Informe 1 Bioquimica.,,

Universidad de La Sabana. Castañeda David, López Mayra. Espectrofotometría de biomoleculas.

I OBJETIVOS

Establecer el espectro de absorción UV-Vis para clorofila para determinar su λmáx.

Aplicar la ley de Lambert-Beer y realizar una recta de calibrado para clorofila

Calcular gráficamente el valor del coeficiente de extinción molar.

Determinación cuantitativa de clorofila en una muestra problema.

II INTRODUCCIÓNLa espectrofotometría es un método cuantitativo de análisis químico, que se basa en la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones tales como, el espectro UV-VIS. Se

conocen otros métodos espectrofotométricos como la espectrofotometría de radiación visible, la infrarroja entre otras, y en nuestro laboratorio se usó el caso de la técnica de espectro UV-VIS debido a que las moléculas de clorofila presentan picos de máxima absorción entre los 400-500 nm y 600-700nm, absorciones que se encuentran en la región visible que está limitada entre 400 y 700nm.(Cordoba, 2010)

La clorofila es el pigmento que hace que las plantas sean verdes, la clorofila absorbe la luz

Laboratorio de Bioquímica, Felipe Arroyave.

Castañeda, David. Y López, Mayra.Universidad de La Sabana

Resumen— En la sesión de laboratorio se realizó el espectro de absorción UV-Vis para clorofila en diferentes concentraciones para determinar su máx., aplicando la ley de Lambert-Beer, calculando gráficamente el valor del coeficiente de extinción molar, para ello se utilizó una solución patrón y clorofila comercial para así implementar la espectrofotometría como método de análisis del cual se obtuvo 0.580 de absorbancia por parte de la clorofila comercial y (0.008, 0.009, 0.014, 0.021) para las concentraciones (2,4,8,16,20) respectivamente a partir de la solución patrón, este estudio permito la realización de una curva de calibración, de esta se determinó que Utilizando la ley de Lambert- Beer se realizó una regresion lineal de calibrado para la clorofila la cual no quedo recta por variaciones en la toma de la absorbancia de las diluciones.

Abstract— In the laboratory session spectrum UV -Vis absorption was performed to chlorophyll in different concentrations to determine their max. , Applying the law of Lambert -Beer , graphically calculating the value of the molar extinction coefficient , for this solution was used pattern and implement commercial chlorophyll so spectrophotometry as a method of analysis which 0.580 absorbance was obtained by the commercial chlorophyll (0.008 , 0.009 , 0.014 , 0.021 ) for the concentrations ( 2,4,8,16,20 ) respectively from the standard solution , this study allow the realization of a calibration curve , this is determined using the Lambert-Beer law linear regression calibration for chlorophyll which not stay straight performed by variations in the absorbance making dilutions .

Índice de Términos— Ley de Lambert-Beer, Espectrofotométria, Absorbancia y Transmitancia.

Espectrofotometría: Espectros de absorción y cuantificación espectrofotométrica de Biomoléculas

1


en el espectro violeta, azul y rojo, pero transmite y refleja la luz verde.

Existen varios tipos de clorofila que varían en su estructura, Las más importantes en las plantas son, la clorofila tipo A que es el pigmento ligado directamente en la transformación de la energía de la luz en energía química, y la otra es la clorofila B que las células fotosintéticas casi siempre contienen que es la clorofila b y otro grupo de pigmentos llamados carotenoides. (Cordoba, 2010)

Los carotenoides pueden absorber luz de longitudes de onda diferentes de las que absorbe la clorofila. Estos pigmentos operan como pantallas que transfieren la energía a la clorofila A, desarrollando así la gama de luz utilizable para la fotosíntesis. (Berjio, 2006)

La clorofila B se diferencia de la clorofila A por estar sustituido el grupo metilo (--CH) del carbono 3 en el segundo anillo, por un grupo aldehído (--CHO). Esta diferencia es suficiente para generar un cambio en la coloración y también en el espectro de absorción de la molécula.

Figura 1. Estructura de la clorofila A Y B

En el espectro de absorción se revelan las partes de la radiación visible absorbidas por las

clorofilas, las clorofilas A y B tienen puntos de máxima absorción en la radiación roja y azul, mientras que la verde o la roja oscura son poco absorbidas.

