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Jorge FUENTES-BERAZATEGUIBIOTECNOLOGÍA

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INGENIERÍA GENÉTICA

(TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE ) ( CLONAJE)

1. INTRODUCCIÓN:

La información que determina las características observables de un organismoconcreto (FENOTIPO) está contenida en sus genes (GENOTIPO).Un GEN es una molécula de ADN constituida por 2 cadenas de nucleótidos

cuyas bases son 2 purinas (A y G) y 2 pirimidinas (T y C). Las dos cadenas son complementarias de tal manera que cada purina está

unida siempre a una pirimidina determinada:

A TG C

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→ las 2 hebras del ADN SON ANTIPARALELAS. Esto significa que una de ellas tienepolaridad 3 - 5, mientras que la otra 3' - 5'.

MECANISMO DE CRECIMIENTO (natural o sintético) DE LA CADENA DE ADN

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- d TTP desoxitimidina tri - fosfato←

- d ATP desoxiadenosina tri - fosfato ← - d CTP desoxicitosina tri - fosfato ←

→ la Biología Molecular tiene como fundamental objetivo el comprender cómo está organizaday cómo se regula la expresión de la información contenida en el ADN, estos conocimientospueden permitir a la BIOTECNOLOGÍA obtener entre otras cosas de interés:

sanitarioagrícolaganadero

a costos más bajos que por los métodos tradicionales. Como un gen es sólo una mínima parte

del ADN genómico, la tecnología del ADN recombinante (ADN - r ) que permite aislar un

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gen de la totalidad del ADN genómico, purificarlo y clorarlo es, sin lugar a dudas, más eficienteque cualquiera de los métodos clásicos empleados antes de la década del 80.

→ a continuación intentaremos dar una visión que, sin perder el rigor técnico, permitacomprender estas técnicas de la biología que ya están cambiando el mundo y la imagen rígidaque teníamos del mundo de los seres vivos.

El clonaje de un gen se basa en:

1) la fragmentación del ADN total del organismo que posee el gen de interés, paraseparar de él y sin que resulte fragmentado, el gen elegido.

2) la unión del ADN correspondiente al gen elegido al ADN de un vector genéticoresultado de lo cual se obtiene una molécula de ADN recombinante (ADN - r).

3) la introducción de este ADN - r en un hospedador adecuado que haga posible suclonación o propagación o multiplicación.

4) la selección de células individuales del hospedador que haya recibido (CLONES) lamolécula de ADN - r.

5) conseguir en esa células la expresión de ese ADN - r para obtener la proteína que él

codifica.6) separar y purificar la proteína buscada.7) si el vector es resistente al CLOROFENICOL (que inhibe la síntesis proteíca celular)

se pueden obtener hasta 3000 copias del vector (con su ADN - r incorporado) aumentando laproductividad de la proteína buscada.

DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

→ El ADN de un organismo procariota está constituido por una secuencia continua de genes

que se expresan;→El ADN de un organismo eucariota contiene regiones que no se expresan (INTRONES)dispuestas entre las regiones que sí se expresan (EXONES).

OTROS PROBLEMAS: → Un gen puede estar regulado de tal forma que sólo se exprese:

a) en un determinado período de desarrollo del organismo;b) sólo en un tipo de determinado de células (tejidos)

⇒ CONSECUENCIAS:

Las características especiales de esos tipos de genes hacen que pueda ser deinterés el clonaje a partir de un ARN - m como material de partida, el cual, por acción de laTRANSCRIPTASA INVERSA o RETROTRANSCRIPTASA pueden dar lugar a un ADN - c(ADN complementario) que sólo contendrá las secuencias que se expresan (EXONES). EsteADN - c puede clonarse, y bajo ciertas condiciones, expresarse en un hospedar bacteriano,

→ pude ser útil tener todo el genoma de un organismo clonado, es decir, construir un BANCODE GENES o GENOTECA para disponer de todas las secuencias del ADN que codificanproteínas.→ el BANCO DE GENES puede ser también obtenido a partir de ARN - m en forma de ADN -c.→ el banco de genes sólo estará completo cuando se haya conseguido una colección de

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células hospedadoras de tal forma que cada categoría de ellas contenga un solo ADN oADN - c inserto.

OBTENCIÓN DE ADN

El ADN que se pretende clonar puede obtenerse de dos maneras:

→ por extracción desde la célula que lo contiene,→ por síntesis, como ADN -c , a partir de ARN - m .

Obtención y purificación de ADN celularEl estudio de la estructura molecular de las células bacterianas ha sido posible

gracias al perfeccionamiento de diversos métodos de fragmentación celular tales como:• la centrifugación• la cromotografía• la electroforesis

La primera operación a realizar consiste en la ruptura de las células lo que puederealizarse por:

• sonicación• trituración• sometiendo las células a presiones del orden de 1.400 atm. y

liberando rápidamente la presión.Cualquiera de los métodos permite obtener lo que genéricamente llamamos

EXTRACTO CELULAR

A continuación, la suspención de células rotas se somete a centrifugación

CENTRIFUGACIÓN

Para la centrifugación se comienza a velocidades bajas para que se sedimentenlas células que no se han roto y luego se pasa a 10.000 g durante 10 minutoS.

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El sobrenadante de esta primera centrifugación contiene fragmentos demembrana, ribosomas y todos los constituyentes solubles del citoplasma.

Este sobrenadante se somete ahora a una ULTRA - CENTRIFUGACIÓN . Laultracentifuga opera en una cámara al vacio (para reducir el ruido) y a través de refrigeración sehace un cuidadoso control de la temperatura.

El tratamiento de ultracentrifugación dependerá del tipo de células en estudio.Por ej.: para células eucariotas:

1º centrifugación a 1000 g durante 10 min.

sobrenadante culote: nucleos y células intactas

2º centrifugación : a 20.000 g, 20 min.

sobrenadante culote: mitocondrias y cloroplastos

3º centrifugación: a 10.000 g , 1 hora

sobrenadante culote: membranas

4º centrifugación: a 150.000 g , 3 horas

culote: ribosomas

sobrenadante

extracto celular

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FRACCIONAMIENTO DE LOS COMPONENTES CELULARES:

Del sobrenadante se pueden reparar por varias técnicas la macrocélulascelulares, de las que las proteínas son las más abundantes.

→ una de la técnicas más útiles es la ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa. Enun tubo de centrífuga se colocan, por ej.: 3 concentraciones de sacarosa (la mayor en el fondo)

y se agrega la muestra (por ej. con 3 componentes).Se centrifuga durante varias horas. Las proteínas migran hacia abajo hastaencontrar una densidad similar a la propia y allí se estacionan.

→ cromotografía de afinidad de columna→ electroforesis

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN CELULAR Si lo que se desea aislar es ADN el primer requisito es que este libre de otras

substancias. Para ello, lo principal es tratar el sobrenadante de laúltima ultracentrifugación (

si fueran células eucariotas, por ej. 3 horas a 150.000 g ) con ARN - asa.Esto elimina los ARNLas otras proteínas pueden eliminarse desnaturalizandolas selectivamente

con fenol.Si estas etapas se repiten varias veces pueden obtenerse ADN puro, pero ,por

supuesto, en fragmentos de varios tamaños al azar.La longitud de estos segmentos nunca supera la centésima parte de uncromosoma completa.

→si se partiera de células completas, y sin pasar por la ultracentifugación, el esquema básicodel tratamiento sería el siguiente:

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ELECTROFORESIS EN GEL La forma rutinaria de analizar moléculas de ADN es la electroforesis en gel.El gel es una red compleja de moléculas poliméricas sobre un soporte

(placa de vidrio).La electroforesis consiste en aplicar un campo eléctrico continuo. El

desplazamiento de una partícula colocada sobre el gel de agar es inversamenteproporcional a su talla. para que pueda desplazarse deberá tener carga eléctrica.

Si se usa AGAROSA como gel se pueden separar moléculas de varios cientoshasta 2.000 pares de bases.

Si se emplea POLIACRILAMIDA se puede elegir el grado de polimerización yobtener una malla que permita la separación de trozos de ADN más pequeños.

→ en la inmunoelectroferesis después de someter una mezcla de moléculas (ANTÍGENOS) al campo eléctrico, se hace correr los ANTICUERPOS específicos de las moléculasbuscadas. La especificidad de la reacción antígeno - anticuerpo y el empleo de anticuerposque lleven adosados un compuesto fluorescente permite la ubicación inmediata delfragmento de proteína (INMUNOFLUORESCENCIA) por observación , usando la luz U.V.→ normalmente los fragmentos de ADN , después de correr sobre la placa de agarosa opoliacrilina, se tiñen (por simple rociado) con BROMURO DE ETIDIO y se observantambién empleando luz U. V.

