CAPTULO 4

Inmunoglobulinas. Sntesis y regulacin de la produccin de IgEMara Roco lvarez Lpez, Mara Roco Lpez lvarez, Manuel Muro Amador

Las inmunoglobulinas (Igs) son un grupo de glucoprotenas sricas de movilidad electrofortica variable, aunque la mayora se concentran en la fraccin de las globulinas. Se caracterizan por su capacidad de unirse a un antgeno y son sintetizadas por clulas de estirpe B y secretadas al medio tras la diferenciacin del linfocito B a clula plasmtica. Cuando un linfocito B entra en contacto con un antgeno lo hace atravs de su receptor especfico (inmunoglobulina). Tras esta interaccin sufre una expansin a clula plasmtica secretoras de inmunoglobulinas en forma soluble (anticuerpos), molculas que son los principales efectores de la respuesta inmunitaria humoral. Las funciones de los anticuerpos pueden realizarse por la protena unida a membrana, al funcionar como receptor del antgeno y, tambin por las formas solubles o anticuerpos sricos. Entre las funciones que realizan las formas solubles destacan las siguientes: neutralizacin, opsonizacin, activacin del complemento y citoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC). Las funciones y su efectividad varan segn el tipo o subtipo de inmunoglobulina y su localizacin. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM que se diferencian en la estructura molecular, en el tipo de cadena pesada (, , , y ) y en el contenido de hidratos de carbono. Los miembros de cada clase se dice que son del mismo isotipo. En este captulo se har referencia a la estructura, sntesis, tipos y funciones de las distintas inmunoglobulinas, aunque por la naturaleza de la temtica que aborda el libro se estudiar en mayor profundidad la sntesis y regulacin de la inmunoglobulina E (IgE).

1. ESTRUCTURA Bioqumicamente las Igs son glucoprotenas, cuyo contenido en glucosacridos vara entre el 3 y el 18%. Desde el punto de vista electrofortico, muestran una gran heterogeneidad, pues su espectro se extiende desde la fraccin , donde se concentran la mayora, hasta la faccin del espectro electrofortico srico. La unidad bsica, monmero, de las inmunoglobulinas est constituida por dos cadenas polipeptdicas ligeras (L) idnticas y otras dos pesadas (H) tambin idnticas. Cada cadena ligera est unida covalentemente a una pesada, y las pesadas unidas entre s por puentes disulfuro y fuerzas no covalentes (figura 1A). Las cadenas pesadas (H), son responsables de las caractersticas estructurales y funcionales de cada inmunoglobulina. Cada cadena puede dividirse en "dominios" o regiones de homologa, de aproximadamente 110 aminocidos. En su forma nativa, globular, cada dominio forma una estructura plegada en dos estratos a la que confiere estabilidad un puente disulfuro intracatenario. La cadenas pesadas, constan de 4 5 dominios, uno aminoterminal que configura la regin variable (VH) y los otros dominios forman la regin constante (CH). Las cadenas ligeras pueden ser de dos tipos, kappa () y lambda () y, estn slo formadas por dos dominios: uno aminoterminal o variable (VL) y otro carboxiterminal o constante (CL) que se une al dominio CH1 de la cadena pesada. Estos dominios constituyen no slo la unidad estructural y evolutiva de las inmu-

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Sitio unin al antgeno N

N

CDR1 CDR2 CDR3

A

VL

Puentes disulfuro

Carbohidrato

CL

Cadena ligera

CH2 Regin bisagra

CH3

N VL

CH1 Cadena pesada N

Papana

Pepsina

B

SS

SS SS

SS

SS SS SS SS

SS

SS

SS

SS SS SS SS

SS

SS

SS

SS

SS Fc F (ab) 2

Fc

Figura 1. A, representa un modelo de una inmunoglobulina G que muestra la estructura tetracatenaria basica con los diferentes dominios de las cadenas pesadas y ligeras y los puentes disulfuro intercatenarios. B, muestra la estructura con detalle bioqumico la estructura de IgE,las lneas gruesas indican estructura primaria de las cadena pesada e y la de las cadenas ligeras L. Adems se detallan las posiciones de enlaces disulfuro, los sitios de accin de enzimas proteolticas y los correspondientes fragmentos generados.

noglobulinas, sino tambin la de otras molculas, que se encuadran dentro de la denominada superfamilia de las Igs. Dentro de esta familia estructural figuran molculas tan importantes como el receptor de linfocitos T, los antgenos linfocitarios codificados por la regin MHC (clase I y II), los corre-

ceptores CD4 y CD8, molculas de adhesin como CD2, LFA3 e ICAM-1, receptores de factores de crecimiento celular, etc. Todas estas molculas, ejercen funciones de reconocimiento o adhesin intercelular y son fundamentales para el manteniemiento de la homeostasis por el sistema inmunitario1-3.

