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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
10. Kurstag: Mutation und Supplementation
sämtliche Arten verändern sich ständig durch Mutationen
"stabile" Vererbung gibt es nicht!
unterschiedliche Allele eines Gens entstehen immer durch Mutationen:
jedes Allel ist eine Mutante!
was ist 'normal'?
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Klassifizierung von Mutationen
(1) Lage und Ausmaß der DNA-Veränderung:
"unsichtbare" Mutationen:geringfügige Sequenzänderungen in intergenischen Regionen undHeterochromatin
Genmutationen: Veränderung einzelner Gene
Chromosomenmutationen: Veränderungen ganzerChromosomen (strukturelle Chromosomenaberrationen)
Genommutationen: Veränderungen ganzer Chromosomensätze(numerische Chromosomenaberrationen)
Mutationen werden nach unterschiedlichen Kriterien klassifiziert:
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Klassifizierung von Mutationen
(2) Art der DNA-Veränderung:
Mutationen werden nach unterschiedlichen Kriterien klassifiziert:
Punktmutationen
Insertionen
Deletionen
Inversionen
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Klassifizierung von Mutationen
(2) Auswirkung:
Mutationen werden nach unterschiedlichen Kriterien klassifiziert:
'silent' Mutationen: keine Änderung der Proteinsequenz
'missense' Mutationen: veränderte Proteinsequenz
'nonsense' Mutationen: verkürztes Protein durch Entstehung vonStopcodons
'frameshift' Mutationen: veränderte Proteinsequenz durchLeserastermutation
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
spontan
durch chemische Mutagene
durch physikalische Mutagene
durch biologische Mutagene
Entstehung von Mutationen
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
ohne äußere Einwirkung von Mutagenen
durch Insertion von Transposons
während der Replikation:
Punktmutationen = Fehlpaarung von Basen (Transition, Transversion)
Leserasterverschiebung (Insertion oder Deletion einer oder weniger Basen)
die meisten spontanen Mutationen werden bereits während oderunmittelbar nach der Replikation effizient repariert!
Spontan auftretende Mutationen
spontane Mutationen entstehen
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
alkylierende Agenzien (z.B. Nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat)
Basenanaloga (z.B. 5-Bromuracil, 2-Aminopurin)
interkalierende Agenzien (z.B. Acridinorange, polyzyklische Aromaten)
Basen-modifizierende Agenzien (z.B. Aflatoxin, Nitrit, Hydroxylamin)
Chemische Mutagene
einige der bekanntesten chemische Mutagene:
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
UV-Strahlung
Röntgenstrahlung
ionisierende Strahlung (α-, β- und γ-Strahlung)
Physikalische Mutagene
die wichtigsten physikalischen Mutagene:
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Biologische Mutagene
Transposons (endogen)
DNA-Reparaturmechanismen (endogen)
alle integrierenden Viren (exogen; z.B. alle Retroviren)
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Neurospora Mutanten im Ad-3 Gen (ad-3–) bilden rote Kolonien, die von denweißen ad-3+ Wildtypkolonien leicht unterscheidbar sind
EMS
MMSRöntgenstrahlung
UV-Strahlung
polycyclische aromatische Acridine
Frequenz spontaner und induzierter Mutationen in Neurospora
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Basen-Exzisionsreparatur:
(1) DNA-Glycosylasen schneiden die N-glykosidische Bindung zwischen Base undZucker und erzeugen so Apurin- oderApyrimidin-Stellen (AP-Stellen)
Schädigung vonBasen
Zelluläre Mechanismen zur Reparatur von Mutationen
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
(2) AP-Endonucleasen erkennen AP-Stellen und erzeugen einenStrangbruch
(3) ausgehend von dem Strangbruchbauen Exonucleasen die DNA inbeide Richtungen ab
(4) Polymerasensynthetisieren neue DNA
(5) Ligase verschließt denStrangbruch
Zelluläre Mechanismen zur Reparatur von Mutationen
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Biologische Mutagene: Mismatch-Reparatur
während der Replikation (oder durch andere Vorgänge) entstandene Fehlpaarungenwerden durch das Mismatch Reparatur System eliminiert
C
Wildtyp Mutante
aber während der Reparatur können auch Mutationen fixiert werden!
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Physikalische Mutagene: UV-Strahlung
Versuch 17: UV-Mutagenese eines Antibiotika-Resistenzgens
Lernziel: die Beziehung zwischen Dosis und Wirkung von Mutagenen
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Physikalische Mutagene: UV-Strahlung
UV-Strahlung stimuliert die Bildung von verschiedenen Photoprodukten,z.B. Cyclobutanringen zwischen benachbarten Pyrimidinen (meist Thyminen)
bei der Replikation von Pyrimidindimeren entstehen unterschiedliche Mutationen
Thymindimer
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
z.B. Photolyasen zur Reversion von UV-induzierten Pyrimidindimeren:
Photolyasen wurden in Bakterien und niederen Eukaryonten, aber nicht inSäugern gefunden
Zelluläre Mechanismen zur Reparatur von UV-Mutationen
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06Chromosomenmutationen: Änderung der Chromosomenzahl
Zählen Sie die Kolonien auf den Platten
Sammeln Sie an der Tafel die Werte aller Gruppen, berechnen Siedie Mittelwerte und die Standardabweichung
Tragen sie den Logarithmus der gemittelten Zahl der Koloniengegen die Bestrahlungsenergie auf
Bestimmen Sie k
Aufgaben zum UV-Mutageneseversuch
[Der Versuchsteil zur Bestimmung der Mutationsfrequenz im LacZ alpha-Gen entfällt, weil dieUnterscheidung von blauen und weissen Kolonien nicht eindeutig war.]
