnego za produkcję rodnika NO•. Biorąc pod uwagę zdolność do zmniejszenia wytwarzania NO• o co najmniej 50%, badane przez autorów flawony można ustawić w szeregu: kwercetyna (IC50 ≈ 25 µM) ≈ kemferol (IC50 ≈ 25 µM) > genisteina (IC50 ≈ 30 µM) ≈ izoram-netyna (IC50 ≈ 30 µM) > daidzeina (IC50 ≈ 70 µM) > naringenina (IC50 ≈ 80 µM) > pelargonidyna (IC50 ≈ 90 µM). Wspomniani autorzy na podstawie otrzymanych wyników wyróżnili kilka elementów struktury, uznając je za kluczowe dla hamowa-nia produkcji NO•: wiązanie podwójne C2=C3, brak podstawników glikozydowych (ich obecność zmniejszała efekt inhibitorowy) oraz wolne grupy –OH w pozycji C7 i C4’ [Hämäläinen i in. 2007]. Nie są to zatem te same struktury, na które wskazano w tej pracy jako na niezbędne do inaktywacji rodnika ABTS.

Tripoli i inni [2007] dowiedli, że potencjał przeciwrodnikowy zależy od stężenia flawonoidu w środowisku reakcji. Istotnym elementem do zmiatania rodnika ponad-tlenkowego okazała się obecność niepodstawionej grupy –OH przy atomie węgla C3


w pierścieniu C, która to grupa aktywowała podwójne wiązanie między C2 a C3. Obecność grupy hydroksylowej w pierścieniu B natomiast miała istotny wpływ na zdolność zmiatania rodnika ponadtlenkowego tylko w sytuacji, gdy stężenie flawono-idu było mniejsze niż 100 mmol/l. Przykładowo, kemferol w stężeniu 10 mmol/l nie wykazywał aktywności wobec O2

•–, ale w stężeniu 60–100 mmol/l już zmiatał ten rodnik. Cytowani autorzy wykazali, że w zbyt wysokich stężeniach niektóre flawonoidy mogą nawet działać prooksydacyjnie, aktywując procesy generujące wolne rodniki.

Podsumowując należy zauważyć, że podczas analizy aktywności antyoksydacyj-nej związków – w przypadku większości stosowanych metod – tak naprawdę oce-niana jest jedynie zdolność antyrodnikowa, i to wobec konkretnego rodnika. Wyniki takie nie powinny zatem być bezkrytycznie przekładane na zdolność zmiatania wszystkich rodników, jakie mogą zaistnieć w układach biologicznych, a tym bardziej na całkowity potencjał antyoksydacyjny cząsteczki. Stosowany powszechnie wyróż-nik, jakim jest wartość TEAC, będzie więc zmienny dla tego samego związku w za-leżności od środowiska, w jakim ów związek się znajdzie. Oznacza to nie tylko rodzaj rozpuszczalnika, pH czy temperaturę środowiska, ale też rodzaj reaktywnej formy tlenu, jej stężenie w środowisku, stężenie związku przeciwutleniającego, jak również obecność innych substancji, które mogą zarówno wspierać proces inakty-wacji rodników, jak i mu przeszkadzać. Wartość TEAC odzwierciedla zatem po-tencjalną zdolność antyoksydacyjną danej cząsteczki. W prezentowanej pracy wy-kazano, że kluczowe znaczenie dla zdolności do efektywnej inaktywacji rodnika ABTS przez związek ma obecność wolnej grupy –OH przy C4’, C5 i C7 oraz grupy ketonowej przy C4.

4.3. Wpływ związków polifenolowych na bakterie jelitowe

Wpływ rozpuszczalnika na bakterie

Związki polifenolowe były stosowane w doświadczeniach w postaci jednoskładniko-wych roztworów w dimetylosulfotlenku. W zakresie stężeń 0–250 µg/ml nie stwier-dzono żadnego wpływu tego rozpuszczalnika na wzrost badanych gatunków bakterii jelitowych.

Do ekstrakcji związków polifenolowych z surowców badanych w tej pracy zasto-sowano 80-procentowy etanol. Wyboru rozpuszczalnika dokonano na podstawie wyników wcześniejszych badań prowadzonych w Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej UR w Krakowie, które wykazały, że alkohol etylowy w stężeniu 80% umożliwia uzyskanie ekstraktów o wyższym potencjale antyoksyda-cyjnym i większej zawartości polifenoli niż użyta w takich samych warunkach woda, chlorek metylenu czy etanol w innym stężeniu. Skuteczność etanolu była porówny-


walna ze skutecznością metanolu, jednak, ze względu na toksyczność tego drugiego, ostatecznie do badań wybrano alkohol etylowy. Co więcej, jest on także rozpusz-czalnikiem dopuszczonym do stosowania w produkcji żywności (Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 4 września 2008 r., Dz. U. Nr 177, poz. 1093), nie spodzie-wano się zatem negatywnego wpływu jego pozostałości na zdrowie konsumenta. Nie oczekiwano także negatywnego oddziaływania na badane gatunki mikrobioty jelito-wej, gdyż końcowe stężenie rozpuszczalnika w doświadczeniach nie przekraczało 4% (co odpowiada ok. 3,2 g etanolu/100 ml), a istnieją doniesienia, które świadczą o odporności bakterii jelitowych nawet na trzykrotnie wyższe stężenie etanolu [Ingram 1986, Panesar i in. 2007, Liu i Qureshi 2009, Kopit i in. 2014]. Analiza uzyskanych wyników wykazała jednak zaskakująco silny, dawkozależny wpływ etanolu na nie-które z badanych w tej pracy gatunków bakterii. Dlatego też wykonano dodatkowe oznaczenie i sprawdzono dokładniej, jak obecność etanolu w zakresie stężeń od 0,1 do 5% wpływa na wzrost badanych gatunków bakterii. Otrzymane wyniki przedsta-wiono w tabeli 16.

Wykazano, że etanol ma bardzo zróżnicowany wpływ na drobnoustroje, zależ-ny od ich gatunku. W przypadku większości badanych bakterii niskie stężenia (0,1–1,0%) lekko stymulowały wzrost drobnoustrojów, choć tylko w przypadku Eubacterium cylindroides (końcowe stężenie etanolu 0,1–1,0%), Lactobacillus sp. (1%) oraz Bacteroides galacturonicus (0,4 i 1,0%) efekt ten był statystycznie istot-ny. Nie były to wyniki zaskakujące, gdyż o możliwości stymulacji przez etanol wzro-stu bakterii z rodzaju Acinetobacter, choć nie Escherichia coli, pisali już Smith i inni [2004]. Przy wyższych stężeniach dodatek etanolu do medium powodował zahamo-wanie wzrostu wszystkich badanych bakterii, choć w różnym stopniu. Najmocniejszy, o zupełnie niespodziewanej sile, efekt inhibitorowy zanotowano dla Bifidobacterium catenulatum – już przy stężeniu 2% EtOH liczebność populacji malała do niespeł-na 30% wartości kontrolnej, zaś obecność w medium 3% i więcej etanolu powodo-wała zmniejszenie liczebności populacji tej bakterii o co najmniej 95%. Dość wraż-liwe na etanol okazały się także inne pałeczki: Gram-dodatnia Eubacterium cylindroides, oraz Gram-ujemne Escherichia coli i Bacteroides galacturonicus. W przy-padku tej pierwszej obecność 3% etanolu wywołała zmniejszenie liczebności co prawda „tylko” o nieco ponad 30%, jednak stężenie 5% zahamowało wzrost tego mikroorganizmu już całkowicie. Zarówno EC, jak i BAC natomiast przeżywały w stężeniu 5% EtOH, jednak liczebność ich populacji była niższa prawie 10-krotnie w porównaniu z kontrolą.

Najmniejszą wrażliwością na alkohol etylowy charakteryzował się Enterococcus caccae – dopiero dodatek 5% etanolu powodował istotne statystycznie zmniejszenie liczebności populacji, o niecałe 20% w stosunku do kontroli. Podobnie zachowywał się Ruminococcus gauvreauii.

Uzyskane wyniki są dość zaskakujące. Oczywiście, powszechnie wiadomo, że alkohol etylowy jest skutecznym środkiem sterylizującym, jednak w tym celu stosu-

4. Wyniki i dyskusja 97Ta

bela

16.

W

pływ

stę

żeni

a et

anol

u na

wzr

ost

bakt

erii

jelit

owyc

h pr

zeds

taw

iony

jak

o pr

ocen

t w

sto

sunk

u do

lic

zebn

ości

kom

órek

bak

teri

i da

nego

gat

unku

w k

ontr

oli p

ozyt

ywne

j, tj.

hod

owli

bakt

erii

bez

doda

tku

etan

olu

(% K

poz;

śred

nia

± S

D, n

≥ 6

) Ta

ble

16.

Eff

ect

of e

than

ol c

once

ntra

tion

on t

he g

row

th o

f in

test

inal

bac

teri

a ex

pres

sed

as p

erce

nt r

elat

ive

to b

acte

ria

cell

coun

t of

a g

iven

sp

ecie

s in

pos

itive

con

trol

, i.e

. bac

teri

a cu

lture

in m

ediu

m w

ithou

t et

hano

l add

ed (

% K

poz;

mea

n ±

SD

, n ≥

6)

Stęż

enie

et

anol

uE

than

ol

conc

entr

atio

n[%

]

EN

RU

MI

LC

BE

CB

AC

EU

BB

F

0 1

00,0

± 0

,7 b

, c 10

0,0

± 1

,2 b

100,

0 ±

1,7

b 1

00,0

± 7

,2 a

100,

0 ±

8,9

b, c

100,

0 ±

0,9

b

100,

0 ±

0,3

a

0,1

100

,1 ±

2,1

b, c

101,

4 ±

1,4

a, b

102,

2 ±

1,8

a, b

95

,4 ±

6,6

a, b

105,

8 ±

11,

4 a,

b, c

10

1,6

± 1

,1 a

99,

5 ±

0,7

a

0,2

101

,6 ±

1,3

b, c

102,

1 ±

0,5

a, b

105,

9 ±

6,2

a, b

93

,2 ±

2,9

a, b

, c 11

0,1

± 2

,7 a

, b 10

1,8

± 0

,7 a

99,

0 ±

0,6

a

0,4

104

,0 ±

2,7

b

103,

3 ±

1,7

a, b

108,

2 ±

9,9

a, b

90

,1 ±

4,0

b, c

113,

3 ±

1,5

a 10

1,9

± 0

,5 a

98,

7 ±

0,7

a

1,0

104

,2 ±

3,8

b 10

4,3

± 0

,6 a

10

9,7

± 1

2,4

a

85,3

± 1

1,9

c 10

4,0

± 1

,6 c

101,

5 ±

0,6

a 9

4,9

± 1

,2 c

2,0

103

,9 ±

7,9

a, b

105,

1 ±

1,3

a 10

0,1

± 1

3,4

b

61,8

± 1

0,3

d 8

3,0

± 0

,3 d

89,

2 ±

1,6

c 2

8,3

± 4

,6 d

3,0

107

,7 ±

1,1

a 9

9,8

± 7

,0 b

87,

4 ±

1,8

c

42,9

± 7

,8 e

56,

3 ±

3,9

e 6

8,1

± 0

,8 d

5,

3 ±

0,5

e

4,0

97

,1 ±

2,3

c 9

2,0

± 6

,9 c

66,

5 ±

3,4

d

22,6

± 5

,4 f

46,

3 ±

3,9

f 2

0,9

± 0

,9 e

2,

6 ±

1,6

f

5,0

82

,0 ±

9,0

d 8

1,6

± 2

,1 d

26,

7 ±

5,9

e

12,5

± 2

,3 g

13,

5 ±

2,4

g

0,2

± 0

,7 f

2,

4 ±

0,3

f

EN

– E

nter

ococ

cus

cacc

ae,

RU

MI

– R

umin

ococ

cus

gauv

reau

ii, L

CB

– L

acto

baci

llus

sp.,

EC

– E

sche

rich

ia c

oli,

BA

C –

Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus,

E

UB

– E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des,

BF

– B

ifido

bact

eriu

m c

aten

ulat

um

Śred

nie

ozna

czon

e tą

sam

ą lit

erą

w k

olum

nie

nie

różn

ią s

ię is

totn

ie (

p <

0,0

5).

Mea

ns m

arke

d w

ith t

he s

ame

lett

er in

a c

olum

n ar

e no

t si

gnifi

cant

ly d

iffer

ent

(p <

0.0

5).


je się go w stężeniu powyżej 70%. Analizując otrzymane wyniki zauważono, że największy wpływ na podatność bakterii na etanol miał kształt komórki bakteryjnej. Najbardziej wrażliwe na rosnące stężenia etanolu były pałeczki (Gram-dodatnie bardziej niż Gram-ujemne), a najmniej – Gram-dodatnie formy kuliste (ziarniaki i paciorkowce). Nie zaobserwowano natomiast korelacji między podatnością na etanol a pokrewieństwem filogenetycznym; w obrębie jednego typu Firmicutes wy-stępują zarówno odporne gatunki R. gauvreauii i E. caccae, jak i bardziej podatne Lactobacillus sp. oraz bardzo wrażliwy E. cylindroides. Nie powiązano także tole-rancji na etanol z wrażliwością na obecność tlenu w środowisku (względne i bez-względne beztlenowce), wytwarzaniem katalazy (wszystkie gatunki, z wyjątkiem EC, są katalazo-ujemne). Najbardziej jednak zaskakujący jest brak zależności między wrażliwością na etanol a przynależnością do grupy bakterii Gram-dodatnich czy Gram-ujemnych. Spodziewano się, że bakterie Gram-ujemne będą bardziej podat-ne na działanie alkoholu, ich ściana komórkowa zawiera bowiem dodatkową warstwę, błonę zewnętrzną, dzięki czemu zawartość lipidów i lipoprotein u bakterii Gram- -ujemnych jest znacznie wyższa niż u Gram-dodatnich (ponad 50% wobec 0–3%). Dlatego też rosnące stężenie alkoholu powinno szybciej doprowadzić do dezinte-gracji błon komórkowych i ściany, a w konsekwencji do śmierci komórki.

Odpowiedni skład kwasów tłuszczowych umożliwia utrzymanie prawidłowej płynności błony i funkcjonowanie związanych z nią enzymów, a co za tym idzie funkcjonowanie komórki bakteryjnej. Przyjmuje się, że mechanizm uszkadzania błon komórkowych w obecności długołańcuchowych alkoholi polega na ich wniknięciu pomiędzy fosfolipidy w dwuwarstwie lipidowej, co powoduje zwiększenie płynności błon i zaburzenie ich funkcjonowania [Ingram 1976]. W przypadku alkoholi o licz-bie atomów węgla wynoszącej 4 i mniej istnieją różne teorie. Jedna z nich mówi, że cząsteczki tych alkoholi mogą wypierać cząsteczki wody z połączeń z polarnymi główkami fosfolipidów lub z enzymami, powodując zaburzenia w ich konformacji i funkcjonowaniu. Dopuszcza się także możliwość inkorporacji cząsteczek etanolu aż do hydrofobowej części dwuwarstwy lipidowej, gdzie wypełnią one „dziury” po-między ogonkami nienasyconych kwasów tłuszczowych, uszczelniając tym samym błonę i powodując spadek jej płynności oraz ograniczenie ruchów łańcuchów kwasów tłuszczowych budujących membranę. Takiego zachowania nie udało się zaobserwo-wać ani dla dłuższych alkoholi (zbyt duże, by wniknąć w te przestrzenie), ani dla kwasu i aldehydu octowego (bardziej naładowane cząsteczki), których działalność jest ograniczona do hydrofilowej części dwuwarstwy [Ingram 1976].

Wydaje się jednak, że tolerancja na alkohol nie jest predefiniowana i w dużej mierze zależy od możliwości adaptacyjnych bakterii lub od właściwości nabytych w toku ewolucji. Jak wykazał Ingram [1976], Gram-ujemne bakterie E. coli K-12 mogą modyfikować skład lipidów w swoich błonach komórkowych. Autor ten ob-serwował, że w obecności krótkołańcuchowych alkoholi (metanolu, etanolu, propa-nolu i butanolu) komórki wytwarzały więcej C18:1 zamiast C16:0, co zwiększało


płynność błon i niwelowało zmiany spowodowane przez alkohol. W przypadku obec-ności wyższych alkoholi (5 do 9 atomów węgla) reakcja była odwrotna – zwiększała się zawartość C16, a malała C18.

Wiadomo, że niektóre bakterie, w szczególności szczepy termofilne, jak np. Zymomonas mobilis, Clostridium thermocellum, Lactobacillus homohiochii i L. he-terohiochii oraz Ruminococcus albus [Ingram 1986, Panesar i in. 2007, Liu i Qureshi 2009], są zdolne do wytwarzania etanolu. Oznacza to, że muszą być one odporne na takie stężenia tej substancji, jakie same mogą wytworzyć. Ilości etanolu, jakie zastosowano w prezentowanych tutaj doświadczeniach, raczej nie przekraczały tej bezpiecznej granicy, należy bowiem przyjąć, że dodatek 3–5% (v/v) etanolu do me-dium oznacza wprowadzenie odpowiednio 2,37–3,94 g alkoholu etylowego na każde 100 ml. Zymomonas mobilis, jeden z bardziej wydajnych bakteryjnych producentów etanolu, charakteryzuje się tolerancją na obecność etanolu w ilości 4 g/100 ml [Senthilkumar i Gunasekaran 2005]. Z kolei Lactobacillus homohiochii i L. hetero-hiochii, zaliczane do najbardziej odpornych na etanol bakterii, zdolne są przeżyć stężenie etanolu do 16%, co sprawia, że stanowią niepożądaną mikrobiotę i powo-dują psucie się win ryżowych i sake [Ingram 1986]. Tę niezwykłą tolerancję zawdzię-czają bardzo dużej zawartości, w swoich błonach, jednonienasyconych kwasów tłusz-czowych, głównie cis-C18:1, i obniżonej zawartości nasyconych łańcuchów acylowych.

Paciorkowce kałowe uznawane są za mikroorganizmy oporne na niekorzystne warunki środowiska, takie jak silnie alkaliczne medium (pH 9,6), duże stężenie soli (6,5%) i żółci (40%) czy obecność związków, które dla większości bakterii są tok-syczne. Wykazano, że E. faecium szczep NRRL B-2354 jest w stanie rosnąć w obec-ności nawet 8% etanolu, jeśli tylko pH środowiska będzie odpowiednio niskie (pH 2,4), a temperatura wysoka (60°C) [Kopit i in. 2014]. Heterofermentatywne gatunki z rodzaju Lactobacillus również mogą wytwarzać nieznaczne ilości etanolu [Liu i Qureshi 2009], co z kolei mogłoby wyjaśniać stosunkowo dużą odporność użytego w tej pracy szczepu na stężenie etanolu w zakresie do 2% (tab. 16). Nie znaleziono natomiast żadnych doniesień o możliwości wytwarzania etanolu przez Bifidobacterium catenulatum ani o jego tolerancji na ten alkohol.

Wpływ związków polifenolowych na bakterie

W prezentowanej pracy oceniano wpływ różnych stężeń czystych związków polife-nolowych (w zakresie 4–250 µg/ml) na badane bakterie. Wybrane związki to: (+)-ka-techina (CAT), kwercetyna (Q) i jej glikozyd rutyna (RUT), naringenina (N) i jej glikozyd naringina (NR), hesperetyna (H) i jej glikozyd hesperydyna (HR), rezwe-ratrol (RS), kemferol (KMP) oraz florydzyna (PHL). Związki te zostały wybrane do badań, gdyż reprezentują polifenole, które można najczęściej znaleźć w wybranych surowcach (co stwierdzono na podstawie analizy profilu polifenoli w badanych eks-


traktach, określonego metodą HPLC, oraz dostępnej literatury przedmiotu). Starano się ponadto wybrać związki o różnej strukturze szkieletu, aby móc sprawdzić, czy któryś z jego elementów ma szczególne znaczenie dla antybakteryjnego działania. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli 17. Dla związków o aktywności inhibitoro-wej wyznaczono wartości MIC (tab. 18).

Wykazano, że już w stężeniu 20 µg/ml na wszystkie badane gatunki bakterii hamująco działały kwercetyna i kemferol, przy czym w przypadku BF i EN siła hamowania była porównywalna do efektu działania kontrolnego antybiotyku – chlo-ramfenikolu (ChlA) (tab. 17 i 18). Naringenina działała bakteriobójczo wobec EN, RUMI, LCB, BAC i BF, a bakteriostatycznie na pozostałe bakterie, jednak dopiero w stężeniu powyżej 100 µg/ml. Hesperetyna w najwyższym stężeniu ograniczała wzrost wszystkich badanych gatunków z wyjątkiem LCB, przy czym przeważnie było to zmniejszenie liczebności populacji o kilkanaście procent w stosunku do kontroli pozytywnej, czyli liczebności bakterii w medium bez polifenolu. Bakteriostatyczny efekt hesperetyny był wyraźnie widoczny w przypadku Ruminococcus i Enterococcus, a liczebność populacji tych bakterii po zastosowaniu 250 µg H/ml wynosiła odpo-wiednio 27% i 38% wartości kontrolnej. Eubacterium cylindroides to jedyna bakte-ria, spośród badanych, niewrażliwa na rezweratrol. Wobec pozostałych bakterii związek ten działał bakteriobójczo (EN, RUMI, LCB, BAC) lub bakteriostatycznie (EC, BF) i to już w stężeniu 100 µg/ml. Ani (+)-katechina, ani rutyna nie wpływa-ły znacząco na badane bakterie, z wyjątkiem EN, którego liczebność była nieznacz-nie ograniczona w obecności tych związków. Z kolei florydzyna powodowała lekką stymulację wzrostu LCB, BF, EC i EUB, a efekt inhibitorowy wykazywała jedynie wobec EN. Wyznaczone wartości MIC dla poszczególnych polifenoli w odniesieniu do konkretnych gatunków wahały się od 20 do ponad 250 µg/ml i były z reguły wyższe od MIC dla chloramfenikolu (tab. 18).

Z badanych gatunków bakterii najbardziej podatny na dodatek polifenoli do medium okazał się Enterococcus caccae – po 24-godzinnej inkubacji w obecności tych związków w najwyższych badanych stężeniach obserwowano efekty w zakresie od zmniejszenia się liczebności bakterii o 5% w stosunku do kontroli (w przypadku rutyny) aż do całkowitego zaniku bakterii (w przypadku rezweratrolu). Niejako na drugim biegunie wrażliwości znalazła się E. coli, na której wzrost nie miały wpływu (+)-katechina i rutyna, a hesperydyna, naringina i florydzyna nawet nieznacznie go stymulowały.

Analizując budowę chemiczną badanych polifenoli, zaobserwowano kilka cieka-wych prawidłowości (ryc. 6). Po pierwsze, glikozydy (rutyna, naringenina i hespery-dyna) nie wykazywały działania przeciwbakteryjnego lub było ono znikome w porów-naniu z działaniem odpowiedniego aglikonu. Wyniki te są zbieżne z rezultatami, jakie uzyskali Mandalari i inni [2007], którzy wykazali, że deglikozylacja za pomocą enzymu Pectinase 62L znacząco zwiększa antybakteryjną aktywność flawonoidów cytrusowych. Oznacza to, że aktywność flawanonów zależy od obecności bądź braku


przyłączonego cukru w cząsteczce. Wyniki niniejszej pracy wskazują, że aglikony także mogą się bardzo różnić aktywnością przeciwbakteryjną. Naringenina, w stęże-niu 100 i 250 µg/ml, spowodowała zmniejszenie liczebności poszczególnych bakterii odpowiednio o 7–99% i o 19–100% w stosunku do kontroli, podczas gdy hesperety-na w tych stężeniach w większości przypadków ograniczała ich liczebność zaledwie o kilkanaście procent lub wcale nie działała hamująco (LCB). Jak już zademonstro-wano wcześniej, naringenina jest blisko 3-krotnie silniejszym przeciwutleniaczem niż hesperetyna (tab. 15). Naringenina ma o jeden podstawnik mniej (w pierścieniu B nie zawiera grupy –OH przy atomie węgla C3’), ale jej grupa hydroksylowa w pozy-cji para- w tym pierścieniu jest wolna, w odróżnieniu od metylowanej grupy –OH w hesperetynie. Osłabienie właściwości przeciwbakteryjnych wobec Bacillus cereus i innych bakterii, wywołane metylacją grupy hydroksylowej, wykazali już inni autorzy, choć w odniesieniu do innych związków [Dorman i Deans 2000, Ultee i in. 2002]. Sugerowali oni, że przyczyną osłabienia właściwości antybakteryjnych jest zmiana w układzie delokalizacji elektronów. Dwie pozostałe grupy hydroksylowe, w pozycji C5 i C7 (pierścień C), są identyczne w naringeninie i hesperetynie, i w obu przypad-kach są niepodstawione. W niniejszej pracy obserwowano jednak, że glikozylacja grupy –OH w pozycji C7 znacząco zmniejszała zarówno działanie antybakteryjne flawanonów, jak i ich potencjał antyoksydacyjny (tab. 15 i 17). Na podstawie oma-wianych wyników można wysnuć wniosek, że obecność wolnych grup hydroksylowych w pozycji C7 oraz C4’ odgrywa znaczącą rolę w kształtowaniu aktywności antybak-teryjnej flawanonów, o ile nie wszystkich polifenoli.

Struktura katecholu (grupy –OH w pozycji C3’ i C4’ pierścienia B), jak już wspomniano, ma istotne znaczenie dla aktywności antyoksydacyjnej cząsteczki [Burda i Oleszek 2001], ale – co wykazano w tej pracy – niekoniecznie dla jej działania antybakteryjnego. Wprawdzie zarówno (+)-katechina, jak i kwercetyna oraz jej glikozyd zawierają taki układ w swojej strukturze (ryc. 6.), jednak (+)-katechina i rutyna praktycznie nie wywierały wpływu na bakterie (poza EN), podczas gdy kwercetyna działała bardzo silnie (tab. 17). Niska aktywność antybakteryjna rutyny wynikała prawdopodobnie z połączenia aglikonu z rutynozą. Podobnie jak w przy-padku hesperydyny i naringiny, przyłączona cząsteczka cukru mogła stwarzać zawa-dę steryczną i blokować reakcję glikozydu z odpowiednimi miejscami na ścianie komórkowej bakterii. W przeciwieństwie do rutyny (+)-katechina nie występuje w postaci glikozydów, a w porównaniu z kwercetyną brak jej podwójnego wiązania i grupy ketonowej w pierścieniu A. Podwójne wiązanie wydaje się nie odgrywać istotnej roli w aktywności antybakteryjnej flawonoidów, gdyż niezawierająca go naringenina działała hamująco na większość badanych bakterii, choć dopiero w kil-kukrotnie wyższym stężeniu niż kwercetyna. Prawdopodobnie mechanizm działania naringeniny jest zupełnie inny niż kwercetyny.

Postuluje się, że im więcej grup –OH zawierają pochodne, tym większą mają aktywność przeciwdrobnoustrojową, gdyż mogą skuteczniej działać na powierzchni


bela

17.

W

pływ

dod

atku

pol

ifeno

li na

wzr

ost

bakt

erii

jelit

owyc

h pr

zeds

taw

iony

jako

pro

cent

w s

tosu

nku

do li

czeb

nośc

i kom

órek

bak

teri

i da

nego

gat

unku

w k

ontr

oli p

ozyt

ywne

j, tj.

hod

owli

bakt

erii

bez

doda

tku

etan

olu

(% K

poz;

śred

nia

± S

D, n

≥ 6

) Ta

ble

17.

Eff

ect

of t

he a

dditi

on o

f po

lyph

enol

s on

the

gro

wth

of

inte

stin

al b

acte

ria

expr

esse

d as

per

cent

rel

ativ

e to

bac

teri

a ce

ll co

unt

of

a gi

ven

spec

ies

in p

ositi

ve c

ontr

ol, i

.e. b

acte

ria

cultu

re in

med

ium

with

out

etha

nol a

dded

(%

Kpo

z; m

ean

± S

D, n

≥ 6

)

Polifenol / Polyphenol

Stężenie końcoweFinal concentration

[µg/ml]

EN

RU

MI

LC

BE

CB

AC

EU

BB

F

CA

T

20 8

0,41

± 3

,94

*a 10

0,06

± 0

,51

a 10

0,53

± 1

,59

a 11

0,78

± 1

,28

*a 9

8,43

± 1

,18

a 9

6,90

± 1

,80

a 10

1,71

± 1

,94

a

100

78,

91 ±

1,3

0 *a

99,

47 ±

1,2

0 a,

b 9

9,87

± 1

,78

a 10

4,78

± 6

,38

*b 10

1,68

± 0

,98

a 9

7,47

± 1

,29

a 9

8,56

± 2

,05

b

250

81,

05 ±

1,4

9 *a

98,

94 ±

0,4

9 *b

98,

19 ±

2,9

3 a

102,

32 ±

2,2

9 b

101,

25 ±

1,7

7 a

95,

67 ±

2,4

1 a

99,

16 ±

0,8

7 b

HR

20 9

5,66

± 0

,91

a 9

8,24

± 0

,95

*b

101,

71 ±

1,7

3 a

107,

79 ±

2,2

9 *a

95,

59 ±

2,8

8 *a

91,

49 ±

6,1

1 *b

94,

75 ±

6,5

1 a,

b

100

96,

50 ±

1,4

8 a

99,

89 ±

0,6

7 a

91,

41 ±

2,2

1 *b

108,

04 ±

3,2

6 *a

96,

28 ±

0,7

8 *a

101,

23 ±

0,8

4 a

95,

82 ±

4,0

8 a

250

92,

48 ±

1,5

3 a

97,

65 ±

0,6

2 *b

103,

17 ±

0,9

3 *a

102,

79 ±

3,2

3 b

96,

03 ±

0,5

9 *a

94,

25 ±

5,7

9 a

84,

05 ±

14,

78 *b

H

20 9

9,36

± 1

,69

a 8

4,76

± 2

,77

*a 10

3,79

± 0

,99

*a 10

6,34

± 1

,22

*a 10

4,44

± 0

,79

a 9

4,68

± 0

,89

a 10

2,18

± 7

,16

a

100

101,

02 ±

2,0

7 a

27,

25 ±

11,

98 *

b 9

8,34

± 3

,77

b 9

5,82

± 3

,28

*b 8

1,27

± 8

,79

*b 8

9,21

± 4

,79

*a 8

4,95

± 7

,47

*b

250

37,

75 ±

2,4

6 *b

27,

21 ±

0,7

0 *b

101,

48 ±

0,7

0 b

92,

38 ±

1,1

9 *c

93,

59 ±

2,8

3 *c

95,

23 ±

2,6

7 a

83,

54 ±

0,9

9 *b

NR

20 8

8,57

± 1

,26

*a 9

6,61

± 2

,07

*a, b

100,

58 ±

2,5

0 a

108,

23 ±

2,5

4 *a

92,

59 ±

0,7

2 *a

106,

64 ±

3,8

6 a

102,

64 ±

1,0

1 a

100

90,

16 ±

2,0

5 *a

95,

72 ±

2,4

9 *b

101,

85 ±

0,8

5 a

107,

90 ±

1,9

9 *a

8

1,92

± 2

,31

*b 9

6,81

± 4

,60

b 9

9,88

± 2

,16

a

250

89,

57 ±

1,6

0 *a

98,

14 ±

0,4

5 *a

101,

67 ±

1,1

8 a

107,

85 ±

1,7

9 *a

95,

43 ±

1,0

5 *a

99,

66 ±

1,1

7 a,

b 8

7,77

± 7

,68

*b

N

20 8

1,50

± 0

,84

*a 4

6,94

± 2

,24

*a 10

2,85

± 1

,29

a 9

6,33

± 1

,99

*a 10

4,82

± 1

,19

*a 11

4,78

± 5

,07

*a 9

6,42

± 4

,34

a

100

55,

62 ±

1,3

3 *b

1,

19 ±

1,2

8 *b

64,

27 ±

13,

89 *

b 8

3,33

±3,

74 *

b 5

5,89

± 5

,80

*b 9

3,52

± 1

,40

b 4

7,50

± 1

2,49

*b

250

3,

93 ±

0,4

9 *c

0,

00 ±

0,0

3 *b

1,

81 ±

0,4

3 *c

73,

78 ±

1,27

*c

0,

00 ±

0,0

8 *c

81,

15 ±

3,2

0 *c

7,

49 ±

3,1

4 *c


PHL

20 8

6,34

± 1

,12

*a 9

9,53

± 0

,68

a 10

4,51

± 1

,07

*a 10

9,46

± 1

,13

*a 9

5,95

± 1

,33

*b 9

5,12

± 0

,77

b 11

0,29

± 1

,10

*a

100

82,

25 ±

1,2

0 *a

97,

69 ±

0,6

9 a,

b 10

4,59

± 2

,38

*a 10

5,67

± 2

,06

*b

98,3

2 ±

2,1

3 a,

b 9

3,27

± 4

,77

b 10

8,11

± 1

,42

*a

250

79,

41 ±

6,4

8 *a

85,

08 ±

22,

63 *

b 10

5,21

± 1

,19

*a 10

7,56

± 2

,01

*a, b

100,

03 ±

2,2

4 a

105,

20 ±

2,6

2 a

102,

07 ±

3,4

1 b

RS

20 8

6,62

± 2

,11

*a 8

2,62

± 3

,95

*a 7

5,02

± 6

,97

*a 9

9,67

± 2

,22

a 9

3,32

± 1

,20

*a 10

2,12

± 6

,22

a 10

2,52

± 1

,68

a

100

58,

44 ±

2,5

2 *b

1,

68 ±

0,5

3 *b

0,

68 ±

0,5

0 *b

78,

82 ±

6,4

0 *b

22,

65 ±

9,3

2 *b

105,

11 ±

0,8

9 a

58,

04 ±

13,

38 *b

250

0,

00 ±

1,7

8 *c

2,

39 ±

1,4

0 *b

0,

00 ±

0,0

5 *b

48,

23 ±

6,6

7 *c

1,

14 ±

0,7

9 *c

107,

12 ±

7,4

7 a

23,

05 ±

4,0

4 *c

RU

T

20 9

3,81

± 1

,21

a 9

6,25

± 0

,73

*b 10

2,46

± 1

,94

a, b

105,

42 ±

3,1

8 *a

97,

45 ±

1,6

6 a

99,

77 ±

2,5

4 a

100,

46 ±

1,9

7 a

100

94,

05 ±

1,1

8 a

96,

68 ±

0,4

2 *b

102,

91 ±

1,4

2 *a

101,

97 ±

1,5

6 b

96,

70 ±

1,5

6 a

97,

49 ±

3,2

1 a

100,

00 ±

6,2

3 a

250

95,

18 ±

1,1

6 a

98,

92 ±

0,5

9 *a

99,

93 ±

2,6

2 b

100,

78 ±

1,5

9 b

96,

21 ±

0,8

2 *a

94,

02 ±

4,2

8 a

93,

74 ±

5,8

9 *b

KM

P

4 7

2,21

± 1

,79

*a 9

1,01

± 3

,36

*a 9

7,62

± 5

,08

a 9

1,94

± 3

,04

*a 10

7,82

± 1

,77*

a 10

1,65

± 1

2,07

a 9

6,66

± 2

,87

a

20 7

1,23

± 1

,43

*a

5,25

± 0

,76

*b 8

9,40

± 3

,08

*b 8

9,67

± 2

,30

*b 8

2,93

± 2

,48

*b 4

8,75

± 1

0,50

*b

90,

38 ±

3,0

7 *a

50 6

9,21

± 1

,71

*a

8,19

± 1

,66

*c 8

5,58

± 7

,37

*b 8

6,23

± 2

,52

*c 6

8,66

± 1

,34

*c

2,57

± 1

,04

*c 1

6,41

± 9

,03

*b

Q

4 8

9,07

± 0

,84

a 9

4,09

± 1

,06

*a 9

7,09

± 2

,14

a 10

6,00

± 1

,31

*a 9

8,75

± 2

,95

a 10

8,10

± 1

0,08

a 10

3,72

± 0

,60

a

20 7

6,46

± 2

0,70

*a

4,57

± 2

,86

*b 7

1,17

± 7

,58

*b 5

2,25

± 1

,33

*a 6

6,85

± 1

,07

*b 10

0,43

± 2

,45

a 8

9,83

± 4

,53

*b

50 4

8,81

± 1

,65

*b

2,80

± 0

,17

*c 5

8,35

± 8

,54

*c 4

2,79

± 4

,95

*b

2,44

± 4

,00

*c 8

7,11

± 3

,59

*b 1

0,31

± 5

,69

*c

EN

– E

nter

ococ

cus

cacc

ae,

RU

MI

– R

umin

ococ

cus

gauv

reau

ii, L

CB

– L

acto

baci

llus

sp.,

EC

– E

sche

rich

ia c

oli,

BA

C –

Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus,

E

UB

– E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des,

BF

– B

ifido

bact

eriu

m c

aten

ulat

um

CA

T –

(+

)-ka

tech

ina

/ (+

)-ca

tech

in, H

R –

hes

pery

dyna

/ he

sper

idin

, H –

hes

pere

tyna

/ he

sper

etin

, NR

– n

arin

gina

/ na

ring

in, N

– n

arin

geni

na /

nari

n-ge

nin,

RS

– re

zwer

atro

l / r

esve

ratr

ol, R

UT

– r

utyn

a / r

utin

, Q –

kw

erce

tyna

/ qu

erce

tin, K

MP

– ke

mfe

rol /

kae

mpf

erol

, PH

L –

flo

rydz

yna

/ phl

orid

zin

Śred

nie

ozna

czon

e gw

iazd

ką (

*) r

óżni

ą si

ę is

totn

ie w

sto

sunk

u do

kon

trol

i poz

ytyw

nej (

p <

0,0

5).

Mea

ns m

arke

d w

ith a

n as

teri

sk (

*) a

re s

igni

fican

tly d

iffer

ent

in c

ompa

riso

n w

ith p

ositi

ve c

ontr

ol (

p <

0.0

5).

Dla

dan

ej b

akte

rii i

teg

o sa

meg

o po

lifen

olu

śred

nie

ozna

czon

e tą

sam

ą lit

erą

nie

różn

ią s

ię is

totn

ie (

p <

0,0

5).

For

a gi

ven

bact

eria

and

the

sam

e po

lyph

enol

, mea

ns m

arke

d w

ith t

he s

ame

lett

er a

re n

ot s

igni

fican

tly d

iffer

ent

(p <

0.0

5).


Tabela 18. Stężenia hamujące badanych polifenoli dla bakterii jelitowych (µg/ml) Table 18. Inhibitory concentrations of study polyphenols for intestinal bacteria (µg/ml)

PolifenolPolyphenol

EN RUMI LCB EC BAC EUB BF


250* 100 250 > 250** 250 > 250 250

NaringinaNaringin

>> 250*** NI NI NI >> 250 NI > 250

KemferolKeampferol

> 50 20 > 50 > 50 > 50 50 > 50

KwercetynaQuercetin

> 50 20 > 50 > 50 50 > 50 50

RutynaRutin

>> 250 >> 250 NI NI >> 250 >> 250 >> 250

RezweratrolResveratrol

250 100 100 > 250 250 NI > 250


>> 250 >> 250 NI NI >> 250 >> 250 > 250


> 250 > 250 NI >> 250 >> 250 >> 250 > 250

(+)-Katechina(+)-Catechin

> 250 NI NI NI NI >> 250 NI

FlorydzynaPhloridzin

> 250 > 250 NI NI NI NI NI

Chloramfenikol AChloramphenicol A

50 12,5 2 10 2 2 50

EUB – Eubacterium cylindroides, BAC – Bacteroides galacturonicus, LCB – Lactobacillus sp., EN – Enterococcus caccae, BF – Bifidobacterium catenulatum, RUMI – Ruminococcus gauvreauii, EC – Escherichia coli

* wartość wyróżniona pogrubioną czcionką – minimalne stężenie hamujące (MIC), tj. najniższe stężenie powodujące całkowite zahamowanie wzrostu lub zmniejszenie liczebności populacji bak-terii o ponad 90% w stosunku do kontroli value in bold type – minimum inhibitory concentration (MIC), i.e. lowest concentration causing total inhibition of growth or reduction of bacteria population size by more thant 90% relative to control

** wartość ze znakiem „>” – stężenie powodujące zahamowanie wzrostu o 10–90% w stosunku do kontroli value with “>” symbol – concentration causing growth inhibition by 10–90% relative to control

*** wartość ze znakiem „>>” – stężenie powodujące bardzo słabe zahamowanie wzrostu (o mniej niż 10% w stosunku do kontroli) value with “>>”symbol – concentration causing very weak growth inhibition (by less than 10% relative to control)

NI – brak wpływu hamującego przy zastosowanych stężeniach polifenoli (20, 100 i 250 µg/ml; rezwera-trol i kwercetyna: 4, 20 i 50 µg/ml) no inhibitory effect at polyphenol concentrations applied (20, 100 and 250 µg/ml; resveratrol and quercetin: 4, 20 and 50 µg/ml)


komórek, łącząc się z grupami sulfhydrylowymi białek, oraz łatwiej wiązać się do miejsc aktywnych w enzymach, przez co zmieniają metabolizm mikroorganizmów [Friedman i in. 2003, Gyawali i Ibrahim 2014]. Wiadomo również, że jednoczesna obecność wolnych grup hydroksylowych w pozycjach C3, C5, C3’ i C4’ oraz grupy C=O przy C4 jest niezbędna do wiązania jonów metali, które w przypadku wielu gatunków bakterii stanowi czynnik ograniczający ich wzrost. Naringenina nie ma grup –OH w pozycji C3 i C3’ ani wiązania podwójnego C2=C3, jej struktura jest zatem raczej mało dostosowana do chelatowania jonów metali. W stężeniu 20 µg/ml naringenina wywierała tylko słaby efekt bakteriostatyczny wobec RUMI i EN, podczas gdy kwer-cetyna w takim samym stężeniu hamowała wzrost wszystkich badanych bakterii z wy-jątkiem EUB. Z kolei kemferol, o budowie strukturalnej niemal identycznej jak kwer-cetyna, różniący się od niej tylko brakiem grupy –OH przy C3’, w stężeniu 20 µg/ml wpływał hamująco na wszystkie badane bakterie, w tym EUB. Co więcej, wszystkie trzy flawonoidy miały zbliżoną zdolność zmiatania rodnika ABTS (tab. 15).

