Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Investice do rozvoje vzdělávání

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.


Genomika (KBB/GENOM)Genomika (KBB/GENOM)



Fyzické mapováníFyzické mapování

F i ké k ti éFyzické kontigové mapy

Ing. Hana Šimková, CSc.



Cíl přednášky

- seznámení s konstrukcí fyzických kontigových map a jejich ukotvováním

Klíčová slova

- fyzické mapování, fingerprinting, kontig, ukotvování fyzických map, integrace genetických a fyzických mapg g ý y ý p


KONSTRUKCE FYZICKÝCH KONTIGOVÝCH MAPKONSTRUKCE FYZICKÝCH KONTIGOVÝCH MAP

Kontig řetě ec po sobě jdo cích fragmentů DNA t ářejících spojitoKontig – řetězec po sobě jdoucích fragmentů DNA vytvářejících spojitou sekvenciKontigová fyzická mapa se skládá z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů

Konstrukce fyzické kontigové mapy:

sestavování kontigů

ověřování správnosti kontigů pomocí genetických a cytogenetických markerů

integrace genetických a fyzických map

1) Sestavování kontigů1) Sestavování kontigů

- z překrývajících se klonů z knihoven dlouhých inzertů.

Překryvy je možno zjišťovat na základě

- analýzy restrikčních spekter (fingerprintů)ý y ( g )

- vyhledávání společně se vyskytujících markerů

(STS, genetické markery)(STS, genetické markery)

Uspořádání klonů na základě srovnání restrikčních spekter(fingerprinting)(fingerprinting)

Fingerprint = unikátní spektrum restrikčních fragmentů získaných na základě štěpení 1 nebo více restriktázami a frakcionace takto vzniklých fragmentů Klony odvozené znebo více restriktázami a frakcionace takto vzniklých fragmentů. Klony odvozené z jednoho místa genomu sdílejí určitou část restrikčního spektra.

Různé varianty fingerprintingu:a) štěpení 1 restrikční endonukleázou (RE) s 6-bp

restrikčním místem (cca 20-45 proužků na klon)restrikčním místem (cca 20 45 proužků na klon)- elektroforéza na agaróze, barvení ethidium bromidem - vizualizace téměř všech fragmentůg jednoznačnější stanovení přesahů – spolehlivější, je možné zjistit velikost BAC klonu, nejlevnější omezená automatizace, nižší informační hodnota

Alternativní způsob vytváření fingerprintů- optickým mapováním.

Gibson a Muse, 2004

b) štěpení více RE + koncové značení- radioaktivně- fluorescenčně

A lý l k l id é lAnalýza na polyakrylamidovém gelu- vertikální elektroforéza- sekvenátor

Kombinace 2 enzymůKombinace 2 enzymů, radioaktivní značení

Automatizovaný postup fyzického mapování BAC klonů

i l DNA BAC kl ů- izolace DNA z BAC klonů- štěpení 1 až 4 vzácněji štěpícími RE (s 6-bp místem) zanechávajícími kohezní konce- štěpení 1 často štěpící RE (s 4-bp místem) zanechávající tupé konce

T C T A G A

A G A T C T5’ 3’3’ 5’

G G C C

G G C CC C G G

C C G G XbaI+HaeIII

- koncové značení fluorescenčně značenými ddNTP (1 až 4 různé barvičky) – jen u kohezních konců

A G A T C T3 5G G C CC C G G HaeIII

kohezních konců5‘

3‘

3‘

5‘

TCAGATC

CTAGA

CT*

*

Fragmenty 35-600 bp – získáme celkově až stovky fragmentů, viditelných (tj. nesoucích fluorescenční barvičku aspoň na 1 konci) do 50 pro 1 enzym.p ) p yOptimum – 50-250 proužků pro všechny enzymy dohromady.

- frakcionace – sekvenátor – použití vnitřního standardu v každé kapiláře- vyhodnocení – program FPC (FingerPrintedContigs)

- porovná fingerprinty- poskládá klony do kontigů- navrhne nejkratší cestu pro sekvenování (minimum tiling path - MTP)

Štěpení restrikčními endonukleázamia barevné značenía barevné značení

T C T A G A5’ 3’ XbaIA G A T C T3’ 5’

XbaI

BamHIG G A T C C

C C T A G G

5’ 3’

3’ 5’

G A A T T C 5’ 3’EcoRIC T T A A G3’ 5’

XhoIC T C G A G

G A G C T C

5’ 3’

3’ 5’Luo et al. (2003)

G A G C T C3 5

Využití kitu SNaPshot pro barevné značení

EcoRIBamHI EcoRI HaeIII HaeIII

Výstup ze sekvenátoru

(adapted from Luo et al., Genomics, 2003)