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A pesar de la homogeneidad estructural y del comportamiento fsico-qumico de las inmunoglobulinas, stas presentan diferecias en la estructura primaria y secundaria de sus cadenas pesadas, dando lugar a cinco clases de molculas denominadas IgM, IgD, IgG IgA, e IgE. Los diferentes miembros de cada clase se dice que tienen el mismo isotipo, aunque puedan tener distinta especificidad. Variaciones en la secuencia de aminocidos determinan la existencia de subclases: en la clase IgA se diferencian dos, IgA1 e IgA2 y la clase IgG se subdivide en IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4. Las cadenas pesadas son responsables de las caractersticas estructurales y funcionales de cada clase o subclase, se denominan con la letra correspondiente del alfabeto griego (1, 2, , , 1, 2, 3, 4 y ) y como se ha indicado constan de 4 5 dominios. El dominio o regin aminoterminal se denomina "variable" (VH). Dentro de l se diferencian tres regiones hipervariables, tambin llamadas determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3), que estn directamente implicados en la unin al antgeno y son flanqueados por regiones estructurales FRs (del ingls, frame regions), de secuencia altamente conservada que les hace responsables del plegamiento caracterstico. El resto de los dominios forman la regin "constante" (CH), cuya estructura difiere en cada isotipo. En las cadenas , y , existe una regin de longitud variable llamada bisagra (H, del ingls, hinge) que se sita entre los dominios CH1 y CH2 y confiere flexibilidad a la molcula de inmunoglobulina. En las Igs de membrana, el extremo carboxiterminal tiene una prolongacin de unos 26 aminocidos hidrofbicos que constituyen la regin de transmembrana, seguida de otro segmento intracitoplsmico, de longitud variable, rico en aminocidos bsicos y posiblemente implicado en la transduccin de seal. Estas Igs de membrana (mIgs) se pueden unir a un heterodmero de dos molculas Ig-/Ig- con un solo dominio de Ig y un tallo citoplsmico de mayor tamao que el de mIgs que facilita la sealizacin intracelular (1). Este conjunto forma parte con otras molculas del receptor de la clula B o BCR. Las cadenas ligeras kappa () y lambda () estn formadas por 212 aminocidos repartidos en dos dominios. Su dominio carboxiterminal o constante (CL) se une al dominio CH1 de la cadena pesada mediante un puente disulfuro y su secuencia ami-

noacdica no vara entre los miembros de un mismo tipo. El extremo aminoterminal (VL), presenta mayor variabilidad de secuencia, esta variabilidad se concentra en tres regiones hipervariables (CDRs) de aproximadamente 10 aa, cuya situacin y funcin son iguales que las de la cadena pesada.