Przedstawione wyniki sugerują, że mechanizm działania naringeniny prawdopo-dobnie nie zależy od zdolności chelatowania jonów metali ani zdolności zmiatania rodników, ale jest raczej efektem właściwości cząsteczki i jej swoistej struktury prze-strzennej. Istnieją doniesienia wskazujące, że w środowisku hydrofilowym naringenina może działać prooksydacyjnie [Tripoli i in. 2007], co mogłoby stanowić podstawę jej aktywności antybakteryjnej, zwłaszcza w wyższych stężeniach. Z danych literaturowych wiadomo, że naringenina może oddziaływać z ludzkim cytochromem P450 (np. CYP3A4) [Ho i in. 2001]. O ile badania nad wpływem flawonoidów na ludzkie izozymy CYP są powszechne, co wynika z niezmiernie istotnej roli tych hemoprotein w aktywności enzymów odpowiadających za metabolizm steroidów, ksenobiotyków, w tym leków, o tyle doświadczeń z bakteryjnymi CYP praktycznie się nie prowadzi. Jak dotąd stwierdzono jedynie, że wiele gatunków bakterii również zawiera cytochromy z grupy P450, które uczestniczą w istotnych dla bakterii prze-mianach kwasów tłuszczowych, detoksykacji olejków eterycznych (np. kamfory, terpineolu) czy metabolizmie antybiotyków [Lewis i Wiseman 2005]. Zmniejszenie aktywności enzymów z tej grupy miałoby zatem bardzo poważne konsekwencje dla funkcjonowania komórki bakteryjnej. Co ciekawe, cytochromów P450 nie wykryto u E. coli, co mogłoby wyjaśniać niską wrażliwość tej bakterii na badane polifenole i potwierdzałoby istotność interakcji polifenoli z enzymami pozostałych bakterii dla ich aktywności antybakteryjnej.

Kemferol i kwercetyna wykazywały bardzo podobne działanie antybakteryjne, choć w większości przypadków kemferol nieco słabiej hamował wzrost drobnoustro-jów (tab. 17). Jedynie wobec Eubacterium cylindroides kemferol działał silnie hamu-jąco (spadek liczebności o 98%); bakteria ta wydaje się natomiast dość odporna na kwercetynę – związek ten dopiero w najwyższym zastosowanym stężeniu zmniejszał jej liczebność o 13% w stosunku do kontroli. Różnice w oddziaływaniu omawianych polifenoli mogą wynikać z nieobecności jednej grupy –OH w pierścieniu B cząstecz-


ki kemferolu, co wpływa na interakcje z miejscami aktywnymi w receptorach lub enzymach. Inni badacze wykazali, że taka struktura przestrzenna kemferolu zapo-biega jego idealnemu dopasowaniu do miejsca wiązania w receptorze węglowodorów arylowych (AhR). Związany KMP może blokować wiązanie innych ligandów dla AhR, sam zaś nie wykazuje zdolności do aktywacji transkrypcji cytochromu P450 zależnej od AhR. Z kolei kwercetyna, z grupami hydroksylowymi w konfiguracji orto-, dzia-łała silnie aktywująco, co potwierdza jej idealne dopasowanie do miejsca wiązania w AhR [Moon i in. 2006]. Można zatem przypuszczać, że kemferol przyłączył się do jakiegoś enzymu obecnego w komórkach Eubacterium i zablokował istotny dla funk-cjonowania bakterii proces, podczas gdy kwercetyna nie wykazała takiego wpływu.

Florydzyna – dihydrochalkon szczególnie obficie występujący w jabłkach – zy-skuje ostatnio na znaczeniu ze względu na swoją rolę we wspomaganiu leczenia cukrzycy i otyłości. Wykazano, że jej aglikon (floretyna) aktywnie hamuje wzrost wielu patogenów, jak np. S. aureus, S. Typhimurium czy L. monocytogenes. O ile MIC dla florydzyny jest wysokie, przekraczające 1000 µg/ml, o tyle dla floretyny kształtuje się w zakresie 7,81–125 µg/ml w zależności od szczepu [Barreca i in. 2014]. Wykazano też, że niektóre z bakterii, np. Erwinia herbicola, mają zdolność rozkła-dania florydzyny do jej aglikonu [Chatterjee i Gibbins 1969], floretyna zaś hamuje jeden z enzymów kluczowych dla metabolizmu i pozyskiwania energii w warunkach beztlenowych – dehydrogenazę mleczanową [Barreca i in. 2014]. W prezentowanej pracy glukozyd floretyny – florydzyna – nie wykazywał działania bakteriobójczego, nieznacznie hamując jedynie Enterococcus caccae, a w odniesieniu do pozostałych bakterii działał nawet lekko stymulująco. To może być wynikiem zawady sterycznej blokującej przeciwdrobnoustrojową aktywność związku oraz braku zdolności bada-nych bakterii do odcięcia cząsteczki cukru i uwolnienia aktywnego aglikonu.

Podsumowując powyższe rozważania można stwierdzić, że dla właściwości prze-ciwbakteryjnych badanych związków kluczowa wydaje się jednoczesna obecność niepodstawionych grup –OH w pozycji C5, C7 i C4’ oraz grupy ketonowej przy C4. Nie wykazano, by obecność grupy –OH przy C3 oraz wiązania podwójnego C2=C3 znacząco wpływała na aktywność antybakteryjną flawonoidów. Potwierdzono nato-miast, że aglikony są silniejszymi inhibitorami niż ich glikozydy, tracące potencjał antybakteryjny prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po przyłączeniu cząsteczek cukru. Tę wzmożoną aktywność aglikonów należy mieć na uwadze w przypadku przyjmowania związków polifenolowych w postaci preparatów farmaceutycznych, gdzie związki te występują w wysokich stężeniach i głównie w po-staci aglikonów, podczas gdy w surowcach roślinnych dominują formy glikozydowe.

Rezweratrol to jeden z najlepiej poznanych polifenoli wina, jednak w odróżnie-niu od wcześniej omawianych związków jest nie flawonoidem, lecz stilbenem, o zna-cząco odmiennej strukturze. Rezweratrol to 1,2-difenyloeten, w którym pierścienie aromatyczne mają przyłączone grupy hydroksylowe w pozycji 3, 5 oraz 4’. Stilbeny


są wytwarzane przez rośliny w odpowiedzi na atak różnych mikroorganizmów, co stanowi swoisty mechanizm obrony przed patogenami, z definicji mają więc działa-nie antybakteryjnie i przeciwgrzybiczne, choć mechanizmy te nie zostały jeszcze rozpoznane. Z pewnością istotną rolę odgrywa tutaj liczba i rozmieszczenie grup hydroksylowych. Patrząc na cząsteczkę rezweratrolu (ryc. 6), można zauważyć, że zawiera ona większość elementów, które uznano za istotne dla aktywności antybak-teryjnej. Ma dwie grupy –OH w jednym pierścieniu, i to w konfiguracji odpowiada-jącej położeniu C5 i C7 z pierścienia A flawonoidów, oraz jedną grupę–OH w pier-ścieniu drugim, w konfiguracji odpowiadającej położeniu C4’ w pierścieniu B. Nie zawiera grupy ketonowej, ale ma wiązanie podwójne w łańcuchu łączącym pierście-nie fenylowe, które z pewnością odgrywa istotną rolę. Ovesná i Horváthová-Kozics [2005] wykazały, że potencjał antyoksydacyjny trans-izomerów wiąże się z powsta-waniem ich fenoksyrodników o płaskiej konfiguracji semichinonów, która umożliwia delokalizację niesparowanego elektronu w całej cząsteczce. Przemiana formy trans w cis, zachodząca pod wpływem promieniowania UV, powoduje znaczące obniżenie zdolności zmiatania wolnych rodników. Autorki potwierdziły też, że trans-stilbeny zawierające grupę 4-hydroksylową, podwójne wiązanie oraz grupy w pozycji orto- lub para- charakteryzują się wysokim potencjałem chemoprotekcyjnym, co świadczy o istotności tych struktur dla aktywności biologicznej. Chalal i inni [2014] wykazali, że pochodne rezweratrolu różnią się działaniem antymikrobiologicznym w zależno-ści od liczby grup –OH, ich położenia oraz podstawienia estrem metylowym. Co więcej, ten sam związek może działać hamująco na Botrytis cinerea (pleśń), a nie wykazywać takiego działania wobec Plasmopara viticola (lęgniowiec wywołujący mączniaka rzekomego winorośli). Autorzy twierdzą też, że pochodne metylowe mają większy potencjał przeciwgrzybiczy niż przeciwbakteryjny [Chalal i in. 2014]. Z ko-lei Albert i inni [2011] wykazali, że wszystkie badane przez nich pochodne 4-hydrok-sy-stilbenów działają hamująco wobec Bacillus brevis, a nie działają na Gram-ujemny Enterobacter, podczas gdy pochodne 3-hydroksy-stilbenów hamują laseczki oraz Micrococcus luteus. Ponadto stwierdzili, że najwyższą aktywnością antymikrobiolo-giczną charakteryzują się pochodne z niepodstawioną grupą monohydroksylową w pierścieniu A oraz wolnymi grupami –OH w pozycji 2’ i 5’ w pierścieniu B. Zanotowali również, że aktywność pochodnych stilbenowych w stosunku do grzybów jest bardziej zróżnicowana i zależy zarówno od gatunku grzyba, jak i od rodzaju podstawników w cząsteczce.

Rosnąca wiedza konsumentów na temat prozdrowotnego wpływu polifenoli pro-wadzi do zwiększonego spożycia tych składników. Wielu konsumentów sądzi, że skoro naukowo wykazano, iż kwercetyna jest wydajnym antyoksydantem, który do-datkowo ma właściwości przeciwzapalne, antyproliferacyjne i antynowotworowe, to jej spożywanie jest bezpieczne i korzystne dla organizmu. W konsekwencji kwerce-tyna stała się popularnym suplementem diety i składnikiem wielu preparatów, przy czym jej ilość w 1 tabletce sięga nawet 650 mg. Dzienne spożycie kwercetyny z żyw-


nością szacowane jest na 5 do 40 mg, ale może wynieść do 500 mg, kiedy dieta jest szczególnie bogata w owoce i warzywa spożywane wraz ze skórkami. Należy jednak zauważyć, że w owocach i warzywach mamy do czynienia głównie z glikozydami kwercetyny, podczas gdy suplementy zawierają przede wszystkim jej aglikon. Kiedy jakiś składnik jest dostarczany do organizmu w nadmiarze, osiąga poziom toksycz-ności. Jak dotąd, toksyczny wpływ kwercetyny był obserwowany jedynie in vitro i przy-puszczalnie miał związek z powstawaniem produktów utleniania kwercetyny (chino-nów), które zmieniają funkcję kluczowych dla komórki enzymów [Boots i in. 2008]. Oznacza to jednak, że długotrwałe stosowanie suplementów z kwercetyną może doprowadzić do efektów ubocznych. Podobnie sytuacja wygląda w przypadku rezwe-ratrolu, który coraz częściej można nabyć w postaci suplementów diety mających przedłużać życie, szczególnie otyłych osób. Rezweratrol, tak jak i niskokaloryczna dieta, ma zdolność aktywacji sirtuin – enzymów odpowiedzialnych m.in. za deacyla-cję czynników transkrypcyjnych, co w konsekwencji prowadzi do przemian znacząco wydłużających życie komórki [Siedlecka i Bogusławski 2005]. Stężenie rezweratrolu w tabletce wynosi 100–500 mg, w zależności od producenta, a zalecana dawka dzien-na – aż 500 mg na każde 23 kg masy ciała (dane producenta suplementu podane na ulotce), co oznacza przyjmowanie nawet 2 g (!) tego stilbenu na dobę. To tylko dwa przykłady polifenoli, które bez żadnych ograniczeń, zachęcani reklamami, możemy spożywać w postaci farmaceutyków i suplementów zawierających te związki w stęże-niach wielokrotnie wyższych niż naturalnie spotykane w typowej diecie.

Dokładne mechanizmy działania polifenoli na aparat metaboliczny i genetyczny w komórkach ludzkich są już dość dobrze poznane. To, jak polifenole działają na poszczególne bakterie, nadal jednak pozostaje zagadką i wymaga dalszych szczegóło-wych badań. Bakterie zawierają metaloenzymy, a ponieważ flawonoidy silnie wiążą jony metali, ich działanie może doprowadzić do różnych zaburzeń metabolicznych (zahamowania enzymów, upośledzenia funkcji kanałów jonowych) lub niedoboru żelaza w przewodzie pokarmowym, co dotknie wrażliwe populacje bakteryjne i zmie-ni skład mikrobioty jelitowej. Wśród innych proponowanych mechanizmów aktywno-ści bakteriobójczej flawonoidów należy wymienić zahamowanie aktywności enzymów i generowanie reaktywnych form tlenu przez EGCG czy zahamowanie aktywności gyrazy DNA przez kwercetynę [Cushnie i Lamb 2005]. W związku z tym nadmierna ilość polifenoli, jakie dotrą do jelita, może spowodować zahamowanie wzrostu i zmniej-szenie liczebności dobroczynnej, pożytecznej części mikrobioty, która odpowiada za biokonwersję składników diety, zwiększenie ich biodostępności i bioprzyswajalności. Z tego powodu suplementacja diety preparatami zawierającymi wysokie stężenia pojedynczych składników, zwykle w formie aglikonów, może – zamiast pomóc – wy-wołać efekt niekorzystny dla zdrowia. Szczególnie silny wpływ na pożyteczne bakterie Lactobacillus i Bifidobacterium wykazano w tej pracy dla rezweratrolu i naringeniny (LCB) oraz kwercetyny (BF). O negatywnym wpływie polifenoli należy także pamię-tać, przyjmując leki, gdyż wiele polifenoli wchodzi w interakcję z enzymami odpowia-


dającymi za metabolizm ksenobiotyków, głównie z cytochromem P450 (CYP3A4), powodując zmniejszenie lub zwiększenie siły oddziaływania leku na organizm, co w każdym przypadku może być niebezpieczne [Ho i in. 2001].

Wpływ ekstraktów roślinnych i preparatów farmaceutycznych na bakterie

W prezentowanej pracy do przygotowania ekstraktów roślinnych (10% v/v) wyko-rzystano 80-procentowy etanol, co oznacza, że w medium, do którego dodano eks-trakty w stężeniu 1,0, 2,5 i 5,0%, końcowa zawartość alkoholu etylowego nie prze-kraczała odpowiednio 0,72, 1,8 oraz 3,6%. Ze względu na opisane uprzednio działanie inhibitorowe etanolu wobec bakterii, różne w zależności zarówno od ga-tunku bakterii, jak i stężenia etanolu, uzyskane wyniki przedstawiono jako procent liczebności kontroli pozytywnej (równej 100%) dla danego gatunku drobnoustroju, którą w tym przypadku stanowiła populacja tego drobnoustroju po 24-godzinnej hodowli w medium zawierającym jedynie sam rozpuszczalnik (etanol) w stężeniu równym jego zawartości w pożywce z danym stężeniem ekstraktu. Dla odróżnienia jej od kontroli pozytywnej (Kpoz), jaką zastosowano w obliczeniach dla gotowych preparatów (zob. tab. 21) i czystych polifenoli (tab. 17), czyli hodowli w medium bez żadnych dodatków, nazwano ją kontrolą etanolową (KEtOH). Przykładowo, w przy-padku oceny wpływu dodatku 1,0, 2,5 oraz 5,0% (v/v) ekstraktu z malin na bakterie Enterococcus caccae, liczbę komórek po inkubacji z tym ekstraktem przedstawiono jako % KEtOH, czyli procent liczebności EN po 24-godzinnej hodowli w obecności odpowiednio 0,72, 1,8 oraz 3,6% czystego etanolu. Te stężenia etanolu odpowiada-ją maksymalnej zawartości alkoholu w medium z dodatkiem odpowiednich dawek ekstraktu. Dzięki takiemu ujęciu wyników hamujący wpływ składników ekstraktu na badaną bakterię będzie wyrażony przez wartości niższe od 100% KEtOH, podczas gdy działanie stymulujące (ewentualnie ochronne) będzie ukazane przez wartości wyższe od 100% KEtOH. Wpływ poszczególnych ekstraktów na wzrost bakterii jelitowych zaprezentowano w tabelach 19 i 20. Z uwagi na bardzo silny hamujący wpływ eta-nolu na Bifidobacterium catenulatum nie przedstawiono wpływu etanolowych eks-traktów roślinnych na ten drobnoustrój. Uzyskane wyniki wskazywały bowiem na nawet do kilku tysięcy razy większą liczebność tej bakterii w hodowlach z ekstrak-tami, co niekoniecznie było spowodowane ich potencjałem stymulującym, lecz raczej wyjątkowo niską liczbą komórek BF na skutek zahamowania ich wzrostu przez al-kohol. W tej sytuacji nawet nieznaczne różnice sprawiały, że uzyskiwano wyniki niejako „wyolbrzymione”, w związku z czym trudno było uznać je za wiarygodne i zostały one pominięte w prezentacji. W przypadku gotowych preparatów, tj. Citroseptu i soku z noni, które nie zawierały etanolu, wyniki dla wszystkich gatunków bakterii przedstawiono jako % Kpoz, czyli procent liczebności bakterii po 24-godzin-nej hodowli w medium bez żadnych dodatków (tab. 21).


bela

19.

W

pływ

dod

atku

eks

trak

tów

eta

nolo

wyc

h z

owoc

ów p

igw

owca

jap

ońsk

iego

(P)

, m

alin

y (M

), ż

uraw

iny

(Ż),

cyt

ryńc

a ch

ińsk

iego

(C

CH

), d

eren

ia ja

daln

ego

(D),

bor

ówki

bru

szni

cy (

B),

goj

i (G

) i c

zarn

ego

bzu

(BE

Z)

na w

zros

t ba

kter

ii je

litow

ych

prze

dsta

wio

-ny

jako

pro

cent

w s

tosu

nku

do li

czeb

nośc

i kom

órek

bak

teri

i dan

ego

gatu

nku

w k

ontr

oli e

tano

low

ej, t

j. ho

dow

li ba

kter

ii w

med

ium

z

etan

olem

o o

dpow

iedn

im s

tęże

niu

(% K

EtO

H; ś

redn

ia ±

SD

, n ≥

3)

Tabl

e 19

. E

ffec

t of t

he a

dditi

on o

f eth

anol

ic e

xtra

cts

from

Jap

anes

e qu

ince

(P)

, ras

pber

ry (

M),

cra

nber

ry (

Ż),

Sch

isan

dra

(CC

H),

cor

nelia

n ch

erry

(D

), li

ngon

berr

y (B

), g

oji (

G),

and

eld

erbe

rry

(BE

Z)

frui

ts o

n th

e gr

owth

of

inte

stin

al b

acte

ria

expr

esse

d as

per

cent

rel

a-tiv

e to

bac

teri

a ce

ll co

unt

of a

giv

en s

peci

es in

eth

anol

ic c

ontr

ol, i

.e. b

acte

ria

cultu

re in

med

ium

with

eth

anol

at

an a

ppro

pria

te

conc

entr

atio

n (%

KE

tOH; m

ean

± S

D, n

≥ 3

)

Eks

trak

tE

xtra

ct

Stęż

enie

ko

ńcow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

EN

R

UM

I L

CB

E

C

BA

C

EU

B

P

1,0%

88,

40 ±

1,3

7 *a

103,

97 ±

0,5

8 a

94,

15 ±

2,3

7 b

122

,73

± 4

,60

*a 10

0,15

± 0

,75

a

89,4

2 ±

5,4

7 *a

2,5%

80,

28 ±

0,9

2 *b

104,

52 ±

0,5

4 *a

91,

65 ±

3,5

1 *b

50

,58

± 1

,04

*b

50,4

0 ±

0,9

2 *b

10

,52

± 3

,64

*b

5,0%

56,

78 ±

1,3

1 *c

102,

97 ±

1,5

8 a

118,

52 ±

1,8

5 *a

50

,65

± 7

,36

*b

7,16

± 1

,80

*c

2,98

± 0

,89

*b

M

1,0%

95,

36 ±

5,3

4 a

105,

29 ±

4,7

9 *b

81,

10 ±

8,8

9 *a

95

,26

± 7

,15

a

93,6

8 ±

7,7

7 c

91

,67

± 2

,09

*a

2,5%

87,

29 ±

6,9

4 *a

103,

31 ±

0,9

9 b

85,

75 ±

7,3

1 *a

82

,11

± 1

1,52

*b

118,

91 ±

6,1

9 b

61

,91

± 6

,07

*b

5,0%

73,

37 ±

18,

76 *

b 11

2,13

± 7

,55

*a 7

6,91

± 3

,56

*a

45,2

1 ±

4,8

5 *c

167,

62 ±

20,

21 *

a

3,12

± 1

,76

*c

Ż

1,0%

100,

92 ±

0,5

3 a

98

,93

± 1

,17

b 8

6,99

± 1

,76

*a

97,8

5 ±

13,

01 a

85

,96

± 9

,33*

c

58,7

2 ±

11,

82 *

a

2,5%

93,

81 ±

1,6

6 *b

99

,52

± 2

,01

b 7

7,35

± 1

1,62

*a

65

,00

± 1

0,28

*b

110,

04 ±

13,

20 b

11

,08

± 2

,39

*b

5,0%

90,

21±

0,6

2 *b

106,

02 ±

3,9

4 *a

3,

43 ±

0,2

9 *b

25

,67

± 9

,81

*c 16

7,63

± 1

1,28

*a

0,

00 ±

2,0

9 *c

CC

H

1,0%

83,

75 ±

1,7

1 *a

93

,72

± 3

,28

a 9

5,66

± 0

,70

a

93,1

5 ±

12,

25 a

77

,86

± 0

,96

*a 10

8,43

± 3

,98

*a

2,5%

55,

22 ±

2,9

6 *b

66

,85

± 1

0,69

*b

49,

86 ±

7,9

1 *b

69

,11

± 2

,82

*b

45,5

9 ±

7,5

9 *b

75

,88

± 1

,98

*b

5,0%

2,

90 ±

1,1

1 *c

44

,36

± 1

6,89

*c

0,

99 ±

0,5

5 *c

11

,19

± 8

,04

*c

37,0

7 ±

3,7

2 *c

5,

07 ±

3,7

8 *c


D

1,0%

93,

08 ±

1,1

4 *a

99

,66

± 1

,73

a 9

7,23

± 1

,98

a 1

05,3

6 ±

11,

59 a

89

,01

± 5

,06

c 10

5,74

± 4

,31

b

2,5%

79,

96 ±

1,0

0 *b

97

,90

± 3

,17

a 9

3,74

± 3

,60

a 1

05,2

9 ±

4,9

3 a

106,

34 ±

6,9

3 b

96

,96

± 7

,12

b

5,0%

57,

12 ±

8,2

8 *c

90

,45

± 9

,46

*b 5

4,47

± 5

,11

*b

98,7

6 ±

8,9

4 a

155,

40 ±

11,

56 *

a 13

3,84

± 3

3,07

*a

B

1,0%

98,

69 ±

0,9

8 a

99

,79

± 1

,37

a 9

9,53

± 7

,62

b

96,4

1 ±

17,

08 a

73

,37

± 1

1,61

*b

70

,38

± 3

,02

*a

2,5%

83,

49 ±

0,8

4 *b

102,

58 ±

1,2

4 a

100,

67 ±

12,

61 b

70,7

3 ±

8,0

9 *b

111,

10 ±

8,6

8 a

42

,82

± 1

,43

*b

5,0%

64,

11 ±

4,7

5 *c

102,

43 ±

3,4

7 a

139,

00 ±

18,

73 *

a

43,6

7 ±

6,0

2 *c

114,

52 ±

16,

63 a

1,

80 ±

2,4

0 *c

G

1,0%

88,

94 ±

4,4

7 *b

108,

40 ±

3,1

6 *b

105,

14 ±

5,6

2 b

109

,07

± 2

,92

b

95,9

7 ±

5,3

0 c

77

,73

± 3

,04

*a

2,5%

90,

61 ±

1,1

1 *a

110,

01 ±

2,3

2 *a

, b 10

5,63

± 6

,74

b 1

08,3

4 ±

6,0

3 b

117,

34 ±

10,

67 b

29,4

7 ±

2,4

0 *b

5,0%

58,

59 ±

1,8

9 *c

113,

54 ±

8,7

4 *a

135,

69 ±

7,3

1 *a

134

,30

± 3

2,87

*a

156,

86 ±

23,

46 *

a

0,00

± 2

,52

*c

BE

Z

1,0%

93,

85 ±

1,5

0 *a

103,

84 ±

0,7

8 b

98,

39 ±

4,4

2 b

115

,24

± 2

,80

*a 11

4,50

± 0

,14

*a 10

9,29

± 7

,15

*a

2,5%

84,

28 ±

2,0

7 *b

105,

94 ±

0,5

9 *b

98,

43 ±

4,6

0 b

97

,68

± 1

,76

b 10

3,30

± 3

,63

b

80,8

8 ±

8,1

6 *b

5,0%

70,

51 ±

1,4

4 *c

113,

27 ±

0,5

0 *a

124,

86 ±

3,0

9 *a

76

,36

± 5

,51

*c

19,4

6 ±

7,4

5 *c

79

,27

± 1

,79

*b

EN

– E

nter

ococ

cus

cacc

ae,

RU

MI

– R

umin

ococ

cus

gauv

reau

ii, L

CB

– L

acto

baci

llus

sp.,

EC

– E

sche

rich

ia c

oli,

BA

C –

Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus,

E

UB

– E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des

Śred

nie

ozna

czon

e gw

iazd

ką (

*) r

óżni

ą si

ę is

totn

ie (

p <

0,0

5) w

sto

sunk

u do

kon

trol

i poz

ytyw

nej d

la t

ego

sam

ego

stęż

enia

eta

nolu

.M

eans

mar

ked

with

an

aste

risk

(*)

are

sig

nific

antly

diff

eren

t (p

< 0

.05)

in c

ompa

riso

n w

ith p

ositi

ve c

ontr

ol f

or t

he s

ame

etha

nol c

once

ntra

tion.

Dla

dan

ej b

akte

rii i

teg

o sa

meg

o ek

stra

ktu

śred

nie

ozna

czon

e tą

sam

ą lit

erą

nie

różn

ią s

ię is

totn

ie (

p <

0,0

5).

For

a gi

ven

bact

eria

and

the

sam

e ex

trac

t, m

eans

mar

ked

with

the

sam

e le

tter

are

not

sig

nific

antly

diff

eren

t (p

< 0

.05)

.


bela

20.

W

pływ

dod

atku

eks

trak

tów

eta

nolo

wyc

h z

ziel

a po

krzy

wy

(PO

), s

piru

liny

(SP)

, so

i (S

), c

zosn

ku n

iedź

wie

dzie

go (

CN

), c

ebul

i cz

erw

onej

(C

C)

i zie

lone

j her

baty

(G

T)

na w

zros

t ba

kter

ii je

litow

ych

prze

dsta

wio

ny ja

ko p

roce

nt w

sto

sunk

u do

licz

ebno

ści k

o-m

órek

bak

teri

i da

nego

gat

unku

w k

ontr

oli

etan

olow

ej, t

j. ho

dow

li ba

kter

ii w

med

ium

z e

tano

lem

o d

anym

stę

żeni

u (%

KE

tOH;

śred

nia

± S

D, n

≥ 3

) Ta

ble

20.

Eff

ect o

f the

add

ition

of e

than

olic

ext

ract

s fr

om n

ettle

her

b (P

O),

spi

rulin

a (S

P), s

oybe

an (

S), b

ear’

s ga

rlic

(C

N),

red

oni

on (

CC

),

and

gree

n te

a (G

T)

on t

he g

row

th o

f in

test

inal

bac

teri

a ex

pres

sed

as p

erce

nt r

elat

ive

to b

acte

ria

cell

coun

t of

a g

iven

spe

cies

in

etha

nolic

con

trol

, i.e

. bac

teri

a cu

lture

in m

ediu

m w

ith e

than

ol a

t an

app

ropr

iate

con

cent

ratio

n (%

KE

tOH; m

ean

± S

D, n

≥ 3

)

Eks

trak

tE

xtra

ct

Stęż

enie

ko

ńcow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

EN

R

UM

I L

CB

E

C

BA

C

EU

B

PO

1,0%

90,

53 ±

1,7

7 *a

97

,18

± 1

,59

b

94,0

8 ±

1,8

1 b

129

,74

± 3

,00

*c 8

9,42

± 0

,40

*c 8

6,23

± 7

,76

*b

2,5%

84,

29 ±

1,4

6 *b

97

,12

± 1

,22

b

94,5

8 ±

1,8

7 b

169

,56

± 3

,11

*b 11

6,45

± 0

,86

*b 8

1,07

± 1

0,85

*b

5,0%

83,

19 ±

1,3

4 *b

107

,40

± 1

,01

*a 1

29,0

4 ±

4,3

4 *a

289

,15

± 1

2,53

*a

201,

59 ±

2,4

4 *a

181,

21 ±

6,7

6 *a

SP

1,0%

122,

46 ±

24,

82 *

a 1

02,4

3 ±

1,5

5 b

96

,28

± 7

,81

b 1

07,8

4 ±

5,4

5 a

87,

10 ±

5,0

3 *a

74,

54 ±

1,0

5 *a

2,5%

121,

17±

32,

33 *

a 1

02,2

9 ±

2,0

5 b

90

,40

± 7

,20

*b

40,2

6 ±

4,7

3 *b

95,

34 ±

6,1

9 a

45,

34 ±

0,6

5 *b

5,0%

60,

34 ±

5,2

7 *b

115

,19

± 3

,66

*a 1

10,6

3 ±

5,1

6 a

30

,75

± 1

1,45

*c

45,

31 ±

4,9

9 *b

5,

11 ±

2,3

3 *c

S

1,0%

100,

14 ±

9,6

4 a

103

,24

± 2

,66

a 1

11,5

4 ±

4,1

6 *b

108

,82

± 9

,69

a 8

3,74

± 7

,45

c 7

3,85

± 5

,71

*a

2,5%

93,

97 ±

11,

13 a

105

,80

± 6

,41

a 1

11,7

2 ±

2,3

2 *b

56

,40

± 4

,96

*b 10

7,93

± 1

,82

b 1

6,75

± 3

,26

*b

5,0%

55,

75 ±

1,9

8 *b

104

,87

± 5

,28

a 1

29,7

6 ±

2,0

9 *a

27

,85

± 1

3,67

*c

142,

83 ±

24,

96 *

a

1,51

± 1

,40

*c

CN

1,0%

92,

60 ±

0,8

5 *a

105

,29

± 3

,68

b 1

06,3

9 ±

8,2

5 b

111

,46

± 3

,95

*a

83,

33 ±

6,3

1 *c

110,

11 ±

4,6

2 *a

2,5%

83,

71 ±

0,9

1 *b

104

,19

± 5

,36

b 1

05,1

1 ±

4,9

4 b

39

,71

± 8

,09

*b 9

9,59

± 3

,74

b 7

4,61

± 1

,24

*b

5,0%

74,

44 ±

4,3

6 *c

114

,00

± 8

,97

*a 1

28,2

0 ±

1,9

9 *a

51

,87

± 2

,22

*c 13

2,66

± 2

0,62

*a

9,

96 ±

2,6

1 *c


CC

1,0%

94,

63 ±

6,5

7 a

98

,39

± 0

,76

b

89,2

7 ±

3,6

5 *a

79

,38

± 4

,80

*a 9

7,83

± 1

,45

c 9

8,69

± 2

,91

a

2,5%

86,

84 ±

1,5

3 *b

99

,79

± 1

,01

b

87,5

9 ±

3,6

0 *a

80

,31

± 7

,05

*a 12

1,09

± 6

,19

*b 9

1,01

± 1

0,26

*a

5,0%

65,

96 ±

7,7

7 *c

112

,48

± 1

,52

*a

5,76

± 2

,39

*b

52,1

6 ±

5,6

8 *b

192,

53 ±

11,

94 *

a 4

4,09

± 8

,36

*b

GT

1,0%

99,

88 ±

8,6

8 a

105

,44

± 0

,71

*a 1

16,3

7 ±

4,9

8 *b

89

,28

± 1

7,52

a 8

5,63

± 3

,74

*a 9

3,94

± 2

,81

*a

2,5%

94,

57 ±

7,6

8 a

105

,73

± 1

,03

*a 1

15,8

9 ±

8,6

8 *b

52

,66

± 7

,07

*b 6

9,61

± 4

,74

*b 4

0,92

± 1

,98

*b

5,0%

78,

52 ±

2,5

2 *b

96

,28

± 6

,41

b 1

38,3

4 ±

5,0

7 *a

40

,38

± 1

7,14

*c

72,

03 ±

5,5

8 *b

1,

15 ±

0,7

7 *c

EN

– E

nter

ococ

cus

cacc

ae,

RU

MI

– R

umin

ococ

cus

gauv

reau

ii, L

CB

– L

acto

baci

llus

sp.,

EC

– E

sche

rich

ia c

oli,

BA

C –

Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus,

E

UB

– E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des

Śred

nie

ozna

czon

e gw

iazd

ką (

*) r

óżni

ą si

ę is

totn

ie (

p <

0,0

5) w

sto

sunk

u do

kon

trol

i poz

ytyw

nej d

la t

ego

sam

ego

stęż

enia

eta

nolu

. M

eans

mar

ked

with

an

aste

risk

(*)

are

sig

nific

antly

diff

eren

t (p

< 0

.05)

in c

ompa

riso

n w

ith p

ositi

ve c

ontr

ol f

or t

he s

ame

etha

nol c

once

ntra

tion.

Dla

dan

ej b

akte

rii i

teg

o sa

meg

o ek

stra

ktu

śred

nie

ozna

czon

e tą

sam

ą lit

erą

nie

różn

ią s

ię is

totn

ie (

p <

0,0

5).

For

a gi

ven

bact

eria

and

the

sam

e ex

trac

t, m

eans

mar

ked

with

the

sam

e le

tter

are

not

sig

nific

antly

diff

eren

t (p

< 0

.05)

.


bela

21.

W

pływ

dod

atku

Citr

osep

tu (

CIT

) i s

oku

z no

ni (

N)

na w

zros

t ba

kter

ii je

litow

ych

prze

dsta

wio

ny ja

ko p

roce

nt w

sto

sunk

u do

li-

czeb

nośc

i kom

órek

bak

teri

i dan

ego

gatu

nku

w k

ontr

oli p

ozyt

ywne

j, tj.

hod

owli

bakt

erii

w m

ediu

m b

ez d

odat

ków

(%

Kpo

z; śr

ed-

nia

± S

D, n

≥ 3

) Ta

ble

21.

Eff

ect

of t

he a

dditi

on o

f C

itros

ept

(CIT

) an

d no

ni ju

ice

(NO

) on

the

gro

wth

of

inte

stin

al b

acte

ria

expr

esse

d as

per

cent

rel

ativ

e to

bac

teri

a ce

ll co

unt o

f a g

iven

spe

cies

in p

ositi

ve c

ontr

ol, i

.e. b

acte

ria

cultu

re in

med

ium

with

no

addi

tives

(%

Kpo

z; m

ean

± S

D,

n ≥

3)

PreparatPreparation


EN

RU

MI

LC

BE

CB

AC

EU

BB

F

CIT

1,0%

101,

45 ±

6,6

9 a

108,

52 ±

1,4

9 *a

116,

50 ±

4,3

0 *b

108,

94 ±

2,0

2 a

44,9

7 ±

2,4

6 *a

52

,48

± 1

,15

*a 10

8,62

± 1

6,03

a

2,5%

92,

20 ±

9,0

2 a

102,

46 ±

8,7

4 a

122,

08 ±

6,1

7 *a

,b 3

7,55

± 2

,77

*b 37

,49

± 1

,20

*a

29,0

8 ±

3,9

4 *b

110,

19 ±

18,

08 a

5,0%

77,

32 ±

17,

44 *

84,

71 ±

1,0

2 *b

124,

15 ±

6,5

5 *a

19,

17 ±

4,6

0 *c

21,8

4 ±

4,6

3 *b

2,

50 ±

1,3

2 *c

90,

74 ±

5,3

6 b

NO

1,0%

95,

31 ±

1,0

0 *a

104,

39 ±

4,4

1 c

107,

61 ±

3,4

2 *b

141,

16 ±

5,0

2 *a

63,0

0 ±

1,8

0 *a

102

,11

± 4

,95

a 13

5,14

± 1

1,71

*b

2,5%

94,

89 ±

1,3

5 *a

111,

79 ±

1,6

4 *b

113,

46 ±

6,5

5 *a

, b 9

4,79

± 7

,97

b 41

,73

± 3

,12

*b

99,5

7 ±

2,4

0 a

140,

55 ±

4,8

3 *a

, b

5,0%

83,

55 ±

1,8

5 *b

118,

18 ±

1,2

0 *a

118,

47 ±

4,7

8 *a

40,

97 ±

2,4

1 *c

28,7

4 ±

8,1

8*b

36

,58

± 1

,22

*b 15

1,69

± 2

,66

*a

EN

– E

nter

ococ

cus

cacc

ae,

RU

MI

– R

umin

ococ

cus

gauv

reau

ii, L

CB

– L

acto

baci

llus

sp.,

EC

– E

sche

rich

ia c

oli,

BA

C –

Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus,

E

UB

– E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des,

BF

– B

ifido

bact

eriu

m c

aten

ulat

um

Śred

nie

ozna

czon

e gw

iazd

ką (

*) r

óżni

ą si

ę is

totn

ie w

sto

sunk

u do

kon

trol

i poz

ytyw

nej (

p <

0,0

5).

Mea

ns m

arke

d w

ith a

n as

teri

sk (

*) a

re s

igni

fican

tly d

iffer

ent

in c

ompa

riso

n w

ith p

ositi

ve c

ontr

ol (

p <

0.0

5).

Dla

dan

ej b

akte

rii i

teg

o sa

meg

o pr

epar

atu

śred

nie

ozna

czon

e tą

sam

ą lit

erą

nie

różn

ią s

ię is

totn

ie (

p <

0,0

5).

For

a gi

ven

bact

eria

and

the

sam

e pr

epar

atio

n, m

eans

mar

ked

with

the

sam

e le

tter

are

not

sig

nific

antly

diff

eren

t (p

< 0

.05)

.


Jak przewidywano, wpływ ekstraktów był znacznie mniej spektakularny niż oczysz-czonych polifenoli, ze względu na złożoną matrycę żywności oraz niższe stężenia związków w medium. Poszczególne rośliny i preparaty wywierały różnorodny wpływ – od stymulującego, przez neutralny, bakteriostatyczny, aż po bakteriobójczy – w za-leżności od gatunku bakterii oraz zastosowanego stężenia. W przypadku stwierdze-nia wpływu hamującego starano się wyznaczyć wartość minimalnego stężenia hamu-jącego (MIC) (tab. 22).

Cytryniec chiński (CCH) jako jedyny spośród ocenianych surowców hamował wzrost wszystkich badanych drobnoustrojów jelitowych, a wyznaczona wartość MIC była równa lub większa od 5% (tab. 21 i 22). Zgodnie z wynikami opisanymi w po-przednim rozdziale, potencjał antyoksydacyjny tego owocu jest dość niski (2,16 mmol TE/100 g), podobnie jak ogólna zawartość polifenoli (poniżej 250 mg katechiny/100 g), wśród których w większej ilości zidentyfikowano jedynie kwas galusowy. Z danych literaturowych wiadomo jednak, że bardzo ważnymi związkami obecnymi w tych owocach są lignany, w tym schizandrole, schizandryny, schizanteryny i gomisyny [Hancke i in. 1999]. Jak dotąd udowodniono, że schizandryna B silnie hamuje Staphylococcus aureus i Candida albicans (MIC 0,25 mg/ml) oraz Salmonella, E. coli i Bacillus subtilis. Ponadto owoce cytryńca są bogate w cukry, kwasy organiczne (głównie cytrynowy, jabłkowy i winowy), witaminy C i E oraz olejki eteryczne, w skład których wchodzą liczne związki (m.in. cytral, p-cymen, limonen, terpinen, linalol, cytronelol, geraniol i in.) o potwierdzonej aktywności antybakteryjnej i mykostatycz-nej [Lamer-Zarawska 2002, Ultee i in. 2002, Burt 2004]. Ze względu na swoje ko-rzystne oddziaływanie na organizm człowieka (antyalergiczne, przeciwzapalne, an-tywirusowe, adaptogenne) owoce cytryńca są stosowane coraz częściej, dlatego należy mieć na uwadze ich negatywny wpływ na bakterie stanowiące fizjologiczną mikrobiotę naszego jelita i brać w rachubę płynące z tego konsekwencje.