Čtyřbarevné značení – oddělení barevLuo et al. 2003

BamHIBamHI

EcoRI

XbaI

XhoI

Velikostní standard (Liz)

HICF (high information content fingerprinting)fingerprinting s vysokým informačním obsahem

Izolace DNAz BAC klonů

fingerprinting s vysokým informačním obsahem

z BAC klonů

Institut National de la Recherche Agronomique

Štěpení 5 restrikčními endonukleázami

Sestavování kontigů (Genoprofiler, FPC)

K ilá í l kt f é

( p , )Fluorescenční značení

(SNaPshot kit)Kapilární elektroforéza

(ABI3730)(Luo et al, 2003, Genomics)

Konstrukce fyzické mapy

Výběr metody pro daný genom tak, aby byl dosažen

a) optimální počet analyzovaných proužkůa) optimální počet analyzovaných proužků- méně proužků – nižší informační hodnota, větší relativní chyba- příliš mnoho proužků – více falešněpříliš mnoho proužků více falešně pozitivních překryvů

b) dostatečná vzdálenost mezi proužky

Sulston cutoff score (Sulstonova prahové hodnota) vyjadřuje pravděpodobnost, že proužky společné pro 2 fingerprintované p y p p g pklony jsou výsledkem náhody. Pokud je hodnota nižší než tento uživatelem nastavený práh, klony jsou prohlášeny za překrývající se. Udává se jako e-n.

Větší genomy vyžadují mnohem nižší M t l 2004hodnotu Sulstonova skóre (vyšší n). Meyers et al. 2004

Závislost mezi Sulston cutoff scorea rozsahem překryvu BAC klonůa rozsahem překryvu BAC klonů

křivka pro BAC klon o velikosti cca 125 kb

1e- 45

1e-75

70 80%50 60% 70-80%

% překryvu klonů

50- 60%

% překryvu klonů

Sestavení fyzické mapy chromozómu 3B pšenices použitím programu FPCp p g

[e-65]

[e-70]

[e-60]

[e-55][e-75]

gů

[e-45]

[e-50]

Poče

t kon

tig

Následné automatické

P

[e-25]

Manuálníupravování sestavy

(merging, splitting, killing…)

Počáteční sestavení (automaticky s vysokou

přísností)

sestavení s klesající přísností

(merging, DQing…)

E. Paux (2008)

Vyhledávání překryvů na základě společných markerů

Obvykle slouží k doplnění fingerprintingu, propojení dosud nespojených kontigů. Lze použít i samostatně, ale velmi pracné, vyžaduje vysokou hustotu markerů.

STS markery (sequence-tagged site – místo se sekvenční adresou) – krátká sekvence, kterou lze amplifikovat pomocí PCR a kterou lze lokalizovat na jediném místě v genomua) odvozeny z náhodných sekvencí (nemusí být polymorfní)b) d ti ký h k ů ( ř ISBP ik t litů RFLP)b) odvozeny z genetických markerů (např. ISBP, mikrosatelitů, RFLP)c) odvozeny z ESTů (expressed sequence tag – místo s expresní adresou)

2) Ověřování správnosti kontigů

- integrací genetických a fyzických map – markery ve vazbě by měly k l k li t dl hý h k ti í hkolokalizovat na dlouhých kontizích

- sekvence z obou konců dlouhých kontigů použít k odvození genetických markerů – ty by měly kosegregovat

Tyto koncové sekvence (BAC end sequences = BES) také mohou posloužit ke spojení dvou kontigů:

odvození sondy z konce kontigu- odvození sondy z konce kontigu- skríning knihovny- vytipování BACu – získání jeho koncové sekvence – může být na dalším

kontigukontigu

Ukotvování kontigů pomocí FISH

- pro kontigy, které nelze ukotvit- pro kontrolu orientace kontigů Dvoubarevná FISH - pro zjištění velikosti mezer mezi kontigy

VIRTUÁLNÍ SPOJENÍ DVOU KONTIGŮ

172A10 + 173K08 140C18 + 173K08

Na základě dvoubarevné FISH jsou oba kontigy v těsné blízkosti nebo se překrývajíkontigy v těsné blízkosti nebo se překrývají

Ř

FISH

PŘEKRYV ?