→ las distancias que migran los trozos de ADN reflejan sus tamaños, que puedenestimarse haciendo correr en forma paralela fragmentos de ADN de tamaño conocidocomo marcadores y referencia.

ABSORCIÓN DE LUZ U.V. POR EL ADN : Un método muy empleado para detectar la presencia de ADN en una

solución es por absorción de radiación ultravioleta.Debido a las bases de purina y pirimidina, el ADN presenta una absorbancia

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máxima a los 260 nm.El ADN bicatenario absorbe con menor energía que el monocatenaria. Esto

se debe a que los enlaces de puentes de hidrógeno entre las bases opuestas reducen laabsorbancia de la radiación U.V.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL ADN. La oble hélice del ADN se mantiene unida por gran cantidad de enlaces

débiles (puentes de hidrógeno):• 3 puentes en las uniones C - G• 2 puentes en las uniones A - T

La separación de las 2 cadenas provocada por el calor se denomina FUSIÓN Cuanto mayor sea el contenido de C - G tanto mayor será el punto de fusión

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El punto Tm de transición de doble cadena a cadenas sencillas, punto de fusión, es unafunción del contenido en C -G

Si se permite que el ADN fusionado se enfríe lentamente, se puede volver aformar el ADN nativo de doble hélice.

PRODUCCIÓN DE ADN SINTÉTICO:

Si se conoce la secuencia de aminoacidos de una proteína (estructuraprimaria) la "traducción reversa" de los tripletes correspondientes, utilizando el códigogenético, nos permite deducir la secuencia de los pares de bases que la codifican desde elADN.

En 1985, KAPLAN presentó una maquina automática de síntesis de ADN que

puede producir fragmentos de ADN de 20 a 100 pares de bases. Estos pueden serconectados para lograr una secuencia más larga.

Ejemplos:• síntesis del gen de la SOMOSTATINA ( una hormona peptida del crecimiento)• síntesis de los genes correspondientes a las cadenas A y B de la INSULINA

que se consiguieron hacer expresar en Escherichia coli.• producción de mutaciones altamente específicas por síntesis de genes en los que se

cambian unas por otras bases.

cadena A INSULINA

1 Gly Phe 1 2 Ile Val 23 Val Asn 34 Glu Gln 45 Gln His 5 OVEJA Cys Cys Ala Gly Val Cys6 s Cys Leu 67 Sys S - S Cys 7 * VACA Cys Cys Ala Ser Val Cys8 Ala Gly 89 Ser Ser 9 * CERDO Cys Cys Thr Ser Iso Cys10 Val His 1011s Cys Leu 11 * BALLENA Cys Cys Thr Ser Iso Cys

12 Ser Val 12

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13 Lev Glu 13 CABALLO Cys Cys Thr Gly Iso Cys14 Tyr Ala 1415 Gln Leu 1516 Leu Tyr 1617 Glu Leu 1718 Asn Val 1819 Tyr Cys 19

20 Cys s s Gly 2021 Asr Glu 21Arg 22Gly 23

+ HUMANA Phe 24Phe 25Tyr 26Thr 27Pro 28Lys 29Ala 30

cadena B

SÍNTESIS DE ADN-C:Se deberá tener en cuenta que:

• debe haber una relación transcriptasa inversa / ARN - m alta de manera deasegurar un buen rendimiento del proceso;

• debe evitarse la presencia de ARN - asas, para la cual, entre otros método,pueden agregarse inhibidores de estas enzimas como los vanadil -ribonucleótidos;

•

el proceso de síntesis puede ser ligeramente diferente según se use comomolde ARN - m eucariota o ARN - procariota.

SÍNTESIS DE ADN - C A PARTIR DE ARN - m EUCARIOTALos ARN - m eucariotas presentan en el 3 un polímero A.

→ la actividad de la transcriptasa inversa se verá favorecida por el agregado de unpolímero de timidina (oligo - dt) complementario de ese (oligo - dA).

5 AAAA 3 ARNDESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS;Mg , K ; p alcalino;

oligo dT;TRASCRIPTASA REVERSA;3 TTTT 5 ADN - c

hidroliaia o digestión delARN m molde

3 TTTT 5ADN - POLIMERASAMg , K ; pH alcalinodesoxirribonucleótidos tri - P

TTTT 5AAAA 3

NUCLEASA S 1(degrada el ADN monofilar)

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3 TTTT 5 ADN - c 5` AAAA 3 DE DOBLE HÉLICE

SÍNTESIS DE ADN - c A PARTIR DE ARN (eucariota)

SÍNTESIS DE ADN - c A PARTIR DE ARN PROCARIOTA

Los procariotas no presentan ARN - polianelado. Como posibilidades caben:

• añadir poli-A en el extremo 3 mediante la enzima POLI A - POLIMERASA deEscherichia coli;

• si se conoce la secuencia 3 - terminal del ARN, sintetizar en oligonucleótidocomplementario a dicha secuencia y emplearlo como iniciador.

FRAGMENTACIÓN DEL ADN Los procariotas poseen una enzimas que se llaman ENDONUCLEASAS con

las que por un par de actividades enzimáticas pueden defenderse de los ADN exógenostras infecciones virales, etc.

• METILASAS: protegen a las células mediante la metilación del ADN extraño.• ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN: se conocen más

dde600endonucleasas en bacterias.Las enzimas de restricción cortan el ADN bicatenario en sitios específicos. Se las

ha clasificado en tresTipo I : no cortan al ARN en un sitio especifico sino a una distancia de tipos:

varios nucleótidos de ese punto: son poco útiles en Ingeniería Genética.Tipo II : estas enzimas reconocen y rompen el ADN en secuencias

especificas (de 4 11 nucleótidos), dando lugar a fragmentos de ADN discretos enlongitud y con secuencias terminales bien definidas.Tipo III : su actividad está vinculada a la metilación del ADN aunque

lo cortan a distancia definidas de las secuencias de reconocimiento.

→ las enzimas de restricción del Tipo II son las empleadas casi con exclusividad por laIngeniería SECUENCIA ROTACIONAL . Por ej.: Eco RI del plásmido RI de Eschericia coli)tiene la siguiente secuencia de reconocimiento:

5 G A A T T C 3

3 C T T A A G 5 Con estas enzimas se obtendrá un número de fragmentos de ADN mayor

cuanto menor se el número de nucleótidos en la secuencia de reconocimiento.Ej: para una secuencia de reconocimiento de 4 nucleótidos, se producirá un corte

cada 4 = 256 pares de bases, suponiendo que las 4 bases aparecen conla misma frecuencia en el ADN .

Si la secuencia de reconocimiento es de 6 nucleótidos, se producirá un cortecada 4 = 4096 pares de bases del ADN.

∴∴∴∴ no es recomendable emplear endonucleasas de restricción de corte frecuente ya que secorre el peligro de fragmentar la secuencia que se quiere clonar. Así, tenemos en cuenta que

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un gen procariota típico tiene de 1 a 2 pares de kilobases ( 1 kilobase = 1.000 bases), esprobable que una endonucleasa de restricción que reconoce 6 pares de bases no llegue acortar tal secuencia.

Otros ejemplos de formar de cortar ADN:

3 C C C G G G 5 Xma I5 G G G C C C 3

Xanthomonas malvacearum

3 C C C G G G 55 G G G C C C Sma I

Serratia marcescens

3 G G A T C C 55 C C T A G G 3 B a m H I

Bacillus amyloliquefaciens

Las enzimas de restriccon del Tipo II, producen tres tipos de terminales:

a) terminales 5 - 5 PROTUBERANTESEj.: Eco RI

5 .... G A A T T C ... 33 ... C T T A A G ... 5 Eco RI

5 A A T T C ... ... G3 3 G ... ... C T T A A 5

b) terminales 3 - 3 PROTUBERANTES

Ej.: Pst I

5 ... C T G C A G ... 33 ... G A C G T C ... 5 Pst I

... C T G C A 3 5 G ...G 5 3 ACGTC ...

C) terminales ROMOSEj.: Hae III (Haemophilus aegypticus)

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5 ... G G C C ... 33 ... C C G G ... 5 Hae III

... G G 3 5 C C...... C C 5 3 G G ...