Drugim skutecznym inhibitorem okazał się Citrosept. Co prawda, suplement ten nie wykazywał istotnego wpływu na wzrost B. catenulatum, a w sposób dawko-zależny stymulował wzrost Lactobacillus sp., jednak wobec pozostałych badanych gatunków działał bakteriostatycznie (EN, RUMI, EC, BAC) lub bakteriobójczo (EUB), powodując ograniczenie liczebności bakterii (do poziomu stanowiącego od 2% kontroli w przypadku EUB do 85% kontroli dla RUMI), a wartość MIC wyno-siła ≥ 5%.

Inaczej niż cytryniec chiński, Citrosept charakteryzował się bardzo wysokim potencjałem antyoksydacyjnym i zawartością polifenoli (tab. 10), wśród których dominowały naringina, rutyna i hesperydyna, a w mniejszym stężeniu obecne były także kwasy fenolowe, kwercetyna, rezweratrol, hesperetyna i naringenina (tab. 12). Jak już wspomniano wcześniej, rezweratrol i naringenina działały bakteriobójczo na EN, LCB i RUMI, a bakteriostatycznie na BF i EC, natomiast w stosunku do EUB jedynie naringenina działała lekko hamująco, a rezweratrol nawet stymulował wzrost tej bakterii (tab. 17). Również kwercetyna, w stężeniu 50 µg/ml, hamowała


bela

22.

St

ężen

ia h

amuj

ące

bada

nych

eks

trak

tów

lub

prep

arat

ów d

la b

akte

rii j

elito

wyc

h Ta

ble

22.

Inhi

bito

ry c

once

ntra

tions

of

stud

y ex

trac

ts o

r pr

epar

atio

ns f

or in

test

inal

bac

teri

a

Eks

trak

t (Pr

epar

at)

Ext

ract

(Pr

epar

atio

n)E

NR

UM

IL

CB

EC

BA

CE

UB

BF

Pigw

owie

c ja

pońs

ki /

Japa

nese

qui

nce

> 5

%N

IN

I>

5%

5%2,

5%–

Pokr

zyw

a / N

ettle

> 5

%N

IN

IN

IN

IN

I–

Spir

ulin

a / S

piru

lina

> 5

%N

IN

I>

5%

> 5

%5%

–

Mal

ina

/ Ras

pber

ry>

5%

NI

> 5

%>

5%

NI

5%–

Żur

awin

a / C

ranb

erry

>>

5%

NI

5%>

5%

NI

5%–

Soja

/ So

ybea

n>

5%

NI

NI

> 5

%N

I5%

–

Cyt

ryni

ec c

hińs

ki /

Schi

sand

ra5%

> 5

%5%

5%>

5%

5%–

Czo

snek

nie

dźw

iedz

i / B

ear’

s ga

rlic

> 5

%N

IN

I>

5%

NI

5%–

Cze

rwon

a ce

bula

/ R

ed o

nion

> 5

%N

I5%

> 5

%N

I>

5%

–

Der

eń /

Cor

nelia

n ch

erry

> 5

%N

I>

5%

NI

NI

NI

–

Bru

szni

ca /

Lin

gonb

erry

> 5

%N

IN

I>

5%

NI

5%–

Zie

lona

her

bata

/ G

reen

tea

> 5

%N

IN

I>

5%

> 5

%5%

–

Citr

osep

t / C

itros

ept

> 5

%>

5%

NI

> 5

%>

5%

5%

>>

5%

Jago

dy g

oji /

Goj

i ber

ries

> 5

%N

IN

IN

IN

I5%

–

Cza

rny

bez

/ Eld

erbe

rry

> 5

%N

IN

I>

5%

> 5

%>

5%

–

Sok

z no

ni /

Non

i jui

ce>

5%

NI

NI

> 5

%>

5%

> 5

%N

I

Chl

oram

feni

kol A

/ C

hlor

amph

enic

ol A

5%1,

25%

0,2%

1%0,

2%0,

2%5%

EN

– E

nter

ococ

cus

cacc

ae,

RU

MI

– R

umin

ococ

cus

gauv

reau

ii, L

CB

– L

acto

baci

llus

sp.,

EC

– E

sche

rich

ia c

oli,

BA

C –

Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus,

E

UB

– E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des,

BF

– B

ifido

bact

eriu

m c

aten

ulat

um

Pozo

stał

e ob

jaśn

ieni

a ja

k w

tab

eli 1

8 / S

ee T

able

18

for

othe

r ex

plan

ator

y no

tes


wzrost wszystkich badanych gatunków, przy czym szczególnie silnie działała wobec RUMI, BAC i BF. Należy jednak podkreślić, że stężenie tych związków w Citrosepcie, a w konsekwencji w medium, było znacznie mniejsze niż to, przy którym wykazano działanie hamujące w doświadczeniach in vitro z czystymi polifenolami. Co więcej, Citrosept najsilniej hamował Eubacterium, a więc bakterię, która była najmniej wrażliwa na naringeninę i kwercetynę, a którą stymulował rezweratrol. Oznacza to, że polifenole te nie odpowiadały za inhibitorowy wpływ Citroseptu w stosunku do EUB. Stymulujący wpływ CIT na Lactobacillus może być interesujący dla produ-centów żywności, gdyż otwiera szereg możliwości wzbogacania produktów żywno-ściowych, zawierających te bakterie kwasu mlekowego, ekstraktami z grejpfrutów.

Silne działanie inhibitorowe wykazano także dla ekstraktu z owoców pigwowca japońskiego wobec Eubacterium i Bacteroides, z wartościami MIC odpowiednio 2,5% i 5% (tab. 19 i 22). Brak negatywnego wpływu na Lactobacillus oraz bakteriosta-tyczny wpływ na Escherichia i Enterococcus czyni ten surowiec bardzo interesującym dla przetwórstwa i przemysłu farmaceutycznego.

Zupełnie inne działanie wykazano w przypadku ekstraktów z jagód goji (tab. 19) i pokrzywy (tab. 20). Ten pierwszy stymulował wzrost BAC, EC, LCB i RUMI, i jedynie wobec EUB działał bakteriobójczo, a wobec EN – bakteriostatycznie. Ten drugi natomiast w najniższym stężeniu działał lekko hamująco wobec EN, BAC i EUB, ale w najwyższym (dodatek 5% ekstraktu do medium) powodował już zna-czący wzrost liczebności wszystkich badanych gatunków, z wyjątkiem Enterococcus. Szczególnie interesujący jest fakt stymulacji wzrostu E. coli przez pokrzywę. Zaobserwowane zwiększenie liczebności populacji tej bakterii, w stosunku do kon-troli, zależało od stężenia ekstraktu i wynosiło od 30% (dla dodatku 1% ekstraktu) do niemal 200% (dodatek 5%). Otrzymane wyniki sugerują, że tradycyjne stosowa-nie preparatów na bazie wyłącznie pokrzywy w leczeniu chorób układu moczowego [Pieszak i Mikołajczak 2010], mimo moczopędnych właściwości tych preparatów, nie jest korzystne. O ile preparaty żurawinowe hamują rozwój E. coli, która najczę-ściej odpowiada za te dolegliwości, o tyle pokrzywa stymuluje namnażanie się tych bakterii. Optymalne zatem będzie stosowanie preparatów wieloskładnikowych. Uzyskane wyniki wskazują, że – oprócz żurawiny – hamująco wobec EC działają wspomniane już cytryniec chiński i Citrosept, ale także spirulina oraz soja, i właśnie te składniki mogłyby znaleźć zastosowanie w takich farmaceutykach.

Próbując ustalić, które ze składników pokrzywy odpowiadają za stymulację wzro-stu bakterii, przeanalizowano uzyskane wyniki. Pokrzywa zawierała dość dużą za-wartość polifenoli ogółem (619 mg katechiny/100 g ś.m.), choć dominowały w niej związki o raczej niskim potencjale antyoksydacyjnym (tab. 10). Do najważniejszych flawonoidów, jakie w tej pracy zidentyfikowano w pokrzywie, należały florydzyna, rutyna i procyjanidyna B1 oraz witeksyna i izowiteksyna (tab. 13). Pokrzywę wyróż-niało zatem to, że wśród wykrytych polifenoli obecne były glikozydy apigeniny, których – poza czosnkiem niedźwiedzim – nie stwierdzono w pozostałych badanych


surowcach. Jak dotąd nie opublikowano żadnych danych na temat stymulującego wpływu tych polifenoli na rozwój E. coli ani na żadną inną z badanych bakterii, nie można więc potwierdzić roli tych składników. Biorąc jednak pod uwagę, że czosnek niedźwiedzi nie stymulował wzrostu E. coli, należy stwierdzić, że rola witeksyny i izowiteksyny jako stymulatorów budzi spore wątpliwości. W liściach pokrzywy obecne są także barwniki (chlorofil, ksantofil, karoten), witaminy K, C i B2, kwas pantotenowy, garbniki, kwasy organiczne, związki lotne oraz znaczne ilości składni-ków mineralnych (głównie wapń, magnez, żelazo, krzem) [Andersen i Wold 1978]. Dlatego też można się pokusić o hipotezę, że za stymulację wzrostu E. coli przez ziele pokrzywy odpowiadały właśnie składniki mineralne. Tym bardziej, że takie wyjaśnienie potwierdzałyby także wyniki uzyskane dla innego ekstraktu. Jagody goji, które również silnie stymulowały rozwój EC, są bogatym źródłem minerałów, w tym żelaza, selenu, cynku, miedzi i wapnia, oraz witamin (C, E, B2 i B6) [Potterat 2010, Cieślik i Gębusia 2012]. O roli tych pierwiastków w namnażaniu się bakterii, w tym patogennych, wiadomo od dawna [Bullen i in. 2005]. Jony magnezu i wapnia odpo-wiadają za właściwości powierzchni, a co za tym idzie za zdolność bakterii do adhe-zji. Z kolei o znaczeniu żelaza w inwazji patogenów świadczą chociażby mechanizmy obronne, jakie organizmy wyższe wykształciły w toku ewolucji, aby uchronić się przed infekcją bakteryjną. Przyjmuje się, że stężenie wolnego żelaza, jakie musi być osiąg-nięte we krwi, aby zabezpieczało przed namnażaniem się bakterii, wynosi 10–18 M [Bullen i in. 2005]. Aby związać całe wolne żelazo w organizmie, zwierzęta wytwa-rzają białka wiążące ten metal (np. transferryna, laktoferrytyna), dzięki czemu nie jest on dostępny dla bakterii, które w jakiś sposób wniknęły do organizmu. Nawet nieznaczne zwiększenie się ilości dostępnych wolnych jonów żelaza powoduje jednak, że bakterie są bardziej odporne na warunki środowiska, szybciej się namnażają i wykazują większą wirulencję [Bullen i in. 2005]. Spośród analizowanych surowców roślinnych szczególnie bogate w jony żelaza są jagody goji i pokrzywa oraz biomasa cyjanobakterii Spirulina platensis (preparat spirulina). Jednak tylko pokrzywa i ja-gody goji powodowały zwiększenie liczebności EC, zaś spirulina znacząco hamowa-ła wzrost tej bakterii. Sprawdzono zatem, czy w odniesieniu do innych bakterii można by postulować istotny udział jonów żelaza w stymulacji ich wzrostu. Analiza wyników potwierdza, że zarówno pokrzywa, jak i jagody goji działały stymulująco również wobec BAC, RUMI oraz LCB, a pokrzywa dodatkowo w stosunku do EUB. Obydwa ekstrakty natomiast działały bakteriostatycznie wobec Enterococcus, a ja-gody goji nawet bakteriobójczo na EUB. Z kolei spirulina hamowała wzrost wszyst-kich badanych gatunków, z wyjątkiem Ruminococcus i – w niższych stężeniach – Enterococcus caccae (tab. 19–21).

Generalnie uznaje się, że bakterie Gram-dodatnie są bardziej wymagające i czę-sto same nie potrafią syntetyzować niezbędnych do wzrostu składników. Na przykład, Staphylococcus aureus wymaga dostarczenia aminokwasów, tiaminy i kwasu nikoty-nowego; także inne bakterie Gram-dodatnie wymagają obecności w środowisku


właśnie tego typu składników, tj. konkretnych aminokwasów oraz witamin, najczęściej z grupy B. Ich brak w pożywce nie pozwala mikroorganizmom rosnąć bez ograniczeń, zaś dodanie do podłoża – przyspiesza wzrost i namnażanie się drobnoustrojów. Bakterie Gram-ujemne natomiast z reguły potrafią zaspokoić swoje podstawowe potrzeby pokarmowe, korzystając z występujących w żywności lipidów, cukrów i bia-łek oraz minerałów i witamin. W tym miejscu warto przypomnieć, że w prezento-wanej pracy, ze względów technicznych, ani Gram-ujemny BAC ani Gram-dodatnie RUMI i EUB nie były hodowane w optymalnych dla siebie pożywkach. W doświad-czeniach z Bacteroides galacturonicus zastosowano podłoże ST, różniące się od za-lecanego dla hodowli tej bakterii medium 1265 (tab. 6) stężeniem jonów żelaza (4-krotnie niższym) oraz brakiem poligalakturonianu sodu, gdyż związek ten unie-możliwiał pomiar liczebności bakterii za pomocą densytometru. Z kolei RUMI i EUB były hodowane w jeszcze uboższym medium TSYEM, pozbawionym m.in. heminy i witaminy K. Ten okrojony skład zastosowanych pożywek mógł spowodować, że bakterie, mimo całkiem dobrego wzrostu w tych mediach, nie osiągały w nich jednak pełni swoich możliwości, co dało się uzyskać dopiero po odpowiedniej su-plementacji podłoża. O ile brak heminy w podłożu dla RUMI wyraźnie wskazuje na potencjalny niedobór żelaza, który mógł zostać zniwelowany przez dodatek eks-traktu ze spiruliny, pokrzywy czy goji, o tyle w przypadku pozostałych bakterii nie jest to aż tak oczywiste. Udowodniono co prawda, że niedobory żelaza w diecie szczurów skutkują znaczącym spadkiem liczebności Bacteroides [Dostal i in. 2012], jednakże dostępne doniesienia wskazują, że przedstawiciele Bacteroides do wydaj-nego namnażania biomasy wymagają obecności jonów K+ i Mg2+ oraz żelaza w po-staci hemowej, natomiast w formie Fe2+ jest ono znacznie gorzej przyswajalne [Sperry i in. 1977]. Żaden z wymienionych surowców nie zawiera żelaza hemowego. Można oczywiście założyć, że w sytuacji niedoboru żelaza w pożywce zwiększenie jego ilości, poprzez dodanie ekstraktów goji, pokrzywy lub spiruliny, spowodowało wzrost li-czebności RUMI i BAC, w porównaniu do medium bez dodatku, mimo że postać dostarczonego żelaza nie była optymalna. Uzyskane wyniki wskazują jednak, że spirulina – pomimo znacznej zawartości żelaza – działała na BAC hamująco, a nie stymulująco (tab. 20). Z pewnością należy przyjąć, że wpływ danego surowca na bakterie nie jest efektem obecności w nim jednego związku, lecz wypadkową od-działywań wszystkich jego składowych. Spirulina jest bogatym źródłem żelaza i innych minerałów, ale zawiera także dużo białka (do 70% s.m.), nienasyconych kwasów tłuszczowych (do 30% tych kwasów stanowi kwas γ-linolenowy, GLA) oraz barwni-ków (chlorofil a, ksantofile, karotenoidy, fikocyjaniny), jest przy tym raczej uboga w cukry [Belay 2002]. Wykazano, że niektóre kwasy tłuszczowe z grupy ω-6, ω-7 i ω-9 (jak np. kwas linolowy, GLA, arachidonowy i oleinowy) oraz ich estry mogą hamować wzrost E. coli oraz drobnoustrojów bytujących w początkowych odcinkach przewodu pokarmowego, w tym powodujących choroby jamy ustnej, dziąseł i przy-zębia, jak Candida albicans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia czy


Streptococcus mutans [Choi i in. 2012]. Udowodniono też, że niektóre bakterie, w tym gatunki występujące w żwaczu, bakterie kwasu mlekowego z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium oraz przedstawiciele Enterococcus, są zdolne do biotransformacji kwasu linolowego (LA) i α-linolenowego (LNA) do form sprzężo-nych CLA i CLNA [Ogawa i in. 2005]. Na tej podstawie można wysnuć wniosek, że wysoka zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych odpowiadała za inhibitorowy wpływ spiruliny na EC, BAC i EUB. Co więcej, wspomniane doniesienia tłumaczy-łyby, dlaczego spirulina nie hamowała wzrostu LCB i RUMI, a w niskich stężeniach działała nawet stymulująco na wzrost EN.

Wracając do jagód goji i pokrzywy, należy zauważyć, że obecne w nich nienasy-cone kwasy tłuszczowe nie mają wysokiego stężenia, w związku z czym mógł się uwidocznić stymulujący potencjał tych ekstraktów związany z obecnością składników mineralnych (Fe, K, Mg, Ca). W skład jagód goji wchodzi także LBP, polisacharyd złożony z licznych monocukrów, wśród których dominują kwas D-galakturonowy, D-galaktoza i L-arabinoza [He i in. 2012]. Doświadczenia z BAC prowadzono w me-dium pozbawionym poligalakturonianu, zatem wzbogacenie go w ekstrakt z jagód goji, zawierający nie tylko galakturonian, ale także niezbędne minerały (Fe, Mg, K, Ca), mogło spowodować wzrost liczebności BAC. Wzbogacenie medium w te cukry mogło także odpowiadać za zaobserwowany intensywniejszy wzrost EC pod wpływem ekstraktu z goji. Wykazano bowiem, że mannoza, galaktoza, glukozamina, mucyna oraz kwasy glukonowy, glukuronowy i galakturonowy stymulują wzrost E. coli [Fox i in. 2009]. Liczne gatunki bakterii jelitowych mają potencjał metaboliczny do wy-korzystywania cukrów, tym bardziej że wiele z nich to typowe składniki mucyny obecnej w przewodzie pokarmowym człowieka. Nie dziwi więc zdolność badanych bakterii do wykorzystania tych cukrów. Co więcej, wykazano, że Ruminococcus może wykorzystywać również cukry pięciowęglowe, takie jak arabinoza, ryboza i ksyloza [Thurston i in. 1994], co mogłoby wyjaśnić stymulowanie przez ekstrakt z jagód goji wzrostu tej bakterii.

Któryś ze składników obecnych w jagodach goji działa jednak hamująco na Enterococcus i Eubacterium. Można było przypuszczać, że wśród potencjalnych in-hibitorów znajdą się polifenole, gdyż charakteryzują się powszechnie znaną aktyw-nością antybakteryjną. W jagodach goji oznaczono znaczne ilości kwasu galusowego, florydzyny, rutyny i procyjanidyny B1 (tab. 14). Za potencjał inhibitorowy nie od-powiadała rutyna, gdyż jej wpływ na badane bakterie, i w to w szerszym zakresie stężeń, był neutralny (tab. 17). Co więcej, z badanych w tej pracy polifenoli jedynie kemferol istotnie hamował wzrost EUB. Z kolei na EN hamujący wpływ miały przede wszystkim rezweratrol, naringenina i kwercetyna oraz w mniejszym stopniu kemfe-rol. Żaden z tych związków nie występował w jagodach goji w ilości, która mogłaby uzasadniać ich inhibitorowy wpływ na EUB i EN (tab. 14). Wpływu czystych roz-tworów kwasu galusowego, florydzyny czy procyjanidyny B1 nie badano, jednak te składniki obecne są także w dużych ilościach w ekstraktach z czosnku niedźwiedzie-


go, czarnego bzu i pokrzywy. O ile wszystkie te ekstrakty działały bakteriostatycznie wobec Enterococcus, o tyle pokrzywa stymulowała wzrost Eubacterium, co podaje w wątpliwość udział wymienionych polifenoli w hamowaniu, przynajmniej w odnie-sieniu do EUB. Z pozostałych badanych surowców, kwas galusowy i florydzynę w znacznych ilościach zawierały także brusznica, malina, cytryniec chiński, pigwowiec, soja i dereń (tab. 13 i 14). W większości przypadków ekstrakty te działały hamująco zarówno na EN, jak i na EUB, co mogłoby sugerować, że to kwas galusowy i flory-dzyna odpowiadają za hamowanie wzrostu tych dwóch gatunków bakterii. Wyniki przedstawione w tabeli 17 nie potwierdzają jednak tej hipotezy, okazało się bowiem, że florydzyna w stężeniu 250 µg/ml stymulowała nieznacznie wzrost Eubacterium. Być może, do inhibitorowego działania potrzebna jest obecność obydwu tych poli-fenoli. Niestety, w tej pracy nie badano oddziaływania samego kwasu galusowego ani wpływu florydzyny w połączeniu z kwasem galusowym. Nadal jednak rola kwa-su galusowego i florydzyny budzi wątpliwości, tym bardziej że zastanawiający wynik uzyskano dla ekstraktu z derenia, który jako jedyny poza pokrzywą stymulował wzrost EUB. Jest to owoc szczególnie bogaty w procyjanidynę B1, cyjanidyno-3-O-glukozyd, kwas galusowy i florydzynę (ale w przeciwieństwie do pokrzywy nie zawiera gliko-zydów apigeniny) (tab. 14), ale także w cukry proste (glukozę, fruktozę), kwas lino-lowy, wapń, magnez, miedź i żelazo. Przyjmując, że kwas galusowy i florydzyna mają działanie hamujące, należy wnioskować, że to któryś z pozostałych składników tego owocu znacząco zwiększa liczebność Eubacterium. W swoich badaniach Simmering i inni [2002] wykazali, co prawda, że namnażanie się Eubacterium ramulus w jelicie może być stymulowane poprzez suplementację diety rutyną i kwercetyną, zaś flawo-noidy te są degradowane przez E. ramulus, ale wyników tych nie można bezkrytycz-nie odnieść do rezultatów uzyskanych w tej pracy. Wykorzystano w niej bowiem inny gatunek – Eubacterium cylindroides – i stwierdzono, że obecność 50 µg/ml kwerce-tyny powodowała raczej zmniejszanie liczebności populacji tej bakterii niż stymula-cję jej wzrostu, a rutyna nie miała żadnego wpływu w badanym zakresie stężeń (20–250 µg/ml) (tab. 17).

Wydaje się słuszne kontynuowanie badań w celu znalezienia składnika jagód goji o wspomnianym silnym działaniu hamującym wobec EUB. Jest to o tyle pożą-dane, że Eubacterium to dość liczebny rodzaj bakterii jelitowych, które izoluje się także z jamy ustnej oraz pochwy i moczu zdrowych kobiet. Najpowszechniejsze gatunki to E. aerofaciens, E. cylindroides, E. lentum (dawniej Eggerthella lenta) oraz E. rectale. Chociaż jest typowym przedstawicielem mikrobioty jelitowej, to niektóre gatunki tego rodzaju są patogenami. Dotychczas wykazano powiązanie Eubacterium z chorobami przyzębia (E. yurii, E. nodatum), stanami zapalnymi stawów i niektó-rymi nowotworami (E. lentum, E. limosum, E. callanderi), a nawet z bakteriemią [Margaret i in. 1990, Zhang i in. 2001]. Antygen choriogonadotropinopodobny (związany z błoną antygen obecny we wszystkich komórkach uznanych za nowotwo-rowe) wykryto u E. lentum wyizolowanego z nowotworu odbytu, ale nie był on


obecny u innych, niepowiązanych w nowotworami gatunków. Sugeruje to korelację między obecnością tego antygenu u bakterii a ich „powiązaniem z rakiem” [Acevedo i in. 1979]. E. aerofaciens jest typowym przedstawicielem mikrobioty jelitowej. Obserwowano, że niektóre jego szczepy, mające peptydoglikan o typie A4α, indu-kowały przewlekłe zapalenie stawów, podczas gdy szczepy o peptydoglikanie typu A4β wywoływały tylko przejściowy stan zapalny [Zhang i in. 2001]. Ten pierwszy był znacznie silniejszym induktorem produkcji cytokin prozapalnych, a jednocześnie był mniej podatny na działanie enzymów degradujących, np. lizozymu. Dlatego poszu-kiwane są skuteczne sposoby na ograniczenie populacji tych bakterii, zanim dopro-wadzą do rozwoju choroby.

Należy podkreślić, że Eubacterium cylindroides okazał się najbardziej wrażliwym gatunkiem spośród badanych bakterii jelitowych. Istotne statystycznie, dawkozależne zahamowanie namnażania się tej bakterii nastąpiło pod wpływem większości badanych surowców, przy czym spadek liczebności populacji o co najmniej 95%, w stosunku do odpowiedniej kontroli, wykazano w przypadku 5% Citroseptu (MIC = 5%) oraz najwyższych stężeń etanolowych ekstraktów z pigwowca (MIC = 2,5%), żurawiny, goji, brusznicy, cytryńca chińskiego, maliny, soi, zielonej herbaty i spiruliny (dla tych ekstraktów wartość MIC wynosiła 5%).

Jak już napisano wcześniej, do najważniejszych polifenoli zidentyfikowanych w Citrosepcie należały rutyna, kwas p-kumarowy, naringina, hesperydyna, kwas galusowy oraz – w mniejszych ilościach – procyjanidyna B1, kwercetyna, naringe-nina, hesperetyna i cyjanidyno-3-O-glukozyd (tab. 12). Ani rutyna, ani hesperydy-na i naringina nie wykazywały żadnego wpływu na Eubacterium, podczas gdy kwer-cetyna, hesperetyna i naringenina, w stężeniu 250 µg/ml, działały nieznacznie hamująco (tab. 17). Biorąc pod uwagę oznaczoną zawartość tych związków w Citrosepcie (aglikony flawanonów na poziomie 2 mg/100 ml, kwercetyna 0,6 mg/100 ml) (tab. 11 i 12), trzeba zauważyć, że ich ilość w medium, do którego dodano Citrosept w stężeniu 5%, była mniejsza od 1 µg/ml. Nie ma zatem możli-wości, aby w takim stężeniu odpowiadały za efekt bakteriobójczy Citroseptu. Zadziwia jednak niska wrażliwość EUB na naringeninę, związek ten bowiem dzia-łał silnie bakteriobójczo na większość badanych bakterii jelitowych, a efekt bakte-riostatyczny wobec E. coli był silniejszy niż wobec EUB (tab. 17). Co więcej, Eubacterium wydaje się generalnie dość wrażliwą bakterią, o czym świadczy także bardzo niska wartość MIC, jaką wyznaczono dla chloramfenikolu A (ChlA), wyno-sząca zaledwie 0,2% (tab. 18). Podobną wrażliwość na ten antybiotyk wykazywały jedynie Lactobacillus i Bacteroides, podczas gdy w przypadku pozostałych gatunków minimalne stężenie hamujące dla ChlA kształtowało się między 1 a 5%.

Zgodnie z oczekiwaniami, potwierdzono hamujące działanie żurawiny wobec E. coli, choć silniejsze zahamowanie wzrostu wykazano w stosunku do LCB i EUB. Inni autory wcześniej zauważyli, że ekstrakty z żurawiny hamują wzrost E. coli (MIC = 1,25 mg/ml), ale także E. aerogenes, S. aureus (MIC = 0,391 mg/ml)


i K. pneumoniae (MIC = 0,0195 mg/ml) [Rahbar i Diba 2010]. Wykazali również hamujący wpływ soku żurawinowego na patogenne mikroorganizmy E. coli i S. au-reus, a także Salmonella spp., Listeria monocytogenes i Pseudomonas aeruginosa [Rahbar i Diba 2010]. Zdolność hamowania E. coli przez żurawinę i jej przetwory przypisuje się przede wszystkim szczególnej budowie procyjanidyn, które w żurawi-nie mają wiązania typu A, natomiast w innych owocach – typu B. Prawdopodobnie obecność tego szczególnego typu związków zapobiega adhezji uropatogennych szcze-pów E. coli o fimbriach typu P (typu 1 – o powinowactwie do dróg moczowych) do komórek uroepitelium [Howell i in. 2005]. W tej pracy nie badano procyjanidyn typu A, zajmowano się tylko związkami typu B. Procyjanidynę B1 wykryto w po-krzywie, czosnku niedźwiedzim, czarnym bzie, dereniu i jagodach goji, a procyjanidy-nę B2 – w borówce brusznicy i czosnku niedźwiedzim. Z tych surowców pokrzywa i jagody goji, a także w niskich stężeniach czosnek i bez stymulowały wzrost EC, co raczej wyklucza możliwość hamowania tej bakterii przez procyjanidyny B1 i B2.

W przeprowadzonych badaniach wykazano antybakteryjne działanie ekstraktu z pigwowca japońskiego wobec EUB, BAC, EN i EC. Inni autorzy, badając efekt przeciwdrobnoustrojowy ekstraktu ze skórek pigwowca wobec Gram-dodatniej bak-terii S. aureus, Gram-ujemnych E. coli i P. aeruginosa oraz grzybów C. albicans, powiązali go z obecnością kwasu chlorogenowego, który działał synergistycznie z innymi składnikami ekstraktu [Gyawali i Ibrahim 2014]; mechanizm działania polegał prawdopodobnie na uszkadzaniu błon komórkowych. Zawartość kwasu chlorogenowego, oznaczona w ekstrakcie z pigwowca, była znacznie niższa niż w eks-traktach z czosnku czy jagód goji (tab. 13 i 14), które na wiele bakterii działały stymulująco.

Niektóre ekstrakty zawierają polifenole o niskim potencjale antyoksydacyjnym i występujące w nieznacznych stężeniach, mimo to kombinacja kilku takich związków może wywierać synergistyczny efekt antybakteryjny. Udowodniono, że mieszaniny kwasów galusowego i protokatechowego, galusowego i kawowego lub rutyny z kwer-cetyną skutecznie hamują Escherichia coli ATCC 35218 w temperaturze 20°C, zaś najwydajniejsze w temperaturze 4°C są mieszaniny rutyny z kwercetyną oraz kwasów galusowego z kawowym [Rodríguez Vaquero i in. 2010]. Być może, dopiero syner-gistyczne działanie kilku polifenoli jest niezbędne do wywarcia efektu inhibitorowe-go. Kwas galusowy i kawowy w dużych stężeniach zidentyfikowano w ekstrakcie z zielonej herbaty, który miał bakteriostatyczny wpływ na EC. Z kolei znaczne ilości kwasu galusowego i protokatechowego oraz kwercetynę i rutynę zawierał ekstrakt z czosnku niedźwiedziego, również o działaniu inhibitorowym w stosunku do tej bakterii (tab. 20).

Biorąc pod uwagę wyniki chromatograficzne składu polifenolowego (tab. 12–14) użytych w doświadczeniach surowców, należy uznać za mało prawdopodobne, by za efektem działania danego ekstraktu czy preparatu stały wyłącznie związki polifeno-lowe. W wielu przypadkach bogata w daną substancję roślina hamowała wzrost


bakterii, podczas gdy inna, również ją zawierająca, stymulowała ten wzrost. Wyraźnie więc widać, że liczy się tutaj całościowy skład rośliny oraz oddziaływania synergi-styczne i antagonistyczne obecnych w niej związków.

Na przykład, ekstrakt z zielonej herbaty hamował wzrost większości badanych bakterii, z wyjątkiem R. gauvreauii i Lactobacillus sp. Stymulacja LCB była dawko-zależna, co świadczy o obecności w herbacie składnika, który w sposób aktywny stymulował tę bakterię lub był przez nią wykorzystywany do procesów metabolicznych. Z punktu widzenia technologów żywności, ale także klinicystów, jest to korzystne zjawisko, gdyż bakterie z rodzaju Lactobacillus stanowią pożądany element mikro-bioty jelitowej. Zielona herbata była szczególnie bogata w katechiny (EGC, ECAT, EGCG, CAT), kwasy galusowy i kawowy, kwercetynę i jej glikozydy oraz w kemfe-rol, zawierała też stosunkowo dużo rezweratrolu (tab. 13). Jak wykazano, spośród tych składników (+)-katechina słabo hamowała wzrost EN i EUB, natomiast rez-weratrol, kemferol i kwercetyna miały bardzo silne działanie inhibitorowe (tab. 17), co może wyjaśniać hamujący wpływ ekstraktu z zielonej herbaty na rozwój BAC, EUB i EN, ale stoi w sprzeczności z jego oddziaływaniem na LCB i RUMI. Chociaż sam rezweratrol był bakteriobójczy wobec tych dwóch gatunków, a kwercetyna i kem-ferol działały bakteriostatycznie (LCB) lub bakteriobójczo (RUMI), to bakterie te hodowane w obecności ekstraktu z zielonej herbaty były stymulowane, a nie – jak należałoby oczekiwać – hamowane. Ponieważ nie badano wpływu czystych kwasów fenolowych ani pozostałych flawan-3-oli na te mikroorganizmy, nie można wykluczyć ich wpływu. Z danych literaturowych wiadomo jednak, że składniki zielonej herba-ty hamują bakterie, głównie gatunki patogenne z rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium i Bacillus, a także E. coli, H. pylori, M. tuberculosis i P. aeru-ginosa [Bansal i in. 2013]. Inni badacze z kolei wykazali, że nie wpływają one na Escherichia i Eubacterium, a w niskich stężeniach mogą nawet stymulować wzrost bakterii kwasu mlekowego Lactobacillus i Bifidobacterium [Ahn i in. 1990]. Główną rolę inhibitorową przypisuje się EGCG, ale bierze się też pod uwagę polimerowe taniny. Co ciekawe, Lactobacillus może wykorzystywać te związki, gdyż jako jedyny z testowanych mikroorganizmów wytwarza enzym tanazę [Belur i Mugeraya 2005]. Powstający w wyniku rozpadu tanin kwas galusowy jest potem łatwo rozkładany do alifatycznych kwasów, które są wykorzystywane przez bakterie do swojego metabo-lizmu w cyklu kwasu cytrynowego. Bogate w kwas galusowy były także dereń, jago-dy goji, czarny bez, czosnek niedźwiedzi, soja i pokrzywa. Wszystkie te surowce stymulowały wzrost LCB. Wydaje się jednak, że obecność kwasu galusowego nie jest warunkiem wystarczającym do stymulacji, gdyż zawierający znaczne ilości tego kwa-su cytryniec chiński hamował LCB.

Jako jeden z nielicznych badanych ekstraktów, ekstrakt z czerwonej cebuli w stę-żeniu 5% silnie hamował wzrost Lactobacillus, co powinno być brane pod uwagę w kuracjach antybakteryjnych, do których często wykorzystuje się to warzywo. Znaczące spożycie cebuli nie tylko ograniczy wzrost patogenu, ale zaburzy delikat-


ną równowagę w składzie mikrobioty jelitowej, zmniejszając liczebność bakterii z rodzajów Lactobacillus, Enterococcus, Escherichia i Eubacterium, a zwiększając liczebność Bacteroides, co ostatecznie może mieć negatywny wpływ na funkcjono-wanie osłabionego infekcją organizmu.

Zaskakujące wyniki uzyskano dla ekstraktu z soi, który bardzo silnie, dawkoza-leżnie hamował wzrost EUB, w mniejszym stopniu także EC i EN, za to stymulował LCB i BAC. Bardzo specyficzna dla soi jest obecność izoflawonów, głównie daidzy-ny, daidzeiny i genisteiny. Z uwagi na wysokie stężenia tych związków, różnorodne preparaty i suplementy wytworzone z soi są dość powszechnie stosowane przez kobiety pragnące osłabić nieprzyjemne objawy menopauzy. Preparaty te zawierają fitohormony, które wchodzą w interakcję z niezwykle precyzyjnym w działaniu ukła-dem hormonalnym kobiety, należy zatem zachować szczególną ostrożność w ich stosowaniu i dawkowaniu. Przyjmuje się, że dawka izoflawonów sojowych, jaką przyjmują Azjatki (u których negatywne objawy menopauzy nie są zbyt silne), to 50–100 mg, jednak suplementacja diety taką ilością tych fitohormonów wcale nie musi wywoływać fizjologicznych efektów u innych kobiet. Wszystko zależy od składu ich mikrobioty jelitowej, a dokładniej od obecności bakterii, które z daidzeiny wy-tworzą aktywne biologicznie metabolity, tj. ekwol i/lub O-desmetylangolensynę. Tylko nieliczne gatunki bakterii są zdolne do przeprowadzania takiej reakcji (lub jej eta-pów). Wśród już poznanych znajdują się Eubacterium ramulus, Ruminococcus pro-ductus, Enterococcus faecium, Lactobacillus mucosae i Bacteroides ovatus [Atkinson i in. 2005, Yokoyama i Suzuki 2008, Setchell i Clerici 2010a, b]. Nie oznacza to jednak, że gatunki bakterii badane w tej pracy, a należące do tych samych rodzajów, będą zdolne do biotransformacji daidzeiny. Nasiona soi zawierają dużo białka oraz nienasyconych kwasów tłuszczowych, głównie linolenowego i oleinowego, co również mogło przyczynić się do zahamowania wzrostu EUB, ale także EC. Silne zahamo-wanie wzrostu EUB mogło wynikać z obecności w nasionach soi inhibitora trypsyny, jednego z inhibitorów proteazy serynowej. Wykazano, że inhibitory proteaz działa-ją przeciwdrobnoustrojowo, a aktywność tę przypisuje się zahamowaniu bakteryjnych proteaz zaangażowanych w różne procesy fizjologiczne. Ponadto inhibitory wchodzą w interakcje ze ścianami komórkowymi lub białkami błon plazmatycznych, co pro-wadzi do zmiany przepuszczalności błon i do śmierci komórek [Li i in. 2007, Paiva i in. 2013].

Warto jeszcze zwrócić uwagę na działanie czosnku niedźwiedziego, który w naj-wyższym użytym stężeniu silnie hamował Eubacterium cylindroides oraz słabiej Escherichia coli i Enterococcus caccae, natomiast stymulował wzrost Lactobacillus sp., Ruminococcus gauvreauii i Bacteroides galacturonicus. Jak już wspomniano wcześniej, czosnek niedźwiedzi jest zwyczajowo stosowany w Niemczech w celu regeneracji flory bakteryjnej jelit po kuracjach antybiotykowych [Reuter 1995, Sendl 1995]. Wyniki tej pracy potwierdzają jego skuteczność w promowaniu wzrostu po-żytecznych rodzajów bakterii, w tym Lactobacillus.


Uzyskane wyniki wskazują, że należy odrzucić pierwszą hipotezę badawczą sfor-mułowaną w tej pracy. Naturalne składniki przeciwutleniające oraz związki polifeno-lowe zawarte w surowcach roślinnych mogą wywierać silne inhibitorowe działanie na bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej. Najmniej wraż-liwy na działanie badanych ekstraktów okazał się Ruminococcus gauvreauii. Jedynie po zastosowaniu ekstraktu z cytryńca chińskiego oraz Citroseptu uzyskano zahamo-wanie wzrostu tej bakterii. W przypadku RUMI zwiększenie liczebności można uzyskać poprzez dodatek bioaktywnych składników zawartych w spirulinie, czerwonej cebuli, jagodach goji, czarnym bzie oraz soku z noni. Z kolei wobec Enterococcus caccae wszystkie badane ekstrakty, z wyjątkiem spiruliny w stężeniu 1–2,5%, wykazywały działanie bakteriostatyczne. Dość wrażliwym gatunkiem był także Eubacterium cylin-droides, którego wzrost hamowała większość badanych ekstraktów, z wyjątkiem wy-ciągów z derenia i pokrzywy w stężeniu 5% (stymulacja wzrostu). Tylko ekstrakty z cytryńca chińskiego znacząco hamowały wzrost wszystkich badanych bakterii jelito-wych (MIC ≥ 5%), co stwarza możliwość ich zastosowania do eliminacji niepożądanych gatunków mikrobioty jelitowej, przed suplementacją gatunkami pożądanymi. Podobne zastosowanie może również znaleźć ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta (Citrosept), który hamował wzrost badanych bakterii oprócz LCB, oraz owoce pigwowca, które działały silnie hamująco na BAC (MIC = 5%) i EUB (MIC = 2,5%). O hamującym wpływie ekstraktu z grejpfruta warto pamiętać także w kontekście interakcji jego składników z enzymami odpowiadającymi za metabolizm leków.