172A10 140C18 173K08172A10(5 kb)

140C18(8 kb)

173K08(3 kb)

Podle FISH jsou oba kontigy lokalizovány na distálním konci 3B

Zjištění vzájemné pozice dvou BAC klonů pomocí FISH t ž ý h h ó hna natažených chromozómech

mitotickéchromozómy natažené chromozómy

mezera cca 30 kb

3) Integrace genetických a fyzických map

Xb d907Xcfa2191

Xcfa2226 Xcfd143 Xgwm493

Genetická mapaXgwm493 Xbarc87 Xbarc147

Xcfa2191 Xcfa2226 X fd143

Deleční mapa Fyzická mapa

Xbcd907

Xcdo460

Xtam61

Xgwm493 Xbarc147 Xbarc133 Xbarc75 Xbarc102 Xgwm389 Xgwm533-1

Xgwm533-2XksuH7

Xgwm389 Xgwm533 Xbarc68 Xbarc156

Xbarc147 Xbarc102 Xbarc75

Xcfd143 Xbarc133

Xwmc43Xk H7

3BS-8

3BS-9 Xbarc73

Xabg471

Xbcd1418

Xgwm566Xgwm72 Xcfd4 Xgwm285 Xgwm77

Xgwm533 2 Xwmc43 Xgwm264

Xcnl3 Xgwm131

XksuH7Xpsr689

Xcfd79 Xgwm566 Xgwm72 Xgwm285 Xgwm77

Xcfd4

XksuH7 Xpsr689

3BS-1

Xbarc73 Xgwm264 Xgwm144

Xfbb378

Xbcd131

gXgpw1146 Xgwm376 Xgwm284

gXgwm108 Xgwm112 Xbarc164 Xgpw1146

Xgwm376 Xgwm131 Xgwm108 Xbarc77 Xbarc1077

Xgwm77 Xbarc139

Xgwm284 Xbarc164 Xcnl3

C

3BL-2

Xfba360

Xbg131

Xcfa2170

Xgwm114

Xgwm299 Xbarc77 Xbarc84

Xbarc1077 Xgwm112 Xgwm114

Xpsp3081

3BL-2

3BL-10

Xbarc203 Xbarc1044

Xbg131

Xtam63

Xmwg11

gXpsp2151 Xgwm547

Xgwm247Xgwm181 Xgwm340 Xcfa2170

Xgwm547

Xgwm299 Xpsp2151 Xgwm247

Xpsr170 XksuG62

3BL-7Xbarc164

??g

Xgwm181 Xbarc84

Xgwm247 Xgwm340 Xfwm4

XksuG62

A) Přímé ukotvování (forward contig anchoring)

Přímé ukotvování:- z genetických map do kontigů pomocí geneticky

zamapovaných markerů(SSR EST RFLP DA T SNP )(SSR, EST, RFLP, DArT, SNP…)

Provádí se skríning knihovny g ygenetickými markery - je možné i s větším počtem sond –poolovací strategie (strategie směsných vzorků):

a) PCR skríning – pooly z knihovny – miskové+řádkové+sloupcové (=3D), ale i 5D, 6D pooly.

b) k í i h b idi íb) skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě

E. Paux (Science, 2008)

a) Vytváření třídimenzionálních směsných vzorků (poolů)

48 PCR reakcí umožní proskrínovat 8 misek po 384 jamkách tedy najít 1misek po 384 jamkách, tedy najít 1 pozitivní klon mezi 3072.

CNRGV Toulouse

b) Hybridizace na membránách o vysoké hustotěNanášecí schéma 5x5,

každý klon 2x Nylonová membránas nanesenými klonyý y

CNRGV Toulouse

Detail

Po hybridizaci s radioaktivně značnou sondou

Skríning hybridizací – na membránách o vysoké hustotě- sonda z 1 markeru (např. EST)- směsné sondy z několika typů markerůsměsné sondy z několika typů markerů - sondy z překrývajících se oligonukleotidů (overgos)

odvozeny z kusu známé unikátní sekvence – 2 částečně se překrývající oligonukleotidyp ý j g y

8 bp

22-24 bp konce doplněny radioaktivně značenými oligonukleotidy

8 bp22-24 bp

ká ifi it h b idi ( d j d k i ý h vysoká specificita hybridizace (odvozeno z jednokopiových sekvencí), silné signály, lze snadno odmýt – hybridizační membránu je možno použít víckrát poměrně vysoké náklady na syntézu overgos poměrně vysoké náklady na syntézu overgos

B) Reverzní ukotvování (reverse contig anchoring)

Reverzní ukotvování (chromosome landing):- ukotvování kontigů BAC klonů na genetickou mapu (přes genetický marker obsažený v kontigu) – využívá markerů odvozených ze sekvencí BAC kl ů b k ů BAC kl ů (BES) SSR ISBP SNP kt éBAC klonů nebo konců BAC klonů (BES) – SSR, ISBP, SNP, …, které se geneticky zamapují za použití mapovací populace

E. Paux (Science, 2008)

Documents

Inovace studia molekulární a buněčné biologie