En las tablas se muestran las secuencias de reconocimiento de varias enzimas

del Tipo II.NUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (Tipo II)

SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO

SECUENCIAS DE RECONOCIMIENTO

AATT --------- ---------- --------- Eco RI --------- -------- ---------

-

---------

AGCT Alu I Hind III Pvu II Sac I ------- -------- -------- ---------

ATAT -------- -------- Nde I Eco RV --------- --------- -------- -------

CATG -------- -------- Nco I Sph I ------ --------- ------- --------

CCGG Hpa II ------ Xma I Nae I --------- Scr FI Bst NI Nci I

CGCG FnuD II Mlu I Sac II BssH II Nru I --------- --------- ---------

CTAG --------- --------- -------- -------- Xba I Dde I --------- -------

GATC Mbo I Bgl II Pvu Bam HI Bel I Hinf I --------- ----------

GCGC Hha --------- ------- Nar I Mst I Fnu4HI --------- Ns B II

GGCC Hae III Stu I Xma III Apa I Bal I Sau 96 I Ava II --------

GTAC Rsa I Rru I -------- Kpn I -------- ------- -------- ---------

TCGA Taq I Cla I Xho I Sal I Asu II --------- --------- ---------

TGCA --------- --------- Pst I --------- ------- --------- -------- --------

TTAA ---------- -------- Alf II Hpa I Aha III --------- --------- ---------

N = nucleótido cualquiera

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(Hind III : Haemophilus influenzae serotipo D)

UNION DE FRAGMENTOS DE ADN

Una vez disponible el ADN correspondiente a un gen de interés se puede proceder a tratartanto este ADN como el de un vector genético )generalmente un virus i un plásmido conuna misma enzima de restricción.

Por. ej.: Eco RI que produce extremos 5 - protuberantes de una sola cadena(extremos cohesivos). Las moléculas heterólogas se unen por simple apareamiento desecuencias complementarias.

Otro método consite en el empleo del agregado de nucleótidoscomplementarios sintéticos añadidos tanto al ADN como al vector. Estos nucleótidos sonmoléculas con 3 moléculas de ácido fosfórico:

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VECTORES GENÉTICOS

El ADN que participa en las recombinaciones genéticas puede formar partede varias estructuras. El número de genes da una idea del número de funciones quecodifica cada tipo de ADN.

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ORGANISMOO

ESTRUCTURA

Nº APROXIMADODE

GENES

. de cósmidos

. de plásmidos

. de virus, fagos

. de bacterias

. de levaduras

. de células vegetalesy animales

. 10

. 10

. 10

. 10. 10

. 10 10

Debemos recordar que mientras que el ADN procariota está constituido por unasecuencia continua, el ADN eucariota contiene regiones que codifican funciones o proteínas(llamadas EXONES) entre los cuales hay otras regiones que por el contrario, no se expresan(llamadas INTRONES).

Un vector genético es una molécula de ADN con un origen de replicación distintodel ADN cromosomal y que posee zonas de su genoma que no son esenciales para sumultiplicación, donde pueden introducirse trozos de ADN exógeno.

→ Estos vectores actúan como portadores de ese ADN permitiendo su replicación en formade una molécula híbrida vector - ADN exógeno dentro de la célula anfitriona del vector.

→ En general, puede separarse fácilmente el ADN cromosomal del ADN del vector,obteniendo así cantidades importantes del ADN insertado (CLONACIÓN).

Como vectores para la transferencia y clonación de ADN más utilizados son:• los plásmidos• los fagos atenuados o temperados• los cósmidos

PLÁSMIDOSSon moléculas de ADN:

•

circulares• extracromosomales• autorreplicativas

1,5 x 10 = peso molecular = 200 x 10

→ los plásmidos grandes son conjugativos y existen de 1 a 2 copias. por cromosomabacteriano.

→ los plásmidos pequeños no son conjugativos y existen más de 10 copias porcromosoma bacteriano.→ algunos plásmidos exhiben el fenómeno de la INCOMPATIBILIDAD por el que 2 plásmidos

relacionados no pueden ser mantenidos a la vez dentro de la misma célula.

→ los plásmidos son incapaces de añadir ADN exógeno al ADN de la célula anfitriona (por

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ej.: por intercambio recíproco de segmentos =

→ los plásmidos codifican para numerosas y variadas funciones celulares:

• FERTILIDAD: capacidad de transmitir material genético durante la conjugación.• RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: son los plásmidos R que existen en más de 50

especies de bacterias.• RESISTENCIA A METALES PESADOS: Col , Hg .• RESISTENCIA A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA.• PRODUCCIÓN de substancias que inhiben o matan células de la misma especie• PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS• UTILIZACIÓN DE FUENTES DE CARBONO POCO FRECUENTES (ver cuadro)• FORMACIÓN DE TOXINAS Y ANTIGÉNOS DE SUPERFICIE.• INDUCCIÓN DE TUMORES EN PLANTAS: ej.: el plásmido Ti de Agrobacterium

tumefaciens (tumores de agallas).• INFLUENCIA EN LA ESPORULACIÓN (Streptomyces)

PLÁSMIDOS CATABÓLICOS DE pseudomonas (SAUNDERS, 1987)

PLÁSMIDO SUBSTRATO QUEDEGRADA

CONJUGATIVO

NAHSALCAMOCTTOLpJP1pAC25pAC27

naftalenoácido salicílicoalcanforoctano, hexano, decanop ó m-xileno y toluenoác. 2,4 diclorofenoxiacético3 - clorobenzoato3 y 4 clorobenzoato

SISISINOSISISISI

Aunque no puedan ser integrados al ADN cromósomico pueden conferir propiedadesimportantes a la célula anfitriona y mantenerse dentro de la misma a través de suREPLICACIÓN AUTÓNOMA

Un plásmido óptimo para ser utilizado como vector en Ingeniería Genética es aquel que:a) tiene un control relajado de replicación, o sea, puede replicarse

independientemente del ADN comosómico: esto permite obtener grandes cantidades del ADNexógeno insertado en él;b) la resistencia a antibióticos que confiere a la célula anfitriona debe permitir la

identificación de las células que lo contienen;c) posee secuencias de ADN con características tales que pueden ser

reemplazados por ADN exógeno sin que esta subtitulación altere las características dereplicación;

d) posee un amplio espectro de secuencias de reconocimiento para enzimas derestricción.

e) los sitios de restricción se encuentran en el plásmido de tal manera que lainserción de ADN exógeno en cualquiera de ellos deje utilizable al menos un marcador

fenfotípico para selección;f) por seguridad, a veces es preferible que no sea conjugativo.

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Para Escherichia coli se han diseñado un gran número de plásmidos. Se hapodido insertar en algunos de ellos hasta 5 10 kilopares de bases.

ALGUNOS PLASMIDOS DE Escherichia coli EMPLEADOS EN INGENIERÍA GENÉTICA

PLÁSMIDOS SITIOS DERESTRICCIÓN

MARCADORESAMPLIFI-CABLES

* Cco EI

pSC 101

pCR 1

pMB 9

p BR 322

p BR 328

p AT 153

P BR 327

Eco RI, Sma, Xma I,Hind II, Pst 1

Eco RI

Eco RI, Hind III, Sal I

Eco RI, Hind III, Sal IBam HI, Sph

Eco RI, Hind III, Sal I,Bam HI, Pst I, Pvu II

Eco RI, Hind III, Sal

I,Bal I, Pvu II, Bam HI,Pst, Pvu I.

Eco RI, Hind III, SalI,Xma III, Bam HI,Pst I, Pvu I, Sph I.

Eco RI, Hind III, Sal

I,Bam HI, Pst I, Pvu I,Sph I.

Elimm

Tc

KmElimm

TcElimm

ApTc

Cm

ApTc

ApTc

ApTc

+

-

+

+

+

+

+

+

* varios cientos de copias en presencia de clorofenicolElimm: producción de COLICINA; TC , Km , Ap , Cm , resistencia a tetrasiclina,

Kanamicina, ampicilina y Clorombenicol.

Un vector genético comúnmente empleado es el pBR 322 que contiene: pBR 322

• elementos necesarios para si replicación (del pMB 29); ORI representa el origen dereplicación del plásmido;

• el gen Ap (del pRSF 2124) que confiere resistencia a la ampicilina;

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• el gen Tc (del pSC 101) que confiere resistencia a la tetraciclina;• una secuencia de nucleótidos que puede cortarse con la enzima de

restricción Bam HI;• secuencia de nucleótidos que pueden igualmente cortarse con Eco RI,

Hind III, Sal I, Pvu II, Xma III, Sph I y Pst I.

.4363 pares de base

Si el plásmido se corta con BamHI para insertar el ADN exógeno se pierde la resistencia a latetraciclina ( 0 Sal I ).

Si se corta con Pst I, a la ampicilina.Si se corta con Eco RI no pierde ninguna de las 2.

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ESTRUCTURA COMPLETA DEL pBR 322

• se muestran los sitios de ruptura.