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Supplementation
Versuch 18: Supplementation bei Matthiola incana
Lernziel: die Fähigkeit zur Interpretation von mutanten Phänotypen inkomplexen biochemischen Reaktionsketten
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Interaktion zwischen Genen
Komplementation
Supplementation (Kompensation)
Polygenie
Pleiotropie
Epistasie
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Komplementation
Komplementation: funktionelleErgänzung von zwei Genen(cis-trans-Test)
Mutationen sind: im gleichen Gen in verschiedenen Genen
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Supplementation
Supplementation:Kompensation einerMutation durchZugabe einesZwischenproduktes
Enzym 1 Enzym 2
Substrat ZP 1 ZP 2 Endprodukt
ZP 1
externe Zugabe von ZP1:
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Polygenie
Polygenie: an der Ausprägung eines Merkmals sind mehrere Gene beteiligt
Ausbildung von Blütenfarbstoffen (z.B. Anthocyane)heterooligomere Proteine (z.B. Hämoglobin: α-Globin auf Chr. 16, β-Globin auf Chr. 11)....
a) komplementäre Polygenie:
Merkmalsausprägung erfolgt erst beim Zusammenwirken aller beteiligten Gene(z.B. heterooligomere Proteine, mehrstufige Biosynthesewege) - "Serienschaltung"
b) additive Polygenie = quantitative Variation/Vererbung:
bei der Merkmalsausprägung leisten viele Gene kleine additive Beiträge(meist komplexe Merkmale wie Wuchshöhe, Ertrag) - "Parallelschaltung"
Substrat ZP 1 ZP 2 ZP 3 EndproduktA B C D
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Polygenie
Polygenie: an der Ausprägung eines Merkmals sind mehrere Gene beteiligt
additive Polygenie = quantitative Variation/Vererbung:
Beispiel: F2-Spaltung der Kornfarbe von Weizen bei zwei beteiligten Polygenen
die dominanten Allele beider Gene tragen zur Pigmentierung bei
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Polygenie
Polygenie: an der Ausprägung eines Merkmals sind mehrere Gene beteiligt
Beispiel: F2-Spaltung bei drei beteiligten Polygenen
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Polygenie
Schema zurEntstehung vonquantitativer Variation
(a) bei zunehmender Zahlder an derMerkmalsausprägungbeteiligten Gene
(b) bei unterschiedlichstarkem Umwelteinflussauf dieMerkmalsausprägung
kein Umwelteinfluss
2 Gene
5 Gene
10 Gene
kein Umwelteinfluss
2 Gene
leichter Umwelteinfluss
starker Umwelteinfluss
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Pleiotropie (Polyphänie)
Pleiotropie: ein Gen ist an der Ausprägung mehrerer Merkmale beteiligt
Gene, die an verzweigten Syntheseketten beteiligt sind
Bsp.: Gene E und G von Matthiola incana haben eine pleiotrope Wirkung:der Ausfall eines der beiden Gene wirkt sichauf Blütenfarbe und Blattbehaarung aus
Substrat ZP 1 ZP 2 ZP 3 Endprodukt 3A B
Endprodukt 1 Endprodukt 2
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Epistasie
Epistasie:
die Wirkung eines Genshängt von einem anderenGen ab
oder:
ein mutantes Allel einesGens "maskiert" oderüberdeckt die Wirkung einesanderen Gens
oder:
Wechselwirkung zwischenzwei Genen: diegemeinsame Wirkung weichtvon der Summe derEinzelwirkungen ab
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Der Anthocyan - Biosyntheseweg
die weissblühenden Matthiola Pflanzen sind Mutanten der CHS, DFR oder FGT Enzyme
F
E
GF
EG
Dihydroquercetin
Bz1(Mais)
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06Chromosomenmutationen: Änderung der Chromosomenzahl
Anhand der Fähigkeit der weissen Pflanzen zur Weiterverarbeitungvon Dihydroquercetin sollen Sie den Genotyp bestimmen, d.h.feststellen welches der drei in Frage kommenden Gene mutiert ist.