Wiele firm farmaceutycznych czyni starania, by w niedalekiej przyszłości wpro-wadzić na rynek preparaty zaprojektowane tak, by docelowo zmniejszyć lub zwięk-szyć liczebność konkretnej grupy drobnoustrojów wchodzących w skład naszej mi-krobioty. Dzięki temu można będzie skuteczniej prowadzić profilaktykę otyłości, cukrzycy i niektórych nowotworów czy leczyć choroby metaboliczne lub przewlekłe w obrębie przewodu pokarmowego (nietolerancje pokarmowe, IBD, chorobę Crohna). Do wzbogacenia mikrobioty jelitowej w populację Bacteroides galacturo-nicus można wykorzystać bioaktywne składniki pokrzywy, maliny, żurawiny, derenia, czerwonej cebuli oraz jagód goji. Liczebność Bifidobacterium catenulatum natomiast można zwiększyć poprzez suplementację diety sokiem z noni, zaś do stymulacji wzrostu Lactobacillus można wykorzystać składniki bioaktywne z pigwowca, czosn-ku niedźwiedziego, pokrzywy, brusznicy, soi, zielonej herbaty, Citroseptu, jagód goji, czarnego bzu lub noni. Surowce te mogą być zatem z powodzeniem stosowane do jogurtów jako składniki smakowe, a zarazem wzbogacające te artykuły w naturalne związki przeciwutleniające. Do produktów zawierających żywe kultury bakterii z ro-dzaju Lactobacillus nie zaleca się natomiast dodawania ekstraktów z owoców żura-winy i cytryńca chińskiego czy z cebuli ani też tych materiałów roślinnych w postaci liofilizowanej czy suszonej.

W przeprowadzonych doświadczeniach większość preparatów działała stymulu-jąco wobec LCB, BAC i RUMI. Zwiększenie się liczebności populacji RUMI i BAC


może wynikać jednak z faktu, że zastosowane media, umożliwiające ocenę liczeb-ności bakterii przez pomiar densytometryczny, były uboższe w składniki w stosunku do zalecanych pożywek. Niedobór niektórych składników (np. jonów metali, witamin) mógł odpowiadać za to, że po ich wprowadzeniu do tego środowiska wraz z ekstrak-tami stwierdzano znaczący wzrost liczby komórek bakterii. Z pewnością konieczne będzie przeprowadzenie dodatkowych badań, w których liczebność RUMI i BAC zostanie oceniona za pomocą innych metod, w optymalnych dla rozwoju tych bak-terii mediach.

Zróżnicowany wpływ roślin (hamujący lub stymulujący) na poszczególne ga-tunki bakterii potwierdza pogląd, że przez dobór odpowiedniej diety można zna-cząco polepszyć stan zdrowia człowieka. Wskutek promowania wzrostu konkretnych gatunków bakterii w mikrobiocie jelitowej zmieni się metabolizm mikrobiomu w sposób pożądany dla konkretnego organizmu, co ułatwi leczenie choroby. Różnice wpływu związków roślinnych na gatunki bakterii wyjaśniają też zróżnicowanie składu mikrobioty w zależności od nawyków żywieniowych, co widać na przykładzie przebadanych populacji z Japonii, Skandynawii, USA czy Afryki. Mikrobioty po-szczególnych grup dostosowują się do rodzaju pokarmu najczęściej spożywanego w danym regionie. Różnice rodzajów przyjmowanego pokarmu implikują też od-mienną zapadalność na poszczególne choroby, jako że poszczególni członkowie mikrobioty promują lub hamują występowanie określonych jednostek chorobowych. Dlatego na przykład w krajach Dalekiego Wschodu rzadziej niż gdzie indziej mamy do czynienia z objawami menopauzy (dieta bogata w fitoestrogeny z soi w kombi-nacji z mikrobiotą zdolną do ich przemian metabolicznych w kierunku składników aktywnych biologicznie), a w Ameryce Północnej – częściej z otyłością. Te różnice oczywiście będą się zacierać, ze względu na mieszanie się populacji (podróże, migracja), jak i globalizację handlu. Dziś w Polsce możemy jeść to samo, co w Japonii, gdyż sprowadzenie danej potrawy jest tylko kwestią ceny. Być może, za kilkadziesiąt czy kilkaset lat zróżnicowanie mikrobiomów w ramach populacji ludzkiej zaniknie lub znacząco się zmniejszy.

4.4. Wpływ bakterii jelitowych na potencjał antyoksydacyjny polifenoli zawartych w diecie

Kolejny etap badań miał na celu weryfikację hipotezy badawczej mówiącej, że ga-tunki bakteri stanowiące fizjologiczną mikrobiotę jelita ludzkiego zwiększają, na skutek swojego metabolizmu, potencjał antyoksydacyjny bioaktywnych składników obecnych w surowcach roślinnych.

Aby zweryfikować tę hipotezę, poszczególne gatunki bakterii jelitowych inku-bowano przez 24 h w medium zawierającym badany składnik (pojedynczy polifenol


lub ekstrakt czy preparat) w różnym stężeniu, po czym całość wirowano, a w nad-sączu oznaczano potencjał antyoksydacyjny (AOX) metodą z rodnikiem ABTS. Aby ułatwić porównywanie wyników uzyskanych dla poszczególnych związków pod wpływem różnych gatunków bakterii, uzyskane wartości potencjału AOX przed-stawiano jako procent potencjału AOX odpowiedniej kontroli pozytywnej. Przygotowano następujące kontrole: czyste medium bez żadnego dodatku (Kpoz), medium bez dodatku polifenolu/ekstraktu inkubowane w obecności danej bakterii (Kpoz_b), medium z dodatkiem polifenolu/ekstraktu w danym stężeniu, inkubowane w takich samych warunkach jak próba właściwa, ale bez bakterii, oraz kontrole rozpuszczalnikowe. Nie zaobserwowano istotnego wpływu zastosowanych w do-świadczeniach stężeń rozpuszczalników, tj. etanolu i DMSO, na zdolność zmiata-nia rodnika ABTS.

Tak jak się spodziewano, czyste media bardzo się różniły potencjałem antyok-sydacyjnym (tab. 23). W skład pożywek wchodzi dużo związków, z których wiele wykazuje zdolności przeciwrodnikowe, chelatujące lub redukujące (tab. 3–9). Szczególnie obfite w te substancje są bardzo złożone podłoża dla anaerobów, za-wierające rozmaite aminokwasy (w tym tryptofan, tyrozynę, L-cysteinę, metioninę), resazurynę, ale także ekstrakty (sojowy, drożdżowy, mięsny), witaminy i minerały.

Zaskakujące były jednak różnice zanotowane dla poszczególnych etapów badań. Doświadczenia nad wpływem bakterii na czyste polifenole przeprowadzano w roku 2012, podczas gdy nad wpływem bakterii na ekstrakty/preparaty – w roku 2013. Media przygotowywano zgodnie z tymi samymi recepturami i w ten sam sposób, jednak w wielu przypadkach z nowych partii odczynników. Zaobserwowano zna-czące różnice potencjału AOX między podłożami przygotowanymi w kolejnych latach, a nawet – o czym świadczy duży błąd standardowy – między poszczególny-mi partiami odczynników stosowanych w tym samym roku. Dlatego też do obliczeń jako wartość wyjściową zawsze przyjmowano wartość potencjału AOX dla odpo-wiedniego medium hodowlanego przygotowanego w tym samym dniu co dana próba właściwa (kontrola pozytywna – 100%). W wielu przypadkach zaobserwo-wano, że aktywność metaboliczna bakterii spowodowała zmiany potencjału AOX czystych pożywek bez dodatków. Mogło to wynikać z wykorzystania przez drob-noustroje niektórych przeciwutleniających składników medium (aminokwasów, witamin) lub ze zmiany pH spowodowanej metabolizmem bakterii i wytwarzanymi przez nie metabolitami. Collins i inni [1998] wykazali na przykład, że kationorod-nik ABTS może być redukowany, z powrotem do swojej bezbarwnej i nieaktywnej postaci, przez fizjologicznie występujące kwasy organiczne, w największym stopniu przez malonowy, szczawiowy i glioksalowy. Wytwarzanie kwasów przez bakterie spowoduje więc zafałszowanie wyniku, gdyż na skutek zwiększenia się ilości zre-dukowanych rodników uzyskane wartości potencjału AOX będą wyższe. Aby zmniej-szyć wynikający z takich przekłamań błąd, przyjęto osobne kontrole. Dla zbadania zmian potencjału antyoksydacyjnego poszczególnych pożywek na skutek wzboga-


bela

23.

Po

tenc

jał

anty

oksy

dacy

jny

podł

oży

mik

robi

olog

iczn

ych

wyk

orzy

stan

ych

w b

adan

iach

(m

g tr

olok

su/1

00 m

l pod

łoża

; śre

dnia

± S

D,

n ≥

5)

Tabl

e 23

. A

ntio

xida

nt p

oten

tial o

f ba

cter

iolo

gica

l med

ia u

sed

in t

he s

tudy

(m

g Tr

olox

/100

ml m

ediu

m; m

ean

± S

D, n

≥ 5

)

Rok

bad

ańSt

udy

year

Podł

oże

/ Med

ium

EC

ME

NM

LC

BM

BA

CM

BF

MR

UM

IME

UB

M

2012

czys

te p

odło

że (

M)

pure

med

ium

(M

) 4

1,4

± 7

,2 5

05,7

± 3

,4 1

71,3

± 9

,2 5

11,7

± 1

01,0

477

,6 ±

3,7

402

,5 ±

80,

1

podł

oże

+ b

akte

rie

(M+

b)

med

ium

+ b

acte

ria

(M+

b)

24,

5 ±

5,9

410

,3 ±

53,

0 1

15,3

± 8

,5 6

04,9

± 1

9,9

357

,8 ±

2,6

388

,6 ±

21,

9

2013

czys

te p

odło

że (

M)

pure

med

ium

(M

) 1

8,1

± 6

,94

493

,2 ±

27,

5 2

24,7

± 5

7,0

384

,3 ±

16,

7 8

94,6

± 2

7,5

317

,2 ±

127

,4

podł

oże

+ b

akte

rie

(M+

b)

med

ium

+ b

acte

ria

(M+

b)

8,8

7 ±

5,9

486

,6 ±

12,

3 1

63,9

± 5

8,5

403

,2 ±

70,

4 7

60,4

± 1

53,4

256

,2 ±

86,

0

War

unki

/ C

ondi

tions

mik

roae

rofil

owe

/ mic

roae

roph

ilic

anae

robo

we

/ ana

erob

ic

EC

M –

pod

łoże

dla

Esc

heric

hia

coli

(bul

ion

odży

wcz

y), E

NM

– p

odło

że d

la E

nter

ococ

cus

(TSY

EM

, war

unki

mik

roae

rofil

owe)

, LC

BM

– p

odło

że d

la

Lac

toba

cillu

s (M

RS)

, B

AC

M –

pod

łoże

dla

Bac

tero

ides

(ST

), B

FM

– p

odło

że d

la B

ifido

bact

eriu

m,

RU

MIM

/EU

BM

– p

odło

że d

la R

umin

ococ

cus

i Eub

acte

rium

(T

SYE

M, w

arun

ki a

naer

obow

e)

EC

M –

med

ium

for

Esc

heric

hia

coli

(nut

rien

t br

oth)

, E

NM

– m

ediu

m f

or E

nter

ococ

cus

(TSY

EM

, m

icro

aero

phili

c co

nditi

ons)

, L

CB

M –

med

ium

for

L

acto

baci

llus (

MR

S br

oth)

, BA

CM

– m

ediu

m fo

r Bac

tero

ides

(ST

med

ium

), B

FM –

med

ium

for B

ifido

bact

eriu

m, R

UM

IM/E

UB

M –

med

ium

for R

umin

ococ

cus

and

Eub

acte

rium

(T

SYE

M, a

naer

obic

con

ditio

ns)


cania różnymi dawkami polifenolu/ekstraktu uzyskane wartości odnoszono do wyniku uzyskanego dla kontroli pozytywnej (Kpoz), czyli tego samego medium bez żadnych dodatków i nieinokulowanego bakteriami, i wyrażano jako % Kpoz. Z ko-lei wartości potencjału AOX medium wzbogaconego i poddanego działaniu dane-go gatunku bakterii odnoszono do wyniku otrzymanego dla medium bez dodatku polifenolu/ekstraktu, inkubowanego w obecności danej bakterii (Kpoz_b), i wyraża-no jako %Kpoz_b.

Wyniki uzyskane dla czystych roztworów polifenoli przedstawiono w tabelach 24–26, a dla ekstraktów i preparatów – w tabelach 27–29. Podano też wyliczone war-tości współczynnika interakcji (WI), które świadczą o zwiększeniu (WI > 1) bądź zmniejszeniu (WI < 1) potencjału antyoksydacyjnego pod wpływem bakterii. Należy przy tym wyraźnie zaznaczyć, że obniżenie się potencjału antyoksydacyjnego pożywki pod wpływem bakterii nie jest jednoznaczne z przemianami polifenoli w stronę me-tabolitów o niższym potencjale antyoksydacyjnym. Taki spadek może wynikać także z wiązania przeciwutleniaczy do makromolekuł obecnych w medium, z wykorzystania przez bakterie składników pożywki o potencjale przeciwrodnikowym na potrzeby własnego metabolizmu oraz ze zmian pH i/lub hydrofobowości pożywki na skutek metabolizmu bakterii (co zmienia zdolność reagowania polifenoli z rodnikiem ABTS).

Analiza wyników dotyczących potencjału antyoksydacyjnego podłoży wzbogaca-nych związkami polifenolowymi lub ekstraktami roślinnymi (tab. 24–29) po inkuba-cji z bakteriami lub bez bakterii pozwoliła na rozpoznanie kilku typów zmian, które zostały omówione poniżej.

Pierwszy, najbardziej oczywisty i oczekiwany typ zmian występuje wtedy, gdy dodanie polifenolu lub ekstraktu w rosnącym stężeniu powoduje proporcjonalny wzrost potencjału AOX medium, w stosunku do czystego podłoża. Jak już wspo-mniano, wyjściowe medium zawiera składniki, które mają własną zdolność zmiatania rodnika ABTS (tab. 23), i dodanie polifenoli – związków o właściwościach przeciw-utleniających – powoduje zwiększenie tego potencjału. Szczególnie dobrze widać taki rodzaj zmian w prostym medium, o niskim bazowym potencjale antyoksydacyj-nym, jakim jest bulion odżywczy dla Escherichia coli. W zależności od rodzaju do-danego czystego polifenolu i jego stężenia, zanotowane wartości końcowe potencja-łu AOX kształtowały się w zakresie od ok. 108% do nieco ponad 553% wartości wyjściowej (tab. 24). W przypadku wzbogacania ekstraktami lub preparatami zwięk-szenie potencjału antyoksydacyjnego było znacznie większe – uzyskano wartości od ok. 117% do prawie 1431% wyjściowego potencjału antyoksydacyjnego oznaczone-go dla tego medium (tab. 27). Gdy do doświadczeń stosowano bardziej złożone media, o wyższym bazowym potencjale AOX, różnice wywołane dodatkiem polife-nolu lub ekstraktu nie były już tak spektakularne. Nadal, co prawda, następował wzrost potencjału o kilkanaście do kilkudziesięciu procent, ale wartości końcowe nie przekraczały więcej niż 2,5- i 3,5-krotnie (odpowiednio dla pojedynczych poli-fenoli i ekstraktów) wartości bazowej (tab. 24–29).


W wielu przypadkach zaobserwowano, że przy niskich stężeniach dodatków polifenoli (w postaci roztworu czystego związku lub ekstraktu/preparatu) potencjał antyoksydacyjny medium wzbogaconego był niższy niż kontrolnego. Oznacza to, że doszło do reakcji między polifenolami a składnikami medium, co doprowadziło do zablokowania grup uczestniczących w zmiataniu rodnika ABTS. Tego typu zmiany obserwowano między innymi w doświadczeniach z Enterococcus caccae (tab. 25 i 28), Bifidobacterium catenulatum oraz Eubacterium cylindroides (tab. 26). W mia-rę wzrostu stężenia polifenolu lub ekstraktu potencjał AOX podłoża zwykle się zwiększał, co odpowiada reakcjom opisanym w pracy przeglądowej przez Le Bourvellec i Renard [2012]. Według tych autorek, za polifenole szczególnie zaan-gażowane w interakcje z makromolekułami można uznać taniny, zarówno hydroli-zujące (głównie galotaniny), jak i niehydrolizujące, czyli proantocyjanidyny (oligo- i polimery flawan-3-oli). Taniny silnie reagują z białkami, zwłaszcza bogatymi w prolinę lub całkiem hydrofobowymi. Reakcje wiązania polifenoli z proteinami mogą być odwracalne lub nieodwracalne. W pierwszym przypadku połączenie za-chodzi głównie poprzez niekowalencyjne oddziaływania międzycząsteczkowe, tj. wiązania wodorowe oraz oddziaływania hydrofobowe i van der Waalsa. Oddziaływania hydrofobowe zachodzą przede wszystkim między aromatycznymi pierścieniami polifenoli a miejscami hydrofobowymi białek, zaś wiązania wodorowe powstają przede wszystkim między grupami hydroksylowymi polifenoli a miejscami akcep-torowymi dla wodoru w białkach. Połączenia nieodwracalne to wiązania kowalen-cyjne między polifenolem a makrocząsteczką. Do reakcji, w których powstają, za-licza się także utlenianie składników fenolowych z wytworzeniem o-chinonów i o-semichinonów oraz rozerwanie w kwaśnym środowisku wiązania pomiędzy fla-wanami w proantocyjanidynach z wytworzeniem kationu (który łatwiej reaguje z białkami) [Le Bourvellec i Renard 2012].

Niekowalencyjne połączenie, mimo swojej słabej siły, może być przyczyną wy-trącania białek przez polifenole i zaburzania aktywności enzymów (co z kolei może prowadzić do hamowania wzrostu bakterii). Skutki interakcji polifenol–makroczą-steczka zależą od proporcji między tymi składnikami. Przy niskiej zawartości poli-fenoli w stosunku do cząsteczek białek powstają kompleksy rozpuszczalne. Wraz ze wzrostem zawartości polifenolu zmniejsza się rozpuszczalność kompleksów i począt-kowo zwiększa się ich rozmiar i złożoność, by ostatecznie z roztworu wytrąciły się białka niejako opłaszczone polifenolami [Le Bourvellec i Renard 2012]. Wydaje się, że właśnie początkowe etapy tych interakcji wystąpiły w doświadczeniach wykony-wanych w tej pracy. Należy jednak zaznaczyć, że interakcje między cząsteczkami w roztworze zależą również od siły jonowej, temperatury i pH środowiska reakcji oraz od składu rozpuszczalnika, gdyż powstawanie kompleksów zależy od tworzenia wiązań wodorowych i zachodzenia interakcji hydrofobowych. O ile rozpuszczalnik oraz temperatura we wszystkich doświadczeniach były takie same (DMSO dla po-lifenoli lub etanol dla ekstraktów, 37°C), o tyle pH było różne i zależne od medium,


bela

24.

W

pływ

dod

atku

pol

ifeno

li or

az o

becn

ości

Gra

m-u

jem

nych

bak

teri

i Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus

(BA

C)

i Esc

heric

hia

coli

(EC

) na

ak

tyw

ność

ant

yoks

ydac

yjną

pod

łoży

(oz

nacz

oną

met

odą

AB

TS

po 2

4-go

dzin

nej i

nkub

acji)

prz

edst

awio

ną ja

ko p

roce

nt w

sto

sun-

ku d

o od

pow

iedn

iej k

ontr

oli (

śred

nia

± S

D, n

= 3

) Ta

ble

24.

Eff

ect o

f the

add

ition

of p

olyp

heno

ls a

nd th

e pr

esen

ce o

f Gra

m-n

egat

ive

bact

eria

Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus (

BA

C) a

nd E

sche

richi

a co

li (E

C)

on t

he a

ntio

xida

nt a

ctiv

ity o

f m

edia

(as

det

erm

ined

by

AB

TS

assa

y fo

llow

ing

24-h

inc

ubat

ion)

exp

ress

ed a

s pe

rcen

t re

lativ

e to

app

ropr

iate

con

trol

(m

ean

± S

D, n

= 3

)

Polif

enol

Poly

phen

ol

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[µg/

ml]

BA

CM

BA

CM

+b

WI B

AC

EC

ME

CM

+ b

WI E

C

Ø

–10

010

0–

100

100

–

CA

T

20

188,

0 ±

13,

5 *†

c

85,4

± 9

,7 †

b0,

45 2

88,8

± 2

3,0

*†b

21

2,0

± 2

6,6

*†c

0,73

100

15

9,7

± 1

4,9

*b

141,

4 ±

13,

0 *a

0,89

336

,4 ±

31,

0 *b

35

7,6

± 4

0,7

*b1,

06

250

21

2,0

± 1

8,3

*†a

14

6,5

± 8

,3 *

†a0,

69 5

53,3

± 3

7,1

*a

560,

5 ±

79,

0 *a

1,01

HR

20

128,

3 ±

1,5

*†a

84

,6 ±

0,9

*†a

0,66

131

,6 ±

9,2

*b

11

6,0

± 7

,1 a

0,88

100

10

4,8

± 7

,5 b

93

,5 ±

3,9

a0,

8915

8,9

± 2

4,0

*†a

96

,7 ±

5,0

†a

0,61

250

11

5,9

± 1

4,4

*†a,

b

86,3

± 9

,0 *

†a0,

74 1

27,1

± 2

0,7

*†a,

b

122,

2 ±

16,

0 *†

a0,

96

H

20

83,4

± 4

,5 *

†b

86,7

± 3

,7 *

†b1,

04 1

08,2

± 2

2,6

†a

239,

2 ±

39,

9 *†

a3,

47

100

11

0,7

± 5

,0 †

a

84,7

± 3

,3 *

†b0,

77 1

32,3

± 1

6,2

†a

224,

3 ±

26,

3 *†

a1,

70

250

10

6,1

± 1

5,1

a

102,

5 ±

8,4

a

0,97

123

,0 ±

18,

9 †a

24

4,2

± 6

1,3

*†a

1,99

NR

20

135,

4 ±

19,

1 *†

b

59,0

± 6

,3 *

†a0,

44 1

48,1

± 1

2,8

*b

135,

4 ±

33,

8 *b

0,91

100

13

7,1

± 1

3,4

*†b

88

,0 ±

6,2

†b

0,64

165

,8 ±

12,

4 *†

a, b

19

6,0

± 8

,7 *

†a1,

18

250

22

9,1

± 1

4,5

*†a

11

5,2

± 5

,8 †

a0,

50 1

85,5

± 1

3,8

*a

169,

0 ±

9,9

*a

0,91

N

20

112,

6 ±

8,0

*†b

87

,3 ±

13,

1 *†

c0,

78 1

10,9

± 1

1,9

†c

232,

8 ±

41,

2 *†

c2,

10

100

14

9,9

± 0

,9 *

a

150,

7 ±

0,5

*a

1,01

188

,2 ±

11,

3 *†

b

384,

3 ±

5,2

*†b

2,04

250

11

7,5

± 2

,3 *

b

128,

0 ±

1,7

*b

1,09

340

,2 ±

20,

8 *†

a

531,

8 ±

48,

9 *†

a1,

56

PHL

20

157,

1 ±

30,

1 *a

12

5,8

± 3

5,0

a0,

80 1

30,5

± 8

,9 †

c

277,

3 ±

7,7

*†c

2,13

100

18

6,6

± 1

8,1

*†a

70

,7 ±

9,0

†b

0,38

282

,8 ±

24,

8 *†

b

333,

8 ±

25,

8 *†

b1,

18

250

18

2,6

± 1

3,2

*†a

12

6,5

± 2

0,3

†a0,

69 4

74,4

± 2

0,8

*†a

38

5,0

± 4

4,9

*†a

0,81


RS

20

124,

8 ±

7,6

*†c

97

,3 ±

5,3

†a

0,78

245

,0 ±

18,

7 *†

c

430,

3 ±

4,4

*†c

1,76

100

19

3,2

± 1

0,2

*†b

12

9,1

± 4

,7 *

†b0,

67 2

62,3

± 2

5,1

*†b

46

7,9

± 1

1,4

*†b

1,78

250

22

2,9

± 2

,6 *

†a

152,

8 ±

0,7

*†a

0,69

332

,7 ±

16,

4 *†

a

502,

8 ±

10,

4 *†

a1,

51

RU

T

20

109,

8 ±

9,2

†b

56

,9 ±

9,2

*†a

0,52

128

,6 ±

7,0

†c

22

5,8

± 1

2,2

*†c

1,76

100

13

8,0

± 1

0,0

*†a

76

,7 ±

8,3

*†b

0,56

192

,1 ±

9,8

*†b

32

7,2

± 5

6,2

*†b

1,70

250

13

2,1

± 1

3,0

*†a

94

,2 ±

3,6

†a

0,71

264

,4 ±

18,

6 *†

a

527,

9 ±

13,

7 *†

a2,

00

KM

P

4

94,5

± 7

,8 a

96

,6 ±

7,7

a, b

1,02

147

,4 ±

21,

0 *†

b

270,

6 ±

9,4

*†b

2,14

20

104,

3 ±

6,3

a

112,

4 ±

5,8

a1,

08 1

79,1

± 5

,3 *

†a

258,

9 ±

7,5

*†b

1,45

50

92,3

± 1

8,8

a

86,7

± 1

3,7

b0,

93 1

78,8

± 1

1,2

*†a

38

9,6

± 2

,5 *

†a2,

18

Q

4

157,

5 ±

21,

8 *†

c

81,3

± 1

2,6

†b0,

52 2

62,0

± 1

0,7

*b

254,

5 ±

17,

9 *b

0,97

20

192,

3 ±

21,

1 *†

b

102,

1 ±

13,

3 †a

, b0,

53 2

80,3

± 1

6,0

*†b

35

0,9

± 1

9,4

*†a

1,25

50

249,

9 ±

10,

2 *†

a

116,

9 ±

0,6

†a

0,47

323

,5 ±

19,

3 *a

32

6,3

± 1

4,7

*a1,

01

CA

T, H

R, H

, NR

, N, P

HL

, RS,

RU

T, K

MP,

Q –

jak

w t

abel

i 17

/ see

Tab

le 1

7 B

AC

M, E

CM

, BA

CM

+b,

EC

M+

b –

jak

w t

abel

i 23

/ see

Tab

le 2

3

Ø (

kont

rola

): d

la B

AC

M i

EC

M –

Kpo

z (po

dłoż

e od

pow

iedn

ie d

la d

aneg

o ga

tunk

u ba

kter

ii, b

ez p

olife

noli

i be

z ba

kter

ii);

dla

BA

CM

+b

i E

CM

+b

– K

poz+

b (po

dłoż

e be

z po

lifen

oli,

z ba

kter

iam

i dan

ego

gatu

nku)

Ø

(co

ntro

l):

for

BA

CM

and

EC

M –

Kpo

z (m

ediu

m a

ppro

pria

te f

or a

giv

en b

acte

ria

spec

ies,

with

out

poly

phen

ols

and

with

out

bact

eria

); f

or B

AC

M+

b an

d E

CM

+b

– K

poz+

b (m

ediu

m w

ithou

t po

lyph

enol

s, in

cuba

ted

with

bac

teri

a)

WI

– w

spół

czyn

nik

inte

rakc

ji (W

I =

AO

XM

+b/A

OX

M; w

arto

ści W

I >

1 i

WI

< 1

, odp

owie

dnio

, św

iadc

zą o

wzr

ości

e lu

b sp

adku

pot

encj

ału

anty

oksy

da-

cyjn

ego

(AO

X)

pod

wpł

ywem

bak

teri

i)

WI

– in

tera

ctio

n co

effic

ient

(W

I =

AO

XM

+b/A

OX

M; v

alue

s W

I >

1 a

nd W

I <

1, r

espe

ctiv

ely,

test

ify to

an

incr

ease

or

a de

crea

se in

ant

ioxi

dant

pot

en-

tial (

AO

X)

due

to b

acte

ria)

Śred

nie

ozna

czon

e gw

iazd

ką (

*) r

óżni

ą si

ę is

totn

ie w

sto

sunk

u do

odp

owie

dnie

j kon

trol

i (Ø

) (p

< 0

,05)

. M

eans

mar

ked

with

an

aste

risk

(*)

are

sig

nific

antly

diff

eren

t in

com

pari

son

with

res

pect

ive

cont

rol (

Ø)

(p <

0.0

5).

Dla

dan

ej b

akte

rii i

teg

o sa

meg

o st

ężen

ia p

olife

nolu

śre

dnie

ozn

aczo

ne s

ymbo

lem

† r

óżni

ą si

ę is

totn

ie (

p <

0,0

5).

For

a gi

ven

bact

eria

and

the

sam

e po

lyph

enol

con

cent

ratio

n, m

eans

mar

ked

with

sym

bol †

are

sig

nific

antly

diff

eren

t (p

< 0

.05)

.

Dla

dan

ego

polif

enol

u śr

edni

e oz

nacz

one

tą s

amą

liter

ą w

kol

umni

e ni

e ró

żnią

się

isto

tnie

(p

< 0

,05)

. Fo

r a

give

n po

lyph

enol

, mea

ns m

arke

d w

ith t

he s

ame

lett

er in

a c

olum

n ar

e no

t si

gnifi

cant

ly d

iffer

ent

(p <

0.0

5).


bela

25.

W

pływ

dod

atku

pol

ifeno

li or

az o

becn

ości

bak

teri

i Rum

inoc

occu

s ga

uvre

auii

(RU

MI)

i E

nter

ococ

cus

cacc

ae (

EN

) na

akt

ywno

ść

anty

oksy

dacy

jną

podł

oża

TSY

EM

(oz

nacz

oną

met

odą

AB

TS

po 2

4-go

dzin

nej i

nkub

acji)

prz

edst

awio

ną ja

ko p

roce

nt w

sto

sunk

u do

odp

owie

dnie

j kon

trol

i (śr

edni

a ±

SD

, n =

3)

Tabl

e 25

. E

ffec

t of

the

add

ition

of

poly

phen

ols

and

the

pres

ence

of

bact

eria

Rum

inoc

occu

s ga

uvre

auii

(RU

MI)

and

Ent

eroc

occu

s ca

ccae

(E

N)

on t

he a

ntio

xida

nt a

ctiv

ity o

f T

SYE

M m

ediu

m (

as d

eter

min

ed b

y A

BT

S as

say

follo

win

g 24

-h i

ncub

atio

n) e

xpre

ssed

as

perc

ent

rela

tive

to a

ppro

pria

te c

ontr

ol (

mea

n ±

SD

, n =

3)

Polif

enol

Poly

phen

ol

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[µg/

ml]

RU

MIM

RU

MIM

+b

WI R

UM

IE

NM

EN

M+

bW

I EN

Ø–

100

100

–10

010

0–

CA

T

20

105,

9 ±

6,9

b 1

18,6

± 4

,5 *

a, b

1,12

84

,0 ±

14,

5 b

128

,9 ±

7,3

*†a

1,53

100

13

8,0

± 4

,9 *

†a 1

08,8

± 8

,3 †

b0,

79

87,4

± 9

,5 †

b 1

37,5

± 1

4,5

*†a

1,57

250

13

8,2

± 1

7,5

*a 1

33,7

± 1

,9 *

a0,

97 1

15,0

± 8

,3 †

a 1

39,0

± 4

,1 *

†a1,

21

HR

20

113,

0 ±

13,

8 b

112

,7 ±

12,

1 b

1,00

98

,9 ±

12,

2 a

114

,6 ±

12,

1 b

1,16

100

14

9,5

± 1

6,1

*a 1

50,8

± 1

3,2

*a1,

00

94,3

± 1

7,3

†a 1

17,8

± 1

7,2

†b1,

42

250

12

5,6

± 1

8,3

*b 1

12,0

± 1

3,9

b0,

89 1

02,1

± 7

,7 †

a 1

31,5

± 3

,2 *

†a1,

29

H

20

102,

4 ±

2,9

b 1

07,5

± 1

,4 b

1,05

98

,1 ±

8,1

a 1

06,6

± 1

3,5

a1,

09

100

11

0,6

± 6

,1 a

, b 1

23,7

± 8

,9 *

a1,

19

97,1

± 7

,7 a

109

,4 ±

3,1

a1,

10

250

12

3,1

± 1

5,5

*a 1

09,9

± 2

,8 b

0,89

83

,5 ±

10,

4 *†

a 1

14,4

± 5

,3 *

†a1,

37

NR

20

93,4

± 1

8,7

†b 1

17,3

± 1

3,8

†a, b

1,26

88

,8 ±

22,

5 †b

143

,6 ±

2,6

*†a

, b1,

62

100

12

1,9

± 1

5,0

*a 1

35,8

± 5

,2 *

a1,

11

91,8

± 6

,1 †

b 1

34,1

± 1

,6 *

†b1,

46

250

13

3,9

± 1

5,7

*†a

97

,3 ±

9,3

†b

0,73

127

,2 ±

16,

1 *†

a 1

63,2

± 2

3,6

*†a

1,28


N

20

96,3

± 5

,3 c

94

,6 ±

1,5

b0,

98 1

15,2

± 9

,9 a

122

,2 ±

4,8

*b

1,06

100

11

1,1

± 6

,0 *

b 1

20,0

± 5

,7 *

a1,

08 1

06,4

± 1

5,2

†a 1

28,7

± 1

1,3

*†b

1,21

250

15

0,1

± 1

1,8

*†a

123

,3 ±

2,1

*†a

0,82

109

,3 ±

13,

4 †a

162

,1 ±

1,6

*†a

1,48

PHL

20

112,

6 ±

13,

8 †b

131

,2 ±

0,6

*†a

1,17

86

,3 ±

15,

9 †a

165

,3 ±

19,

0 *†

a1,

92

100

13

0,8

± 9

,9 *

a 1

33,0

± 1

,8 *

a1,

02

89,4

± 5

,4 †

a 1

27,2

± 1

,8 *

†b1,

42

250

14

1,5

± 1

7,6

*a 1

32,8

± 3

,5 *

a0,

94

99,6

± 0

,6 †

a 1

32,0

± 0

,1 *

†b1,

32

RS

20

84,6

± 6

,7 *

†b 1

46,1

± 2

0,5

*†a

1,73

87

,7 ±

4,6

*†c

132

,4 ±

3,6

*†b

1,51

100

14

4,1

± 8

,2 *

†a 1

26,0

± 0

,1 *

†b0,

87

98,8

± 6

,2 †

b 1

38,9

± 2

,8 *

†b1,

41

250

12

9,7

± 1

0,1

*a 1

39,9

± 8

,5 *

a, b

1,08

117

,2 ±

3,8

*†a

156

,6 ±

5,6

*†a

1,34

RU

T

20

89,1

± 1

1,8

b

96,3

± 1

9,9

b0,

92

82,8

± 1

3,3

†a 1

61,6

± 1

1,2

*†a

1,95

100

10

4,3

± 1

7,3

a, b

116

,5 ±

15,

2 b

1,31

107

,5 ±

19,

0 †a

160

,9 ±

32,

1 *†

a1,

50

250

11

4,2

± 1

0,1

†a 1

61,2

± 0

,3 *

†a1,

41

99,6

± 8

,0 †

a 1

49,4

± 6

,6 *

†a1,

50

KM

P

4

80,3

± 7

,3 *

†b 1

01,1

± 4

,6 †

a0,

77

97,3

± 8

,2 a

120

,6 ±

6,7

b1,

24

20

131,

1 ±

12,

0 *†

a 1

11,8

± 1

3,0

†a1,

39

96,0

± 6

,7 †

a 1

52,7

± 3

6,3

*†a,

b1,

59

50

145,

5 ±

9,7

*†a

110

,3 ±

10,

9 †a

0,76

92

,1 ±

6,7

†a

189

,1 ±

49,

2 *†

a2,

05

Q

4

123,

4 ±

11,

0 *a

115

,1 ±

4,8

a0,

93

80,7

± 6

,4 †

c 1

13,7

± 3

,7 *

†b1,

41

20

124,

5 ±

8,9

*a

112

,0 ±

8,6

a0,

90

88,9

± 2

,1 †

b 1

08,4

± 0

,4 *

†b1,

22

50

125,

1 ±

20,

4 *a

115

,3 ±

11,

9 a

0,92

128

,3 ±

4,4

†a

138

,9 ±

3,5

*†a

1,08

CA

T, H

R, H

, NR

, N, P

HL

, RS,

RU

T, K

MP,

Q –

jak

w t

abel

i 17

/ see

Tab

le 1

7

RU

MIM

, EN

M, R

UM

IM+

b, E

NM

+b

– ja

k w

tab

eli 2

3 / s

ee T

able

23

Pozo

stał

e ob

jaśn

ieni

a ja

k w

tab

eli 2

4 / S

ee T

able

24

for

othe

r ex

plan

ator

y no

tes


bela

26.