→ dirección de transcipción de los genes Ap y Tc

→

dirección de duplicación semiconservativa del ADN• los números corresponden al nucleótido 5 de cada secuencia de reconocimiento.

(de R.W.OLD y S.B. PRIMROSE; "Principles of Gene Manipulatiin").

BACTERIOFAGOS

• Los fagos presentan algunas ventajas sobre los plásmidos y de ellas la principal esque pueden alojar mayores fragmentos de ADN exógeno.

• El más empleado es el BACTERIOFAGO LAMBDA DE E. coli.

El genoma del fago es un ADN de doble cadena de un tamaño de 50 Kb.

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Se extrae de la cápside viral como una molécula circular, debido a que en sus extremos 5´posee 12 nucleótidos protuberantes de cadena sencilla y de secuencia complementaria(extremos cohesivos COS) cuya hibridación permite la circularización de la molécula.

• tan importante es el fago como vector de clonación, que A.D. HERSHEY ha

escrito en un libro para ocuparse de él (The bacteriofage lambda).• Sólo haremos referencia aquí a sus principales características.

→ Si consideramos al fago como una milécula lineal podemos esquematizarlo:

→ en la parte izquierda están los genes requeridos para la síntesis del virus:1 : proteínas del CÁPSIDE estructura 2 : proteínas de la COLA del fago

→ en la parte derecha están:5 : genes implicados en la lisis de la célula anfitriona4 : genes que codifican la síntesis del ADN del fago.

→ a parte central está constituida por:3 : genes que controlan la recombinación e integración de ADN exógena.

- xxx -- xxx - : genes que no son esenciales para el desarrollo del fago.

el ADN de esta zona es el que se puede emplear para fabricarvectores de clonación.

La zona central puede ser utilizada para:→ reemplazar el ADN del fago por fragmentos exógenos de ADN que se pretende

clonarvector de reeplazamiento

→ insertar fragmentos de ADN exógenos

Vector de inserción

→ después de extraído de la cápside viral y de haber sido transformado en un vectorde reemplazamiento o en un vector de inserción, el ADN del fago se reempaqueta enla cápside obteniéndose un virus infeccioso que contiene o porta fragmentos de ADNexógeno.

→ los vectores de reemplazamiento tienen capacidad de hasta 25 kb.

→

los vectores de inserción tienen capacidad de hasta 18 kb.(hasta 10 kb en los plásmidos)

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COSMIDOS

Los cósmidos son vectores genéticos que pueden considerarse mezcla deplásmidos y fagos.

→ posee genes que le confieren reistencia a antibióticos, el origen de replicación de unplásmido, los extremos cohesivos del fago , secuencias de corte por enzimas derestricción donde pueden colocarse los fragmentos de ADN exógeno que se quiereclonar.

→ su tamaño es PEQUEÑO : 5 kb.

⇒ tiene capacidad para fragmentos de ADN exógeno de hasta 45 kb.

OTROS VECTORES

Si bien la bacteria Escherichfia coli es la célula más empleada como anfitrionade ADNr, se han creado vectores que pueden funciones en otros tipos de células.

PARA PROCARIOTAS

• Bacillus sp : sobre todo para producir enzimas;• Pseudomonas sp : son recomendables par hospedar plásmidos

recombinates debido a su capacidad para degradar muchos contaminantes.

PARA EUCARIOTAS

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• LEVADURASLas levaduras contienen el PLÁSMIDO 2Se han construído plásmido para levaduras para obtener proteínas de

mamíferos que pueden o no contener el plásmido 2 .Algunos de estos plásmidos por contener secuencias del ADN cromosómico

de las pueden replicarse dentro de ellas de manera autonóma y estar presentes envarias copias.

Las levaduras más empleadas son:

. Saccharomyces cereviside

. Kluyveromyces fragilis

. Hansenula polymorpha

• VEGETALES

Se han diseñado vectores de clonación de genes en vegetales empleando elPLÁSMIDO Ti de Agrobacterium tumefaciens .

La bacteria Agrobacterium tumefaciens es inductora de tumores en forma deagallas en los vegetales al incorporarse al ADN de las plantas.

Estos plásmidos se construyen cortando el plásmido Ti e insertando ADNcon el objeto de fmejorar el valor nutritivo o las características de flos frutos, incorporar laresistencia a herbicidas, y se busca poder expresar en cereales los genes fijadores denitrógeno de RHIZOBIUM.

• Células de mamífero

Se emplea el SV 40El ADN de este virus tiene un peso molecular de 3 x 10 dalton.Posee 2 sitios de restricción:

• uno para Hpa II• otro para Bam HI

Estas enzimas permiten cortarlo en 2 fragamentos:• uno que contiene un gen (GEN A) que codifica la proteína requerida para la

replicación viral junto al gen que codifica el origen de esta replicación;• otro que contiene solamente los genes que codifican las protéinas

estructurales del virus.

→ el primer segmento sirve para ligar el ADN que se quiere clonar obteniendose un virusmutante capaz de donarse en las células anfitrionas del mono (las del riñón).

INTRODUCCIÓN DEL ADN-R EN LACELULA ANFITRIONA

CASO DE PROCARIOTAS

Lo más usual es:a) introducir el ADN exógeno utilizando como vectores plásmidos y bacteriofagos

previo tratamiento de las bacterias con soluciones de Ca y Mg a bajas temperaturas.b) el ADN - r si penetra con un bacteriofago puede hacerlo también según el

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mecanismo de la TRANSDUCCIÓN que ya hemos descripto.c) moléculas de ADN - r pueden penetrar en una célula bacteriana mediante un

mecanismo descripto como TRANSFORMACIÓN cuyo mecanismo puede describirse comosigue:

TRANSFORMACIÓN • El ADN - r sólo puede penetrar una bacteria en el momento de la división celular

en el que se está sintetizando la pared celular: en este estado del ciclo decrecimiento las células se dicen COMPETENTES;• El ADN - r se une a esos lugares accesibles de la pared celular; unido el ADN -

r a la pared celular una de las fhebras del mismo es degradada porendonucleasas;

• la hebra no degradada ingresa a la célula bacteriana;• por fla existencia de zonas de homología el ADN - r es ontegrado al ADN

cromsómico (por ej.: por intercambio recíproco de segmentos).

d) por FUSIÓN DE PROTOPLASTOSSe llama PROTOPLASTOS a las células desfprovistas de su pared celular.Esto puede conseguirse por digestión de la pared celular con la enzima

LISOZIMA o bien por tratamiento con PENICILINA que es un antibiótico inhibidor específicode la síntesis de la pared celular.

El polietilen glicol favorece la fusión de las protoplastos y la obtención de unacélula híbrida vfiable (capaz de dividirse).

La fusión de protoplastos permite recombinar ADN provenientes de ce`pas yhasta de especies diferentes y obtener así una célula híbrida.

La recombinación de protoplastos se produce con la frecuencia superior al 20

% (relativamente alta).Los protoplastos una vez fusionados reparan por recombinación su ADN yesto es muy importante porque su ADN y esto es muy importante porque la recombinaciónpuede hacerse entre segmentos de muy diferente localización. . Algunos productosobtenidos por BIOTECNOLOGÍA dependen de un gran número de genes (rutasmetábfolicas de producción del metabolito, alteración de la permeabilidad celular, etc.).

El rendimiento del proceso puede ser optimizado por irradiación conultravioleta: esta es letal para los protoplastos que no han refparado por fusión yrecombinación sus cromosomas.

CASO DE CÉLULAS EUCARIOTAS

a) La fusión de protoplastos que comenzó aplicándose primero a células vegetales yanimales

Recordar que el producto de la fusión de 2 protoplastos es una nueva célula,híbrida pero viable, es decir, capaz de dividirse y formar colonias.

b) la transformación (introducción de ADN - r) de células eucariotas desprovistas dela pared celular , tanto para células vegetales como animales.

c) la microinyección (sobre todo en caso de células de mamíferos).

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RECONOCIMIENTO Y SELECCIÓN DE LASCÉLULAS QUE CONTIENEN ADN -r

• genes marcadores• hibridación• de colonias• por electroforesis

Por la presencia de genes marcadores

El reconocimiento y selección de células que contengan ADN recombinantepuede realizarse estudiando la presencia de genes marcadores incluídos en la molécula delADN - r.

Estos genes confieren a la célula anfitriona resistencia a algún antibiótico, loque le permite crecer en presencia del mismo.

Después de cortar, por ej.: el pBR 322 y el ADN que contiene el gen deinterés, utilizando una LIGASA se obtiene el plásmido con el ADN r. Luego se trasnformaun cultivo de E. coli y se siguen los pasos del esquema.