2. ORGANIZACIN GNICA: REORDENAMIENTO Y DIVERSIDAD El conocimiento de la extraordinaria diversidad de inmunoglobulinas que es capaz de sintetizar el organismo signific una aparente contradiccin respecto al principio de "un gen-una protena", establecido como mxima en los inicios de la gentica molecular y que implicaba la necesidad de tener una gran cantidad de DNA destinado a este fin. Posteriormente se comprob que la informacin gentica necesaria para la sntesis de todas las inmunoglobulinas est contenida en un pequeo espacio del genoma4. Los genes que codifican cada uno de los tipos de cadenas ligeras y las cadenas pesadas estn situados en cromosomas distintos. El locus de la cadena pesada se sita en el cromosoma 14, el de la cadena kappa en el 2 y el de la lambda en el 22. Sin embargo, la organizacin de estos tres loci es similar. Cada locus est compuesto de mltiples genes o segmentos gnicos que codifican las regiones V y C de la protena, separados por intrones y por segmentos que no se transcriben. En el extremo 5' se sitan los genes V que codifican la mayor parte de la regin variable (95 aa.), cada uno de ellos precedido por un exn "leader" (L) que contiene la seal de inicio de la transduccin y codifica los 20 o 30 aa. aminoterminales que forman un pptido que slo se mantiene en las protenas secretoras o de transmembrana. A una distancia variable de esta regin, en sentido 3', se encuentra la regin de los genes C, uno en el locus y seis en el , que codifican el dominio constante de la cadena ligera. En el locus H existe un gen C de cada clase o subclase y que consta de tres o cuatro exones que codifican los dominios constantes de la cadena pesada y de otros exones que codifican los extremos de transmembrana y citoplsmico. En los loci H y , entre los genes V y C, se sitan los genes J (del ingls: join, unir). En el locus H, adems, existen los genes D (de diversidad) y en el locus cada gen C va precedido de un gen J. Los segmentos D y J

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Locus de la cadena pesadaL1 V1 L1 V1 Ln Vn D ?

J (6 genes funcionales)

C

C

C3

C2

DNA embrionario Reordenamiento DJ (linfocito pro-B L1 V1 L1 V1 Ln Vn D3 J2 C C C3 C2

Reordenamiento VDJ

L1 V1 D3 J2 DNA del linfocito B Transcripcin L1 V1 D3 J2 RNA primario Procesamiento del RNA splicing RNA mensajero Transcripcin L Polipeptido V DJ

C

C

C3

C2

C

C

C3

C2

L1 V1 D3 J2 AAAA

Procedimiento y glicosilacin L Cadena pesada (Linfocito pro-D) Carbohidrato Regin variable Regin constante V DJ

Figura 2. Esquema del reordenamiento del gen de la cadena pesada. En este caso se representa el proceso para la sntesis de la cadena .

codifican los aa. carboxiterminales de la regin V, incluyendo la tercera regin hipervariable (CDR3).

2.1. SNTESIS Y REORDENAMIENTO GNICO La sntesis de inmunoglobulinas requiere que los linfocitos B sufran un proceso madurativo lineal. Durante este proceso de diferenciacin, estos linfocitos pasan por diferentes estadios, desde el de pro-linfocito B al de linfocito B maduro que expresa en su superficie molculas de inmunoglobulinas y,

de aqu el linfocito B se diferencia a clulas plasmticas secretoras de anticuerpos. Inicialmente, los linfocito B producen anticuerpos IgM. Los dominios de la regin variable de la cadena pesada son codificados por los elementos V, D, J y se localizan adyacentes a los exones C que codifican la regin constante (C) de la cadena pesada de IgM en el extremo 5 del locus de la cadena pesada de las Inmunoglobulinas (IgH). Tras una apropiada estimulacin, el linfocito B, puede modificar el isotipo de anticuerpo que produce conservando la especificidad frente al antgeno. Durante el proceso, el

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DNA genmico se divide y se vuelve a unir yuxtaponiendo los elementos VDJ a los exones de la regin C que codifican las cadenas las pesadas , y de los isotipos IgG, IgA e IgE respectivamente5. El proceso de reordenamiento gnico (del ingls, switching), se inicia en el linfocito pro-B. El primer paso afecta a uno slo de los cromosomas que contiene el locus H y consiste en la unin de un segmento D con uno J, mediante un mecanismo de recombinacin en el que se pierde el material gnico intermedio (figura 2). Despus un proceso anlogo, junta un segmento V con el reordenado DJ formando el gen VDJ. Las uniones D-J y V-DJ permiten cierta flexibilidad de modo que pueden perderse o introducirse uno o varios nucletidos al azar. Si el reordenamiento VDJ tiene xito (pues la variabilidad en la unin implica la posibilidad de aparicin de un codn sin sentido), se suprime el proceso en el otro cromosoma, y si no, se intenta en el otro cromosoma. De esta forma, cada clula produce una sola cadena H diferente. En este estado se produce la transcripcin dando lugar a una cadena de RNA que contiene los genes CH y el VDJ separados por un intrn. Este posteriormente se elimina mediante un proceso llamado de divisin (del ingls, splicing), que pone en contacto el gen VDJ con el C (el ms proximal), al tiempo que se aade la cola de poli-A caracterstica de los mRNA. La traduccin de este RNA origina las cadenas citoplasmticas que se pueden detectar por primera vez en los linfocitos pre-B. Si el reordenamiento del gen de la cadena pesada tiene xito se activa el reordenamiento del locus kappa que se hace de forma similar y, slo si este no es efectivo en ninguno de los cromosomas, se reordenar un gen lambda. De este modo cada clula producir uno solo de los dos tipos de cadena ligera.