W

pływ

dod

atku

pol

ifeno

li or

az o

becn

ości

bak

teri

i Bifi

doba

cter

ium

cat

enul

atum

(B

F),

Lac

toba

cillu

s sp

. (L

CB

) i E

ubac

teriu

m c

y-lin

droi

des

(EU

B)

na a

ktyw

ność

ant

yoks

ydac

yjną

pod

łoża

(oz

nacz

oną

met

odą

AB

TS

po 2

4-go

dzin

nej

inku

bacj

i) p

rzed

staw

ioną

ja

ko p

roce

nt w

sto

sunk

u do

odp

owie

dnie

j kon

trol

i (śr

edni

a ±

SD

, n =

3)

Tabl

e 26

. E

ffec

t of

the

add

ition

of

poly

phen

ols

and

the

pres

ence

of

bact

eria

Bifi

doba

cter

ium

cat

enul

atum

(B

F),

Lac

toba

cillu

s sp

. (L

CB

) an

d E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des

(EU

B)

on th

e an

tioxi

dant

act

ivity

of m

ediu

m (

as d

eter

min

ed b

y A

BT

S as

say

follo

win

g 24

-h in

cuba

-tio

n) e

xpre

ssed

as

perc

ent

rela

tive

to a

ppro

pria

te c

ontr

ol (

mea

n ±

SD

, n =

3)

Polyphenol


[µg/ml]

BFM

BFM

+b

WI B

FL

CB

ML

CB

M+

bW

I LC

BE

UB

ME

UB

M+

bW

I EU

B

Ø–

100

100

–10

010

0–

100

100

–

CA

T

20

74,7

± 1

2,1

*†b

124

,4 ±

12,

1 *†

a1,

67 1

55,2

± 4

,2 *

†b 2

02,2

± 2

,8 *

†c1,

30

78,8

± 8

,6 *

†b 1

09,0

± 1

4,2

†b1,

38

100

102

,9 ±

6,3

†a

126

,5 ±

3,0

*†a

1,23

168

,0 ±

14,

6 *†

b 2

39,0

± 1

3,0

*†b

1,42

110

,0 ±

4,4

†a

132

,8 ±

2,0

*†a

1,21

250

106

,8 ±

7,9

a 1

10,5

± 6

,1 a

1,03

202

,0 ±

28,

2 *†

a 2

84,9

± 5

,8 *

†a1,

41 1

07,9

± 1

1,7

†a 1

42,0

± 1

6,0

*†a

1,32

HR

20

47,9

± 5

,8 *

†c 1

07,9

± 6

,5 †

a2,

25 1

02,1

± 9

,1 a

, b

81,5

± 1

1,2

c0,

80

77,0

± 4

,7 *

†b 1

12,2

± 0

,4 †

a1,

46

100

81

,5 ±

0,7

*†a

109

,1 ±

0,8

*†a

1,33

120

,2 ±

18,

6 *a

112

,9 ±

17,

0 b

0,94

93

,1 ±

5,1

a 1

02,7

± 1

,9 a

1,08

250

69

,1 ±

5,8

*†b

101

,9 ±

7,5

†a

1,47

91

,5 ±

9,5

†b

137

,3 ±

7,8

*†a

1,50

77

,0 ±

15,

3 *†

b 1

14,9

± 1

2,0

*†a

1,49

H

20

73,6

± 1

,9 *

a, b

70

,0 ±

2,8

*b

0,95

103

,7 ±

19,

6 a

98

,1 ±

20,

9 b

0,95

110

,4 ±

8,2

*†a

99

,0 ±

6,2

†a

0,90

100

79

,7 ±

10,

4 *a

66

,9 ±

14,

6 *b

0,84

115

,5 ±

15,

0 a

141

,0 ±

17,

3 *a

1,22

104

,0 ±

2,6

a

99,7

± 1

,2 a

0,95

250

66

,4 ±

8,7

*†b

91

,5 ±

1,2

†a

1,38

103

,0 ±

15,

3 a

126

,3 ±

2,3

*a

1,23

109

,7 ±

8,3

a 1

02,2

± 6

,1 a

0,93

NR

20 1

34,3

± 1

7,6

*a 1

42,3

± 1

6,7

*a1,

06

99,6

± 3

,1 b

96

,8 ±

5,8

b0,

97 1

05,4

± 7

,7 †

c

85,9

± 4

,9 †

b0,

59

100

97

,8 ±

12,

6 b

103

,3 ±

13,

8 b

1,06

101

,1 ±

3,8

†b

126

,1 ±

2,4

*†a

1,25

126

,3 ±

7,3

*b

109

,9 ±

6,9

a1,

04

250

70

,2 ±

10,

5 *c

82

,2 ±

11,

7 b

1,17

154

,3 ±

19,

2 *a

134

,1 ±

28,

5 *a

0,87

145

,7 ±

19,

4 *†

a 1

06,5

± 8

,2 †

a0,

84


N

20

62,9

± 1

0,7

*†b

94

,4 ±

7,4

†b

1,50

129

,9 ±

16,

9 b

150

,5 ±

25,

5 *b

1,16

150

,4 ±

11,

4 *†

a 1

00,9

± 4

,2 †

b0,

67

100

76

,1 ±

7,4

*†b

109

,5 ±

9,2

†a

1,44

153

,1 ±

16,

1 *†

a, b

251

,3 ±

52,

2 *†

a1,

64 1

46,7

± 2

5,1

*†a

104

,7 ±

20,

1 †a

, b0,

71

250

92

,8 ±

1,6

†a

120

,7 ±

1,9

*†a

1,30

189

,7 ±

11,

1 *†

a 2

67,5

± 2

8,6

*†a

1,41

161

,9 ±

13,

1 *†

a 1

28,7

± 4

,4 *

†a0,

79

PHL

20

85,2

± 1

8,6

†b 1

34,9

± 7

,6 *

†a1,

58 1

55,3

± 1

4,6

*†a

220

,8 ±

15,

6 *†

b1,

42

87,7

± 1

3,2

b

99,6

± 1

4,6

b1,

14

100

105

,4 ±

20,

7 a

116

,6 ±

12,

9 a

1,11

121

,5 ±

9,0

*†b

225

,9 ±

12,

2 *†

b1,

86 1

08,9

± 5

,8 a

120

,1 ±

4,5

*a,

b1,

10

250

96

,3 ±

9,2

†a,

b 1

21,6

± 6

,8 *

†a1,

26 1

67,0

± 1

2,1

*†a

258

,9 ±

9,9

*†a

1,50

116

,4 ±

23,

0 a

131

,4 ±

4,1

*a

1,16

RS

20 1

08,0

± 4

,1 †

b 1

28,2

± 3

,5 *

†b1,

19 1

68,1

± 2

7,8

†a 2

60,9

± 5

0,2

*†b

1,55

140

,4 ±

12,

9 *†

b 1

10,9

± 5

,4 †

b0,

79

100

138

,9 ±

19,

0 *a

143

,6 ±

15,

3 *b

1,03

243

,2 ±

31,

2 *a

246

,0 ±

31,

2 *b

1,01

157

,3 ±

10,

9 *†

a 1

07,1

± 5

,7 †

b0,

68

250

113

,3 ±

8,0

†b

167

,8 ±

10,

2 *†

a1,

48 2

21,6

± 1

9,2

*†a

395

,9 ±

121

,5 *†

a1,

79 1

65,3

± 1

4,4

*†a

131

,2 ±

0,1

*†a

0,79

RU

T

20 1

23,7

± 1

0,8

*†a

102

,2 ±

10,

0 †a

0,83

193

,9 ±

37,

2 *a

176

,6 ±

28,

0 *a

0,91

77

,2 ±

3,9

*†b

114

,3 ±

3,6

*†b

1,48

100

105

,2 ±

7,4

a, b

118

,8 ±

2,7

*a

1,13

125

,2 ±

23,

5 †b

203

,5 ±

37,

9 *†

a1,

62

88,0

± 1

0,7

†b 1

25,9

± 1

3,4

*†a,

b1,

43

250

87

,8 ±

8,3

†b

117

,3 ±

23,

5 †a

1,33

136

,7 ±

12,

3 b

176

,4 ±

3,7

*a

1,29

112

,2 ±

12,

8 †a

138

,4 ±

0,0

*†a

1,23

KM

P

4 1

17,3

± 1

8,3

*a 1

01,4

± 1

8,2

b0,

86 1

98,6

± 1

3,5

*†a

231

,8 ±

6,0

*†a

1,17

94

,2 ±

11,

7 a

104

,2 ±

13,

0 a

0,98

20

90,4

± 5

,9 †

b 1

32,5

± 3

,3 *

†a1,

47 1

94,6

± 1

0,4

*†a

223

,3 ±

11,

7 *†

a1,

15

87,8

± 6

,1 †

a 1

06,5

± 1

0,1

†a1,

21

50

90,0

± 1

,6 †

b 1

24,4

± 0

,7 *

†a1,

38 1

86,8

± 1

5,0

*†a

225

,0 ±

10,

4 *†

a1,

20

93,1

± 6

,3 †

a 1

12,9

± 1

6,6

†a1,

21

Q

4 1

13,4

± 1

0,0

a 1

21,1

± 6

,2 *

c1,

07 2

03,1

± 2

9,3

*†a

372

,2 ±

30,

6 *†

a1,

83 1

25,0

± 1

1,3

*†b

97

,0 ±

17,

7 †b

0,59

20

91,3

± 1

1,5

b 1

04,7

± 1

0,4

b1,

15 1

73,7

± 1

3,1

*†a

277

,2 ±

18,

0 *†

b1,

60 1

31,0

± 8

,7 *

b 1

19,4

± 1

,0 *

a0,

91

50

91,7

± 4

,3 †

b 1

48,9

± 1

2,7

*†a

1,62

115

,5 ±

5,5

†b

251

,5 ±

10,

2 *†

b2,

18 1

64,7

± 2

1,7

*†a

112

,5 ±

2,7

†a,

b0,

90

CA

T, H

R, H

, NR

, N, P

HL

, RS,

RU

T, K

MP,

Q –

jak

w t

abel

i 17

/ see

Tab

le 1

7 B

FM

, LC

BM

, EU

BM

, BF

M+

b, L

CB

M+

b, E

UB

M+

b –

jak

w t

abel

i 23

/ see

Tab

le 2

3

Pozo

stał

e ob

jaśn

ieni

a ja

k w

tab

eli 2

4 / S

ee T

able

24

for

othe

r ex

plan

ator

y no

tes


bela

27.

W

pływ

dod

atku

eks

trak

tów

lub

prep

arat

ów o

raz

obec

nośc

i Gra

m-u

jem

nych

bak

teri

i Bac

tero

ides

gal

actu

roni

cus (

BA

C) i

Esc

heric

hia

coli

(EC

) na

akty

wno

ść a

ntyo

ksyd

acyj

ną p

odło

ża (o

znac

zoną

met

odą

AB

TS

po 2

4-go

dzin

nej i

nkub

acji)

prz

edst

awio

ną ja

ko p

roce

nt

w s

tosu

nku

do o

dpow

iedn

iej k

ontr

oli (

śred

nia

± S

D, n

= 3

) Ta

ble

27.

Eff

ect

of t

he a

dditi

on o

f ex

trac

ts o

r pr

epar

atio

ns a

nd t

he p

rese

nce

of G

ram

-neg

ativ

e ba

cter

ia B

acte

roid

es g

alac

turo

nicu

s (B

AC

) an

d E

sche

richi

a co

li (E

C)

on t

he a

ntio

xida

nt a

ctiv

ity o

f m

ediu

m (

as d

eter

min

ed b

y A

BT

S as

say

follo

win

g 24

-h i

ncub

atio

n) e

x-pr

esse

d as

per

cent

rel

ativ

e to

app

ropr

iate

con

trol

(m

ean

± S

D, n

= 3

)

Eks

trak

t (P

repa

rat)

Ext

ract

(P

repa

ratio

n)

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[%]

BA

CM

BA

CM

+b

WI B

AC

EC

ME

CM

+b

WI E

C

Ø–

100

100

–10

010

0–

P

1,0

103

,2 ±

1,4

†b

81

,3 ±

4,5

*†c

0,67

288

,3 ±

19,

5 *†

b

409,

8 ±

17,

5 *†

b1,

42

2,5

110

,7 ±

4,3

*†b

91

,6 ±

1,1

†b

0,83

388

,6 ±

17,

9 *†

a

624,

7 ±

49,

6 *†

a1,

61

5,0

121

,5 ±

5,1

*†a

101

,8 ±

2,3

†a

0,99

381

,4 ±

34,

6 *†

a

455,

9 ±

55,

1 *†

b1,

20

PO

1,0

107

,0 ±

8,3

a 1

04,1

± 7

,5 a

0,97

433

,0 ±

8,0

*†b

108

2,3

± 2

8,8

*†a

2,50

2,5

117

,2 ±

8,9

*a

110

,3 ±

4,3

a0,

94 4

94,8

± 8

,9 *

†b

772,

4 ±

74,

9 *†

b1,

56

5,0

111

,7 ±

5,9

a 1

09,6

± 0

,5 a

0,98

698

,1 ±

146

,8 *

a

777,

5 ±

10,

7 *b

1,11

SP

1,0

103

,3 ±

2,1

†b

122

,1 ±

10,

6 *†

a1,

18 1

40,5

± 1

5,5

†a

271,

0 ±

68,

4 *†

c1,

93

2,5

124

,9 ±

5,6

*†a

106

,0 ±

4,9

†b

0,85

131

,7 ±

12,

3 †a

37

6,0

± 1

4,6

*†b

2,86

5,0

110

,0 ±

4,1

a, b

109

,6 ±

13,

1 a,

b1,

00 1

73,1

± 1

0,1

*†a

58

8,6

± 3

,6 *

†a3,

40

M

1,0

177

,3 ±

14,

6 *†

a 1

18,9

± 3

,3 *

†a0,

67 2

48,8

± 3

6,9

*†c

61

8,9

± 3

7,3

*†c

2,49

2,5

109

,4 ±

9,6

b

99,5

± 3

,8 b

0,91

395

,4 ±

32,

5 *†

b

724,

0 ±

17,

6 *†

b1,

83

5,0

99

,2 ±

5,0

b 1

09,8

± 6

,9 a

, b1,

11 5

26,2

± 2

1,9

*†a

87

3,6

± 9

,3 *

†a1,

66


Ż

1,0

137

,6 ±

14,

6 *a

115

,4 ±

7,6

a0,

84 2

50,6

± 9

,3 *

†c

960,

5 ±

2,7

*†a

3,83

2,5

120

,4 ±

15,

1 a

124

,0 ±

16,

4 a

1,03

331

,0 ±

45,

6 *†

b

924,

0 ±

23,

9 *†

a2,

79

5,0

87

,4 ±

14,

4 b

82

,7 ±

12,

5 b

0,95

511

,0 ±

25,

9 *†

a

819,

2 ±

70,

0 *†

b1,

60

S

1,0

138

,1 ±

13,

0 *†

a 1

02,2

± 1

1,4

†a0,

74 3

95,9

± 9

,9 *

†c

779,

4 ±

6,5

*†b

1,97

2,5

127

,9 ±

15,

7 *†

a

97,4

± 8

,2 †

a0,

76 5

27,2

± 2

6,8

*†b

82

6,8

± 1

02,3

*†b

1,57

5,0

134

,8 ±

14,

7 *†

a 1

13,1

± 5

,4 †

a0,

84 6

81,4

± 3

7,2

*†a

92

3,8

± 1

5,2

*†a

1,36

CC

H

1,0

156

,6 ±

5,2

*†a

83

,9 ±

9,7

†b

0,54

134

,9 ±

12,

9 *†

b

469,

7 ±

13,

1 *†

a3,

48

2,5

95

,8 ±

4,2

b 1

03,1

± 0

,3 a

1,08

195

,6 ±

10,

7 *†

a

275,

5 ±

14,

7 *†

b1,

41

5,0

151

,4 ±

3,9

*†a

104

,5 ±

14,

8 †a

0,69

238

,6 ±

25,

0 *†

a

176,

2 ±

26,

5 *†

c0,

74

CN

1,0

151

,6 ±

4,2

*†a

106

,5 ±

7,5

†a

0,70

117

,5 ±

2,6

†c

38

6,7

± 4

7,0

*†c

3,29

2,5

125

,2 ±

19,

2 b

128

,4 ±

12,

8 *a

1,03

375

,0 ±

17,

0 *†

b

745,

9 ±

10,

5 *†

b1,

99

5,0

89

,0 ±

11,

1 †c

122

,9 ±

21,

5 †a

1,38

514

,3 ±

52,

1 *†

a 1

025,

7 ±

93,

1 *†

a1,

99

CC

1,0

150

,8 ±

3,3

*†a

100

,3 ±

17,

8 †a

0,67

237

,8 ±

13,

7 *†

b

103,

0 ±

2,2

†c

0,43

2,5

135

,4 ±

14,

4 *†

a 1

01,0

± 9

,4 †

a0,

75 2

44,4

± 3

,1 *

†a, b

42

0,0

± 3

7,7

*†a

1,72

5,0

103

,6 ±

1,7

b 1

20,0

± 3

0,5

a1,

16 2

96,4

± 1

4,8

*†a

23

7,3

± 5

7,9

*†b

0,80

D

1,0

108

,6 ±

6,8

a 1

14,7

± 3

,7 a

1,06

585

,8 ±

14,

2 *†

a

938,

7 ±

6,2

*†a

1,60

2,5

110

,5 ±

3,4

a 1

15,3

± 1

4,5

a 1,

03 6

25,8

± 6

,5 *

a

630,

8 ±

133

,7 *

c1,

01

5,0

99

,4 ±

4,8

a 1

12,0

± 6

,8 a

1,13

623

,8 ±

12,

8 *†

a

749,

0 ±

3,9

*†b

1,20

B

1,0

110

,4 ±

5,0

a, b

124

,8 ±

4,9

*a

1,13

229

,4 ±

8,3

*†b

53

2,4

± 1

1,3

*†b

2,32

2,5

125

,7 ±

9,5

*a

112

,4 ±

15,

0 a

0,89

366

,8 ±

6,6

*†a

56

7,5

± 5

5,2

*†b

1,55

5,0

99

,9 ±

5,5

b

87,1

± 1

4,3

b0,

87 2

90,1

± 4

0,6

*†b

48

2,4

± 2

0,8

*†a

1,66


Eks

trak

t (P

repa

rat)

Ext

ract

(P

repa

ratio

n)

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[%]

BA

CM

BA

CM

+b

WI B

AC

EC

ME

CM

+b

WI E

C

GT

1,0

121

,6 ±

4,4

*b

112

,0 ±

7,3

c0,

92 7

34,6

± 1

03,4

*†c

97

0,7

± 1

2,0

*†c

1,32

2,5

122

,0 ±

5,8

*†b

141

,4 ±

5,6

*†a

1,16

1031

,6 ±

69,

4 *†

b 2

013,

2 ±

178

,1 *

†b1,

95

5,0

163

,5 ±

15,

1 *†

a 1

45,0

± 0

,2 *

†a0,

89 14

30,8

± 1

24,4

*†a

228

8,0

± 2

7,5

*†a

1,60

CIT

1,0

111

,2 ±

3,4

†c

88

,4 ±

3,2

†c

0,80

327

,1 ±

36,

5 *†

c

882,

6 ±

37,

0 *†

c2,

70

2,5

150

,8 ±

8,8

*†b

128

,4 ±

18,

4 *†

b0,

85 6

73,0

± 2

1,1

*†b

208

7,7

± 2

0,7

*†b

3,10

5,0

189

,4 ±

14,

0 *a

176

,9 ±

13,

8 *a

0,93

1340

,4 ±

169

,2 *

†a 3

109,

5 ±

8,4

*†a

2,32

G

1,0

112

,5 ±

4,8

b 1

05,1

± 1

,2 b

0,93

376

,5 ±

17,

5 *†

a

617,

6 ±

15,

3 *†

a1,

64

2,5

114

,6 ±

8,5

†b

138

,7 ±

8,7

*†a

1,21

398

,7 ±

9,0

*†a

58

9,1

± 8

6,9

*†a

1,48

5,0

141

,4 ±

7,7

*†a

120

,6 ±

8,8

*†b

0,85

400

,0 ±

35,

2 *†

a

572,

5 ±

16,

2 *†

a1,

43

BE

Z

1,0

133

,5 ±

10,

2 *a

122

,9 ±

9,4

a0,

92 1

14,1

± 6

,7 †

b

556,

3 ±

21,

8 *†

a4,

88

2,5

122

,0 ±

5,0

a 1

21,3

± 1

9,7

a0,

99 1

68,3

± 9

,0 *

†a, b

48

0,9

± 7

3,0

*†b

2,86

5,0

134

,1 ±

15,

1 *†

a 1

06,3

± 2

,6 †

a0,

79 1

87,6

± 1

8,4

*†a

51

6,3

± 3

5,6

*†a,

b2,

75

NO

1,0

120

,9 ±

4,6

†b

99

,7 ±

19,

1 †a

0,83

200

,6 ±

20,

8 *b

24

2,9

± 5

,9 *

c1,

21

2,5

145

,7 ±

8,8

*†a

111

,9 ±

10,

9 †a

0,77

278

,7 ±

25,

9 *†

a

502,

2 ±

13,

3 *†

b1,

80

5,0

142

,5 ±

6,9

*†a

111

,0 ±

10,

4 †a

0,78

308

,2 ±

43,

9 *†

a

683,

2 ±

81,

4 *†

a2,

22

Tabe

la 2

7. c

d.

Tabl

e 27

. con

t.

4. Wyniki i dyskusja 141P

– ow

oce

pigw

owca

japo

ński

ego

/ Jap

anes

e qu

ince

frui

ts, P

O –

zie

le p

okrz

ywy

/ net

tle h

erb,

SP

– sp

irul

ina,

M –

ow

oce

mal

iny

/ ras

pber

ry fr

uits

, Ż –

ow

o-ce

żur

awin

y /

cran

berr

y fr

uits

, S

– so

ja /

soy

bean

, C

CH

– o

woc

e cy

tryń

ca c

hińs

kieg

o /

Schi

sand

ra f

ruit

s, C

N –

czo

snek

nie

dźw

iedz

i /

bear

’s g

arlic

, C

C –

cze

rwon

a ce

bula

/ re

d on

ion,

D –

ow

oce

dere

nia

jada

lneg

o / c

orne

lian

cher

ry f

ruits

, B –

ow

oce

boró

wki

bru

szni

cy /

lingo

nber

ry f

ruits

, GT

– z

ielo

-na

her

bata

/ gr

een

tea,

CIT

– C

itros

ept,

G –

jago

dy g

oji /

goj

i ber

ries

, BE

Z –

ow

oce

czar

nego

bzu

/ el

derb

erry

fru

its, N

O –

sok

z n

oni /

non

i jui

ce

BA

CM

, EC

M, B

AC

M+

b, E

CM

+b

– ja

k w

tab

eli 2

3 / s

ee T

able

23

Ø (

kont

rola

): d

la B

AC

M i

EC

M –

Kpo

z (po

dłoż

e od

pow

iedn

ie d

la d

aneg

o ga

tunk

u ba

kter

ii, b

ez e

kstr

aktó

w lu

b pr

epar

atów

i be

z ba

kter

ii); d

la B

AC

M+

b i E

CM

+b

– K

poz+

b (po

dłoż

e be

z po

lifen

oli,

z ba

kter

iam

i dan

ego

gatu

nku)

Ø

(co

ntro

l):

for

BA

CM

and

EC

M –

Kpo

z (m

ediu

m a

ppro

pria

te fo

r a

give

n ba

cter

ia s

peci

es, w

ithou

t ext

ract

s or

pre

para

tions

and

with

out b

acte

ria)

; for

B

AC

M+

b an

d E

CM

+b

– K

poz+

b (m

ediu

m w

ithou

t po

lyph

enol

s, in

cuba

ted

with

bac

teri

a)

WI

– w

spół

czyn

nik

inte

rakc

ji (W

I =

AO

XM

+b/A

OX

M; w

arto

ści W

I >

1 i

WI

< 1

, odp

owie

dnio

, św

iadc

zą o

wzr

ości

e lu

b sp

adku

pot

encj

ału

anty

oksy

-da

cyjn

ego

(AO

X)

pod

wpł

ywem

bak

teri

i)

WI

– in

tera

ctio

n co

effic

ient

(W

I =

AO

XM

+b/A

OX

M; v

alue

s W

I >

1 a

nd W

I <

1, r

espe

ctiv

ely,

test

ify to

an

incr

ease

or

a de

crea

se in

ant

ioxi

dant

pot

en-

tial (

AO

X)

due

to b

acte

ria)

Śred

nie

ozna

czon

e gw

iazd

ką (

*) r

óżni

ą si

ę is

totn

ie w

sto

sunk

u do

odp

owie

dnie

j kon

trol

i (Ø

) (p

< 0

,05)

. M

eans

mar

ked

with

an

aste

risk

(*)

are

sig

nific

antly

diff

eren

t in

com

pari

son

with

res

pect

ive

cont

rol (

Ø)

(p <

0.0

5).

Dla

dan

ej b

akte

rii i

teg

o sa

meg

o st

ężen

ia e

kstr

aktu

lub

prep

arat

u śr

edni

e oz

nacz

one

sym

bole

m †

róż

nią

się

isto

tnie

(p

< 0

,05)

. Fo

r a

give

n ba

cter

ia a

nd t

he s

ame

conc

entr

atio

n of

ext

ract

or

prep

arat

ion,

mea

ns m

arke

d w

ith s

ymbo

l † a

re s

igni

fican

tly d

iffer

ent

(p <

0.0

5).

Dla

dan

ego

ekst

rakt

u lu

b pr

epar

atu

śred

nie

ozna

czon

e tą

sam

ą lit

erą

w k

olum

nie

nie

różn

ią s

ię is

totn

ie (

p <

0,0

5).

For

a gi

ven

extr

act

or p

repa

ratio

n, m

eans

mar

ked

with

the

sam

e le

tter

in a

col

umn

are

not

sign

ifica

ntly

diff

eren

t (p

< 0

.05)

.


bela

28.

W

pływ

dod

atku

eks

trak

tów

lub

prep

arat

ów o

raz

obec

nośc

i bak

teri

i Rum

inoc

occu

s ga

uvre

auii

(RU

MI)

i E

nter

ococ

cus

cacc

ae (

EN

) na

akt

ywno

ść a

ntyo

ksyd

acyj

ną p

odło

ża T

SYE

M (o

znac

zoną

met

odą

AB

TS

po 2

4-go

dzin

nej i

nkub

acji)

prz

edst

awio

ną ja

ko p

roce

nt

w s

tosu

nku

do o

dpow

iedn

iej k

ontr

oli (

śred

nia

± S

D, n

= 3

) Ta

ble

28.

Eff

ect o

f the

add

ition

of e

xtra

cts o

r pre

para

tions

and

the

pres

ence

of b

acte

ria

Rum

inoc

occu

s gau

vrea

uii (

RU

MI)

and

Ent

eroc

occu

s ca

ccae

(E

N)

on th

e an

tioxi

dant

act

ivity

of m

ediu

m (

as d

eter

min

ed b

y A

BT

S as

say

follo

win

g 24

-h in

cuba

tion)

exp

ress

ed a

s pe

rcen

t re

lativ

e to

app

ropr

iate

con

trol

(m

ean

± S

D, n

= 3

)

Eks

trak

t (P

repa

rat)

Ext

ract

(P

repa

ratio

n)

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[%]

RU

MIM

RU

MIM

+b

WI R

UM

EN

ME

NM

+b

WI E

N

Ø–

100

100

–10

010

0–

P

1,0

99

,8 ±

6,9

†a

14

6,0

± 6

,5 *

†a1,

46

108,

7 ±

7,2

b

114,

3 ±

5,4

*a

1,05

2,5

105

,3 ±

5,5

†a

15

2,1

± 2

2,6

*†a

1,44

12

1,3

± 1

3,7

*†a

10

6,1

± 6

,0 †

a0,

87

5,0

101

,7 ±

6,9

†a

15

0,0

± 9

,4 *

†a1,

45

112,

1 ±

8,1

*a

10

2,1

± 2

,6 a

0,91

PO

1,0

114

,1 ±

17,

7 a

13

4,4

± 2

1,3

*a1,

18

93,7

± 1

0,8

a

89,2

± 1

1,1

a0,

95

2,5

107

,6 ±

12,

3 †a

13

9,0

± 2

,2 *

†a1,

29

92,2

± 1

0,0

a

96,4

± 1

2,2

a1,

05

5,0

103

,3 ±

5,9

†a

15

1,7

± 4

,6 *

†a1,

47

87,6

± 7

,5 a

86

,3 ±

4,5

a0,

99

SP

1,0

107

,4 ±

11,

9 †b

14

8,3

± 9

,6 *

†a1,

38

91,9

± 7

,8 b

82

,8 ±

0,2

*b

0,90

2,5

113

,1 ±

8,6

†a,

b

141,

6 ±

7,2

*†a

1,25

98

,2 ±

12,

7 b

10

1,9

± 2

,2 a

1,04

5,0

134

,1 ±

15,

3 *†

a

165,

5 ±

30,

1 *†

a1,

23

111,

9 ±

7,6

*†a

88

,8 ±

9,3

†a,

b0,

79

M

1,0

111

,8 ±

7,9

†a

15

1,6

± 1

6,8

*†a

1,36

16

5,7

± 1

1,3

*†a

11

2,5

± 1

9,4

†a0,

68

2,5

104

,3 ±

6,4

†a

14

7,3

± 4

,2 *

†a1,

41

110,

9 ±

10,

5 †b

89

,7 ±

2,9

†b

0,81

5,0

99

,7 ±

1,6

†a

14

6,9

± 6

,8 *

†a1,

47

97,5

± 1

2,0

b

93,7

± 2

,5 b

0,96

Ż

1,0

143

,0 ±

5,6

*†a

12

3,7

± 7

,1 *

†c0,

87

104,

8 ±

8,0

a

104,

5 ±

14,

7 a

1,00

2,5

112

,8 ±

8,2

†b

14

9,9

± 2

,6 *

†b1,

33

96,7

± 8

,9 a

96

,1 ±

2,4

a, b

0,99

5,0

101

,1 ±

4,0

†b

17

5,1

± 4

,3 *

†a1,

72

95,2

± 7

,9 a

82

,4 ±

2,2

*b

0,87


S

1,0

97

,3 ±

11,

2 †b

13

9,2

± 2

0,4

*†a

1,43

86

,5 ±

13,

0 b

10

0,3

± 1

6,6

a1,

16

2,5

101

,5 ±

4,4

†b

13

4,7

± 9

,0 *

†a1,

33

106,

3 ±

13,

4 a

11

3,7

± 7

,7 a

1,07

5,0

116

,2 ±

5,7

a

118,

5 ±

1,2

a1,

02

93,2

± 1

0,4

a, b

77

,7 ±

10,

5 *b

0,83

CC

H

1,0

94

,3 ±

4,2

†b

13

9,8

± 1

2,6

*†b

1,48

10

5,5

± 1

3,7

a

111,

5 ±

10,

5 a

1,06

2,5

97

,5 ±

11,

2 †b

15

0,3

± 3

,6 *

†b1,

54

88,5

± 8

,2 b

97

,9 ±

7,6

a, b

1,44

5,0

131

,0 ±

16,

0 *†

a

193,

8 ±

8,6

*†a

1,48

10

3,4

± 2

,9 a

94

,9 ±

9,7

b0,

92

CN

1,0

109

,9 ±

4,8

†a

15

1,8

± 1

0,5

*†a

1,38

11

4,0

± 1

9,2

a

95,8

5 ±

6,4

a0,

84

2,5

99

,1 ±

1,7

†a

14

5,6

± 1

9,8

*†a

1,47

10

8,2

± 8

,6 a

10

4,4

± 1

1,8

a0,

96

5,0

110

,0 ±

11,

0 †a

14

5,6

± 2

,8 *

†a1,

32

112,

8 ±

8,2

a

100,

9 ±

12,

3 a

0,89

CC

1,0

114

,2 ±

17,

8 †a

16

0,5

± 1

,6 *

†a1,

41

107,

3 ±

5,2

a

107,

5 ±

18,

4 a

1,00

2,5

103

,1 ±

5,3

†a,

b

146,

3 ±

7,0

*†a

, b1,

42

98,0

± 4

,8 a

93

,2 ±

2,2

b0,

95

5,0

95

,4 ±

4,4

†b

12

7,0

± 2

,4 *

†b1,

33

96,5

± 7

,3 a

90

,1 ±

0,5

b0,

93

D

1,0

95

,3 ±

4,3

†a

19

1,7

± 9

,9 *

†a2,

01

84,0

± 9

,5 *

b

86,3

± 2

,7 *

b1,

03

2,5

106

,2 ±

7,4

†a

15

2,7

± 1

,4 *

†b1,

44

112,

9 ±

6,9

*a

10

9,6

± 7

,7 a

0,97

5,0

101

,2 ±

4,2

†a

15

8,9

± 4

,5 *

†b1,

57

89,9

± 5

,3 b

93

,5 ±

6,6

b1,

04

B

1,0

92

,5 ±

5,9

†b

13

8,4

± 0

,4 *

†a1,

20

111,

8 ±

7,6

a

123,

0 ±

23,

3 *a

1,10

2,5

137

,0 ±

17,

2 *†

a

114,

8 ±

17,

2 †b

0,84

91

,5 ±

12,

3 b

83

,6 ±

97,

5 b

0,91

5,0

106

,0 ±

8,1

†b

14

5,7

± 1

1,6

*†a

1,38

95

,2 ±

10,

1 a,

b

86,6

± 8

,1 b

0,91

GT

1,0

103

,6 ±

9,0

b

106,

2 ±

5,9

c1,

03

100,

5 ±

2,9

†b

13

4,4

± 4

,8 *

†a1,

34

2,5

109

,3 ±

12,

2 †b

16

0,3

± 2

0,8

*†b

1,47

11

2,1

± 6

,4 *

†a

89,6

± 9

,5 *

†c0,

80

5,0

147

,3 ±

10,

5 *†

a

188,

7 ±

0,4

*†a

1,28

11

6,7

± 3

,6 *

a

117,

1 ±

5,9

*b

1,00

CIT

1,0

105

,6 ±

5,6

†a

15

7,4

± 2

4,0

*†a

1,49

13

6,5

± 1

1,2

*†b

10

9,9

± 2

,1 †

b0,

80

2,5

110

,2 ±

3,8

†a

16

6,4

± 9

,4 *

†a1,

51

164,

6 ±

16,

2 *†

a

126,

3 ±

5,5

*†a

0,77

5,0

120

,8 ±

10,

3 †a

15

4,6

± 2

2,9

*†a

1,28

12

9,0

± 1

0,8

*b

125,

8 ±

7,2

*a

0,97


Eks

trak

t (P

repa

rat)

Ext

ract

(P

repa

ratio

n)

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[%]

RU

MIM

RU

MIM

+b

WI R

UM

EN

ME

NM

+b

WI E

N

G

1,0

130

,8 ±

2,4

*a

13

9,2

± 8

,8 *

a, b

1,06

95

,8 ±

5,9

a

87,8

± 3

,9 a

0,92

2,5

116

,1 ±

5,7

†a

14

5,2

± 7

,2 *

†a1,

25

105,

1 ±

13,

9 a

99

,3 ±

3,7

a0,

94

5,0

95

,8 ±

4,3

†b

12

1,1

± 1

1,1

*†b

1,26

10

1,5

± 1

3,0

a

91,7

± 3

,7 a

0,90

BE

Z

1,0

112

,0 ±

2,9

†a

15

0,1

± 1

6,5

*†a

1,35

10

5,7

± 1

6,1

a

113,

3 ±

13,

5 a

1,07

2,5

125

,5 ±

18,

2 a

14

7,1

± 6

,0 *

a1,

17

96,1

± 3

,4 a

92

,3 ±

3,6

b0,

96

5,0

114

,1 ±

17,

6 a

13

8,1

± 1

9,4

*a1,

24

100,

6 ±

2,9

†a

78

,5 ±

4,9

*†b

0,78

NO

1,0

100

,2 ±

1,6

†b

13

4,7

± 2

2,3

*†a

1,35

13

8,5

± 1

4,1

*†a

10

2,4

± 1

0,2

†a0,

74

2,5

96

,7 ±

8,3

†b

14

9,0

± 2

3,7

*†a

1,54

98

,1 ±

7,5

b

98,2

± 0

,8 a

1,00

5,0

149

,3 ±

10,

0 *a

14

8,0

± 9

,1 *

a0,

99

84,2

± 1

6,1

†b

115,

8 ±

15,

7 †a

1,38

P, P

O, S

P, M

, Ż, S

, CC

H, C

N, C

C, D

, B, G

T, C

IT, G

, BE

Z, N

O –

jak

w t

abel

i 27

/ see

Tab

le 2

7

RU

MIM

, EN

M, R

UM

IM+

b, E

NM

+b

– ja

k w

tab

eli 2

3 / s

ee T

able

23

Pozo

stał

e ob

jaśn

ieni

a ja

k w

tab

eli 2

7 / S

ee T

able

27

for

othe

r ex

plan

ator

y no

tes

Tabe

la 2

8. c

d.Ta

ble

28. c

ont.


bela

29.

W

pływ

dod

atku

eks

trak

tów

lub

prep

arat

ów o

raz

obec

nośc

i bak

teri

i Lac

toba

cillu

s sp

. (L

CB

) i E

ubac

teriu

m c

ylin

droi

des

(EU

B)

na

akty

wno

ść a

ntyo

ksyd

acyj

ną p

odło

ża T

SYE

M (

ozna

czon

ą m

etod

ą A

BT

S po

24-

godz

inne

j ink

ubac

ji) p

rzed

staw

ioną

jako

pro

cent

w

sto

sunk

u do

odp

owie

dnie

j kon

trol

i (śr

edni

a ±

SD

, n =

3)

Tabl

e 29

. E

ffec

t of t

he a

dditi

on o

f ext

ract

s or p

repa

ratio

ns a

nd th

e pr

esen

ce o

f bac

teri

a L

acto

baci

llus s

p. (L

CB

) and

Eub

acte

rium

cyl

indr

oide

s (E

UB

) on

the

ant

ioxi

dant

act

ivity

of

med

ium

(as

det

erm

ined

by

AB

TS

assa

y fo

llow

ing

24-h

inc

ubat

ion)

exp

ress

ed a

s pe

rcen

t re

lativ

e to

app

ropr

iate

con

trol

(m

ean

± S

D, n

= 3

)

Eks

trak

t (P

repa

rat)

Ext

ract

(P

repa

ratio

n)

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[%]

LC

BM

LC

BM

+b

WI L

CB

EU

BM

EU

BM

+b

WI E

UB

Ø–

100

100

–10

010

0–

P

1,0

128,

9 ±

6,0

*†a

157,

4 ±

3,6

*†b

1,22

10

8,8

± 6

,9 a

124

,7 ±

5,0

*a

1,15

2,5

127,

4 ±

7,9

*†a

170,

9 ±

11,

6 *†

a, b

1,34

12

3,4

± 9

,2 *

a 1

18,5

± 3

,5 a

0,96

5,0

136,

0 ±

15,

2 *†

a 18

2,3

± 2

,7 *

†a1,

34

118,

2 ±

4,2

a 1

17,1

± 2

3,1

a0,

99

PO

1,0

168,

7 ±

14,

8 *†

a 20

9,1

± 3

,9 *

†b1,

24

124,

9 ±

7,0

a, b

118

,0 ±

5,6

a0,

94

2,5

174,

1 ±

20,

7 *†

a 21

4,9

± 2

,1 *

†a, b

1,23

13

9,5

± 5

,5 *

a 1

36,8

± 3

5,5

*a0,

98

5,0

176,

5 ±

12,

3 *†

a 23

4,5

± 0

,6 *

†a1,

33

115,

5 ±

8,5

b 1

33,2

± 1

0,1

*a1,

15

SP

1,0

141,

3 ±

16,

1 *a

155,

0 ±

9,4

*a

1,10

10

6,1

± 8

,3 †

b 1

44,5

± 2

6,6

*†a

1,36

2,5

144,

9 ±

7,7

*a

157,

0 ±

17,

4 *a

1,08

11

3,3

± 8

,5 a

, b 1

02,1

± 8

,7 b

0,90

5,0

148,

4 ±

14,

7 *a

158,

3 ±

0,0

*a

1,07

13

3,8

± 1

0,8

*a 1

14,3

± 7

,3 b

0,85

M

1,0

151,

3 ±

9,6

*†a

158,

7 ±

8,4

*†b

1,05

97

,6 ±

4,6

b

97,9

± 3

,8 b

1,00

2,5

129,

5 ±

14,

1 *†

b 18

9,4

± 7

,9 *

†a1,

46

122,

2 ±

3,7

*a

116

,4 ±

1,2

*a

0,95

5,0

120,

9 ±

5,2

*†b

174,

6 ±

11,

8 *†

a1,

44

99,8

± 5

,5 †

b 1

19,7

± 1

2,6

*†a

1,20

Ż

1,0

147,

3 ±

9,6

*†a

216,

9 ±

17,

5 *†

b1,

47

133,

2 ±

10,

9 *a

132

,2 ±

4,0

*a

0,99

2,5

171,

7 ±

22,

4 *†

a 21

7,3

± 6

,1 *

†b1,

27

102,

2 ±

5,0

†b

123

,3 ±

16,

9 †a

1,21

5,0

161,

6 ±

27,

5 *†

a 25

3,6

± 1

,1 *

†a1,

57

131,

2 ±

12,

1 *a

126

,8 ±

15,

0 *a

0,97


Eks

trak

t (P

repa

rat)

Ext

ract

(P

repa

ratio

n)

Stęż

enie

koń

cow

eF

inal

co

ncen

trat

ion

[%]

LC

BM

LC

BM

+b

WI L

CB

EU

BM

EU

BM

+b

WI E

UB

S

1,0

141,

5 ±

29,

2 *†

b 22

6,0

± 8

,2 *

†a1,

60

140,

0 ±

9,7

*a

137

,2 ±

3,7

*a

0,98

2,5

169,

0 ±

20,

8 *†

a 20

3,8

± 5

,6 *

†a1,

21

129,

8 ±

9,0

*a,

b 1

45,6

± 1

2,3

*a1,

12

5,0

175,

1 ±

1,9

*a

200,

0 ±

0,2

*a

1,14

11

5,2

± 8

,5 †

b 1

44,6

± 8

,2 *

†a1,

26

CC

H

1,0

106,

5 ±

6,6

c 11

8,4

± 0

,6 *

b1,

11

118,

2 ±

5,5

†b

135

,8 ±

7,5

*†a

1,15

2,5

136,

8 ±

9,3

*b

147,

9 ±

11,

0 *a

1,08

12

6,0

± 5

,5 *

a, b

135

,6 ±

6,3

*a

1,08

5,0

198,

0 ±

8,9

*†a

160,

9 ±

1,3

*†a

0,81

13

7,1

± 1

3,3

*a 1

36,9

± 1

3,8

*a1,

00

CN

1,0

147,

8 ±

8,2

*a

146,

5 ±

7,1

*a

0,99

12

9,9

± 1

2,5

*a 1

40,6

± 1

0,4

*a1,

08

2,5

140,

8 ±

29,

9 *a

136,

3 ±

23,

5 *a

0,97

12

9,4

± 1

6,5

*a 1

44,4

± 4

,4 *

a1,

12

5,0

148,

0 ±

8,6

*a

162,

4 ±

11,

9 *a

1,10

13

7,2

± 1

1,5

*a 1

53,1

± 1

,5 *

a1,

12

CC

1,0

109,

2 ±

8,3

a 11

1,8

± 1

2,0

b1,

02

144,

4 ±

7,8

*a

133

,0 ±

17,

3 *a

0,92

2,5

106,

8 ±

3,6

†a

124,

7 ±

2,1

*†b

1,17

78

,1 ±

10,

7 *†

b 1

30,5

± 0

,6 *

†a1,

67

5,0

88,

8 ±

9,8

†b

154,

0 ±

2,8

*†a

1,74

62

,7 ±

6,5

*†b

95

,2 ±

5,0

†b

1,52

D

1,0

199,

7 ±

20,

4 *a

221,

1 ±

15,

8 *a

1,11

13

3,3

± 1

3,7

*†a

108

,0 ±

12,

2 †b

0,81

2,5

184,

9 ±

19,

6 *†

a 22

6,8

± 3

7,0

*†a

1,23

15

3,9

± 5

,3 *

a 1

46,8

± 1

9,4

*a0,

95

5,0

193,

4 ±

18,

1 *†

a 23

3,7

± 1

,9 *

†a1,

21

65,2

± 3

,4 *

†b

96,9

± 1

8,2

†b1,

49

B

1,0

143,

4 ±

9,9

*a

154,

6 ±

20,

6 *b

1,08

89

,0 ±

11,

6 †a

130

,2 ±

12,

7 *†

a1,

46

2,5

111,

6 ±

12,

0 †b

174,

8 ±

3,0

*†a

1,57

96

,9 ±

4,3

a 1

10,9

± 6

,9 a

1,14

5,0

107,

7 ±

2,9

†b

175,

5 ±

9,6

*†a

1,63

92

,9 ±

5,2

a 1

11,6

± 2

1,2

a1,

20

Tabe

la 2

9. c

d.Ta

ble

29. c

ont.