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICOS

→ Cuando se tiene ADN de una sola hebra la hidridación consiste en la formación de lasegunda hebra por simple complementariedad de bases. Es lo que se denominaTRANSFERENCIA DE SOUTHERN En este método, si se parte de un ADN natural (de 2

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hebras), uno de los pasos intermedios será, necesariamente, su desnaturalización, o sea laobtención de un ADN de cadenas sencillas.

Es decir, la TRANSFERENCIA SOUTHERN describe el proceso de hibridaciónde una sonda de ADN sencillo con ADN complementario. Este ADN complementario puedeestar marcado , por ej.: con P 32 , de manera de poder obtener una radiografía con rayos X.

La transferencia de SOUTHERN puede realizarse a partir de una placa deelectroféresis en agarosa o bien a partir de un cultivo en cajas de Petri.

La TRANSFERENCIA DE NOTHERM hibrida ADN de una sola hebra pero conARN marcado, por ej.: con P lo que permite la posterior obtención de una imagenradiográfica con rayos X.

HIBRIDACIÓN DE COLONIAS

Este es el método más útil.

Debe disponerse de una SONDA que consiste en un ácido nucleico con unasecuencia Complementaria y posee un marcador radioactivo (generalmente P ). En estemétodo se parte de las colonias cultivadas en agar y presumiblemente transformadas.

A partir de esta "placa madre" se hace una REPLICACIÓN EN PLACA.Esta consiste en hacer contactar una almohadilla estéril de terciopelo con la

"placa madre" Con la almohadilla de terciopelo se lleva la imagen especular de las colonias de

la "placa madre" a una membrana filtrante de nitrocelulosa que luego se deposita sobre otracaja de Petri que contiene un medio nutritivo sólido.

Los nutrientes difunden a través del filtro lo que permite obtener después de laincubación lo que hemos dicho es la imagen especular de la "placa madre".

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..

.;

A continuación se lisan con un álcali las colonias que han desarrollado sobre lamembrana filtrante.Esta operación también desnaturaliza su ADN (lo corta en 2 hebras) y este

ADN se fija por calentamiento a 65º C.

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→ El resultado de estas operaciones es la substitución de las colonias por ADNdesnaturalizado y fijado en el mismo sitio que ellas ocupaban.

A continuación, la membrana filtrante se incuba en una solución de la sondamarcada con P a temperatura también de 65 º C. La sonda marcada sólo se hibridarácuando haya complementariedad perfecta entre las 2 hebras de ADN.

Luego se procede a lavar el filtro para eliminar la sonda que no se ha unido.

Una radiografía por exposición a los rayos X del filtro permite conocer lasposiciones de la sonda hibridada y a partir de ellas seleccionar, recuperar y cultivar lascolonias transformadas

RECONOCIMIENTO Y SELECCIÓN DE CÉLULASCON ADN- r POR ELECTROFORESIS SOBRE GEL

→ La TRANSFERENCIA SOUTHERN consta de los siguientes pasos:• El ADN celular, de alto peso molecular se fragmenta con varias enzimas de

restricción• Los fragmentos obtenidos en cada uno de los ataques se separan por tamaños

empleando electroforesis en gel de agarosa;• Luego el gel de agarosa se coloca sobre una hoja de nitrocelulosa;• Se hace pasar una solución amortiguadora para que los fragmentos de ADN pasen

a la hoja de nitrocelulosa.• Sobre la hoja de nitrocelulosa queda una réplica de los fragmentos de ADN sobre el

gel de agarosa;• Se desnaturaliza el ADN con álcali (se obtiene ADN monofilar) y se fija a 65º C;• Se híbrida con una sonda de ADN monofilar marcado con P ;

• Los fragmentos de ADN que hayan hibridado con la sonda se harán visibles despuésde una autorradiografía con rayos X.

→ La TRANSFERENCIA NOUTHERN sólo se diferencia de la SOUTHERM en que la sondaempleada para hibridar el ADN monofilar es una sonda, también marcada con P , pero no deADN sino de ARN.

Como sólo el ARN- m se puede hibridar a un ADN monofilar, la primeraoperaciónOPCIÓN es aislar el ARN-m.

Para aislar el ARN-m del ARN-r y del ARN-t se puede utilizar la propiedad, yamencionada, de que el ARN-m presenta una cola poli-A en el extremo 3´.

La separación se realiza haciendo pasar la mezcla de ácidos nucleicos a través de unacolumna de celulosa con extremos poli-T.

El ARN-m se hace hibridar luego con el ADN desnaturalizado total. Luego se lava, conlo cual el ARN-m no hibridado es eliminado.

A continuación se libera el ARN-m hibridado y se lo traduce "in vitro".Se determina la estructura de la proteína y a continuación se selecciona el clon que

contenía el ADN-r lavado.

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ARN total

. aislamiento de ARN-m utilizando una columna de celulosa oligo . d T

. hibridación de todo el ARN-m con el total del ADN

. lavado de los ARN no hibridados

. liberación del ARN-m hibridado

. traducción "in vitro" del ARN-m hibridado

. determinación de la estructura de la proteína producida

. selección de los clones que poseen el ADN-r buscado.

→ La opción más sencilla, si se conoce la estructura de la proteína que codificar el ADN-rbuscado, es sintetizar el ARN.m correspondiente marcándolo con P (verdaderaTRANSFERENCIA NORTHERN).

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SECUENCIACIÓN DEL ADN

La secuenciación del ADN representa el paso último en la caracterización del gen..Deben destacarse que:

→ hay programas de computación que permiten comparar secuencias de manera eficiente(FRISTENSKI et al. )→ existen bancos de información sobre secuencias nucleotidicas que pueden ser consultadosy que contienen todas las secuencias de genes que han sido publicadas (GENBANK)

De todas maneras, la secuencia de nucleótidos en un gen sólo puede serdeducida parcialmente→ porque la secuenciación abarca sólo la parte codificadora del gen y dejfa de lado lossectores reguladores y aquellos que no codifican (INTRONES).→ la secuenciación no tiene en cuenta que un aminoácido puede ser codificado por más deun cordón.

Debemos recordar que el ADN crece siempre en el sentido 5 ----- 3 porincorporación de un desoxirribonucleótido trifosfato en el extremo 3 (oxhidrilo libre). Los 4

desoxirribonucleótidos trifosfato son:

d TTP : desoxitimidina - tri - Pd ATP : desoxiadenosín- tri - P

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d CTP : desoxicitosina - tri Pd GTP : desoxiguanidin - tri P

Es evidente, que si alguno de los 4 desoxirribonucleótidos - tri- P, no contiene eloxidrilo en la posición 3 (será entonces un di - desoxirribonucleótido - tri ) se convertirá enun TERMINADOR DE LA CADENA.

Uno de los métodos de secuenciamiento de ADN es el de SANGER - NICKEN -COULSON que consite en lo siguiente:

a) se parte de una hebra de ADN a la que se le adosa un cebador o iniciador cortode ADN (esto implica el conocer el extremo o desconocida esa secuencia "pegar" primero una

conocida);

b) se divide en 4 alicuotas iguales;

c) a cada una de ellas se agrega un desoxirribonucleótido - tri - P marcadoradioactivamente y un di - desoxirribonucleótido - tri - P (terminador); una porción con A, otro

con C, otra con T y otra con G; y además ADN - polimerasa;d) se hacen correr los compuestos de A, T, C y G por electroforesis sobre un gelde poliacrimida, cada una de las mezclas por un camino;

e) en cada uno de los 4 casos la ADN polimerasa ha ido produciendo la cadena

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complementaria, incorporando por lo menos una vez una de las cuatro bases nitrogenadas A,T, C y G.

e´) cada una de las 4 cadenas complementarias se cortará cuando se incorporea la misma un di- desoxirribonucleótido - tri - P (terminador).

f) se hacen correr paralelamente cada una de las 4 mezclas reaccionantes porelectroforesis sobre un gel de poli - acrilamida;

g) la electroforesis separa los fragmentos sintetizados por la ADN - polimerasa,

h) la autorradiografía por exposición a los rayos X permite ubicar las bandas decada producto de reacción.i) el patrón obtenido puede leerse directamente.

ALGUNAS APLICACIONES DE LAINGENIERÍA GENÉTICA

POLIMERIZACIÓN EN CADENA DEL ADNLa ampliación "in vitro" del ADN (o PCR: Polymerase Chain Reactión) ha

significado una autentica revolución en la Biología.Fue desarrollada en 1985 por K.B. MULLIS de la empresa norteamericana

CETUS.Permite obtener en un breve tiempo grandes cantidades de copias de un trozo

de ADN a partir de muy poco ADN (incluso el aportado por una sola célula).La patente de la PCR fue comprada por la empresa HOFFMAN - LA ROCHE.Sus aplicaciones comprenden desde la investigación de una mutación en un

embrión (problema ético: podría así impedirse el nacimiento de un niño a través de undiagnostico prenatal de enfermedades hereditarias graves), descubrir una infección virica obacteriana, seguir la evolución de un cáncer, establecer la paternidad o no de un niño eincluso, hasta identificar a un criminal.