Aufgabe zum Supplementationsversuch
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Transposons
Versuch 19: Transposonmutagenese in Mais
Lernziel: das Verständnis der von Transposons verursachten variegiertenPhänotypen
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Entdeckung der Transposons
1914: Rollins Emerson und Marcus Rhoades finden inMais "instabile Mutationen" (variegierte Körner)
1945: Barbara McClintock beschreibt den genetischenLocus Dissociation (Ds) als eine Stelle aufeinem der 10 Maischromosomen, an der sehrhäufig Chromosomenbrüche auftreten. BeiKreuzungen bemerkt sie, daß dieser Locusseine Position verändern und auf ein anderesChromosom transponieren kann.
Barbara McClintock, 1984
1948: McClintock beschreibt den genetischen LocusActivator (Ac), der die Aktivität von Dskontrolliert und auch selbst transponieren kann.
1970: Entdeckung der Transposons in Bakterien
1980: Klonierung des Ac Transposons
1983: Verleihung des Nobelpreises an McClintock
1986: Transfer von Ac in eine andere Pflanze (Tabak)
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
TE-history 1
Wie erkennt man Chromosomenbrüche?
wxc sh bz
WxC Sh Bz Ds
wxc sh bz
Wx
C Sh BzD s
Chromosomenbrüchein einigen Zellen
azentrischesChromosomenfragment
Zellteilung
wxc sh bz
s
farbig
farblos
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
TE-Klassen
Transposons sind ubiquitär verbreitet
Retroelemente ("Klasse I - Transposons"):transponieren über ein RNA-Intermediatsind nur in Eukaryonten bekannt
Retroviren (Säuger)Retrotransposons (Vertebraten, Pilze, Pflanzen)Retrogene (Vertebraten, Pflanzen)
DNA-Elemente ("Klasse II - Transposons"):transponieren durch DNA-Exzision und -Reintegrationgibt es in allen Eubakterien, Archae und Eukaryonten
temperente BakteriophagenIS Elemente (Bakterien)Tn Transposons (Bakterien)Transponierbare Elemente (Vertebraten, Pilze, Pflanzen)
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
TE in Bacteria
IS-Elemente und Transposons in Bakterien
Transposons (Tn) in Bakterien wurden als mobile genetische Elementeentdeckt, die Antibiotika-Resistenz von Krankheitserregern verursachen.
Insertion Sequences (IS)
Transposons
TPase
0.7 kb - 2 kb
TPase R-Gen
2.5 kb - 20 kb
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Struktur des Mais Transposons Activator (Ac)
Ac
AAAmRNA
TPaseTPaseProtein
TPaseBindestellen
TTTCATCCCTAAAAGTAGGGAT
CAGGGATGAAAGTCCCTACTTTTIRs
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Modell des Ac Transpososoms
Die Ac Transposase bindet an dieTerminalen Inverted Repeats und ansubterminale SequenzmotiveDie Ac Transposase agiert alsMultimerProtein-Interaktionen der AcTransposase bewirken die 'Synapsis'der Transposonenden
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Transposons sind Biologische Mutagene
Transposons verursachen Mutationen mit "instabilen" Phänotypen:durch Exzision finden häufige Reversionen statt
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Ac/Ds Elemente transponieren in Pflanzen und in Hefe
HefeSaccharomyces cerevisiae
PappelPopulusSalatLactuca sativaFlachsLinum usitatissimum
Lotus japanicusSojaGlycine max
Arabidopsis thalianaPetersiliePetroselinum crispumMöhreDaucus carota
Datura innoxiaPetuniePetunia hybridaKartoffelSolanum tuberosumTomateLycopersicon esculentum
Nicotiana plumbaginifoliaTabakNicotiana tabacumGersteHordeum vulgareWeizenTriticum aestivumReisOryza sativa
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06
Das Maiskorn: ein ideales Objekt für genetische Analysen
Das Maiskornbesteht aus genetisch verschiedenen Organenbzw. Geweben:
Perikarp
Endosperm
Aleuron
Embryo
diploid (MM); maternales Gewebe
triploid (MMP); doppelte Befruchtung!
triploid (MMP); äußerste Endospermschicht
diploid (MP); Nachkommengeneration
Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06Chromosomenmutationen: Änderung der Chromosomenzahl
Doppelte Befruchtung bei Pflanzen
Perikarp(2n - maternal)
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Institut für Biologie / Angewandte Genetik Grundkurs Genetik - WiSe 05/06Chromosomenmutationen: Änderung der Chromosomenzahl
Schleifen Sie die Körner an und untersuchen Sie, ob sich die aufder Oberfläche sichtbaren Variegationsmuster in das Innere desEndosperms fortsetzen.
Analysieren Sie die Stärkezusammensetzung im Inneren derKörner durch Anfeilen und Färbung mit Iod-Iodkaliumlösung.Fotografieren Sie die Körner für das Protokoll.
Leiten Sie aus den Phänotypen ab, in welchen Geweben die Waxy,P und Bz Gene exprimiert werden.
Schließen Sie aus den Reversionsmustern auf denEntwicklungszeitraum in dem die Transposons aktiv waren.
Aufgaben zu den Transposon-Mutanten