ocurren mutaciones somticas que afectan a las CDRs. La consecuencia es una nueva diversificacin y la posibilidad de que alguno de estos cambios signifiquen una ganancia de afinidad por el antgeno. Aunque en principio todos los linfocitos B sintetizan IgM, con posterioridad a la estimulacin antignica y gracias a la interaccin con linfocitos colaboradores (Th) y las citoquinas producidas por estos puede tener lugar el cambio de isotipo, que permite la produccin de anticuerpos con cadenas pesadas pertenecientes a diferentes clases. El cambio hacia uno u otro isotipo est en relacin con la citoquina secretada y, concretamente la IL-4 y la IL-13 determinan el cambio a IgE.

3. FUNCIONES DE LAS INMUNOGLOBULINAS Tras la interaccin del antgeno con el anticuerpo tiene lugar la funcin efectora de ste. Esta funcin la puede desarrollar como receptor de membrana de linfocitos B, provocando su activacin para la sntesis de Igs y la diferenciacin a clula plasmtica productora de anticuerpos solubles. Aparte de la unin a antgenos (virus, toxinas, etc) que impide el contacto con sus receptores especficos y neutraliza su accin patgena, accin que es comn a cualquier tipo de anticuerpo, el resto de funciones efectoras son dependientes del tipo de anticuerpo, de su estructura y de su localizacin (1,3). Por ello, en esta primera parte, se ofrece un resumen de las propiedades y funciones de las distintas clases de inmunoglobulinas existentes, reflejando sus propiedades fsicoqumicas y las diversas funciones que realizan (tabla I).

3.1. INMUNOGLOBULINA G Esta inmunoglobulina constituye el 75% del total de las Igs en suero, siendo su concentracin aproximada de 1500 mg/dl. Su forma molecular es la de monmero, con un peso molecular de 146 kd y un coeficiente de sedimentacin de 7S. Las cadenas pesadas estn constituidas por cuatro dominios, con una regin bisagra entre los dominios CH1 y CH2. Su contenido de hidratos de carbono es de un 2-3% al tener unido al dominio CH2 un N-oligosacrido. Existen 4 subclases de IgG que se diferencian en la cadena pesada, el nmero de

2.2. DIVERSIDAD Los genes de las inmunoblobulinas se reordenan durante la ontogenia del linfocito B. Gracias a dicho reordenamiento cada linfocito produce una inmunoglobulina distinta dando lugar a un sin nmero de molculas diferentes que, en conjunto, podrn reconocer cualquier antgeno. Adems, cuando tiene lugar el reconocimiento antignico, el linfocito B implicado va a sufrir un proceso de activacin y proliferacin durante el cual

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TABLA I. Caractersticas fisicoqumicas y funciones de las Igs PROPIEDADESPeso Molecular Forma secretada % Glicosilacin Subtipos Concentracin (mg/mL) % en suero Vida media (das) Barrera placentaria Act. Complemento Va clsica Va alternativa Unin por Fc Macrfago Neutrfilo Basfilo y mastocito Actividad antiviral Lisis bacteriana +++ +++ +/ +/ + + +++ +++ +++ +++ + + +++ ? ? +++ ? ? ++ + + + +++ + + + ++++ +? + IgG1 IgG2

IgG150.000 Monmero 4% IgG3 IgG4

IgA160=400.000 Mono-Di-Trmero 10% IgA1 IgA2

IgM900.000 Trmero 15% IgM

IgD180.000 Monmero 18% IgD

IgE190.000 Monmero 18% IgE

9 50% 23 +++

3 12% 23 +

1 8% 7 +++

0,5 5% 23 +++

3 12% 6

0,5 3%

1,5 10% 5

0,04