En la práctica, el índice medio de ampliación de una PCR es de

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aproximadamente un millón.Supongamos que deseara investigar una anomalía de la hemoglobina en el

marco de un diagnóstico prenatal.El gen responsable, supongamos está compuesto de 1.500 nucleótidos. una

toma de sangre del feto a la madre embarazada aportaría como mínimo unas 10.000 células.De estas 10.000 células se obtendrían 10 g del ADN genómico del feto y de

estos sólo 10 g del ADN de ese gen.

Y esto, puede realizarse en pocas horas mientras que las técnicas clásicas quehemos visto con el uso de enzimas de restricción y de los vectores adecuado llevaría variassemanas.

10 g de ADN se analizarían rápidamente a través de una electroforesis. Porej.

Veamos en un esquema en que consiste la técnica de la PCR.

Se puede observar que el ADN se multiplica en forma exponencial.

→ problema de los CEBADORESSe necesita inexcusablemente conocer la secuencia de por lo menos los

extremos del ADN.En la práctica, cuando se buscan determinadas contaminaciones, el equipo de

un costo de $ 30.000, contiene un "banco" de cebadores (para Salmonella, Shigella, virus dela hepatitis B, agentes de enfermedades como lepra, tuberculosis, etc.).

Si se conoce la secuencia de aminoácidos de una proteína, a través del CódigoGenético, pueden sintetizarse los cebadores correspondientes para ampliar y estudiar el genque codifica su síntesis. Si se conoce alguno de los e extremos se puede sintetizar elcebador correspondiente y fijar en el otro un ANCLA constituido por una serie de C o G.

Cuando sedesconocen ambos, se fijan ANCLAS en los 2 extremos.

→ las condiciones experimentales deben ser optimizadas para conseguir los máximos

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rendimientos.→ ventajas : pone en evidencia las formas "viables pero no cultivables" de microorganismos

pero amplifica también ADN de células muertas.

→ problemas de contaminación: deben extremarse los cuidados pues una sola moléculade ADN intruso, por la sensibilidad del método, puede llegar a falsear los resultados.

→ LOS PROBLEMAS ÉTICOS DE LA PCR• podría llegarse a un abuso del diagnóstico prenatal y a que la sociedad

sólo aceptara a individuos que gozarán de buena salud.• la PCR podría generar una discriminación de individuos en el plano

laboral;• pondría a los padres en la disyuntiva de aceptar o no tener algún defecto;• las huellas genéticas pondrían al descubierto que en Europa, por ej.: más

del 10 % de los hijos que se presumen legítimos son enrealidad adulterinos;

• en Francia (en 1991) la ley estableció que al margen de los fines médicos o

científicos, la identificación genética de las personas, aún encasos judiciales, sólo puede realizarse con el acuerdo expresode las personas a quienes se toman muestras.

La identificación de personas a través de la PCR esta basada en :• si bien el ADN humano presenta mínimas variaciones de un individuo a

otro, existen en el genoma regiones llamadas MINISATÉLITESy MICROSATÉLITES variables y repartidos a lo largo de los

cromosomas;• para poder diferenciar una persona de otra sólo interesan las fracciones

de ADN polimórficas, es decir que sean muy distintas de una

a otra persona:• los MINISATELITALES sin pequeñas secuencias de bases que se

repiten. Por ej.: si una hebra de ADN normal fuera:

... A G G A T G C T C A A T...

Un minisatélite seria

... A G G G C T C T C T C T CT C T C T T G C T C A A T...

se presenta como una sucesión de un par de bases nitrogenadas repetidas "n" veces,mientras que un MICROSATÉLITE no sobrepasa de un par de bases copiadassucesivamente no más de 5 veces;

• los genetistas han logrado identificar algunas de estas secuenciashepervariables de una persona a otra, no solo por su constitución sinopor su longitud;

• los genetistas han sintetizado a partir de estas secuencias sondasradioactivas capaces de identificar los minisatélites que

constituyen lo que llamaríamos una verdadera HUELLAGÉNICA : en una electroforesis se obtiene para cada personalo que sería equivalente al CÓDIGO DE BARRAS con que se

identifican los productos en un supermercado;• en la HUELLA GÉNICA de un individuo sólo aparecen dos bandas

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individuales:una heredada del padre y otra de la padre.

I I ABUELO MATERNOI I ABUELA MATERNA

I I ABUELO PATERNO I I ABUELA PATERNA I I PADRE

I I MADREI I HIJO 1

I I HIJO 2I I HIJO 3

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Para producir anticuerpos habría que inyectar animales con los antígeneos,esperar que estos los produjeran, extraer la sangre y separarlos del suero. El procedimiento,largo y tedioso, permitía obtener, en cantidades limitadas, anticuerpos que variaban de unanimal a otro en especificidad y afinidad, y que además contenían proteínas contaminantes.

Con el descubrimiento de CESAR MILSTEIN se puede disponer ahora de

anticuerpos absolutamente homogéneos, que se pueden producir en forma continua y con lamisma especificidad y afinidad.En los años de la década de los 90, la venta de anticuerpos monoclonales

supera holgadamente los 4.000 millones de pesos anuales.

→ las células productoras de losa anticuerpos son los LINFOCITOS B que se extraen delBAZO y pueden cultivarse "in vitro" aunque no sobreviven más allá de algunas divisiones.

→ el descubrimiento de MILSTEIN consistió en FUSIONAR los linfocitos B con célulasMIELOMATOSAS (células cancerosas de un tumor de finfocitos) en un medio de cultivoadecuado al que además se agrega POLIETILENGLICOL.

→ como las células MIELOMATOSAS tienen capacidad de vivir indefinidamente, las célulasque se obtienen por fusión y se llaman HIBRIDOMAS , no sólo puede crecer indefinidamentesino que además producen los mismos anticuerpos que los linfocitos B.

→ como sólo una de cada 2 X 10 células de linfocitos B logran fusionarse, debeneliminarse las células mielomatosas no hibridadas.

→ para ello se usan células mielomatosas genéticamente alteradas y por ello incapaces desintetizar la HIPOXANTINA - GUANINA - FOSFO - RIBOSIL - TRANSFERASA.

→ como esta enzima sólo la producen los linfocitos B , sólo lograrán sobrevivir losHIBRIDOMAS.

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.

.

Para producir industrialmente los anticuerpos monoclonales se emplea un métododenominado ENCAPEL

Los hibridomas se colocan en una solución de ALGINATOS (substancia derivada

del alga GRACILARIA.Luego, se vuelcan por gotas en otra solución de polímeros de ALMIDÓN y quedan

así finalmente encapsulados.Encapsulados los hibridomas, como el almidón polimerizado permite el pasaje de

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gases y nutrientes, se reproducen a la vez que también a través de la cápsula eliminan losproductos de desecho.

Cuando se alcanza la concentración adecuada de anticuerpos monoclonales, éstosse recuperan por ruptura de la cápsula, tal como se ve en el esquema

Algunos de los usos de los anticuerpos monoclonantes

• diagnostico de: . embarazos. hepatitis. virus del SIDA, bacterias, parásitos. cáncer

• terapéutica de: . leucemia. cáncer

. prevención de rechazos en trasplantes• industriales: . purificación en columna de: interferón

insulinahormona de crecimientoetc.

MILSTEIN no patentó su descubrimiento: su modestia no le permitió imaginar elcambio que producirían los anticuerpos monoclonales en la ciencia.

TRATAMIENTO DEL CÁNCER CON ANTICUERPOS MONOCLONALES

Hasta hoy, el tratamiento del cáncer sigue siendo un problema sin solución.Aunque hay drogas que sirven de inhibidores de las células cancerosas y pueden matarla, y es laque se llama QUIMIOTERAPIA DEL CÁNCER, muchas veces estas substancias también son

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tóxicas para células normales: aún a dosis moderadas generalmente producen efectossecundarios muy desagradables. Lo mismo puede decirse del tratamiento conRADIACIONES

En los últimos años se trabaja sobre una idea qie podría denominarse BALAMÁGICA. Dentro de este concepto, un antibiótico puede ser considerado como una balamágica . Se sabe que los antibióticos matan e impiden la proliferación de células bacterianas sin

afectar mayormente células de tejidos animales o vegetales. Esto sucede porque la mayor partede los antibióticos solo inhiben procesos metábolicos propios de las células procariotas. Másdíficil es el combate de hongos y más aún de enteroparásitos que por ser células eucariotastienen metabolismos muy semejantes a las células de los mamíferos por lo cual las substanciasque son tóxicas para ellos también lo son para las células hospedadoras.

