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INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
Antígeno
-Toda molécula reconhecida como estranha pelo organismo – interage com Ac e TCR
-Epitopo – menor fração de um antígeno capaz de ser reconhecida por anticorpos ou se ligar a TCRs.
-Antigenicidade: capacidade de um antígeno de ser reconhecido pelo sistema imunológico
-Imunogenicidade: capacidade do antígeno de ativar uma resposta imunológica
Determinantes Antigênicos
A estrutura íntegra do antígeno é primordial para seu reconhecimento ideal
Ligação do Antígeno ao Anticorpo
A ligação entre Ag e Ac é resultado da conformação do Ag e do Fab do Ac e das interações químicas entre eles
INTERAÇÃO AG-AC
Ag + Ac Ag-Ac
A interação Antígeno-Anticorpo segue a lei das massas
Complexo Ag-AC
A quantidade de um antígeno e de um anticorpo em umaSolução é fundamental para a formação de complexos Ag-Ac
INTERAÇÕES Reações reversíveisReações reversíveis.
Ligações não covalentes:Ligações não covalentes:-Pontes de hidrogênio-Interações hidrofóbicas-Interações de Van der Waals-Ligações iônicas
Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para
pesquisa e diagnóstico
MÉTODOS
• PRECIPITAÇÃOPRECIPITAÇÃO- Imunodifusão
• AGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs
• IMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
- - Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia
MÉTODOS
1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados• Radioimunoensaios (RIA)• Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)• Imunofluorescência• Western Blotting
PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
• Precipitação:Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac.
• Aglutinação:Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.
• As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.
Classificação das reações de precipitação
1.Precipitação em meio líquido
2.Imunodifusão radial dupla
3.Imunodifusão radial simples
Precipitação em meio líquido
(Oudin, 1946)
• Zona de excesso de anticorpo = Formam-se imunocomplexos menores e solúveis e o sinal de leitura é baixo.
• Zona de equivalência = Formam-se grandes complexos gerando um sinal máximo.
• Zona de excesso de antígeno = Formam-se imunocomplexos menores e solúveis e o sinal de leitura decresce novamente.
O sistema para detecção dos precipitados:
• Fonte de energia radiante (halogênio, tungstênio e laser)
• Condensador (flash de luz paralelo e não divergente)
• Seletor de comprimentos de onda (filtro ou monocromadores)
• Cubeta
• Sistema de detecção (define a técnica empregada)
• 0º = Turbidimetria
• 90º = Nefelometria
Fontede luz
Cubeta
0º
• Turbidimetria:
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Fontede luzTungstênioMercúrioXenônio
Cubeta
30º
0º
90º
• Nefelometria:
Imunodifusão radial dupla
(Ouchterlony, 1947)
Antígeno e anticorpo colocados em posição horizontal, em pontos diferentes, difundem-se um contra o outro formando um precipitado.
Ac
Ag Ag
1. Os reagentes são colocados em
concentrações molares idênticas
a velocidade de difusão vai
depender do PM.
2. A curvatura estará dirigida
sempre para o orifício em que se
encontra a substância de maior
PM, nas condições ideais para a
reação.
Imunodifusão radial simples
(Mancini e Fahey, 1965)
• Ac + Ag multivalente particulado • Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-
quantitativo)• Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
ANTÍGENOS PARTICULADOS
Exemplos: Aglutinação Ativa: Bactérias (Brucelose) Hemácias (Sistema ABO)
Aglutinação Passiva: Hemácias tratadas antígenos Partículas tratadas antígenos anticorpos
Partículas Naturais PartículasSintéticas
PassivaConjugaçãoPrévia Ag
HEMAGLUTINAÇÃO BACTÉRIAS LÁTEX, ETC
PassivaConjugação
Prévia Ag ou Ac
Antígenossuperfície
membrana
Antígenos ouReceptoressuperfície
membrana
2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
Leitura do resultado:
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
negativo positivo
AGLUTINAÇÃO DIRETA
N acetil glicosamina
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
+Soro anti - hCGUrina
São incubados e colocados numa placa
Adicionam-se Partículas revestidas com hCG
Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.
Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial
Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.
TESTE DE COOMBS
• Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs);
• DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
• Não aglutinam os eritrócitos;• Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;• Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno. • Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.
• Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)
• Tipos:- Radioimunoensaios
- Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)
- Imunofluorecência / Citometria de Fluxo
- Western blotting
IMUNOENSAIOS
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
Marcação de Anticorpos
1966 Nakane Avrameas
Conjugação de anticorpos com a
Peroxidase
Inicialmente aplicada a antígenos particulados
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
EIE
Todo em fase líquidaHOMOGÊNEOS
HETEROGÊNEOSSeparação em
fase sólida
(ELISA)
CROMÓGENOS SOLÚVEIS CROMÓGENOS INSOLÚVEIS
( W. BLOTTING)
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
1971 Engval & Perlmann
IMOBILIZAÇÃO DE ANTÍGENOS SOLÚVEISEM FASES SÓLIDAS (PLÁSTICOS)
ELISA
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
ELISAFASE SÓLIDA POLIESTIRENO
POLIVINILCLORETO
NYLON
IMUNOPEROXIDASE
SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES
WESTERN BLOTTING
SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE ELETROFORESE
UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
O QUE LEVAR EM CONSIDERAÇÃO ???
•Pureza•Atividade específica•Limiar de detecção•Facilidade de conjugação•Eficácia após conjugação•Estabilidade do conjugado
ENZIMAS
PEROXIDASE
FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO
FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS
ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO
VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS
PEROXIDASE
Como se processa a reação ????
H2O2
H2O
½ O2
PEROXIDASE
Cromógeno
COR
CROMÓGENOS PARA PEROXIDASE
Orthophenylene diamine (OPD)
5-aminosalicylic acid (5AS)
Tetramethylbenzidine (TMB)
2,2 azino-di(3- ethylbenzothiazoline) (ABTS)
4-Cloronaphthol
Diaminobenzidine (DAB)
ELISA INDIRETO
ELISA / CAPTURA
TMB
OPD
APLICAÇÕES DOS ENSAIOS IMUNO-ENZIMÁTICOSAPLICAÇÕES DOS ENSAIOS IMUNO-ENZIMÁTICOS
- - Borrelia burgdorferiBorrelia burgdorferi (IgG e IgM) (IgG e IgM)
- Citomegalovírus (IgG e IgM)- Citomegalovírus (IgG e IgM)
- Citomegalovírus (Ag)- Citomegalovírus (Ag)
- Hepatite A (Ac totais)- Hepatite A (Ac totais)
- Hepatite B:- Hepatite B:anti-HBsanti-HBsanti-HBc (IgG e IgM)anti-HBc (IgG e IgM)anti-HBeanti-HBeHBsAgHBsAgHBeAgHBeAg
- Hepatite D (Ac totais)- Hepatite D (Ac totais)
- Hepatite C- Hepatite C
- HIV - Ac- HIV - Ac
- HIV - Ag- HIV - Ag
- HTLV-1 e HTLV-2 - Ac- HTLV-1 e HTLV-2 - Ac
- Rubéola (IgG e IgM)- Rubéola (IgG e IgM) Curso CBAB/CNPq/MCT - 2006Curso CBAB/CNPq/MCT - 2006
ELISPOTELISPOT
Imuno-histoquímicaImuno-histoquímica
Western-blotWestern-blot
Negative Negative -No bands presentNo bands present
PositivePositive-Bands at either p31 OR p24 Bands at either p31 OR p24 AND bands present at either AND bands present at either
gp160 OR gp120 gp160 OR gp120
IndeterminateIndeterminate
- Bands present, but pattern - Bands present, but pattern does not meet criteria for does not meet criteria for
positivity positivity
gp160
gp120
gp55
gp41
gp31
gp24
RadioimunoensaiosRadioimunoensaios
lucigeninalucigenina
luminolluminol luciferinaluciferina
QuimioluminescênciaQuimioluminescência
Reações de ImunofluorescênciaReações de Imunofluorescência
Luz ultra-Luz ultra-violeta violeta
(145-290 nm)(145-290 nm) Luz visível Luz visível (>450nm)(>450nm)
(Coons (Coons et al.,et al., 1941,1942) 1941,1942)
Isotiocianato de Isotiocianato de Fluoresceína Fluoresceína
(ITCF)(ITCF)
Isotiocianato de Isotiocianato de Rodamina BRodamina B
Treponema pallidumTreponema pallidum
Pneumocystis cariniiPneumocystis carinii
Tripanosoma cruziTripanosoma cruzi
Giardia lambliaGiardia lamblia