GT

1,0

179,

9 ±

20,

7 *b

200,

6 ±

12,

5 *c

1,12

12

8,1

± 1

4,9

c 1

19,1

± 9

,7 b

0,93

2,5

207,

0 ±

31,

1 *†

a, b

244,

5 ±

6,0

*†b

1,18

16

8,4

± 1

7,7

*†b

140

,1 ±

20,

2 *†

a, b

0,83

5,0

222,

9 ±

28,

5 *†

a 30

2,1

± 1

,2 *

†a1,

36

262,

8 ±

20,

8 *†

a 1

61,9

± 4

,4 *

†a0,

62

CIT

1,0

151,

0 ±

21,

6 *b

180,

6 ±

5,5

*b

1,20

16

7,5

± 1

9,2

*b 1

64,6

± 2

0,1

*c0,

98

2,5

189,

7 ±

18,

2 *a

208,

2 ±

17,

4 *b

1,10

19

7,3

± 1

7,1

*b 2

12,6

± 2

4,3

*b1,

08

5,0

218,

8 ±

32,

7 *†

a 28

5,4

± 3

0,4

*†a

1,30

36

5,7

± 3

0,3

*†a

306

,3 ±

24,

2 *†

a0,

84

G

1,0

144,

3 ±

9,1

*†a

176,

7 ±

3,6

*†b

1,22

12

1,2

± 5

,3 a

136

,8 ±

24,

6 *a

1,13

2,5

150,

6 ±

8,8

*†a

183,

9 ±

3,7

*†a

, b1,

22

136,

8 ±

15,

0 *a

139

,2 ±

7,5

*a

1,02

5,0

158,

9 ±

16,

7 *†

a 19

5,6

± 8

,6 *

†a1,

23

124,

9 ±

5,7

*a

140

,6 ±

0,5

*a

1,13

BE

Z

1,0

80,

5 ±

13,

4 *†

b 13

6,3

± 1

6,2

*†a

1,69

13

1,7

± 1

4,3

a 1

33,5

± 1

6,4

b1,

01

2,5

90,

0 ±

5,1

†b

119,

5 ±

9,4

*†a

1,33

12

8,7

± 1

5,6

†a 1

66,1

± 3

0,6

*†a

1,29

5,0

123,

2 ±

5,0

*a

130,

7 ±

5,3

*a

1,06

12

7,1

± 1

5,3

a 1

38,6

± 1

3,2

*a, b

1,09

NO

1,0

126,

7 ±

2,7

†b

179,

4 ±

27,

5 *†

a, b

1,42

12

2,1

± 6

,2 b

130

,4 ±

6,0

*a

1,07

2,5

157,

5 ±

23,

9 *†

a,b

191,

1 ±

27,

3 *†

a1,

21

144,

4 ±

15,

6 *a

132

,1 ±

16,

3 *a

0,92

5,0

184,

7 ±

14,

3 *a

151,

3 ±

15,

2 *b

0,82

14

7,4

± 1

3,2

*a 1

26,4

± 1

4,4

a0,

86

P, P

O, S

P, M

, Ż, S

, CC

H, C

N, C

C, D

, B, G

T, C

IT, G

, BE

Z, N

O –

jak

w t

abel

i 27

/ see

Tab

le 2

7 L

CB

M, E

UB

M, L

CB

M+

b, E

UB

M+

b –

jak

w t

abel

i 23

/ see

Tab

le 2

3

Pozo

stał

e ob

jaśn

ieni

a ja

k w

tab

eli 2

7 / S

ee T

able

27

for

othe

r ex

plan

ator

y no

tes


ale też od aktywności bakterii. W tabeli 26 zestawiono wyniki dla trzech gatunków bakterii oraz przeznaczonych dla nich podłoży, które różniły się wartością pH i – przede wszystkim – składem. Medium dla LCB miało pH 6,2–6,5, dla BF – pH 6,8, zaś dla EUB – pH 7,0–7,2. Największe spadki potencjału AOX w medium z polife-nolami, w stosunku do wartości wyjściowych, wystąpiły w przypadku medium dla BF. Jest ono lekko kwaśne, ale w porównaniu do pozostałych dwóch podłoży ma najbogatszy i najbardziej złożony skład. Podłoże TSYEM zawiera ekstrakt drożdżo-wy i hydrolizat sojowo-kazeinowy, MRS zawiera pepton kazeinowy oraz ekstrakty wołowy i drożdżowy, zaś BFM – wymienione trzy składniki oraz pepton sojowy, cysteinę, resazurynę i sole mineralne. Zmniejszenie się potencjału antyoksydacyjne-go było szczególnie duże w przypadku zastosowania dodatku hesperydyny i hespe-retyny oraz naringeniny, co potwierdza łatwość wchodzenia tych polifenoli w połą-czenia z macierzą pożywki. Ciekawe różnice zaobserwowano, analizując potencjał antyoksydacyjny takiego samego medium, ale inkubowanego w różnych warunkach (tab. 25). Enterococcus caccae (podobnie jak Ruminococcus gauvreauii i Eubacterium cylindroides) był hodowany w medium TSYEM, które zawiera liczne białka i cukry pochodzące z ekstraktu drożdżowego oraz z hydrolizatu soi i kazeiny. Jednak tylko w przypadku doświadczeń z EN spadki potencjału AOX w medium po wzbogaceniu polifenolami są tak wyraźne; istotne zmniejszenie potencjału AOX (o kilkanaście % w stosunku do Kpoz) zanotowano dla CAT, H, NR, PHL, RS i Q. Wynika to najpraw-dopodobniej z faktu, że doświadczenia z EN były prowadzone w warunkach mikro-aerofilowych, podczas gdy z RUMI i EUB – w ściśle anaerobowych. Wydaje się, że niewielkie ilości tlenu, jakie docierały do składników pożywki, spowodowały utle-nianie polifenoli, co oprócz interakcji z białkami znacząco zmniejszyło potencjał antyoksydacyjny podłoża. Wyniki wielu badań potwierdzają, że utlenianie składników fenolowych może zachodzić nawet bez udziału enzymów, pod wpływem generowa-nych w środowisku reaktywnych form tlenu, niektórych jonów metali czy zmian temperatury, szczególnie przy obojętnym lub zasadowym odczynie środowiska [Le Bourvellec i Renard 2012], a podłoże TSYEM miało pH 7,0–7,2. Powstające w wy-niku utleniania o-chinony i o-semichinony tworzą związki addycyjne z tiolami. O-chinony mogą też reagować z resztami siarkowymi aminokwasów, zarówno tych wolnych, jak i budujących krótkie peptydy, a więc powszechnych składników pożywek, do których przyrządzenia wykorzystano hydrolizaty białkowe, peptony i ekstrakty. Zablokowanie wolnych grup –SH w aminokwasach także spowoduje zmniejszenie potencjału redukcyjnego pożywki.

Kolejny typ zmian to obniżenie się potencjału antyoksydacyjnego podłoża na skutek zbyt wysokiego stężenia dodanych związków. Obserwowano, że po począt-kowym wzroście potencjału AOX następowało – mimo dalszego zwiększania dawki związku – zatrzymanie wzrostu lub wręcz zmniejszenie się aktywności przeciwrod-nikowej medium. Prawdopodobnie w tej sytuacji, oprócz interakcji ze składnikami medium (matrycą), dochodziło również do polimeryzacji flawonoidów, ich autoutle-


niania lub reakcji enzymatycznych powodujących rozpad polifenoli (np. pod wpływem obecnej w surowcach roślinnych polifenolooksydazy). Takie sytuacje zaobserwowa-no dla kilku różnych podłoży wzbogacanych hesperydyną i hesperetyną, jak również ekstraktami z derenia i brusznicy.

Potencjał antyoksydacyjny mediów wzbogaconych związkami polifenolowymi może pod wpływem bakterii zwiększać się lub zmniejszać bądź też pozostawać bez zmian. O ile wyjaśnienie tej ostatniej możliwości jest w miarę oczywiste, o tyle wzrost i spadek potencjału AOX mógł wynikać z przemian związków polifenolowych pod wpływem bakterii do pochodnych o odpowiednio większych lub mniejszych właści-wościach antyoksydacyjnych, jak również z uwalniania polifenoli (bez ich przemian) z wiązań z matrycą podłoża, powodującego zwiększenie się liczby wolnych cząsteczek i grup mogących wchodzić w reakcje z rodnikiem. Ponadto, podczas swoich procesów metabolicznych, bakterie wytwarzają różne związki, np. kwasy organiczne, które obniżają pH badanego roztworu i wpływają na strukturę cząsteczki przeciwutlenia-cza. Przy niższym pH roztworu wiele polifenoli jest bardziej stabilnych i przyjmuje postać uprotonowaną, dzięki czemu mają większy potencjał zmiatania wolnych rod-ników [Materska 2008]. Wytworzone metabolity mogą także powodować zmianę polarności środowiska i poprzez wpływ na lipofilność/hydrofilowość polifenoli mo-dyfikować ich potencjał antyoksydacyjny.

W licznych doświadczeniach przeprowadzonych w układach modelowych wyka-zano, że mogą powstawać wiązania kowalencyjne między różnymi oczyszczonymi białkami (białka surowicy, serwatki, sojowe, mioglobina, laktoglobulina), enzymami (α-amylaza, trypsyna, lizozym) lub składnikami pochodzącymi z matrycy żywności (białka mleka) a związkami polifenolowymi (kwasy ferulowy, kawowy, chlorogeno-wy, chinowy, galusowy, apigenina, kemferol, kwercetyna, rutyna, myrycetyna, izo-flawony). Za najważniejsze reaktywne reszty uznaje się nukleofilowe łańcuchy bocz-ne, jak np. wolne tiolowe grupy cysteiny, wolne aminowe grupy lizyny, reszty metioniny czy pierścień indolowy w tryptofanie [Le Bourvellec i Renard 2012]. Oznacza to, że stosowane podłoża MRS, TSYEM, ST i BFM stanowią idealne źródło białek do interakcji z polifenolami.

Szczególnie wysoki przyrost aktywności antyoksydacyjnej nastąpił pod wpływem E. coli dla podłoży z dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu (WI 2,75–4,88), żurawiny (WI 1,6–3,83), czosnku niedźwiedziego (WI 1,99–3,29) oraz zielonej herbaty (WI 1,32–1,95). Przy tym, poza ostatnim przykładem, wartość WI malała wraz ze wzrostem stężenia ekstraktu, co może wynikać z bakteriostatycznego wpływu tych ekstraktów na EC. W przypadku zielonej herbaty przypuszczalnie zbyt duże stężenie katechin spowodowało, że część z nich znajdowała się w podłożu w formie niedo-stępnej, związanej z białkami czy polisacharydami obecnymi w pożywkach.

W skład grejpfrutów wchodzą glikozydy flawanonów o dwóch cząsteczkach cu-krów, głównie rutynozydy (np. narirutyna, eriocytryna) i neohesperozydy (np. na-ringina, neohesperydyna, poncyryna) [Nogata i in. 2006]. Można się zatem spodzie-


wać, że produkty ich hydrolizy, czyli aglikony, powstające w przewodzie pokarmowym pod wpływem enzymów trawiennych i/lub bakteryjnych, będą charakteryzowały się jeszcze większym potencjałem antyoksydacyjnym. Powszechnie bowiem wiadomo, że glikozydy są słabszymi zmiataczami wolnych rodników niż odpowiednie aglikony. Zakładając, że bakterie wykorzystane do doświadczeń w tej pracy mają zdolność degradowania glikozydów flawanonów, można sądzić, że potencjał antyoksydacyjny medium z dodatkiem czystych flawanonów lub Citroseptu powinien rosnąć po in-kubacji w obecności bakterii. Analiza uzyskanych wyników (tab. 24–29) wskazuje, że potencjał AOX w przypadku podłoży z dodatkiem hesperydyny zwiększył się pod wpływem EN, BF i EUB, a z dodatkiem Citroseptu – pod wpływem EC (WI 2,32– –3,10) i RUMI (WI 1,28–1,51). Znaczący wzrost potencjału AOX pod wpływem bakterii wykazano też dla innych flawanonów zidentyfikowanych w ekstrakcie z grejp-fruta, tj. hesperetyny (EC), naringeniny (EC, w mniejszym stopniu EN, BF, i LCB) oraz naringiny (EC, EN).

Znaczący wzrost potencjału antyoksydacyjnego mediów z dodatkiem (+)-kate-chiny nastąpił pod wpływem EN, BF, LCB i EUB (z maksymalną wartością współ-czynnika interakcji WI wynoszącą 1,67). Przypuszczalnie do przemian metabolicznych kwercetyny były zdolne Lactobacillus (WI 1,6–2,18) i Enterococcus (WI 1,08–1,41), podczas gdy rutynozyd kwercetyny mógł być przekształcany do aglikonu lub pochod-nych o większym potencjale AOX przez EC (WI 1,7–2,0), EN (1,5–1,95) i EUB (1,23–1,48). Właściwości przeciwrodnikowe podłoży z dodatkiem florydzyny i rez-weratrolu zwiększały się pod wpływem EN, BF, EC i LCB (maksymalne wartości WI odpowiednio 2,13 i 1,79), zaś podłoża z kemferolem – pod wpływem wszystkich bakterii oprócz BAC (maks. WI 2,18).

W doświadczeniach z ekstraktami roślinnymi i suplementami diety wzrost po-tencjału AOX w obecności E. coli zanotowano praktycznie we wszystkich próbach. Współczynnik interakcji wynosił od 1,01 do 4,88 (BEZ), co oznacza prawie 5-krotne zwiększenie potencjału antyoksydacyjnego składników medium z dodatkiem eks-traktu z czarnego bzu pod wpływem tej bakterii. Wyjątkiem były podłoża z dodatkiem ekstraktu z czerwonej cebuli (WI 0,43, 1,72 i 0,80 dla rosnących stężeń) oraz 5% ekstraktu z cytryńca chińskiego (0,74), co mogło być spowodowane bardzo silnym zahamowaniem wzrostu E. coli wywołanym przez te ekstrakty. W przypadku pozo-stałych gatunków bakterii wyniki były bardziej zróżnicowane. Do najciekawszych można zaliczyć przypuszczalne przekształcenie związków bioaktywnych zawartych w ekstrakcie z soi do pochodnych o wyższym potencjale przeciwrodnikowym przez LCB i RUMI, a o niższym – przez BAC.

Zaskakujący jest również wzrost potencjału antyoksydacyjnego składników me-dium z największym dodatkiem ekstraktu z czerwonej cebuli pod wpływem LCB oraz EUB i RUMI (tab. 28 i 29). Zgodnie z wynikami opisanymi w poprzednich rozdziałach (tab. 20), ekstrakt ten w stężeniu 5% działał bakteriobójczo wobec LCB, być może zatem wzrost potencjału antyoksydacyjnego należy przypisać przemianom


glikozydów kwercetyny do pochodnych o wyższej aktywności antyoksydacyjnej i an-tymikrobiologicznej.

Znaczący wzrost potencjału AOX zanotowano także w przypadku pożywek z do-datkiem ekstraktu z derenia pod wpływem RUMI (WI 1,44–2,01) i ekstraktu z brusz-nicy pod wpływem LCB (WI 1,08–1,63). Z kolei spadek aktywności AOX wykazano dla wszystkich stężeń ekstraktów/preparatów BEZ, PO, S, NO i CIT w obecności Bacteroides galacturonicus oraz M, CN, G i CIT w obecności Enterococcus caccae. Możliwe, że za ten spadek odpowiada tu wykorzystanie przez bakterie na swoje potrzeby związków przeciwutleniających obecnych w pożywce.

Aby zweryfikować, czy za wykazany wzrost bądź spadek potencjału antyoksyda-cyjnego odpowiada biotransformacja poszczególnych flawonoidów do aglikonu i/lub innych pochodnych, wykonano analizę HPLC, której wyniki omówiono w następnym rozdziale.

4.5. Zmiany związków polifenolowych pod wpływem bakterii jelitowych

Jak już wspomniano, nie każda zmiana potencjału antyoksydacyjnego, zaobserwo-wana w podłożu po dodaniu bakterii, jest wynikiem metabolizmu polifenoli przez te bakterie. Aby sprawdzić, czy dany związek polifenolowy ulegał biotransformacji pod wpływem badanych gatunków bakterii jelitowych (do metabolitów o większym lub mniejszym potencjale AOX), wykonano dodatkowe oznaczenia. Media hodow-lane z dodatkiem lub bez dodatku polifenoli bądź ekstraktów po inkubacji z bakte-riami poddano analizie HPLC pod kątem zmian obecności i stężenia wybranych związków polifenolowych.

Wykazano, że wykorzystane w doświadczeniach gatunki bakterii, poza kilkoma wyjątkami, nie przejawiały zdolności metabolizowania większości badanych związków polifenolowych.

Istotne zmiany zanotowano dla rutyny, która częściowo ulegała biotransforma-cji (tab. 30–33). Pod wpływem Escherichia coli w medium z dodatkiem rutyny nie-znacznie malała zawartość rutynozydu (tab. 30), pojawił się też w wykrywalnym stężeniu kwercetyno-3-O-glukozyd (do 8,61±2,10 µg/ml). Zwiększała się również aktywność antyoksydacyjna medium (tab. 24), co mogłoby stanowić poparcie tezy o degradacji rutyny pod wpływem enzymów E. coli.

W obecności Enterococcus caccae rutyna była przekształcana do kwercetyny oraz innego, niezidentyfikowanego związku (dodatkowy pik na chromatogramie). Wraz ze wzrostem dawki rutyny zwiększało się jej stężenie w medium, choć przy najniższej dawce (20 µg/ml) część dodanego polifenolu prawdopodobnie uległa związaniu z białkami lub cukrami w pożywce (tab. 31). Świadczą o tym wartości potencjału


AOX tej próbki (tab. 25), niższe od wartości kontrolnej, co wskazuje na zablokowa-nie części grup o potencjale redukującym w białkach obecnych w medium. Pod wpływem bakterii dochodziło do uwolnienia wolnej rutyny z tych połączeń (jej ozna-czone stężenie wzrosło), co więcej, część rutyny została przekształcona do kwerce-tyny, której śladowe ilości wykryto w próbkach zaszczepionych E. caccae (tab. 31).

Tabela 30. Wpływ bakterii Escherichia coli (EC) na stężenie rutyny (RUT) i kwercetyno-3-O--glukozydu (QR) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 30. Effect of bacteria Escherichia coli (EC) on the concentration of rutin (RUT) and quercetin-3-O-glucoside (QR) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie RUT / RUT concentration [µg/ml] Stężenie QR / QR concentration

[µg/ml]

Teoretyczne Theoretical

Oznaczone / Determined

podłożemedium

podłoże + ECmedium + EC

podłożemedium


20 15,19 ± 1,32 a 14,45 ± 0,93 a n.d. tr

100 103,51 ± 14,49 a 88,75 ± 4,03 b n.d. 8,61 ± 2,10

250 263,87 ± 36,94 a 273,64 ± 14,36 a n.d. 0,97 ± 0,19

n.d. – stężenie poniżej progu detekcji / not detected tr – wykryto ilości śladowe / trace amounts

Średnie oznaczone tą samą literą w wierszu nie różnią się istotnie (p < 0,05). Means marked with the same letter in a row are not significantly different (p < 0.05).

Tabela 31. Wpływ bakterii Enterococcus caccae (EN) na stężenie rutyny (RUT) i kwercetyny (Q) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 31. Effect of bacteria Enterococcus caccae (EN) on the concentration of rutin (RUT) and quercetin (Q) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie RUT / RUT concentration [µg/ml] Stężenie Q / Q concentration

[µg/ml]



podłożemedium

podłoże + ENmedium + EN

podłożemedium

podłoże + ENmedium + EN

20 9,38 ± 1,22 a 18,81 ± 6,71 b n.d. n.d.

100 104,79 ± 9,05 a 96,73 ± 6,90 a n.d. tr

250 279,72 ± 39,16 a 280,14 ± 23,02 a n.d. tr

n.d. – stężenie poniżej progu detekcji / not detected tr – wykryto ilości śladowe / trace amounts



Bacteroides galacturonicus i Eubacterium cylindroides przekształcały rutynę do pochodnych, które nie zostały zidentyfikowane, nie były to jednak ani kwercetyna, ani jej glukozyd. Potencjał antyoksydacyjny medium z dodatkiem rutyny istotnie wzrastał pod wpływem EUB (tab. 26), co może wskazywać na powstanie metabo-litów o wyższym AOX. Wzrost stężenia rutyny w obecności bakterii (wyraźny szczególnie dla niższych dawek) świadczy o uwalnianiu tego glikozydu z połączeń z matrycą pożywki (tab. 32 i 33). Metabolity powstałe w reakcjach zachodzących z udziałem BAC natomiast miały potencjał antyoksydacyjny niższy od wyjściowe-

Tabela 32. Wpływ bakterii Bacteroides galacturonicus (BAC) na stężenie rutyny (RUT) w podło-żu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 32. Effect of bacteria Bacteroides galacturonicus (BAC) on the concentration of rutin (RUT) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie RUT / RUT concentration [µg/ml]



podłożemedium

podłoże + BACmedium + BAC

20 8,65 ± 0,78 a 13,27 ± 9,06 a

100 56,64 ± 6,34 a 54,81 ± 2,79 a

250 212,22 ± 28,86 a 189,42 ± 32,46 a


Tabela 33. Wpływ bakterii Eubacterium cylindroides (EUB) na stężenie rutyny (RUT) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 33. Effect of bacteria Eubacterium cylindroides (EUB) on the concentration of rutin (RUT) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie RUT / RUT concentration [µg/ml]



podłożemedium

podłoże + EUBmedium + EUB

20 5,99 ± 1,26 a 7,01 ± 3,76 a

100 33,56 ± 5,34 a 61,08 ± 21,95 b

250 194,26 ± 24,67 a 160,95 ± 22,27 a



go (bez bakterii) (tab. 24). Ponieważ rozerwanie pierścienia aromatycznego przez enzymy bakteryjne powoduje spadek potencjału antyoksydacyjnego związku, moż-na przypuszczać, że BAC dokonał właśnie tego typu przemiany w obrębie cząste-czek rutyny.

Na podstawie zaprezentowanych wyników można sformułować wniosek, że bak-terie jelitowe mają zdolność do metabolizowania tego samego związku poprzez odmienne szlaki metaboliczne i z wytworzeniem odmiennych pochodnych, także takich o niższym potencjale antyoksydacyjnym.

W medium dla E. coli wzbogacanym (+)-katechiną w rosnącym stężeniu (bez inokulacji bakteriami) oznaczona zawartość katechiny była 3–4 razy mniejsza niż dawka dodana do podłoża (tab. 34). Pod wpływem bakterii ilość tego związku ma-lała, co może świadczyć o wykorzystywaniu go przez EC. Jak podano wcześniej, (+)-katechina nie hamowała wzrostu badanych bakterii, w tym E. coli. Potencjał antyoksydacyjny medium pod wpływem EC nie zmieniał się istotnie, jedynie w pró-bach z dodatkiem 20 µg katechiny/ml malał (tab. 24). W przypadku pozostałych podłoży wzbogacanych (+)-katechiną nie wykryto piku charakterystycznego dla tego związku, pojawiał się natomiast dodatkowy pik, którego wysokość (i pole powierzch-ni pod pikiem) zwiększała się wraz z rosnącą dawką dodanej katechiny. Pik ten prawdopodobnie odpowiadał pochodnej (+)-katechiny. W dostępnej literaturze można znaleźć informacje o wiązaniu katechin do kazeiny [Haratifar i Corredig 2014]. Ponieważ hydrolizaty kazeiny były składnikiem wszystkich, poza bulionem odżywczym dla EC, stosowanych w tej pracy mediów, można wnioskować, że wspo-mniana reakcja zachodziła także w tych podłożach.

Tabela 34. Wpływ bakterii Escherichia coli (EC) na stężenie (+)-katechiny (CAT) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 34. Effect of bacteria Escherichia coli (EC) on the concentration of (+)-catechin (CAT) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie CAT / CAT concentration [µg/ml]



podłożemedium


20 6,14 ± 0,39 n.d.

100 16,90 ± 2,70 a 14,04 ± 2,01 a

250 89,91 ± 17,80 a 42,73 ± 4,74 b

n.d. – stężenie poniżej progu detekcji / not detected



Wzrost potencjału antyoksydacyjnego medium pod wpływem Ruminococcus gauvreauii dla najniższej dawki naringiny (tab. 25) wynikał prawdopodobnie z prze-mian tego flawanonu do pochodnych o wyższym potencjale AOX. Spadkowi zawar-tości naringiny pod wpływem RUMI nie towarzyszyło jednak pojawienie się agliko-nu – naringeniny (tab. 35), a zatem przemiany metaboliczne musiały prowadzić do powstania innych pochodnych, np. kwasów fenolowych. Taki szlak biotransformacji znany jest dla bakterii Clostridium orbiscindens, która przekształca naringeninę aż do floroglucyny, poprzez stadium dihydrochalkonu oraz kwasu 3-(4-hydroksyfenylo)--propionowego [Schoefer i in. 2003]. Co ciekawe, bakteria ta nie ma zdolności metabolizowania naringiny (glikozydu). Podobnie Eubacterium ramulus nie działa na naringinę, zaś naringeninę przekształca do kwasów fenolowych [Schneider i Blaut 2000]. Zanotowany spadek potencjału antyoksydacyjnego w podłożach z naringiną w wyniku działania Bacteroides galacturonicus nie wynikał z przemian tego związku do aglikonu. Nie wykryto naringeniny, a zmiany stężenia naringiny pod wpływem BAC w większości przypadków nie były istotne statystycznie (tab. 36). Także w po-zostałych podłożach nie stwierdzono istotnych zmian stężenia tego glikozydu pod wpływem innych badanych bakterii.

W przypadku hesperydyny zmiany potencjału antyoksydacyjnego medium nie znalazły uzasadnienia w przemianach tego związku pod wpływem bakterii – dla żadnej z nich, z wyjątkiem Ruminococcus gauvreauii, nie zaobserwowano istotnych statystycznie zmian ani stężenia HR, ani czasu retencji odpowiadającego jej piku na chromatogramach. W tym przypadku na uwagę zasługuje znacznie mniejsze (niż wynikałoby to z dodanej dawki) stężenie HR w medium wzbogaconym najwyższą

Tabela 35. Wpływ bakterii Ruminococcus gauvreauii (RUMI) na stężenie naringiny (NR) i jej aglikonu naringeniny (N) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 35. Effect of bacteria Ruminococcus gauvreauii (RUMI) on the concentration of naringin (NR) and its aglycone naringenin (N) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie NR / NR concentration [µg/ml] Stężenie N

N concentration [µg/ml]



podłożemedium

podłoże + RUMImedium + RUMI


20 34,56 ± 2,66 a 15,73 ± 2,06 b n.d.

100 116,67 ± 21,23 a 96,51 ± 11,58 a n.d.

250 276,65 ± 34,19 a 206,48 ± 35,36 b n.d.




dawką tego glikozydu, co znalazło odzwierciedlenie w niskim potencjale antyoksy-dacyjnym tej próby (tab. 25). W obecności bakterii doszło do dalszego obniżenia potencjału AOX, czemu towarzyszył znaczny spadek zawartości hesperydyny, ale nie przełożyło się to na pojawienie się wykrywalnych stężeń aglikonu – hesperetyny (tab. 37). Jeśli zatem miałby to być rozpad hesperydyny pod wpływem RUMI, to należałoby przypuszczać, że proces zachodzi dalej niż tylko do aglikonu i prowadzi do powstania związków o niższym potencjale antyoksydacyjnym niż potencjał wyj-ściowego glikozydu.

Wykazano zanik pików dla kwercetyny, kemferolu, rezweratrolu i hesperetyny we wszystkich badanych pożywkach, niezależnie od stężenia dodanych związków. Z pod-łoży dla EUB i LCB znikała także florydzyna, a w pozostałych mediach jej stężenie, oznaczone metodą HPLC, było kilkukrotnie mniejsze niż wynikałoby to z ilości do-danego polifenolu i nie ulegało zmianie pod wpływem bakterii. Z kolei naringeninę wykryto jedynie w mediach dla EC i EN, choć – podobnie jak w przypadku florydzy-ny – jej stężenie, oznaczone na podstawie chromatogramów, było kilkukrotnie niższe niż wynikałoby to z rzeczywiście dodanej do pożywek ilości związku. Również w tych przypadkach obecność bakterii nie miała istotnego wpływu na stężenie tego związku w podłożu. Nie wykryto natomiast naringeniny w podłożach dla BAC, RUMI, LCB i EUB (poza śladowymi ilościami dla najwyższej dodanej dawki 250 µg/ml). Wyniki te potwierdzają wcześniejsze przypuszczenia o wiązaniu się niektórych polifenoli do białek czy polisacharydów obecnych w mediach, dlatego też w przypadku Q, KMP, RS, H, PHL i N zrezygnowano z prezentacji wyników w postaci tabel, gdyż znalazła-by się tam jedynie adnotacja „stężenie poniżej progu detekcji”.

Tabela 36. Wpływ bakterii Bacteroides galacturonicus (BAC) na stężenie naringiny (NR) i jej aglikonu naringeniny (N) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 36. Effect of bacteria Bacteroides galacturonicus (BAC) on the concentration of naringin (NR) and its aglycone niringenin (N) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie NR / NR concentration [µg/ml]

Stężenie NN concentration

[µg/ml]Teoretyczne Theoretical


podłożemedium



20 24,76 ± 1,39 a 20,39 ± 0,12 b n.d.

100 105,40 ± 13,96 a 117,85 ± 21,86 a n.d.

250 269,14 ± 24,76 a 251,90 ± 44,49 a n.d.




W podłożach z dodatkiem ekstraktów końcowe stężenia wykrywanych i identy-fikowanych polifenoli były znacznie niższe niż w przypadku dodatku czystych związ-ków, przeważnie poniżej progu detekcji chromatografu. Dla tych związków, które udało się zidentyfikować, wykazano tylko kilka istotnych statystycznie zmian stęże-nia pod wpływem badanych gatunków bakterii. Z tego też powodu nie przedstawio-no uzyskanych rezultatów w postaci tabelarycznej, a wartości, które wskazywały na istotne statystycznie zmiany, przedyskutowano poniżej.

W podłożach wzbogaconych ekstraktem z soi (w stężeniu 5%) nastąpił pod wpływem Eubacterium cylindroides całkowity zanik daidzyny (z wyjściowej wartości 4,12 ± 0,49 µg/ml do 0) z jednoczesnym pojawieniem się jej aglikonu – daidzeiny (wzrost z 0 do 4,22 ± 2,03 µg/ml) i brakiem zmian poziomu genisteiny. Należy za-znaczyć, że w stężeniu 5% ekstrakt z soi bardzo silnie hamował wzrost EUB; być może, właśnie te śladowe pozostałości tych bakterii były zdolne do przekształcania daidzyny w daidzeinę. Pozostałe testowane gatunki bakterii nie wpływały na poziom izoflawonoidów w medium lub związki te występowały w stężeniu niewykrywalnym.

Warto tutaj podkreślić, że wpływ danej substancji na bakterie zależy nie tylko od jej budowy, ale także od możliwości metabolicznych bakterii. Niektóre gatunki wytwarzają bowiem enzymy umożliwiające rozkład poszczególnych związków, np. Eubacterium ramulus może rozcinać pierścień aromatyczny w cząsteczkach flawo-noidów. Dzięki temu bakterie mogą wykorzystywać niektóre flawonoidy na swoje potrzeby. Rodzaj flawonoidu zależy od gatunku bakterii i wytwarzanych przez nie enzymów; niektóre gatunki preferują glikozydy, z których odłączają cząsteczki cu-krów, wykorzystywane dalej jako źródło węgla i energii (np. Bacteroides [Bokkenheuser

Tabela 37. Wpływ bakterii Ruminococcus gauvreauii (RUMI) na stężenie hesperydyny (HR) i jej aglikonu hesperetyny (H) w podłożu oznaczone metodą HPLC (średnia ± SD, n = 3)

Table 37. Effect of bacteria Ruminococcus gauvreauii (RUMI) on the concentration of hesperi-din (HR) and its aglycone hesperetin (H) in medium as determined by HPLC method (mean ± SD, n = 3)

Stężenie HR / HR concentration [µg/ml] Stężenie H

H concentration [µg/ml]



podłożemedium



20 28,66 ± 4,18 a 19,83 ± 4,74 b n.d.

100 118,02 ± 13,16 a 91,79 ± 5,31 b n.d.

250 129,42 ± 17,21 a 60,67 ± 2,84 b n.d.




i in. 1987]), często jednak nie mają możliwości, by wykorzystać również aglikon. Inne z kolei, jak np. Clostridium orbiscindens czy E. ramulus, nie potrafią aktywnie ko-rzystać z glikozydów, uzależnione są więc od działania enzymów innych organizmów, by móc wykorzystać wytworzony przez nie aglikon [Schoefer i in. 2003]. Szlak me-taboliczny wielu polifenoli prowadzi do floroglucyny, która następnie może być przekształcana przez kolejne gatunki bakterii (np. Eubacterium oxidoreducens) [Krumholz i in. 1987]. Wyraźnie więc widać, że w rozkład danego związku zaanga-żowanych jest często wiele gatunków bakterii, stąd brak zmian wykazany w warun-kach in vitro, przy udziale jednego tylko mikroorganizmu, nie musi być jednoznacz-ny z brakiem możliwości uczestniczenia tego drobnoustroju w procesach biotransformacji danego związku. W warunkach rzeczywistych, tzn. w przewodzie pokarmowym, współistnieją liczne gatunki mikroorganizmów mogące współdziałać w metabolizmie danej substancji.

W doświadczeniach z dodatkiem ekstraktów wykazano także zachodzenie, pod wpływem bakterii, nieznacznych zmian stężenia rutyny, stanowiącej składnik niektó-rych surowców. W podłożu wzbogacanym najwyższą badaną dawką ekstraktu z czosn-ku niedźwiedziego stężenie rutyny malało pod wpływem Enterococcus caccae z 0,16 ± 0,02 do 0,08 ± 0,01 µg/ml. Jednocześnie w medium pojawiała się kwerce-tyna, której stężenie wzrastało z poziomu niewykrywalnego do 0,20 ± 0,00 µg/ml. Wyniki te są potwierdzeniem rezultatów doświadczeń z czystymi polifenolami, wska-zujących na zdolność przekształcania rutyny do kwercetyny przez EN. Z kolei pod-czas przemian tego samego ekstraktu, ale pod wpływem Ruminococcus gauvreauii, stężenie rutyny malało z 2,32 ± 0,26 do 1,86 ± 0,02 µg/ml. Nie pojawiły się w wy-krywalnych ilościach ani kwercetyna, ani glukozyd kwercetyny, zatem ubytek rutyny polegał na czymś więcej niż tylko na odszczepieniu cząsteczki monocukru lub dwu-cukru od aglikonu, tym bardziej że podczas rozdziału chromatograficznego zaob-serwowano nowy, niezidentyfikowany związek. Nie zanotowano zmian pod wpływem EUB, zaś w próbach z EC polifenole miały stężenia poniżej progu detekcji.

Stężenie rutyny w podłożach wzbogaconych ekstraktem z jagód goji (w stężeniu 5%), będących bogatym źródłem tego związku, malało pod wpływem EUB z 0,43 ± 0,05 do 0,23 ± 0,32 µg/ml, ale nie towarzyszyły temu zmiany stężeń kwer-cetyno-3-O-glukozydu i kwercetyny. Nie zanotowano żadnych zmian stężenia rutyny pod wpływem RUMI, a w próbach z EC i EN jej poziom był poniżej możliwości detekcji aparatu. Co ciekawe, w medium z 5-procentowym dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu stężenie rutyny nie ulegało zmianie pod wpływem EN, podczas gdy stężenie kwercetyny się zwiększało (z 0,18 ± 0,03 do 2,00 ± 0,01 µg/ml). W przy-padku pozostałych bakterii wykazano brak zmian stężenia tych związków lub stwier-dzono, że ich poziom mieści się poniżej progu wykrywalności.

Brak istotnych zmian stężenia pod wpływem większości badanych gatunków bakterii (w tym RUMI) wykazano także dla hesperydyny i naringiny w mediach z dodatkiem Citroseptu. Wyjątek stanowiły próby inkubowane z EUB, w których


poziom naringiny malał z 37,19 ± 2,23 do 21,49 ± 4,33 µg/ml, zaś hesperydyny pozostawał bez zmian. Potwierdza to wyniki doświadczeń z czystymi polifenolami, świadczące, że badane bakterie nie metabolizują flawanonów obecnych w grejpfru-cie. Niestwierdzenie zmian ilości hesperydyny pod wpływem RUMI może być kon-sekwencją znacznego błędu wynikającego z faktu, że stężenie tego związku w medium znajdowało się na progu wykrywalności.

Wykazano, że niektóre badane gatunki bakterii powodują spadek zawartości kwasów fenolowych w podłożu, co może świadczyć zarówno o procesach rozkłada-nia tych związków przez bakterie, jak i o wykorzystaniu ich jako źródła węgla i ener-gii w procesach metabolicznych mikroorganizmu. W podłożach z 5-procentowym dodatkiem ekstraktu z czosnku niedźwiedziego stwierdzono spadek stężenia kwasu protokatechowego (PCA) pod wpływem Enterococcus caccae. Bakteryjny metabolizm kwasu PCA prowadzi do wytworzenia kwasów pirogronowego, bursztynowego i szcza-wiowego oraz acetaldehydu i acetyloCoA, które są włączane w cykl kwasów trójkar-boksylowych [Karegoudar i Kim 2000].

W mediach wzbogaconych ekstraktem z cytryńca chińskiego w stężeniu 5% wykazano z kolei spadek stężenia kwasu galusowego (GA) pod wpływem Escherichia coli i Enterococcus caccae, odpowiednio z 6,51 ± 0,86 do 0,33 ± 0,47 µg/ml oraz z 23,24 ± 3,78 do 13,84 ± 6,59 µg/ml. Także w podłożach z najwyższą dawką eks-traktu z jagód goji poziom kwasu galusowego malał pod wpływem E. coli z 1,44 ± 0,19 do 0,17 ± 0,24 µg/ml. W przypadku dodania do pożywki ekstraktu z zielonej herbaty (w stężeniu 5%) zanotowano wzrost stężenia kwasu galusowego (z niewykrywalnego do 6,11 ± 4,38 µg/ml) z całkowitym rozkładem (-)-epigaloka-techiny (z 5,87 ± 0,65 µg/ml do n.d.) pod wpływem E. caccae, co może wskazywać na zdolność tej bakterii do odszczepiania reszty kwasu galusowego od cząsteczki (-)-epigalokatechiny. Odmienne prawidłowości wykazano w doświadczeniach z zie-loną herbatą prowadzonych w obecności Eubacterium cylindroides oraz Lactobacillus sp. – pod wpływem tych bakterii zmniejszało się zarówno stężenie kwasu galuso-wego, jak i galusanu (-)-epigalokatechiny; odpowiednio z 4,12 ± 0,45 do 2,34 ± 3,50 µg/ml i z 171,86 ± 18,90 do114,86 ± 32,96 µg/ml dla EUB oraz z 6,61 ±0,73 do 2,97 ± 0,30 µg/ml i z 172,83 ± 19,21 µg/ml do niewykrywalnego dla LCB. Wykorzystanie kwasu galusowego przez LCB może tłumaczyć sugero-wane wcześniej stymulowanie wzrostu tej bakterii przez kwas galusowy.

Stężenie obecnego w ekstrakcie z malin kwasu elagowego malało pod wpływem EC (z 0,08 ± 0,01 do 0,03 ±0,05 µg/ml), EN (z 0,39 ± 0,06 µg/ml do niewykrywal-nego) i LCB (z 0,32 ± 0,02 do 0,17 ± 0,24 µg/ml).

Analizując wyniki uzyskane dla podłoży wzbogacanych ekstraktami roślinnymi oraz preparatami farmaceutycznymi, należy uwzględnić również obecność dodatko-wych składników, zarówno substancji pochodzących z podłoży bakteryjnych, jak i substancji pochodzenia roślinnego, które przeszły do wyciągów podczas ekstrakcji. Ta złożona matryca spowodowała, że większość polifenoli pozostała związana z biał-


kami i polisacharydami. Prowadząc doświadczenia z ekstraktami z owoców, nie można także zapominać o występującej w wielu z nich polifenolooksydazie (PPO). Guyot i inni [1996] stwierdzili bowiem, że w wodnych roztworach katechina w obec-ności PPO ulega utlenianiu, co prowadzi do wytworzenia szeregu dimerów w wyni-ku powstania połączenia C–C oraz C–O między flawanami, przy czym typ powsta-jących dimerów zależy od pH środowiska. Przy niskim pH faworyzowane są produkty bezbarwne, a przy wyższym pH powstają żółte produkty dimeryzacji. Wśród zidentyfikowanych przez tych autorów dimerów były dehydrodikatechina A i B, będące izomerami procyjanidyn typu B. W niniejszej pracy wykazano zanik katechi-ny z podłoży z jednoczesnym pojawieniem się niezidentyfikowanych związków, bę-dących przypuszczalnie produktami utleniania i/lub degradacji katechiny.