Hoy se sabe que flas células cancerosas llevan sobre su membrana ANTIGENOS diferentes a los de las células normales.

La idea de una bala mágica para combatir células cancerosas está sustentada enel hecho de preparar anticuerpos monoclonales específicos para esos antígenos y que a su vez

éstos lleven adherida alguna substancia tóxica capaz de destruir células cancerosas. Estapuede, a su vez, provenir de bacterias, plantas o síntesis química.

Como antecedentes de proyectos en marcha sobre este fundamento puedencitarse los llevados a cabo por :

- INSTITUTO NACIONAL DEL CÁNCER (EEUU de A)- CLÍNICA SCRIPPS (California, EEUU de A)- CITOGEN (EEUU de A)- CARLO ERBA (Italia)- LABORATORIOS LILLY (EEUU de A)etc., etc.

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INSULINA HUMANA

Uno de los primeros objetivos de la Ingeniería Génetica fue la de poder producira bajo costo substancias caras y aplicación médica de limitada producción.

La primera de estas substancias de importancia terapeútica en producirse fue lainsulina humana.

Como ya era conocida la secuencia de aminoacidos de las 2 cadenas (A y B)de la insulina, a través del Código Genético se sintetizaron los ARN-m por separado y deellos los ADN-c complementarios correspondientes.

A cada uno de los ADN-c se unió el gen de producción de la galactosidasa.Luego en los lugares ECO RI y BAM HI del vector genético pBR 322 se introdujeron losADN en forma independiente. Se obtuvo así 2 líneas de Escherichiae coli por

transformación.

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Las 2 líneas de bacterias se cultivaron por separado en un medio que conteníatiogaláctosido induciéndose así la producción de 2 proteínas híbridas: cada una contienegalactosidasa unida a través de metionina a la respectiva cadena de insulina.

Las proteínas así obtenidas se separan y purifican.Se tratan luego con BrCN que corta las proteínas a nivel de las metioninas. Se

purifican las cadenas sin metionina y luego se oxidan junatas abteniéndose inulina humanaactiva. Esta producción de insulina humana no sólo abarató los costos y los problemas de

disponibilidad de páncreas de animales (vacunos) sino que por su elevada pureza eliminó lasreacciones inmunológicas de algunos pacientes.

conocimiento de laestructura de la insulina humana

(cadenas A y B)

ARN-m) ARN-m)

ADN (gen) de la- galactosidasa

ARN-m) - ARN-m) ARN-m) - ARN-m)

ADN-c

p BR -322

sitio ECO - RI 2 cepas transformadas sitio BAM HIde E. coli

cultivos en mediocon tiogaláctosido

CADENA A CADENA Bmeteorito meteorito

Br CN Br CN

CADENA A CADENA BOXIDACIÓN DE LAS2 CADENAS JUNTAS

PRODUCCIÓN DE INSULINAINSULINA HUMANA

PRODUCCIÓN DE ASPARTAMOEl aspartamo es el L - aspartil - L - fenilalamina éster.

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(ASPARTAMO) dipéptido Asp - Phe

El aspartamo es un producto importante como EDULCORANTE en losdenominados productos DIETÉTICOS.

En solución acuosa, el dulzor del aspartamo es 200 veces superior al de unasolución de sacarosa al 4 % (40g/l).

Para producción industrial de aspartamo se utilizan L - aspártico y L - fenilalamina,cuyas producciones pasaron desde 1981 (50 ton.) a más 4.000 en 1997.

El aspartamo es el dipéptido Asp - Phe.El aspartamo está contraindicado en aquellos individuos que padecen deFENILCETONURIA o IDIOTEZ FENILPIRÚVICA.

La fenilcetonuria es una enfermedad hereditaria de carácter recesivo y del tipometabólico y no ligada al sexo.

Algunos ejemplos (que podríamos haber citado antes)

daltonismorecesivas

Enfermedades hemofiliahereditariasligadasal sexo dominantes raquitismo - vitamina D - resistente

____________________________________________________________________________

fenilcetonuriametábolicas Diabetes mellitus

albinismo totalEnfermedades

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heriditarias metabólicas enanismono ligadas no recesivas albinismo parcialal sexo

no metabólicas sordomudezrecesivas hereditaria

no metabólicas polidactilia

dominantes braquidactilia

La fenilcetonuria, por defecto de genes recesivos, se traduce en la ausencia de laenzima que transforma la fenilalamina en tirosina (una HIFROLASA) por lo cual la fenilalaminase convierte en ácido fenilpirúvico:

Mediante las técnicas de la Ingeniería Genética, ha sido posible obtener un polímero opolipéptido que por acción enzimática puede ser convertido en el dipéptido aspartil -fenilalamina o aspartamo (comercializado bajo la marca NUTRASWEET).

¿Cómo se lo ha conseguido?

Si consultamos el CÓDIGO GENÉTICO veremos que los codones:→ para Phe son: UUU

UUC

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UUA

→ para el ác. Asp.: GAUGAC

Estos codones, en el ADN serán tripletes:

AAA CTA• para Phe AAG para Asp CTG

AAT

∴ habrá que sintetizar los tripletes correspondientes al ADN.

Estas estructuras, pueden corresponder, por ej. a las siguientes para esteOLIGONUCLEÓTIDO:

HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANO

Es un polipéptido de 191 aminoácidos producida por la glándula pituitaria. Regula

el crecimiento corporal.Su escasez puede llevar a la baja estatura de algunos enanos.Para obtenerla se combinó la síntesis química del ADN que codifica los

aminoácidos 1 24, anteponiéndole el triplete ATG (que codifica METIONINA), esto asegura lainiciación correcta de la traducción, y se unió este ADN al gen productor de la

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galactosidasa de Escherichia coli.Para los aminoácidos 25 191, se copiaron los ARN - m de glándula pituitaria

humana, que por retrotranscripción se convirtió en el ADN-c para el segmento 25 191.Con la enzima de restricción Hae III (GG CC) se lo cortó justo delante del triplete

correspondiente al aminoácido N° 25 y se pegó al extremo del fragmento resultante un triplete determinación.

Se clonarón por separado los 2 ADN. Se unieron con un ADN ligasa, a través del

gen de la galactosidas, y se lo incorporó al pBR -322.Se clonó el gen en la bacteria. Se obtuvo su expresión y grandes cantidades de flahormona de crecimiento humano unida a galactosidas de Escherichia coli a través delaminoácdio metionina.

Se hidrolizó "in vitro" el producto así obtenido utilizando BrCN (bromuro decianógeno o cianuro).

Se intenta representar los pasos de la técnica seguida en el esquema siguiente.

APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA EN LA AGRICULTURA Con seguridad, la manipulación genética de plantas y animales ya está

produciendo una verdadera revolución en la producción de alimentos.En lo que va del siglo, será el tercer gran cambio:

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a) el primero, se produjo entre 1920 y 1950 con la mecanización , o sea el reemplazodel hombre y del animal por las máquinas;

b) el segundo, que se llamó revolución verde , se produjo entre 1950 y 1980 con elempleo de fertilizantes y de productos químicos para combatir las plagas;

c) la manipulación genética y la obtención de plantas y animales transgénicos está ya

produciendp un gran impacto y a esto debemos agregr la posibilidad de clonaranimales, como los mamiferos, con una mejora substancial de las razas y resistencia aenfermedades.

MICROPROPAGACIÓN DE VEGETALES

La micropropagación de vegetales, basada en una reproducción ASEXUAL, esun procedimiento relativamente sencillo que, entre otras ventajas, presenta las siguientes:

• acortamiento de los plazos naturales de desarrollo de los vegetales, sobre todocuando se reproducen sólo por semillas que tardan muchos días engerminar (caso de árboles de maderas preciosas; palmeras como las queproducen cocos; dátiles o aceite de palma)

• obtener un cultivar de plantas exactamente iguales en su resistencia aenfermedades, calidad y cantidad de los frutos, etc.

• producir en poco tiempo un número, prácticamente tan grande como se quiera,de plantas exactamente iguales (ej.: las necesarias para implantar un

viñedo de varietale finos)• entre las propiedades de las plantas obtenidas por esta metodología se

pueden conseguir aumentar sus contenidos en aminoácido esenciales ovitaminas.

(ESTO VA DESPUÉS DEL GRÁFICO DE LA PÁGINA SIGUIENTE)

Aparte de poder producir miles de plantas al mismo tiempo, esto posibilita el podersometerlas luego a variables adversas como la sequía, la salinidad del terreno, algunaenfermedad en particular, etc., para recomenzar con la/s sobreviviente/s y obtener el cultivar que

cumple con todas las expectativas.Se ha logrado obtener así zanahorias, alfalfa, arroz, maíz ricas en determinadoácido aminado o vitamina.

MICROPROPAGACIÓN DE VEGETALES

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APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA A LA GANADERÍA

Animales transgénicos

La cría de convencional de animales ha conducido a razas adaptada a un climao fin determinado. La posibilidad de transferir material genéico de una a otra raza puede

acelerar enormemente este proceso.El aumento del tamaño incorporado al cigote el gen de la hormona humana decrecimiento ha tenido éxito en salmones y vacas. En aves de granja, ha reducidocesiblemente la tasa de reproducción.

Otros objetivos han sido el aumento de la lactación en vacas, e incluso laproducción de leche conteniendo proteínas medicamentosas, la mejora de las calidades delcuero y de la lana, etc.

Hast hoy, la técnica de obtención de animales transgénicos tiene muy bajorendimiento. Probablemente la CLONACIÓN permita resolver este problema.

La producción de leche por vacas transgénicas proporcionaría una leche librede productos alergénicos y con proteínas humanas lo que la haría ideal para alimentar bebés

prematuros.

Clonación de animalesDesde hace varias décadas, las multinacionales de Biotecnología compiten en

dos frentes:• la mejora de la productividad y de la calidad de la cabaña ganadera;• la explotación de animales transgénicos, es decir que portan genes extraños,

destinados a producir en su leche proteínas de interés terapeútico.El concepto de clonación no es nuevo, sobre todo par los veterinarios.Una "historia" de lo ocurrido desde 1950 podría ayudar a ubicarse a algunos:

•

1950 : se logra congelar con éxito semen de toro a 79 grdos bajo cero para sutransporte e inseminación de vacas.• 1952 : a partir de células indiferenciadas, Thomas KING y Robert BRIGGS

logran clonar ranas• 1962: John GOURDON logra clonar ranas a partir de células de renacuajos;• 1978: Nace el primer bebe concebido mediante "fecundación in vitro". Ese

mismo año, la película "Los Niños del Brasil" plantea la posibilidad de obtenerréplicas clónicas de Adolf HITLER

• 1982: Científicos de la Universidades de Seattle (San Diego) y Californiaobtienen el primer ratón transgénico, portador del gen de la hormona decrecimiento de la ratas;

• 1984: primer nacimiento de un bebé a partir de un embrión congelado• 1985 : Ralph BRINSTER obtiene cerdos que producen en su leche la hormona

de crecimiento humano.• 1987 : Primera cepa de ratones transgénicos que portan genes humanos.• 1992 . Primera inyección intra citoplasmática nuclear de espermatozoides;• 1993 : Steven SPILBERG produce la película "PARQUE JURÁSICO"

(dinosaurios clónicos).

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• 1998 : El Dr. Richard SEED anuncia su intención de clonar bebés humanos.

¿Qué representa DOLLY?

• la cordera DOLLY fue "concebida" por Ian WILMUT y su equipo deinvestigadores del Instituto ROSLIN, de Edimburgo (Escocia).

• DOLLY es la prueba viviente de la resolución de uno de los mayores desafíosde la Biología moderna: no sólo la clonación de mamíferos, sino lamanipulación genética de una célula de un individuo adulto para obtener unacopia idéntica de él.

• DOLLY representa la culminación de más de 5 décadas de investigaciones,con más fracasos que éxitos. Ya en las postrimerías de la Primera GuerraMundial, el embriólogo alemán fue tildado de loco al proponer sustituir elnúcleo de un óvulo de rana (N) por el de una célula de embrión (2N) de estebatracio. Recién en 1952, los norteamericanos Thomas KING y RobertBRIGGS, consiguen llevar a cabo esta experiencia y demostraron además quelas primeras divisiones celulares que acontecen después de la fecundaciónson células indiferenciadas (células TOTIPOTENTES). Hasta ese momento noha comenzado la diferenciación tisular. Cuando este proceso comienza, loscientíficos no consiguieron, hasta DOLLY, la clonación a partir de una céluladiferenciada o SOMATICA

• El esquema muestra someramente como nació DOLLY con un éxito sobre 277embriones obtenidos por la técnica empleada.

• A DOLLY siguieron GEORGE Y CHARLEY, dos terneros engendrados enInglaterra (pero a partir de células embrionarias) y la ternera MARGARITA,clonada por Jean- Paul RENARD (DELinra, fRANCIA) a partir de célulasmusculares extraídas de un feto bovino de 60 días.

ALGUNAS DE LAS POSIBLES APLICACIONES DE LA CLONACIÓN

• Estudios sobre el envejecimientoComo DOLLY contiene por un lado el ADN de las células mamarias adultas de la

oveja blanca y mitocondrias de la oveja con manchas negras, se podrá estudiar el papel de lasmitocrondrias en el proceso de envejecimiento.

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• Fármacos puros y baratosLa producción de animales transgénicos como vacas y ovejas permite producir

leche con proteínas humanas de uso terapéutico. Como la obtención de animalestransgénicos tiene muy bajos rendimientos, la clonación podría resolver este problema.

• Terapia celularSi se consiguiera clonar células humanas sin tener que fusionarlas con óvulos

enucleados, se podrían producir células sanas para tratar patologías como algunos cánceres,

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la diabetes o el mal de Parkinson.

• Animales "humanizados" para obtener órganos para trasplanteLa clonación de animales portadores de genes humanos podría proporcionar

animales que "donen" sus órganos para hacer trasplantes (ej.: cerdos para trasplantes decorazón) (ya vimos que un corazón de cerdo "humanizado" fue trasplantado a un mono en1996). Se alejaría así el fenómeno indeseable del rechazo.

• Solución a la infertibilidad humana.Las parejas estériles podrían recurrir a la clonación para tener hijos: por ej. los

espermatozoides podrían ser sustituidos por otras células o un óvulo (N) ser enucleado parainyectarle un juego de cromosomas (N) de la madre.

• Solución a la extinción de especies animales o vegetalesComo se dispone de células congeladas de especies en vías de extinción

(como el oso panda, el rinoceronte de Sumatra, etc.) se podría utilizar la clonación como unasolución posible.

• Leche para niños prematurosVacas transgénicas podrían suministrar leche libre de substancias alergénicas y

con proteínas ideales para bebés prematuros.

• Experimentación con animales modeloLa clonación de primates modelo podría, por ej.: servir para estudiar algunas

enfermedades graves de los humanos, como la fibrosis quística )de origen hereditario)

DESAFÍO PARA LOS PAÍSES EN VÍAS DE DESARROLLO

En primer lugar, no debemos creer en que los científicos de los paísesdesarrollados trabajan por la humanidad, y si lo hacen en verdad, quienes los patrocinanesperan resarcirse de su inversiones a través del pago de patentes de invención.

Así, para descubrir los productos transgénicos de las naturales, una de lasmaneras más sencilla ha sido incorporar como los genes de interés el gen de la LUCIFERINA

La LUCIFERINA es una proteína responsable de la bioluminiscencia, fenómenobiológico difundido en protozoos, algunos peces y ciertas bacterias.

En presencia de ATP y de óxigeno, la enzima LUCIFERSA cataliza lareacción:

luciferina ATP luciferina + ADP + luz

La luciferasa viene en un pequeño frasco, un trozo del vegetal o lechetransgénica o carne animal transgénico o bacteria transgénica, proporcionan el ATP. La luzemitida es captada por un censor como "luz fría", como los empleados para dilucidar si unbillete es o no verdadero.Este ensayo, tan sencillo, pone al descubierto el uso de un ser transgènico y el correspondientey debido pago de patentes.

En segundo lugar, debemos tener muy presente, que en particular la RepúblicaArgentina, tiene un potencial enorme de recursos naturales para desarrollar la BIOTECNOLOGIA

y otro tanto en recursos humanos. Recordemos que este desarrollo de la BIOTECNOLOGIA DEAVANZADA no solo tenemos a Bernardo HOUSAY, Luis LELOIR y César Milstein, sino toda unaescuela argentina representada entre otros por la fundación Campomar, el INTA, el INGEBI,BIOSIDUS.

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Sólo hacen falta el convencimiento de los jóvenes para emprender una tareaestratégica para el desarrollo nacional, y sobre todo, la DECISIÓN POLÍTICO

Sería muy injusto olvidar al Dr. Atanasio QUIROGA, descubridor de la ARGININA(conf. París 25/04/1896)

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