Uzyskane wyniki potwierdzają sugerowane wcześniej interakcje związków poli-fenolowych ze składnikami pożywek. W niektórych przypadkach dochodziło pod wpływem bakterii do uwalniania tych związków z wytworzonych połączeń, prawdo-podobnie na skutek wykorzystywania przez bakterie do swojego metabolizmu ami-nokwasów czy cukrów albo na skutek zmiany pH medium pod wpływem metabolitów bakterii. Większość badanych gatunków bakterii w warunkach beztlenowych wytwa-rza kwasy organiczne, które powodują spadek odczynu podłoża i zmianę siły od-działywań między cząsteczkami. Zmiana pH podłoża (bakteryjna) powoduje też zmiany budowy cząsteczek polifenoli. Wykazano, że kwercetyna w bardziej kwaśnym środowisku staje się mniej lipofilna, co wynika z przybrania formy uprotonowanej i prowadzi do zwiększenia zdolności oddawania protonu [Materska 2008].

Podsumowując przedstawione rozważania należy stwierdzić, że postawiona na początku badań hipoteza nr 2 powinna zostać odrzucona, wykazano bowiem, że bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej mogą prze-kształcać związki polifenolowe do pochodnych o niższym potencjale antyoksydacyj-nym. Co prawda, w przypadku niektórych składników wykazano wzrost potencjału antyoksydacyjnego, ale często było to spowodowane nie przemianami metabolicz-nymi polifenoli, ale ich uwalnianiem z powiązań z białkami czy innymi składnikami obecnymi w środowisku reakcji. Takie procesy mają jednak istotne znaczenie w wa-runkach in vivo, gdyż do przewodu pokarmowego związki polifenolowe rzadko trafiają w postaci wolnej i oczyszczonej (preparaty farmaceutyczne, suplementy diety), a znacznie częściej – jako składniki żywności, są więc powiązane z matrycą. Uwalnianie z tych powiązań zwiększa biodostępność polifenoli dla organizmu go-spodarza oraz rezydujących w nim przedstawicieli mikrobioty jelitowej. Dzięki temu składniki polifenolowe mogą być przekształcane przez inne bakterie jelitowe, tym bardziej że w skład ludzkiej mikrobioty wchodzi kilkaset gatunków, a w tej pracy przebadano ich zaledwie siedem. Wytworzone metabolity mogą następnie być wy-korzystywane przez bakterie lub komórki nabłonka jelitowego w procesach meta-bolicznych albo zostać wchłonięte, by wywrzeć wpływ na organizm gospodarza.


Terapie celowane wobec konkretnego gatunku, który powinien być wyelimino-wany albo, odwrotnie, którym planuje się wzbogacić mikrobiotę jelitową, będą jed-nym z ważniejszych zagadnień badawczych najbliższych lat. Wyjaśnienie, w jaki sposób można odwrócić stan dysbiozy, którą bakterię „wzmocnić”, a którą „osłabić”, żeby pomóc choremu wydostać się z zaklętego kręgu choroby, stanowi już dziś temat wielu projektów badawczych na skalę światową. Wynika to stąd, że dysbiozę uważa się za jeden z elementów odpowiedzialnych za rozwój licznych poważnych jednostek chorobowych, takich jak choroby zapalne jelita (IBD, choroba Crohna), astma, otyłość, cukrzyca typu 1, alergie, celiakia, syndromy metaboliczne i miażdżyca. Wprowadzenie indywidualnych terapii dostosowanych do wieku osobnika, jego płci, regionu zamieszkania i współistniejących chorób jest na razie melodią przyszłości, jednak już dziś stosowane są różne rodzaje takich celowanych interwencji, w tym antybiotyki, probiotyki, prebiotyki, immunomodulatory czy terapia fagowa.

Wydaje się, że szczególnie cennym wnioskiem wynikającym z tych badań jest to, że związki polifenolowe obecne w diecie w postaci wieloskładnikowych mieszanin, a przede wszystkim w formie glikozydów, są mniej „agresywne” w stosunku do ga-tunków bakterii zasiedlających ludzkie jelito niż te, które można nabyć pod postacią jednoskładnikowych suplementów. Nasuwa się też druga ważna konkluzja, że zbyt duże stężenia polifenoli, jakie trafiają do przewodu pokarmowego, mogą wywrzeć negatywny efekt na organizm, zamiast go wspomóc.

5. Wnioski

Wyniki tej pracy wskazują, że należy odrzucić hipotezę badawczą nr 1, mówiącą, iż naturalne składniki przeciwutleniające i związki polifenolowe zawarte w surowcach roślinnych nie wywierają hamującego wpływu na bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej. Jak wykazano, mogą one wywierać silne inhibi-torowe działanie na te bakterie. 1. Szczególnie silny wpływ hamujący na bakterie Lactobacillus sp., Enterococcus

caccae i Bacteroides galacturonicus wykazano dla rezweratrolu i naringeniny, a na Bifidobacterium catenulatum – dla kwercetyny. Wzrost Ruminococcus gauvreauii był silnie hamowany przez wszystkie wymienione polifenole i do-datkowo przez kemferol, który działał bakteriobójczo także wobec Eubacterium cylindroides.

2. Spośród badanych ekstraktów roślinnych i suplementów diety ekstrakty z cytryń-ca chińskiego, jako jedyne, znacząco hamowały wzrost wszystkich badanych bak-terii jelitowych (MIC ≥ 5%). Ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta (Citrosept) hamował wzrost badanych bakterii, oprócz LCB, zaś ekstrakt z owoców pigwow-ca działał silnie hamująco na B. galacturonicus (MIC = 5%) i E. cylindroides (MIC = 2,5%). Pozostałe ekstrakty wywierały bardziej zróżnicowany wpływ: od hamującego, przez neutralny, do stymulującego, w zależności od gatunku bakterii.

3. Dla właściwości antyoksydacyjnych i antybakteryjnych badanych związków po-lifenolowych kluczowa była jednoczesna obecność wolnych grup hydroksylowych przyłączonych do szkieletu cząsteczki w pozycji C5, C7 i C4’ oraz grupy ketono-wej przy C4.

4. Wykazano, że glikozydy flawonoidów są słabszymi inhibitorami niż ich aglikony, prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po przyłączeniu cząsteczek cukrów.

5. Możliwe jest takie dobranie składników polifenolowych, by zwiększyć lub zmniej-szyć liczebność wybranej grupy bakterii wchodzących w skład mikrobioty jelito-wej. Takie celowane terapie w przyszłości mogą zostać wykorzystane do przy-wracania równowagi w przewodzie pokarmowym i wspomagania leczenia różnych chorób wywołanych przez dysbiozę. Zahamowanie wzrostu Ruminococcus gau-

5. Wnioski 163

vreauii uzyskano jedynie po zastosowaniu ekstraktu z cytryńca chińskiego oraz Citroseptu, natomiast zwiększenie liczebności tej bakterii osiągnięto przez do-datek bioaktywnych składników zawartych w spirulinie, czerwonej cebuli, jago-dach goji, czarnym bzie oraz soku z noni. Wobec Enterococcus caccae wszystkie badane ekstrakty wykazywały działanie bakteriostatyczne, z wyjątkiem spiruliny w stężeniu 1,0 i 2,5%. Dość wrażliwym gatunkiem był także Eubacterium cylin-droides, którego wzrost hamowała większość badanych ekstraktów, z wyjątkiem ekstraktów z derenia i pokrzywy w stężeniu 5% (stymulacja wzrostu). Do zwięk-szenia populacji Bacteroides galacturonicus w mikrobiocie jelitowej można wy-korzystać bioaktywne składniki pokrzywy, malin, żurawiny, derenia, czerwonej cebuli oraz jagód goji. Liczebność Bifidobacterium catenulatum można zwiększyć poprzez suplementację diety sokiem z noni, zaś do stymulacji wzrostu Lactobacillus sp. można wykorzystać składniki bioaktywne z pigwowca, czosnku niedźwiedzie-go, pokrzywy, brusznicy, soi, zielonej herbaty, Citroseptu, jagód goji, czarnego bzu lub soku z noni.

Na podstawie uzyskanych wyników należy również odrzucić hipotezę badawczą nr 2, mówiącą, że gatunki bakterii stanowiące fizjologiczną mikrobiotę jelita ludz-kiego zwiększają, na skutek swojego metabolizmu, potencjał antyoksydacyjny bio-aktywnych składników obecnych w surowcach roślinnych. Wykazano bowiem, że bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej mogą prze-kształcać polifenole z wytworzeniem pochodnych o niższym potencjale antyoksyda-cyjnym. W przypadkach gdy w obecności bakterii rosła aktywność antyoksydacyjna badanych roztworów, często przyczyną tego były nie przemiany metaboliczne poli-fenoli, ale prawdopodobnie ich uwalnianie z powiązań z białkami czy innymi skład-nikami obecnymi w środowisku reakcji. Procesy takie mają istotne znaczenie w wa-runkach in vivo, gdyż do przewodu pokarmowego związki polifenolowe rzadko trafiają w postaci wolnej i oczyszczonej, a znacznie częściej jako składniki powiąza-ne z matrycą żywności. Uwalnianie polifenoli z tych powiązań wskutek działania bakterii zwiększa ich biodostępność dla organizmu gospodarza oraz innych przed-stawicieli rezydującej w nim mikrobioty jelitowej. Dzięki temu składniki polifeno-lowe mogą być dalej przekształcane przez inne drobnoustroje jelitowe, tym bardziej że w skład ludzkiej mikrobioty wchodzi kilkaset gatunków, a w tej pracy przebada-no ich zaledwie siedem. Wytworzone metabolity mogą następnie być wykorzystane przez bakterie lub komórki nabłonka jelitowego w procesach metabolicznych albo zostać wchłonięte w jelicie i po przedostaniu się do krwi wywierać wpływ na cały organizm gospodarza.

6. Zalecenia dla przemysłu i konsumentów

Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na pewne ważne prawidłowości dotyczą-ce interakcji związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suple-mentach diety z bakteriami reprezentującymi mikrobiotę jelitową człowieka, choć kwestie te z pewnością wymagają dalszego badania. Przede wszystkim wydaje się konieczne sprawdzenie, czy prawidłowości podobne do wykazanych w tej pracy na modelu in vitro występują także w warunkach rzeczywistych, tzn. w przewodzie po-karmowym człowieka (in vivo) lub w gotowych produktach żywnościowych. W obu przypadkach należy bowiem jeszcze uwzględnić oddziaływania zarówno związków przeciwutleniających, jak i bakterii z innymi składnikami środowiska (m.in. matrycą żywności) oraz z pozostałymi gatunkami stanowiącymi mikrobiotę jelita. Niemniej jednak, nawet na tym etapie badań i przy obecnym stanie wiedzy, wydaje się uza-sadnione sformułowanie kilku wskazówek dla konsumentów oraz producentów żywności. 1. Należy zachować umiar w stosowaniu suplementów diety zawierających poje-

dyncze związki polifenolowe. Wiele z nich występuje w takich preparatach w daw-kach wielokrotnie przekraczających zawartość tych składników w naturalnych produktach spożywczych, co może prowadzić do osiągnięcia w przewodzie po-karmowym stężenia toksycznego. Wykazano wprawdzie, że niektóre polifenole mają stymulujący wpływ na mikrobiotę jelitową, jednak dotyczyło to jedynie ich niskich dawek, natomiast dawki wyższe powodowały znaczące zmniejszenie się liczebności populacji bakterii.

2. Wykazano, że aglikony polifenoli mają niekorzystny wpływ na większość badanych gatunków fizjologicznej mikrobioty jelitowej, natomiast glikozydy nie wykazują takiego działania. Jest to szczególnie istotne, gdyż w suplementach diety polife-nole występują przede wszystkim w postaci aglikonów, podczas gdy w żywności formą dominującą są glikozydy.

3. Ze względu na korzystne oddziaływanie na organizm człowieka (antyalergiczne, przeciwzapalne, antywirusowe, adaptogenne) owoce cytryńca chińskiego są co-raz częściej stosowane w postaci suplementów diety. Wyniki przeprowadzonych badań sugerują jednak, że trzeba też brać pod uwagę negatywny wpływ, jaki

6. Zalecenia dla przemysłu i konsumentów 165

niektóre składniki obecne w tych owocach wywierają na bakterie stanowiące fizjologiczną mikroflorę naszego jelita, i uwzględniać płynące stąd konsekwencje.

4. Z uwagi na wykazany silnie hamujący wpływ ekstraktów z czosnku niedźwiedzie-go i cytryńca chińskiego wydaje się możliwe ich zastosowanie w przemyśle spo-żywczym jako naturalnych składników hamujących wzrost niepożądanej mikro-flory. Podobne zastosowanie mogą znaleźć oczyszczone polifenole: rezweratrol i naringenina.

5. Znaczący potencjał aplikacyjny w produkcji żywności probiotycznej mogą znaleźć zielona herbata, soja, czosnek niedźwiedzi, owoce noni, czarnego bzu, borówki brusznicy i grejpfruta oraz jagody goji. Zastosowane w charakterze dodatków wzbogacających produkt w składniki smakowe i przeciwutleniające, mogą pomóc w zahamowaniu wzrostu niepożądanych bakterii, a jednocześnie nie będą wy-wierały wpływu na bakterie kwasu mlekowego z rodzaju Lactobacillus lub będą miały efekt stymulujący.

6. Nie zaleca się używania owoców cytryńca chińskiego do wzbogacania produktów żywnościowych zawierających bakterie Lactobacillus, a ostrożność należy zacho-wać przy wykorzystywaniu w takich produktach czerwonej cebuli i żurawiny.

Literatura

Acevedo H.F., Slifkin M., Pouchet-Melvin G.R., Campbell-Acevedo E.A. 1979. Choriogonadotropin-like antigen in an anaerobic bacterium, Eubacterium lentum, iso-lated from a rectal tumor. Infect. Immun., 24(3), 920–924.

Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Galtier P., Gilbert J., Gott D.M., Gundert- -Remy U., König J., Lambré C., Leblanc J.-C., Mortensen A., Mosesso P., Parent- -Massin D., Stankovic I., Tobback P., Waalkens-Berendsen D.H., Woutersen R.A., Wright M.C. 2012. Statement on the safety assessment of the exposure to butylated hydroxyanisole E 320 (BHA) by applying a new exposure assessment methodology. EFSA J., 10(7), 2759.

Ahn Y.-J., Sakanaka S., Kim M.-J., Kawamura T., Fujisawa T., Mitsuoka T. 1990. Effect of green tea extract on growth of intestinal bacteria. Microb. Ecol. Health Dis., 3, 335–338.

Albert S., Horbach R., Deising H.B., Siewert B., Csuk R. 2011. Synthesis and antimicro-bial activity of (E) stilbene derivatives. Bioorg. Med. Chem., 19(17), 5155–5166.

Al-Malaika S. 1989. Antioxidants and stabilizers for hydrocarbon polymers: past, present, and future. [W:] Handbook of polymer science and technology. Vol. 2. Performance properties of plastics and elastomers. Red. N.P. Cheremisinoff. CRC Press, Boca Raton, 261–290.

Alzoghaibi M.A. 2013. Concepts of oxidative stress and antioxidant defense in Crohn’s disease. World J. Gastroenterol., 19(39), 6540–6547.

Amagase H., Farnsworth N.R. 2011. A review of botanical characteristics, phytochemistry, clinical relevance in efficacy and safety of Lycium barbarum fruit (Goji). Food Res. Intern., 44, 1702–1717.

Amezouar F., Badri W., Hsaine M., Bourhim N., Fougrach H. 2012. Chemical composi-tion, antioxidant and antibacterial activities of leaves essential oil and ethanolic extract of Moroccan Warionia saharae Benth. & Coss. J. Appl. Pharmac. Sci., 2(5), 212–217.

Andersen S., Wold J.K. 1978. Water-soluble glycoprotein from Urtica dioica leaves. Phytochem., 17(11), 1875–1877.

Astill C., Birch M.R., Dacombe C., Humphrey P.G., Martin P.T. 2001. Factors affecting the caffeine and polyphenol contents of black and green tea infusions. J. Agric. Food Chem., 49(11), 5340–5347.

Literatura 167

Atanassova S.S., Gutzow I.S. 2013. Hippuric acid as a significant regulator of supersatura-tion in calcium oxalate lithiasis: the physiological evidence. Biomed. Res. Int., ID 374950 (http://dx. doi.org/10.1155/2013/374950).

Atkinson C., Frankenfeld C.L., Lampe J.W. 2005. Gut bacterial metabolism of the soy isoflavone daidzein: exploring the relevance to human health. Exp. Biol. Med. (Maywood), 230(3), 155–170.

Ayehunie S., Belay A., Baba T.W., Ruprecht R.M. 1998. Inhibition of HIV-1 replication by an aqueous extract of Spirulina platensis (Arthrospira platensis). J. Acquir. Immune Defic. Synd. Hum. Retrovirol., 18(1), 7–12.

Bagiu R.V., Vlaicu B., Butnariu M. 2012. Chemical composition and in vitro antifungal activity screening of the Allium ursinum L. (Liliaceae). Int. J. Mol. Sci., 13(2), 1426– –1436.

Bahadoran Z., Mirmiran P., Azizi F. 2013. Dietary polyphenols as potential nutraceuticals in management of diabetes: a review. J. Diabetes Metab. Disord., 12(1), 43.

Bansal S., Choudhary S., Sharma M., Kumar S.S., Lohan L., Bhardwaj V., Syan N., Jyoti S. 2013. Tea: a native source of antimicrobial agents. Food Res. Int., 53, 568–584.

Barak V., Halperin T., Kalickman I. 2001. The effect of Sambucol, a black elderberry-based, natural product, on the production of human cytokines. I. Inflammatory cytokines. Eur. Cytokine Netw., 12(2), 290–296.

Barreca D., Bellocco E., Laganà G., Ginestra G., Bisignano C. 2014. Biochemical and antimicrobial activity of phloretin and its glycosilated derivatives present in apple and kumquat. Food Chem., 160, 292–297.

Bartz R.R., Piantadosi C.A. 2010. Clinical review: oxygen as a signaling molecule. Crit. Care, 14(5), 234.

Basar S., Uhlenhut K., Högger P., Schöne F., Westendorf J. 2010. Analgesic and antiin-flammatory activity of Morinda citrifolia L. (Noni) fruit. Phytother. Res., 24(1), 38–42.

Beckman K.B., Ames B.N. 1998. The free radical theory of aging matures. Physiol. Rev., 78(2), 547–581.

Beesk N., Perner H., Schwarz D., George E., Kroh L.W., Rohn S. 2010. Distribution of quercetin-3,4’-O-diglucoside, quercetin-4’-O-monoglucoside, and quercetin in different parts of the onion bulb (Allium cepa L.) influenced by genotype. Food Chem., 122, 566–571.

Belay A. 2002. The potential application of Spirulina (Arthrospira) as a nutritional and therapeutic supplement in health management. J. Am. Nutraceut. Ass., 5, 27–49.

Belur P.D., Mugeraya G. 2011. Microbial production of tannase: state of the art. Res. J. Micriobiol., 6(1), 25–40.

Bevilacqua A., Corbo M.R., Sinigaglia M. 2010. Combining eugenol and cinnamaldehyde to control the growth of Alicyclobacillus acidoterrestris. Food Control, 21, 172–177.

Björksten B., Naaber P., Sepp E., Mikelsaar M. 1999. The intestinal microflora in allergic Estonian and Swedish 2-year-old children. Clin. Exp. Allergy, 29(3), 342–346.


Błażewicz-Woźniak M., Michowska A. 2011. The growth, flowering and chemical compo-sition of leaves of three ecotypes of Allium ursinum L. Acta Agrobot., 64(4), 171–180.

Bokkenheuser V.D., Shackleton C.H., Winter J. 1987. Hydrolysis of dietary flavonoid glycosides by strains of intestinal Bacteroides from humans. Biochem J., 248(3), 953–956.

Bomhard E.M., Bremmer J.N., Herbold B.A. 2002. Review of the mutagenicity/genotoxic-ity of butylated hydroxytoluene. Mutat. Res., 277, 187–200.

Boots A.W., Haenen G.R., Bast A. 2008. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. Eur. J. Pharmacol., 585(2–3), 325–337.

Botterweck A.A., Verhagen H., Goldbohm R.A., Kleinjans J., van den Brandt P.A. 2000. Intake of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene and stomach cancer risk: results from analyses in the Netherlands cohort study. Food Chem. Toxicol., 38(7), 599–605.

Bramorski A., da Rosa Cherem A., Marmentini C.P., Torresani J., Mezadri T., Silva Costa A.A. 2010. Total polyphenol content and antioxidant activity of commercial Noni juice and its components. Braz. J. Pharm. Sci., 46(4), 651–656.

Brown K., DeCoffe D., Molcan E., Gibson D.L. 2012. Diet-induced dysbiosis of the intes-tinal microbiota and the effects on immunity and disease. Nutrients, 4(8), 1095–1119.

Bullen J.J., Rogers H.J., Spalding P.B., Ward C.G. 2005. Iron and infection – the heart of the matter. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 43, 325–330.

Burda S., Oleszek W. 2001. Antioxidant and antiradical activities of flavonoids. J. Agric. Food Chem., 49, 2774–2779.

Burt S. 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods – a review. Int. J. Food Microbiol., 94(3), 223–253.

Burton G.J., Jauniaux E. 2011. Oxidative stress. Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol., 25(3), 287–299.

Campisi J., Kim S.H., Lim C.S., Rubio M. 2001. Cellular senescence, cancer and aging: the telomere connection. Exp. Gerontol., 36(10), 1619–1637.

Cantoreggi S., Dietrich D.R., Lutz W.K. 1993. Induction of cell proliferation in the fore-stomach of F344 rats following subchronic administration of styrene 7,8-oxide and butyl-ated hydroxyanisole. Cancer Res., 53, 3505–3508.

Cao G., Sofic E., Prior R.L. 1997. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: structure–activity relationships. Free Radic. Biol. Med., 22(5), 749–760.

Carotenuto A., De Feo V., Fattorusso E., Lanzotti V., Magno S., Cicala C. 1996. The flavonoids of Allium ursinum. Phytochemistry, 41(2), 531–536.

Chacko S.M., Thambi P.T., Kuttan R., Nishigaki I. 2010. Beneficial effects of green tea: a literature review. Chin. Med., 5, 13.

Chakraborty A.K., Funasaka Y., Komoto M., Ichihashi M. 1998. Effect of arbutin on melanogenic proteins in human melanocytes. Pigment Cell Res., 11(4), 206–212.

Chalal M., Klinguer A., Echairi A., Meunier P., Vervandier-Fasseur D., Adrian M. 2014. Antimicrobial activity of resveratrol analogues. Molecules, 19(6), 7679–7688.

Literatura 169

Chamorro-Cevallos G., Garduño-Siciliano L., Barrón B.L., Madrigal-Bujaidar E., Cruz-Vega D.E., Pages N. 2008. Chemoprotective effect of Spirulina (Arthrospira) against cyclophosphamide-induced mutagenicity in mice. Food Chem. Toxicol., 46, 567–574.

Chang R., So K. 2008. Use of anti-aging herbal medicine, Lycium barbarum, against aging- -associated diseases. What do we know so far? Cell. Mol. Neurobiol., 28, 643–652.

Chang Y.C., Nair M.G., Nitiss J.L. 1995. Metabolites of daidzein and genistein and their biological activities. J. Nat. Prod., 58, 1901–1905.

Chao P.Y., Lin S.Y., Lin K.H., Liu Y.F., Hsu J.I., Yang C.M., Lai J.Y. 2014. Antioxidant activity in extracts of 27 indigenous Taiwanese vegetables. Nutrients, 6(5), 2115–2130.

Chatterjee A.K., Gibbins L.N. 1969.Metabolism of phloridzin by Erwinia herbicola: nature of the degradation products, and the purification and properties of phloretin hydrolase. J. Bacteriol., 100(2), 594–600.

Chen X., Li Y., Lin Q., Wang Y., Sun H., Wang J., Cui G., Cai L., Dong X. 2014. Tea polyphenols induced apoptosis of breast cancer cells by suppressing the expression of Survivin. Sci Rep., 4, 4416.

Chirumbolo S. 2011. Quercetin as a potential anti-allergic drug: which perspectives? Iran J. Allergy Asthma Immunol., 10(2), 139–140.

Choi J.S., Park N.H., Hwang S.Y., Sohn J.H., Kwak I., Cho K.K., Choi I.S. 2012. The antibacterial activity of various saturated and unsaturated fatty acids against several oral pathogens. J. Environ. Biol., 34, 673–676.

Cieślik E., Gębusia A. 2012. Charakterystyka właściwości prozdrowotnych owoców roślin egzotycznych. Post. Fitoter., 2, 93–100.

Collins P.J., Dobson D.W., Field J.A. 1998. Reduction of the 2,2’-azinobis(3-ethylbenzthia-zoline-6-sulfonate)cation radical by physiological organic acids in the absence and pres-ence of manganese. Appl. Environ. Microbiol., 64(6), 2026–2031.

Cook N.C., Samman S. 1996. Flavonoids – chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary sources. J. Nutr. Biochem., 7(2), 66–76.

Corzo-Martínez M., Corzo N., Villamiel M. 2007. Biological properties of onions and garlic. Trends Food Sci. Technol., 18, 609–625.

Cos P., Ying L., Calomme M., Hu J.P., Cimanga K., Van Poel B., Pieters L., Vlietinck A.J., Vanden Berghe D. 1998. Structure–activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers. J. Nat. Prod., 61(1), 71–76.

Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents, 26, 343–356.

Davies K.J. 1987. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects. J. Biol. Chem., 262(20), 9895–9901.

Davies K.J., Delsignore M.E. 1987. Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertiary structure. J. Biol. Chem., 262(20), 9908–9913.


Davies K.J., Delsignore M.E., Lin S.W. 1987a. Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids. J. Biol. Chem., 262(20), 9902–9907.

Davies K.J., Lin S.W., Pacifici R.E. 1987b. Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein. J. Biol. Chem., 262(20), 9914–9920.

De Filippo C., Cavalieri D., Di Paola M., Ramazzotti M., Poullet J.B., Massart S., Collini S., Pieraccini G., Lionetti P. 2011. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(33), 14691–14696.

Del Rio D., Rodriguez-Mateos A., Spencer J.P.E., Tognolini M., Borges G., Crozier A. 2013. Dietary (poly)phenolics in human health: structures, bioavailability, and evidence of protective effects against chronic diseases. Antioxid. Redox Signal., 18(14), 1818–1892.

De Oliveira S., Alves de Souza G., Rodriguez Eckert C., Alves Silva T., Silva Sobral E., Aparecida Fávero O., Pena Ferreira M.J., Romoff P., Baader W.J. 2014. Evaluation of antiradical assays used in determining the antioxidant capacity of pure compounds and plant extracts. Quim. Nova, 37(3), 497–503.

de Souza V.R., Pereira P.A., da Silva T.L., de Oliveira Lima L.C., Pio R., Queiroz F. 2014. Determination of the bioactive compounds, antioxidant activity and chemical composition of Brazilian blackberry, red raspberry, strawberry, blueberry and sweet cherry fruits. Food Chem., 156, 362–368.

Dicksved J. 2008. Exploring the human intestinal microbiome in health and disease. Praca doktorska. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala. Acta Universitatis Agriculturae Sueciae, 2008:30.

Di Majo D., Giammanco M., La Guardia M., Tripoli E., Giammanco S., Finotti E. 2005. Flavanones in Citrus fruit: structure–antioxidant activity relationships. Food Res. Int., 38, 1161–1166.

Dmowski P., Śmiechowaska M., Tesmar A. 2013.Właściwości przeciwutleniające herbaty jako czynnik kształtujący jej wartość zdrowotną. Probl. Hig. Epidemiol., 94(2), 309–312.

Dorman H.J., Deans S.G. 2000. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J. Appl. Microbiol., 88(2), 308–316.

Dostal A., Chassard C., Hilty F.M., Zimmermann M.B., Jaeggi T., Rossi S., Lacroix C. 2012. Iron depletion and repletion with ferrous sulfate or electrolytic iron modifies the composition and metabolic activity of the gut microbiota in rats. J. Nutr., 142, 277–277.

Droebner K., Ehrhardt C., Poetter A., Ludwig S., Planz O. 2007. CYSTUS052, a poly-phenol-rich plant extract, exerts anti-influenza virus activity in mice. Antiviral Res., 76(1), 1–10.

Dröge W. 2002. Free radicals in the physiological control. Physiol. Rev., 82(1), 47–95. Duda-Chodak A. 2007. Rola przeciwutleniaczy w mechanizmach obronnych organizmu

przed stresem antyoksydacyjnym. [W:] Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowot-ne, technologiczne, molekularne i analityczne. Red. W. Grajek. WNT, Warszawa, 245– –261.

Literatura 171

Duda-Chodak A., Tarko T., Rus M. 2011. Antioxidant activity and total polyphenol content of selected herbal medicinal products used in Poland. Herba Pol., 57(1), 48–61.

Duda-Chodak A., Tarko T., Sroka P., Satora P. 2008. Antioxidant activity of different kinds of commercially available teas – diversity and changes during storage. EJPAU, 11(4), # 7 (http://www.ejpau.media.pl/volume11/issue4/art-07.html).

Duda-Chodak A., Wojdyło A. 2007. Charakterystyka chemiczna związków polifenolowych. [W:] Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. Red. W. Grajek. WNT, Warszawa, 141–151.

Elizabeth S.B., Murugesan K. 2012. Evaluation of antioxidant potential of Morinda citrifo-lia L. root extract. Int. Res. J. Pharmac., 2(4), 106–111.

Esrefoglu M. 2012. Experimental and clinical evidence of antioxidant therapy in acute pan-creatitis. World J. Gastroenterol., 18(39), 5533–5541.

Fanaro S., Chierici R., Guerrini P., Vigi V. 2003. Intestinal microflora in early infancy: composition and development. Acta. Paediatr. Suppl., 91(441), 48–55.

Fernandez M.T., Mira M.L., Florêncio M.H., Jennings K.R. 2002. Iron and copper chelation by flavonoids: an electrospray mass spectrometry study. J. Inorg. Biochem., 92(2), 105–111.

Figueiredo A.R., Campos F., de Freitas V., Hogg T., Couto J.A. 2008. Effect of phenolic aldehydes and flavonoids on growth and inactivation of Oenococcus oeni and Lactobacillus hilgardii. Food Microbiol., 25(1), 105–112.

Finkel T. 2011. Signal transduction by reactive oxygen species. J. Cell Biol., 194(1), 7–15. Fiorentino A., D’Abrosca B., Pacifico S., Golino A., Mastellone C., Oriano P., Monaco P.

2007. Reactive oxygen species scavenging activity of flavone glycosides from Melilotus neapolitana. Molecules, 12(2), 263–270.

Fox J.T., Drouillard J.S., Shi X., Nagaraja T.G. 2009. Effects of mucin and its carbohydrate constituents on Escherichia coli O157 growth in batch culture fermentations with ruminal or fecal microbial inoculum. J. Anim. Sci., 87(4), 1304–1313.

Friedman M., Henika P.R., Mandrell R.E. 2003. Antibacterial activities of phenolic benz-aldehydes and benzoic acids against Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria mono-cytogenes, and Salmonella enterica. J. Food Prot., 66(10), 1811–1821.

Friedman M., Levin C.E., Lee S.U., Kozukue N. 2009. Stability of green tea catechins in commercial tea leaves during storage for 6 months. J. Food Sci., 74(2), H47–H51.

Gadkari P.V., Balaraman M. 2014. Catechins: sources, extraction and encapsulation: a review. Food Bioprod. Process (w druku; http://dx.doi.org/10.1016/j.fbp.2013.12.004).

Galati G., Sabzevari O., Wilson J.X., O’Brien P.J. 2002. Prooxidant activity and cellular effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics. Toxicology, 177(1), 91–104.

Galleano M., Verstraeten S.V., Oteiza P.I., Fraga C.G. 2010. Antioxidant actions of flavo-noids: thermodynamic and kinetic analysis. Arch. Biochem. Biophys., 501(1), 23–30.

Gan L., Zhang S. 2002. Effects of Lycium barbarum polysaccharide on cytokine expression in human monocytes. Acta Nutr. Sin., 24, 67–69.


Garg A., Garg S., Zaneveld L.J., Singla A.K. 2001. Chemistry and pharmacology of the Citrus bioflavonoid hesperidin. Phytother. Res., 15(8), 655–669.

Gattuso G., Barreca D., Gargiulli C., Leuzzi U., Caristi C. 2007. Flavonoid composition of Citrus juices. Molecules, 12(8), 1641–1673.

Gennaro L., Leonardi C., Esposito F., Salucci M., Maiani G., Quaglia G., Fogliano V. 2002. Flavonoid and carbohydrate contents in Tropea red onions: effects of homelike peeling and storage. J. Agric. Food Chem., 50(7), 1904–1910.

Gomez-Pinilla F., Nguyen T.T. 2012. Natural mood foods: the actions of polyphenols against psychiatric and cognitive disorders. Nutr. Neurosci., 15(3), 127–133.

Gonthier M.P., Verny M.A., Besson C., Rémésy C., Scalbert A. 2003. Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats. J. Nutr., 133(6), 1853–1859.

Gorinstein S., Martín-Belloso O., Park Y.S., Haruenkit R., Lojek A., Ĉíž M., Caspi A., Libman I., Trakhtenberg S. 2001. Comparison of some biochemical characteristics of different citrus fruits. Food Chem., 74, 309–315.

Grahame T.J., Schlesinger R.B. 2012. Oxidative stress-induced telomeric erosion as a mech-anism underlying airborne particulate matter-related cardiovascular disease. Part. Fibre Toxicol., 9, 21.

Gramza A., Korczak J., Amarowicz R. 2005. Tea polyphenols – their antioxidant properties and biological activity – a review. Pol. J. Food. Nutr. Sci., 14/55(3), 219–235.

Grieger J.A., Wood L.G., Clifton V.L. 2013. Improving asthma during pregnancy with di-etary antioxidants: the current evidence. Nutrients, 5(8), 3212–3234.

Grune T., Reinheckel T., Davies K.J. 1997. Degradation of oxidized proteins in mamma-lian cells. FASEB J., 11(7), 526–534.

Gupta R.K., Patel A.K. 2013. Do the health claims made for Morinda citrifolia (Noni) harmonize with current scientific knowledge and evaluation of its biological effects. Asian Pac. J. Cancer Prev., 14(8), 4495–4499.

Gutierrez J., Barry-Ryan C., Bourke P. 2008. The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. Int. J. Food Microbiol., 124(1), 91–97.

Guyot S., Vercauteren J., Cheynier V. 1996. Structural determination of colourless and yellow dimers resulting from (+)-catechin coupling catalysed by grape polyphenoloxidase. Phytochemistry, 42(5), 1279–1288.

Guzik T.J., Korbut R., Adamek-Guzik T. 2003. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J. Physiol. Pharmacol., 54(4), 469–487.

Gyawali R., Ibrahim S.A. 2014. Natural products as antimicrobial agents. Food Contr., 46, 412–429.

Hakansson A., Molin G. 2011. Gut microbiota and inflammation. Nutrients, 3(6), 637–682. Hämäläinen M., Nieminen R., Vuorela P., Heinonen M., Moilanen E. 2007. Anti-

inflammatory effects of flavonoids: genistein, kaempferol, quercetin, and daidzein in-

Literatura 173

hibit STAT-1 and NF-κB activations, whereas flavone, isorhamnetin, naringenin, and pelargonidin inhibit only NF-κB activation along with their inhibitory effect on iNOS expression and NO production in activated macrophages. Mediat. Inflamm., ID 45673 (doi:10.1155/2007/45673).

Hancke J.L., Burgos R.A., Ahumada F. 1999. Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Fitoterapia, 70, 451–471.

Haratifar S., Corredig M. 2014. Interactions between tea catechins and casein micelles and their impact on renneting functionality. Food Chem., 143, 27–32.

Harris E.D. 1992. Regulation of antioxidant enzymes. FASEB J., 6, 2675–2683. Hayashi H., Takahashi R., Nishi T., Sakamoto M., Benno Y. 2005. Molecular analysis of

jejunal, ileal, caecal and recto-sigmoidal human colonic microbiota using 16S rRNA gene libraries and terminal restriction fragment length polymorphism. J. Med. Microbiol., 54, 1093–1101.

He N., Yang X., Jiao Y., Tian L., Zhao Y. 2012. Characterisation of antioxidant and anti-proliferative acidic polysaccharides from Chinese wolfberry fruits (goji). Food Chem., 133, 978–989.

Hehemann J.H., Correc G., Barbeyron T., Helbert W., Czjzek M., Michel G. 2010. Transfer of carbohydrate-active enzymes from marine bacteria to Japanese gut microbiota. Nature, 464(7290), 908–912.

Henning S.M., Fajardo-Lira C., Lee H.W., Youssefian A.A., Go V.L., Heber D. 2003. Catechin content of 18 teas and a green tea extract supplement correlates with the an-tioxidant capacity. Nutr. Cancer., 45(2), 226–235.

Henning S.M., Wang P., Heber D. 2011. Chemopreventive effects of tea in prostate cancer: green tea versus black tea. Mol. Nutr. Food Res., 55(6), 905–920.

Herrera C.L., Alvear M., Barrientos L., Montenegro G., Salazar L.A. 2010. The antifun-gal effect of six commercial extracts of Chilean propolis on Candida spp. Cien. Inv. Agr., 37(1), 75–84.

Hervert-Hernández D., Goñi I. 2011. Dietary polyphenols and human gut microbiota: a review. Food Rev. Int., 27(2), 154–169.

Ho P.C., Saville D.J., Wanwimolruk S. 2001. Inhibition of human CYP3A4 activity by grapefruit flavonoids, furanocoumarins and related compounds. J. Pharm. Pharm. Sci., 4(3), 217–227.

Hodgson J.M. 2008. Tea flavonoids and cardiovascular disease. Asia Pac. J. Clin. Nutr., 17(S1), 288–290.

Howell A.B., Reed J.D., Krueger C.G., Winterbottom R., Cunningham D.G., Leahy M. 2005. A-type cranberry proanthocyanidins and uropathogenic bacterial anti-adhesion activity. Phytochemistry, 66(18), 2281–2291.

Ingram L.O. 1976. Adaptation of membrane lipids to alcohols. J. Bacteriol., 125(2), 670–678. Ingram L.O. 1986. Microbial tolerance to alcohols: the role of the cell membrane. Trends

Biotechnol., 4, 2, 40–44.


Ionică M.E., Nour V., Trandafir I. 2012. Polyphenols content and antioxidant capacity of goji fruits (Lycium chinense) as affected by the extraction solvents. South West. J. Hort. Biol. Environ., 3(2), 121–129.

Ip S.P., Mak D.H.F., Li P.C., Poon M.K.T., Ko K.M. 1996. Effect of a lignan-enriched extract of Schisandra chinensis on aflatoxin B1 and cadmium chloride-induced hepato-toxicity in rats. Pharmacol. Toxicol., 78(6), 413–416.

Ismail N.A., Ragab S.H., ElBaky A.A., Shoeib A.R.S., Alhosary Y., Fekry D. 2011. Frequency of Firmicutes and Bacteroidetes in gut microbiota in obese and normal weight Egyptian children and adults. Arch. Med. Sci., 7(3), 501–507.

Ivanišová E., Fikselová M., Vietoris V., Mellen M. 2009. Antioxidant effects of herbal extracts and their food application. Potravinárstvo, 4, 34–37.

Iverson I. 1999. In vivo studies on butylated hydroxyanisole. Food Chem. Toxicol., 37, 993–997. Jeffery I.B., O’Toole P.W. 2013. Diet–microbiota interactions and their implications for

healthy living. Nutrients, 5(1), 234–252. Jeong E.M., Liu M., Sturdy M., Gao G., Varghese S.T., Sovari A.A., Dudley S.C. Jr. 2012.

Metabolic stress, reactive oxygen species, and arrhythmia. J. Mol. Cell. Cardiol., 52(2), 454–463.

Jin M., Huang Q., Zhao K., Shang P. 2013. Biological activities and potential health ben-efit effects of polysaccharides isolated from Lycium barbarum L. Int. J. Biol. Macromol., 54, 16–23.

Karegoudar T.B., Kim C.K. 2000. Microbial degradation of monohydroxybenzoic acids. J. Microbiol., 38(2), 53–61.

Karori S.M., Wachira F.N., Wanyoko J.K., Ngure R.M. 2007. Antioxidant capacity of dif-ferent types of tea products. Afr. J. Biotechnol., 6(19), 2287–2296.

Kelebek H. 2010. Sugars, organic acids, phenolic compositions and antioxidant activity of grapefruit (Citrus paradisi) cultivars grown in Turkey. Ind. Crops Prod., 32, 269–274.

Khan M.K., Zill-E-Huma, Dangles O. 2014. A comprehensive review on flavanones, the major citrus. J. Food Comp. Anal., 33, 85–104.

Kim H.M., Lee E.H., Cho H.H., Moon Y.H. 1998. Inhibitory effect of mast cell-mediated immediate-type allergic reactions in rats by Spirulina. Biochem. Pharmacol., 55, 1071–1076.

Kirakosyan A., Seymour E.M., Noon K.R., Urcuyo Llanes D.E., Kaufman P.B., Warber S.L., Bolling S.F. 2010. Interactions of antioxidants isolated from tart cherry (Prunus cerasus) fruits. Food Chem., 122, 78–83.

Kizhakekuttu T.J., Widlansky M.E. 2010. Natural antioxidants and hypertension: promise and challenges. Cardiovasc. Ther., 28(4), e20–e32.

Kloner R.A., Przyklenk K., Whittaker P. 1989. Deleterious effects of oxygen radicals in ischemia/reperfusion. Resolved and unresolved issues. Circulation, 80(5), 1115–1127.

Kopit L.M., Kim E.B., Siezen R.J., Harris L.J., Marco M.L. 2014. Safety of the surrogate microorganism Enterococcus faecium NRRL B-2354 for use in thermal process valida-tion. Appl. Environ. Microbiol., 80(6), 1899–1909.

Literatura 175

Krumholz L.R., Crawford R.L., Hemling M.E., Bryant M.P. 1987. Metabolism of gallate and phloroglucinol in Eubacterium oxidoreducens via 3-hydroxy-5-oxohexanoate. J. Bacteriol., 169(5), 1886–1890.

Kvietys P.R., Granger D.N. 2012. Role of reactive oxygen and nitrogen species in the vas-cular responses to inflammation. Free Radic. Biol. Med., 52(3), 556–592.

Labbe D., Tremblay A., Bazinet L. 2006. Effect of brewing temperature and duration on green tea catechin solubilization: basis for production of EGC and EGCG-enriched fractions. Separ. Purif. Technol., 49, 1–9.

Lal D., Gardner J.J. 2012. Production, characterization and purification of tannase from Aspergillus niger. Eur. J. Exp. Biol., 2(5), 1430–1438.

Lamer-Zarawska E. 2002. Cytryniec chiński – wartościowa roślina lecznicza. Wiad. Ziel., 2, 18–19.

Lanzotti V. 2006. The analysis of onion and garlic. J. Chromatogr., A, 1112(1–2), 3–22. Larrosa M., García-Conesa M.T., Espín J.C., Tomás-Barberán F.A. 2010. Ellagitannins,

ellagic acid and vascular health. Mol. Aspects Med., 31(6), 513–539. Le Bourvellec C., Renard C.M.G.C. 2012. Interactions between polyphenols and macro-

molecules: quantification methods and mechanisms. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 52(3), 213–248.

Lee J., Finn C.E. 2007. Anthocyanins and other polyphenolics in American elderberry (Sambucus canadensis) and European elderberry (S. nigra) cultivars. J. Sci. Food Agric., 87(14), 2665–2675.

Lee L.S., Kim S.H., Kim Y.B., Kim Y.C. 2014. Quantitative analysis of major constituents in green tea with different plucking periods and their antioxidant activity. Molecules, 19(7), 9173–9186.

Lee M., Hyun D., Jenner P., Halliwell B. 2001. Effect of overexpression of wild-type and mutant Cu/Zn-superoxide dismutases on oxidative damage and antioxidant defences: relevance to Down’s syndrome and familial amyotrophic lateral sclerosis. J. Neurochem., 76(4), 957–965.

Lee M.H., Kwon H.A., Kwon D.Y., Park H., Sohn D.H., Kim Y.C., Eo S.K., Kang H.Y., Kim S.W., Lee J.H. 2006. Antibacterial activity of medicinal herb extracts against Salmonella. Int. J. Food Microbiol., 111(3), 270–275.

Leuner K., Schütt T., Kurz C., Eckert S.H., Schiller C., Occhipinti A., Mai S., Jendrach M., Eckert G.P., Kruse S.E., Palmiter R.D., Brandt U., Dröse S., Wittig I., Willem M., Haass C., Reichert A.S., Müller W.E. 2012. Mitochondrion-derived reactive oxygen species lead to enhanced amyloid beta formation. Antioxid. Redox Signal., 16(12), 1421– –1433.

Levitan I., Volkov S., Subbaiah P.V. 2010. Oxidized LDL: diversity, patterns of recognition, and pathophysiology. Antioxid. Redox Signal., 13(1), 39–75.

Lewis D.F.V., Wiseman A. 2005. A selective review of bacterial forms of cytochrome P450 enzymes. Enzyme Microb. Technol., 36, 377–384.


Ley R.E., Turnbaugh P.J., Klein S., Gordon J.I. 2006. Microbial ecology: human gut mi-crobes associated with obesity. Nature, 444(7122), 1022–1023.

Li J., Zhang C., Xu X., Wang J., Yu H., Lai R., Gong W. 2007. Trypsin inhibitory loop is an excellent lead structure to design serine protease inhibitors and antimicrobial peptides. FASEB J., 21, 2466–2473.

Lin C.L., Wang C.C., Chang S.C., Inbaraj B.S., Chen B.H. 2009. Antioxidative activity of polysaccharide fractions isolated from Lycium barbarum Linnaeus. Int. J. Biol. Macromol., 45(2), 146–151.

Lin K.H., Yang Y.Y., Yang C.M., Huang M.Y., Lo H.F., Liu K.C., Lin H.S., Chao P.Y. 2013. Antioxidant activity of herbaceous plant extracts protect against hydrogen peroxide- -induced DNA damage in human lymphocytes. BMC Res. Notes, 6, 490.

Liou G.Y., Storz P. 2010. Reactive oxygen species in cancer. Free Radic. Res., 44(5), 479–496. Liu S., Qureshi N. 2009. How microbes tolerate ethanol and butanol. New Biotechnol.,

26(3-4), 117–121. Longo G., Karan M., Sharma P.D., Rakesh D.D., Vyas S., Vasisht K. 2008. Quantitative

analysis of green tea polyphenols in Indian cultivars. [W:] Economic crisis in tea industry. Red. N.K. Jain, F. Rahman, P. Baker. Studium Press, Houston, 275–282.

Lu X., Wang J., Al-Qadiri H.M., Ross C.F., Powers J.R., Tang J., Rasco B.A. 2011. Determination of total phenolic content and antioxidant capacity of onion (Allium cepa) and shallot (Allium oschaninii) using infrared spectroscopy. Food Chem., 129, 637–644.

Luo Q., Cai Y., Yan J., Sun M., Corke H. 2004. Hypoglycemic and hypolipidemic effects and antioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum. Life Sci., 76(2), 137– –149.

Łomnicki A. 2013. Wprowadzenie do statystyki dla przyrodników. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa.

Määttä-Riihinen K.R., Kamal-Eldin A., Mattila P.H., González-Paramás A.M., Törrönen A.R. 2004. Distribution and contents of phenolic compounds in eighteen Scandinavian berry species. J. Agric. Food Chem., 52(14), 4477–4486.

Maiese K., Morhan S.D., Chong Z.Z. 2007. Oxidative stress biology and cell injury during type 1 and type 2 diabetes mellitus. Curr. Neurovasc. Res., 4(1), 63–71.

Mandalari G., Bennett R.N., Bisignano G., Trombetta D., Saija A., Faulds C.B., Gasson M.J., Narbad A. 2007. Antimicrobial activity of flavonoids extracted from ber-gamot (Citrus bergamia Risso) peel, a byproduct of the essential oil industry. J. Appl. Microbiol., 103(6), 2056–2064.

Mane C., Loonis M., Juhel C., Dufour C., Malien-Aubert C. 2011. Food grade lingon-berry extract: polyphenolic composition and in vivo protective effect against oxidative stress. J. Agric. Food Chem., 59(7), 3330–3339.

Margaret B.S., Heath J.R., Krywolap G.N. 1990. Pathogenic potential of Eubacterium yurii subspecies. J. Med. Microbiol., 31(2), 103–108.

Literatura 177

Martins Mdo R., Arantes S., Candeias F., Tinoco M.T., Cruz-Morais J. 2014. Antioxidant, antimicrobial and toxicological properties of Schinus molle L. essential oils. J. Ethno-pharmacol., 151(1), 485–492.

Materska M. 2008. Quercetin and its derivatives: chemical structure and bioactivity – a review. Pol. J. Food Nutr. Sci., 58(4), 407–413.

Mathew B., Sankaranarayanan R., Nair P.P., Varghese C., Somanathan T., Amma B.P., Amma N.S., Nair M.K. 1995. Evaluation of chemoprevention of oral cancer with Spirulina fusiformis. Nutr. Cancer, 24, 197–202.

Matsumoto H., Nakamura Y., Tachibanaki S., Kawamura S., Hirayama M. 2003. Stimulatory effect of cyanidin 3-glycosides on the regeneration of rhodopsin. J. Agric. Food Chem., 51(12), 3560–3563.

Maxwell S.R., Lip G.Y. 1997. Free radicals and antioxidants in cardiovascular disease. Br. J. Clin. Pharmacol., 44(4), 307–317.

Mazur S.P., Nes A., Wold A.B., Remberg S.F., Aaby K. 2014. Quality and chemical com-position of ten red raspberry (Rubus idaeus L.) genotypes during three harvest seasons. Food Chem., 160, 233–240.

Mazzola P.G., Jozala A.F., de Lencastre Novales L.C., Moriel P., Vessoni Penna T.C. 2009. Minimal inhibitory concentration (MIC) determination of disinfectant and/or sterilizing agents. Braz. J. Pharm. Sci., 45(2), 241–248.

McDougall G.J., Kulkarni N.N., Stewart D. 2009. Berry polyphenols inhibit pancreatic lipase activity in vitro. Food Chem., 115, 193–199.

McNeil J.D., Wiebkin O.W., Betts W.H., Cleland L.G. 1985. Depolymerisation products of hyaluronic acid after exposure to oxygen-derived free radicals. Ann. Rheum. Dis., 44(11), 780–789.

Mehta M., Muddapur U.M., Priya V.G. 2013. Fungal production of tannase. A review. Int. J. Sci. Eng. Technol., 2(8), 752–755.

Meydani M., Hasan S.T. 2010. Dietary polyphenols and obesity. Nutrients, 2(7), 737–751. Mihaylova D.S., Lante A., Tinello F., Krastanov A.I. 2014. Study on the antioxidant and

antimicrobial activities of Allium ursinum L. pressurised-liquid extract. Nat. Prod. Res. (w druku; doi: 10.1080/14786419.2014.923422).

Mika M., Wikiera A., Żyła K. 2009. Effects of thermally modified green tea catechins on the oxidative and hydrolytic stability of butter. Health, 1(3), 192–196.

Miller A.A., De Silva T.M., Drummond G.R., Sobey C.G., Chrissobolis S. 2014. Reactive oxygen species and cerebrovascular disease. [W:] Systems biology of free radicals and antioxidants. Red. I. Laher. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1895–1924.

Mittman P. 1990. Randomized, double-blind study of freeze-dried Urtica dioica in the treat-ment of allergic rhinitis. Planta Med., 56, 44–47.

Moch R.W. 1986. Pathology of BHA- and BHT-induced lesions. Food Chem. Toxicol., 24(10– –11), 1167–1169.

Moon Y.J., Wang X., Morris M.E. 2006. Dietary flavonoids: effects on xenobiotic and car-cinogen metabolism. Toxicol. In Vitro, 20, 187–210.


Mosqueda-Melgar J., Raybaudi-Massilia R.M., Martín-Belloso O. 2008. Combination of high-intensity pulsed electric fields with natural antimicrobials to inactivate pathogenic microorganisms and extend the shelf-life of melon and watermelon juices. Food Microbiol., 25(3), 479–491.

Muchová J., Zitňanová I., Duračková Z. 2014. Oxidative stress and Down syndrome. Do antioxidants play a role in therapy? Physiol. Res., 63(5), 535–542 (http://www.biomed.cas.cz/physiolres/pdf/prepress/932722.pdf).

Mulder T.P., Rietveld A.G., van Amelsvoort J.M. 2005. Consumption of both black tea and green tea results in an increase in the excretion of hippuric acid into urine. Am. J. Clin. Nutr., 81(1 Suppl), 256S–260S.

Narumi K., Sonoda J., Shiotani K., Shigeru M., Shibata M., Kawachi A., Tomishige E., Sato K., Motoya T. 2014. Simultaneous detection of green tea catechins and gallic acid in human serum after ingestion of green tea tablets using ion-pair high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr., B, Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 945–946, 147–153.

Niki E. 2011. Do free radicals play causal role in atherosclerosis? Low density lipoprotein oxidation and vitamin E revisited. J. Clin. Biochem. Nutr., 48(1), 3–7.

Niki E., Yoshida Y., Saito Y., Noguchi N. 2005. Lipid peroxidation: mechanisms, inhibition, and biological effects. Biochem. Biophys. Res. Commun., 338(1), 668–676.

Nile S.H., Park S.W. 2014. Edible berries: bioactive components and their effect on human health. Nutrition, 30(2), 134–144.

Nogata Y., Sakamoto K., Shiratsuchi H., Ishii T., Yano M., Ohta H. 2006. Flavonoid composition of fruit tissues of citrus species. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(1), 178– –192.

Nohynek L.J., Alakomi H.L., Kähkönen M.P., Heinonen M., Helander I.M., Oksman- -Caldentey K.M., Puupponen-Pimiä R.H. 2006. Berry phenolics: antimicrobial proper-ties and mechanisms of action against severe human pathogens. Nutr. Cancer., 54(1), 18–32.

Ogawa J., Kishino S., Ando A., Sugimoto S., Mihara K., Shimizu S. 2005. Production of conjugated fatty acids by lactic acid bacteria. J. Biosci. Bioeng., 100(4), 355–364.

Okunieff P., Swarts S., Keng P., Sun W., Wang W., Kim J., Yang S., Zhang H., Liu C., Williams J.P., Huser A.K., Zhang L. 2008. Antioxidants reduce consequences of ra-diation exposure. Adv. Exp. Med. Biol., 614, 165–178.

Olinski R., Gackowski D., Foksinski M., Rozalski R., Roszkowski K., Jaruga P. 2002. Oxidative DNA damage: assessment of the role in carcinogenesis, atherosclerosis, and acquired immunodeficiency syndrome. Free Radic. Biol. Med., 33(2), 192–200.

Omar S.H., Al-Wabel N.A. 2010. Organosulfur compounds and possible mechanism of garlic in cancer. Saudi Pharm. J., 18(1), 51–58.

Oomah B.D., Ladet S., Godfrey D.V., Liang J., Girard B. 2000. Characteristics of rasp-berry (Rubus idaeus L.) seed oil. Food Chem., 69, 187–193.

Literatura 179

Othman S.F.C., Idid S.Z., Koya M.S., Rehan A.M., Kamarudin K.R. 2011. Antioxidant study of garlic and red onion: a comparative study. Pertanika J. Trop. Agric. Sci., 34(2), 253–261.

Ovesná Z., Horváthová-Kozics K. 2005. Structure–activity relationship of trans-resveratrol and its analogues. Neoplasma, 52(6), 450–455.

Paiva P.M.G., Pontual E.V., Coelho L.C.B.B., Napoleão T.H. 2013. Protease inhibitors from plants: biotechnological insights with emphasis on their effects on microbial pathogens. [W:] Microbial pathogens and strategies for combating them: science, tech-nology and education. Red. A. Méndez-Vilas. Formatex Research Center, Badajoz, 641–649.

Pal S., Ghosh D., Dey S.K., Saha C. 2013. Effect of infusion time and consecutive brewing on antioxidant status of black tea infusion. Int. J. Tea Sci., 9(SI 2–3), 65–68.

Palipoch S. 2013.A review of oxidative stress in acute kidney injury: protective role of me-dicinal plants-derived antioxidants. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med., 10(4), 88–93.

Pandey K.B., Rizvi S.I. 2009. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxid. Med. Cell Longev., 2(5), 270–278.

Panesar P.S., Marwaha S.S., Kennedy J.F. 2007. Comparison of ethanol and temperature tolerance of Zymomonas mobilis strain in glucose and molasses medium. Indian J. Biotechnol., 6, 74–77.

Pantelidis G.E., Vasilakakis M., Manganaris G.A., Diamantidis G.R. 2007. Antioxidant capacity, phenol, anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries, blackberries, red currants, gooseberries and Cornelian cherries. Food Chem., 102, 777–783.

Pawlus A.D., Kinghorn D.A. 2007. Review of the ethnobotany, chemistry, biological activ-ity and safety of the botanical dietary supplement Morinda citrifolia (noni). J. Pharm. Pharmacol., 59(12), 1587–1609.

Peleg H., Naim M., Rouseff R.L., Zehavi U. 1991. Distribution of bound and free pheno-lic acids in oranges (Citrus sinensis) and grapefruits (Citrus paradisi). J. Sci. Food Agric., 57, 417–426.

Penders J., Thijs C., Vink C., Stelma F.F., Snijders B., Kummeling I., van den Brandt P.A., Stobberingh E.E. 2006. Factors influencing the composition of the intestinal microbio-ta in early infancy. Pediatrics, 118(2), 511–521.

Peng X.D., Xiu D.Q., Peng J.Z., Liu C.H. 2002. Effects of Lycium barbarum polysaccha-ride on hippocampal activity in animals. J. Ningxia Medical College, 24, 79–81.

Peng X.M., Huang L.J., Qi C.H., Zhang Y.X., Tian G.Y. 2001. Studies on chemistry and immunomodulating mechanism of a glycoconjugate from Lycium barbarum L. Chin. J. Chem., 19, 1990–1997.

Percário S., Moreira D.R., Gomes B.A., Ferreira M.E., Gonçalves A.C., Laurindo P.S., Vilhena T.C., Dolabela M.F., Green M.D. 2012. Oxidative stress in malaria. Int. J. Mol. Sci., 13(12), 16346–16372.


Peterson J., Dwyer J., Bhagwat S., Haytowitz D., Holden J., Eldridge A.L., Beecher G., Aladesanmi J. 2005. Major flavonoids in dry tea. J. Food Compos. Anal., 18, 487–501.

Pieszak M., Mikołajczak P.Ł. 2010. Właściwości lecznicze pokrzywy zwyczajnej (Urtica dioica L.). Post. Fitoter., 4, 199–204.

Poljsak B., Šuput D., Milisav I. 2013. Achieving the balance between ROS and antioxidants: when to use the synthetic antioxidants. Oxid. Med. Cell Longev., ID 956792 (doi: 10.1155/2013/956792).

Ponce A.G., Roura S.I., del Valle C.E., Moreira M.R. 2008. Antimicrobial and antioxidant activities of edible coatings enriched with natural plant extracts: in vitro and in vivo stud-ies. Postharv. Biol. Technol., 49, 294–300.

Possemiers S., Bolca S., Verstraete W., Heyerick A. 2011. The intestinal microbiome: a separate organ inside the body with the metabolic potential to influence the bioactiv-ity of botanicals. Fitoterapia, 82, 53–66.

Potterat O. 2010. Goji (Lycium barbarum and L. chinense): phytochemistry, pharmacology and safety in the perspective of traditional uses and recent popularity. Planta Med., 76, 7–19.

Potterat O., Hamburger M. 2007. Morinda citrifolia (Noni) fruit – phytochemistry, pharma-cology, safety. Planta Med., 73(3), 191–199.

Prakash D., Singh B.N., Upadhyay G. 2007. Antioxidant and free radical scavenging ac-tivities of phenols from onion (Allium cepa). Food Chem., 102, 1389–1393.

Premkumar K., Pachiappan A., Abraham S.K., Santhiya S.T., Gopinath P.M., Ramesh A. 2001. Effect of Spirulina fusiformis on cyclophosphamide and mitomycin-C induced genotoxicity and oxidative stress in mice. Fitoterapia, 72, 906–911.

Proestos C., Boziaris I.S., Kapsokefalou M., Komaitis M. 2008. Natural antioxidant con-stituents from selected aromatic plants and their antimicrobial activity against selected pathogenic microorganisms. Food Technol. Biotechnol., 46(2), 151–156.

Qian J.Y., Liu D., Huang A.G. 2004. The efficiency of flavonoids in polar extracts of Lycium chinense Mill. fruits as free radical scavenger. Food Chem., 87, 283–288.

Radha Krishnan K., Babuskin S., Azhagu Saravana Babu P., Sasikala M., Sabina K., Archana G., Sivarajan M., Sukumar M. 2014. Antimicrobial and antioxidant effects of spice extracts on the shelf life extension of raw chicken meat. Int. J. Food Microbiol., 171, 32–40.

Rahbar M., Diba K. 2010. In vitro activity of cranberry extract against etiological agents of urinary tract infections. Afr. J. Pharm. Pharmacol., 4(5), 286–288.

Rahman K. 2001. Historical perspective on garlic and cardiovascular disease. J. Nutr., 131(3 Suppl.), 977S–979S.

Randall C., Meethan K., Randall H., Dobbs F. 1999. Nettle sting of Urtica dioica for joint pain – an exploratory study of this complementary therapy. Complement. Ther. Med., 7(3), 126–131.

Raz R., Chazan B., Dan M. 2009. Cranberry juice and urinary tract infection. Clin. Inf. Dis., 38, 1413–1419.

Literatura 181

Reuter H.D. 1995. Allium sativum and Allium ursinum. Part 2. Pharmacology and medicinal application. Phytomedicine, 2(1), 73–91.

Rhodes M.J., Price K.R. 1996. Analytical problems in the study of flavonoid compounds in onions. Food Chem., 57(1), 113–117.

Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. 1996. Structure–antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic. Biol. Med., 20(7), 933–956.

Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. 1997. Antioxidant properties of phenolic com-pounds. Trends Plant Sci., 4(2), 152–159.

Ríos-Arrabal S., Artacho-Cordón F., León J., Román-Marinetto E., Del Mar Salinas- -Asensio M., Calvente I., Núñez M.I. 2013. Involvement of free radicals in breast can-cer. SpringerPlus, 2, 404 (doi:10.1186/2193-1801-2-404).

Robards K., Prenzler P.D., Tucker G., Swatsitang P., Glover W. 1999. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chem., 69, 401–436.

Rodríguez Vaquero M.J., Aredes Fernández P.A., Manca de Nadra M.C., Strasser de Saad A.M. 2010. Phenolic compound combinations on Escherichia coli viability in a meat system. J. Agric. Food Chem., 58(10), 6048–6052.

Romay C., Armesto J., Remirez D., González R., Ledon N., García I. 1998. Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-phycocyanin from blue-green algae. Inflamm. Res., 47, 36–41.

Ross S.A., Ziska D.S., Zhao K., ElSohly M.A. 2000. Variance of common flavonoids by brand of grapefruit juice. Fitoterapia, 71(2), 154–161.

Rusaczonek A., Świderski F., Waszkiewicz-Robak B. 2010. Antioxidant properties of tea and herbal infusions – a short report. Pol. J. Food Nutr. Sci., 60(1), 33–35.

Saarela M., Lähteenmäki L., Crittenden R., Salminen S., Mattila-Sandholm T. 2002. Gut bacteria and health foods – the European perspective. Int. J. Food Microbiol., 78, 99–117.

Safarinejad M.R. 2005. Urtica dioica for treatment of benign prostatic hyperplasia: a pro-spective, randomized, double-blind, placebo-controlled, crossover study. J. Herb. Pharmacother., 5(4), 1–11.

Sakata H., Yoshioka H., Fujita K. 1985. Development of the intestinal flora in very low birth weight infants compared to normal full-term newborns. Eur. J. Pediatr., 144, 186– –190.

Sang S., Lee M.J., Hou Z., Ho C.T., Yang C.S. 2005. Stability of tea polyphenol (-)-epigal-locatechin-3-gallate and formation of dimers and epimers under common experimental conditions. J. Agric. Food Chem., 53(24), 9478–9484.

Sang S., Yang I., Buckley B., Ho C.T., Yang C.S. 2007. Autoxidative quinone formation in vitro and metabolite formation in vivo from tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate: studied by real-time mass spectrometry combined with tandem mass ion mapping. Free Radic. Biol. Med., 43(3), 362–371.

Sannella A.R., Messori L., Casini A., Vincieri F.F., Bilia A.R., Majori G., Severini C. 2007. Antimalarial properties of green tea. Biochem. Biophys. Res. Commun., 353(1), 177–181.


Sanz Y. 2010. Effects of a gluten-free diet on gut microbiota and immune function in healthy adult humans. Gut Microbes, 1(3), 135–137.

Schneider H., Blaut M. 2000. Anaerobic degradation of flavonoids by Eubacterium ramulus. Arch. Microbiol., 173(1), 71–75.

Schoefer L., Mohan R., Schwiertz A., Braune A., Blaut M. 2003. Anaerobic degradation of flavonoids by Clostridium orbiscindens. Appl. Environ. Microbiol., 69(10), 5849–5854.

Seguchi T., Tamura K., Shimada A., Sugimoto M., Kudoh H. 2012. Mechanism of anti-oxidant interaction on polymer oxidation by thermal and radiation ageing. Rad. Phys. Chem., 81, 1747–1751.

Sendl A. 1995. Allium sativum and Allium ursinum. Part 1. Chemistry, analysis, history, botany. Phytomedicine, 1(4), 323–339.

Senthilkumar V., Gunasekaran P. 2005. Bioethanol production from cellulosic substrates: engineered bacteria and process integration challenges. J. Sci. Ind. Res., 64, 845–853.

Setchell K.D., Clerici C. 2010a. Equol: history, chemistry, and formation. J. Nutr., 140(7), 1355S–1362S.

Setchell K.D., Clerici C. 2010b. Equol: pharmacokinetics and biological actions. J. Nutr., 140(7), 1363S–1368S.

Setchell K.D., Clerici C., Lephart E.D., Cole S.J., Heenan C., Castellani D., Wolfe B.E., Nechemias-Zimmer L., Brown N.M., Lund T.D., Handa R.J., Heubi J.E. 2005. S-equol, a potent ligand for estrogen receptor beta, is the exclusive enantiomeric form of the soy isoflavone metabolite produced by human intestinal bacterial flora. Am. J. Clin. Nutr., 81(5), 1072–1079.

Shakibaei M., Harikumar K.B., Aggarwal B.B. 2009. Resveratrol addiction: to die or not to die. Mol. Nutr. Food Res., 53, 115–128.

Shan B., Cai Y.Z., Brooks J.D., Corke H. 2007. The in vitro antibacterial activity of dietary spice and medicinal herb extracts. Int. J. Food Microbiol., 117(1), 112–119.

Shapiro H., Singer P., Halpern Z., Bruck R. 2007. Polyphenols in the treatment of inflam-matory bowel disease and acute pancreatitis. Gut, 56(3), 426–435.

Shrestha R., Lama J.P., Shrestha K. 2010. Total polyphenols content and antioxidant activ-ity of different tea commercially produced in Nepal. J. Food Sci. Technol. Nepal, 6, 73–79.

Sichel G., Corsaro C., Scalia M., Di Bilio A.J., Bonomo R.P. 1991. In vitro scavenger activity of some flavonoids and melanins against O2

–•. Free Radic. Biol. Med., 11(1), 1–8.

Siedlecka K., Bogusławski W. 2005. Sirtuiny — enzymy długowieczności? Gerontol. Pol., 13(3), 147–152.

Sies H. 1993. Strategies of antioxidant defense. Eur. J. Biochem., 215, 213–219. Simmering R., Pforte H., Jacobasch G., Blaut M. 2002. The growth of the flavonoid-de-

grading intestinal bacterium, Eubacterium ramulus, is stimulated by dietary flavonoids in vivo. FEMS Microbiol. Ecol., 40(3), 243–248.

Literatura 183

Singal A.K., Jampana S.C., Weinman S.A. 2011.Antioxidants as therapeutic agents for liver disease. Liver Int., 31(10), 1432–1448.

Singh B.N., Singh B.R., Singh R.L., Prakash D., Singh D.P., Sarma B.K., Upadhyay G., Singh H.B. 2009. Polyphenolics from various extracts/fractions of red onion (Allium cepa) peel with potent antioxidant and antimutagenic activities. Food Chem. Toxicol., 47(6), 1161–1167.

Singh D.R. 2012. Morinda citrifolia L. (Noni): a review of the scientific validation for its nutritional and therapeutic properties. J. Diabetes Endocrinol., 3(6), 77–91.

Smith M.G., Des Etages S.G., Snyder M. 2004. Microbial synergy via an ethanol-triggered pathway. Mol. Cell. Biol., 24(9), 3874–3884.

Song Y., Xu B. 2013. Diffusion profiles of health beneficial components from goji berry (Lycium barbarum) marinated in alcohol and their antioxidant capacities as affected by alcohol concentration and steeping time. Food, 2, 32–43.

Soylu E.M., Kurt S., Soylu S. 2010. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. Int. J. Food Microbiol., 143(3), 183–189.

Sperry J.F., Appleman M.D., Wilkins T.D. 1977. Requirement of heme for growth of Bacteroides fragilis. Appl. Environ. Microbiol., 34(4), 386–390.

Srinivasahan V., Dubairaj B. 2014. Antioxidant and free radical scavenging effect of Morinda citrifolia fruit extract. Int. J. Pharm. Pharm. Sci., 6(4), 55–59.

Stojković D., Petrović J., Soković M., Glamočlija J., Kukić-Marković J., Petrović S. 2013. In situ antioxidant and antimicrobial activities of naturally occurring caffeic acid, p-coumaric acid and rutin, using food systems. J. Sci. Food Agric., 93(13), 3205– –3208.

Street R., Száková J., Drábek O., Mládková L. 2006. The status of micronutrients (Cu, Fe, Mn, Zn) in tea and tea infusions in selected samples imported to the Czech Republic. Czech J. Food Sci., 24(2), 62–71.

Škerget M., Majhenič L., Bezjak M., Knez Ž. 2009. Antioxidant, radical scavenging and antimicrobial activities of red onion (Allium cepa L.) skin and edible part extracts. Chem. Biochem. Eng., Q., 23(4), 435–444.

Štajner D., Popović B.M., Čanadanović-Brunet J., Štajner M. 2008. Antioxidant and scavenger activities of Allium ursinum. Fitoterapia, 79, 303–305.

Tajkarimi M.M., Ibrahim S.A., Cliver D.O. 2010. Antimicrobial herb and spice compounds in food. Food Control, 21, 1199–1218.

Tarko T., Duda-Chodak A., Satora P., Sroka P., Pogoń P., Machalica J. 2014. Chaenomeles japonica, Cornus mas, Morus nigra fruits characteristics and their processing potential. J. Food Sci. Technol. Mys., 51(12), 3934–3941.

Tarko T., Duda-Chodak A., Satora P., Zając N. 2013. Antioxidant activity of goji berries and bilberry at particular digestion stages in an in vitro model simulating the human alimentary tract. Potravinárstvo, 7, 235–238.


Tarko T., Sroka P., Duda-Chodak A. 2007. Rodzaje aktywnych rodników i reaktywnych form tlenu. [W:] Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne. Red. W. Grajek. WNT, Warszawa, 15–33.

Tchirkov A., Lansdorp P.M. 2003. Role of oxidative stress in telomere shortening in cultured fibroblasts from normal individuals and patients with ataxia-telangiectasia. Hum. Mol. Genet., 12(3), 227–232.

Teke G.N., Elisée K.N., Roger K.J. 2013. Chemical composition, antimicrobial properties and toxicity evaluation of the essential oil of Cupressus lusitanica Mill. leaves from Cameroon. BMC Complement. Altern. Med., 13(1), 130.

Thurston B., Dawson K.A., Strobel H.J. 1994. Pentose utilization by the ruminal bacterium Ruminococcus albus. Appl. Environ. Microbiol., 60(4), 1087–1092.

Tripoli E., La Guardia M., Giammanco S., Di Majo D., Giammanco M. 2007. Citrus flavonoids: molecular structure, biological activity and nutritional properties: a review. Food Chem., 104, 466–479.

Turnbaugh P.J., Ridaura V.K., Faith J.J., Rey F.E., Knight R., Gordon J.I. 2009. The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice. Sci. Transl. Med., 1(6), 6–14.

Ultee A., Bennik M.H.J., Moezelaar R. 2002. The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol., 68(4), 1561–1568.

Vanamala J., Reddivari L., Yoo K.S., Pike L.M., Patil B.S. 2006. Variation in the content of bioactive flavonoids in different brands of orange and grapefruit juices. J. Food Compos. Anal., 19, 157–166.

Vlase L., Parvu M., Parvu E.A., Toiu A. 2013a. Chemical constituents of three Allium spe-cies from Romania. Molecules, 18, 114–127.

Vlase L., Parvu M., Parvu E.A., Toiu A. 2013b. Phytochemical analysis of Allium fistulo-sum L. and A. ursinum L. Dig. J. Nanomater. Biostruct., 8(1), 457–467.

Wang C.C., Chang S.C., Inbaraj B., Chen B.H. 2010. Isolation of carotenoids, flavonoids and polysaccharides from Lycium barbarum L. and evaluation of antioxidant activity. Food Chem., 120, 184–192.

Wang D., Lu J., Miao A., Xie Z., Yang D. 2008a. HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of polyphenols and purine alkaloids in leaves of 22 tea cultivars in China. J. Food Compos. Anal., 21, 361–369.

Wang H., Cao G., Prior R.L. 1997. The oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins. J. Agr. Food Chem., 45, 304–309.

Wang L., Tu Y.C., Lian T.W., Hung J.T., Yen J.H., Wu M.J. 2006. Distinctive antioxidant and antiinflammatory effects of flavonoids. J. Agric. Food Chem., 54(26), 9798–9804.

Wang R., Zhou W., Jiang X. 2008b. Reaction kinetics of degradation and epimerization of epigallocatechin gallate (EGCG) in aqueous system over a wide temperature range. J. Agric. Food Chem., 56(8), 2694–2701.

Literatura 185

Webster K.A. 2012. Mitochondrial membrane permeabilization and cell death during myocar-dial infarction: roles of calcium and reactive oxygen species. Future Cardiol., 8(6), 863–884.

Weerakkody N.S., Caffin N., Turner M.S., Dykes G.A. 2010. In vitro antimicrobial activ-ity of less-utilized spice and herb extracts against selected food-borne bacteria. Food Contr., 21, 1408–1414.

Wei Y., Xie Q., Dong W., Ito Y. 2009. Separation of epigallocatechin and flavonoids from Hypericum perforatum L. by high-speed counter-current chromatography and preparative high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr., A, 1216(19), 4313–4318.

Williams G.M., Iatropoulos M.J. 1996. Inhibition of the hepatocarcinogenicity of afla-toxin B in rats by low levels of the phenolic antioxidants butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene. Cancer Lett., 104, 49–53.

Williams R.J., Spencer J.P.E., Rice-Evans C. 2004. Flavonoids: antioxidants or signalling molecules? Free Rad. Biol. Med., 36(7), 838–849.

Wolin M.S. 2009. Reactive oxygen species and the control of vascular function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 296(3), H539–H549.

Wu G.D., Chen J., Hoffmann C., Bittinger K., Chen Y.Y., Keilbaugh S.A., Bewtra M., Knights D., Walters W.A., Knight R., Sinha R., Gilroy E., Gupta K., Baldassano R., Nessel L., Li H., Bushman F.D., Lewis J.D. 2011. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science, 334(6052), 105–108.

Wu T., Guan Y., Ye J. 2007. Determination of flavonoids and ascorbic acid in grapefruit peel and juice by capillary electrophoresis with electrochemical detection. Food Chem., 100, 1573–1579.

Wu X., Gu L., Prior R.L., McKay S. 2004. Characterization of anthocyanins and proantho-cyanidins in some cultivars of Ribes, Aronia, and Sambucus and their antioxidant capac-ity. J. Agric. Food Chem., 52(26), 7846–7856.

Xu S., Touyz R.M. 2006. Reactive oxygen species and vascular remodelling in hypertension: still alive. Can. J. Cardiol., 22(11), 947–951.

Xu W., Qu W., Huang K., Guo F., Yang J., Zhao H., Luo Y.B. 2007. Antibacterial effect of Grapefruit Seed Extract on food-borne pathogens and its application in the preserva-tion of minimally processed vegetables. Postharv. Biol. Technol., 45, 126–133.

Yamaguchi K., Honda M., Ikigai H., Hara Y., Shimamura T. 2002. Inhibitory effects of (-)-epigallocatechin gallate on the life cycle of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Antiviral Res., 53(1), 19–34.

Yamaki K., Taneda S., Yanagisawa R., Inoue K., Takano H., Yoshino S. 2007. Enhancement of allergic responses in vivo and in vitro by butylated hydroxytoluene. Toxicol. Appl. Pharmacol., 223, 164–172.

Yan M.H., Wang X., Zhu X. 2013. Mitochondrial defects and oxidative stress in Alzheimer disease and Parkinson disease. Free Radic. Biol. Med., 62, 90–101.

Yano Y., Satomi M., Oikawa H. 2006. Antimicrobial effect of spices and herbs on Vibrio parahaemolyticus. Int. J. Food Microbiol., 111(1), 6–11.


Yashin A., Yashin Y., Nemzer B. 2011. Determination of antioxidant activity in tea extracts, and their total antioxidant content. Am. J. Biomed. Sci., 3(4), 322–335.

Ye H., Xu H., Yu C., Dai Y., Liu G., Xu W., Yuan S. 2009. Hydroxylation of naringin by Trichoderma harzianum to dramatically improve its antioxidative activity. Enzyme Microb. Technol., 45, 282–287.

Yokoyama S., Suzuki T. 2008. Isolation and characterization of a novel equol-producing bacterium from human feces. Biosci. Biotechnol. Biochem., 72(10), 2660–2666.

Yuan J.P., Wang J.H., Liu X. 2007. Metabolism of dietary soy isoflavones to equol by human intestinal microflora – implications for health. Mol. Nutr. Food Res., 51(7), 765–781.

Zakay-Rones Z., Varsano N., Zlotnik M., Manor O., Regev L., Schlesinger M., Mumcuoglu M. 1995. Inhibition of several strains of influenza virus in vitro and reduc-tion of symptoms by an elderberry extract (Sambucus nigra L.) during an outbreak of influenza B Panama. J. Altern. Complem. Med., 1(4), 361–369.

Zhang X., Rimpiläinen M., Simelyte E., Toivanen P. 2001. Enzyme degradation and pro-inflammatory activity in arthritogenic and nonarthritogenic Eubacterium aerofaciens cell walls. Infect. Immun., 69(12), 7277–7284.

Zhu B., Wang X., Li L. 2010. Human gut microbiome: the second genome of human body. Protein Cell., 1(8), 718–725.

Zimmer J., Lange B., Frick J.S., Sauer H., Zimmermann K., Schwiertz A., Rusch K., Klosterhalfen S., Enck P. 2012. A vegan or vegetarian diet substantially alters the hu-man colonic faecal microbiota. Eur. J. Clin. Nutr., 66, 53–60.

Interactions between the antioxidant compounds occurring in plants and dietary supplements and the bacteria representing the human intestinal microbiota

Summary

The study aimed at investigating how the antioxidant food components (polyphenols) interact with the bacteria that represent the human intestinal microbiota. Seven species of bacteria (isolated from the human intestine, and bought as pure bacterial cultures in lyophilised form), used in the experiments, were Enterococcus caccae, Escherichia coli, Lactobacillus sp., Bacteroides galacturonicus, Bifidobacterium catenulatum, Ruminococcus gauvreauii and Eubacterium cylindroides. Plant material with known health-promoting properties and a long tradition of use in folk medicine, such as fresh fruits of raspberry, elderberry, cranberry, lingonberry, Japanese quince and cornelian cherry, dried goji and Schisandra berries, red onion, bear’s garlic, nettle, green tea and soybeans, as well as food supplements (commercial pharmaceutical products: spirulina, noni juice and Citrosept) provided the source of polyphenols. In addition, solutions of pure polyphenolic compounds (representing various flavonoid classes and stilbenes) were used. The latter included (+)-catechin, phloridzin, quercetin, rutin, kaempferol, naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin and resveratrol as polyphenols being the most frequently eaten with human diets.

At the first stage of the study, the material was examined for antioxidant activity, total polyphenol content, and polyphenolic profile.

At the second stage, the effect exerted on individual bacteria species by pure polyphenols, plant extracts and food supplements, used in different concentrations, was evaluated. It was found that the natural antioxidant components and the polyphenolic compounds present in plant material produce various effects on intestinal bacteria, from stimulating, through neutral, up to bacteriostatic and bactericidal, depending on the bacteria species. For extracts showing inhibitory potential, the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined. In search


of mechanisms behind the antioxidant and antimicrobial activity of polyphenols, the role of the structural elements of their molecules was discussed.

The third stage of the research concerned the impact of intestinal bacteria on the antioxidant potential and the concentration of selected antioxidant components present in plant material. The changes that occurred due to the influence of particular bacteria species were assessed. It was demonstrated that bacteria representing the physiological intestinal microbiota of humans may biotransform polyphenols through various pathways, producing derivatives of higher or lower antioxidant potential (which has health implications). The increase in antioxidant activity, however, may often be caused not by the metabolic changes of polyphenols, but by their release from the bonds with proteins or other components present in the reaction medium.

The results of the study provided a basis for formulating practical guidance for the consumers of polyphenol-rich foods (among them dietary supplements) and for the food industry.

Documents

Interakcje związków przeciwutleniających występujących w