La clorofila A es de color verde azulada y la clorofila B es de color verde amarillento. Esta diferencia se manifiesta en el espectro de absorción como se había mencionado anteriormente, en la B, ambos máximos de absorción muestran una tendencia hacia la parte verde, es decir, el máximo en la parte roja es desalojado hacia ondas más cortas y el máximo en la parte azul hacia ondas más largas. También se evidencia la diferencia en los máximos de absorción los cuales cambian entre las diferentes clorofilas. (UNAL, 2011)

Imagen 1. Espectro de absorción a partir de clorofila. (Biologicos, 2008)

Ley de Lambert-Beer

La ley de Lambert es una relación práctica que relaciona la absorción de luz con las propiedades del material, y se define por medio de la siguiente formula:

A = log I/Io = ε·c·l


2


La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración es decir a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz entre ellas, depende de la distancia que recorre la luz por la solución, a igual concentración entre más distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará; y también depende de ε que es una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extinción .Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud (l) se formula siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea posible, en m con lo que las dimensiones de ε resultan ser m-1·cm-1 llamado coeficiente de extinción molar (εm). Cuando se desconoce el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en otras unidades distintas de m, por ejemplo g/L, y las dimensiones de ε son distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción específico (εs). (Cordoba, 2010)

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; que tienen valores de c altos, y donde ε varía con la concentración debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc. (Cordoba, 2010)

Transmitancia y Absorbancia

La transmitancia es una magnitud que enuncia la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en unidad de tiempo.

La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, y la cantidad de luz que

incidió sobre ella, y se representa normalmente

en por ciento: % T = It/Io x 100. (Brown T. ,

2011)

La transmitancia da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa. (Brown T. , 2011)

La absorbancia (A) es un concepto relacionado con una muestra, y es conocida como la densidad óptica, que es una relación logarítmica entre la intensidad de la luz que incurre sobre una muestra y la intensidad de esa misma luz que es transmitida a través de esa muestra. Cuando una luz de una longitud de onda determinada, seleccionada por un filtro, incide sobre una muestra, parte de esa luz es absorbida, y la luz no absorbida pasa a través de la muestra y es recogida por un detector frente a la fuente de luz. Y se define como el logaritmo de 1/T, lo que quiere decir que: A = log 1/T = -log T = -log It/Io

Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales, la transmitancia debe ser del 100% lo que nos indica que la muestra no absorbe una longitud de onda determinada, y por lo tanto A es igual a log 1 = 0, y la a cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través de una solución y de la concentración.

(Cordoba, 2010)Documento tomado de informe de la universidad nacional de ingeniería. 15-09-2009, Raul LLantoy. Curva spectral y ley de beer.

II MATERIALES Y REACTIVOS

Espectrofotómetro. Agitador de tubos de ensayo. Balanza. Gradillas con 12 tubos de ensayo.


3


Juego de pipetas graduadas (0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 y 25.0 ml).

Juego de micro pipetas Probetas 100 ml Vaso de precipitado 100 mL 7 Balones aforados de 25 mL Agitador de vidrio Mortero Celdas de cuarzo para medir en el

espectrofotómetro. etanol 90%, éter de etílico 10%.

Los materiales fueron otorgados por el laboratorio de Bioquímica de la Universidad de la Sabana.

IV PROCEDIMIENTO

Se tomó el patrón de clorofila (pastilla) y se maceró con la ayuda del mortero finamente. Luego se preparó una solución patrón de clorofila de 5 mg/mL en una mezcla de etanol y éter etílico. Si no se disuelve completamente el sólido llevar a cabo una filtración.Con el patrón se montó una alícuota en una celda de cuarzo y se llevó a cabo un barrido del espectro UV-Vis con ayuda del espectrofotómetro se determinó la λmax y se realizó la curva de calibración

Curva de calibración para clorofila

Con el patrón preparado en la primera parte preparamos diluciones de 25 mL de 2, 4, 8, 12, 16 y 20 µg/mL determinamos la absorbancia en el espectrofotómetro, y realizamos la curva de calibración.

Determinación de Clorofila en la muestra problema

Se pesaron 200 g de pasto frescoSe cortaron en trozos muy pequeños, y se dejaron en la estufa a 40°C. Luego se pesó

el pasto y se determinó la humedad posteriormente a esto se colocó el material seco dentro de los dedales de soxhlet y se llevó a cabo la extracción con una mezcla de etanol y éter etílico (9:1) durante un tiempo. Colocar el material seco dentro de los dedales de, se secó completamente y se preparó una solución de 1 mg/mL para hacer la determinación de la clorofila en las condiciones que se realizó la curva de calibración.

V RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para la curva de calibración de la clorofila, con la solución patrón se preparó diluciones de 25 mL de 2, 4, 8, 12 , 16 20 µg/mL en los balones aforados, se llevaron a él espectrofotómetro y se determinó la absorbancia en para cada una de las diluciones. Los resultados de la toma en el espectrofotómetro fue la siguiente:

Como se puede observar en el cuadro, la absorbancia de cada una de las diluciones no fueron las mejores ya que tiene una inconsistencia y no tienen una secuencia si no que varían mucho. Esto se puede ser debido principalmente a la hora de la preparación de las disoluciones ya que como fueron preparadas por diferentes personas hubo variaciones en las condiciones de cada una, lo que causa que al


Concentración [ ]

Absorbancia

2 0,008

4 0

8 0,009

12 0,003

16 0,014

20 0,021Tabla 1. Datos tomados durante la practica de laboratorio.

4


tomar la absorbancia no saliera de la forma correcta. Por esta razón para la realización de la curva se decidió tomar solamente las concentraciones 2, 8, 16 y 20 que son las que llevan una secuencia entre ellas.

Para la realización de la curva se tomaron en cuenta los datos de la siguiente tabla:

Concentración [ ]

Absorbancia

2 0,008

8 0,009

16 0,014

20 0,021Tabla 2. Datos utilizados para la realización de

la curva de calibración.

La curva de calibración se definió con una regresión lineal para determinar la ecuación de la recta el rango de error que se presenta en esta es aproximadamente de 14% entre los valores utilizados para esta.

Al realizar la curva de calibración se observa que no da una curva adecuada no da exactamente una recta como debería dar, debido a que la preparación y toma de cada una de las diluciones fueron incorrectas. Para la preparación de cada una de las diluciones se utilizó una sencilla formula:

C1 V1=C2 V2

En donde en el caso de la primera dilución que es 2mg/mL se desarrolló de la siguiente forma, la C1= 2 mg/mL, el V1= 10 mL, C2= 5000. Por lo que la formula queda al despejar el volumen 2 que es lo que se necesita saber para poder preparar la nueva disolución así : 2mg/mL * 10 mL / 5000 mg/mL = 0,04 *1000 = 4mL

(Se multiplica por 1000 para pasar los 5000 mg a g). Después de realizar estos cálculos se toman 4ml de la solución patrón se ponen en el balón aforado de 10 ml y se llena con etanol, y así se prepara cada una de las diluciones con las concentraciones correspondientes. En medio de este procedimiento pudieron haber variaciones de la toma de cálculos en los diferentes grupos


0 5 10 15 20 250

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

f(x) = 0.000687179487179487 x + 0.0050974358974359R² = 0.868698597000484

Absorbancia vs Concentracion

Absorbancia vs ConcentracionLinear (Absorbancia vs Concentracion)

concentracion

Abso

rban

cia

Grafica 1. Curva de calibración Absorbancia vs Concentración

5


lo cual causo que las diluciones y sus concentraciones quedaran mal tomadas y afectaran al final en el resultado de la absorbancia y por lo tanto de la curva.

Se utilizó la ecuación de la recta para determinar el coeficiente de extinción molar en las diluciones correspondientemente para la (tabla 2 pagina 5):

Y = mx+b

X=Y −bm

4.142 5.571 12.714 22.714

Simultáneamente la realización de la muestra con clorofila comercial se desarrolló para la comparación de los datos obtenidos a partir de la solución patrón, los resultados arrojados fueron:

Absorbancia 0.580Coeficiente de

extinción molar1642.5

Tabla 3. Resultados para clorofila comercial.

Para determinar el coeficiente de extinción molar de los datos se expresa el siguiente despeje de la ecuación de la recta:

Y = mx+b

X=Y −bm

X=0.580−0.00510.0007

× 2

X = 1642.5

El coeficiente de extinción molar determinado para la clorofila comercial a partir de la ecuación de la recta arrojo 1642.5 esto permite inferir que las diluciones tomadas de la solución patrón son mucho más concentradas que la clorofila expendida en los establecimientos comerciales, demostrando así las diferencias en la absorbancia por parte de la clorofila de las sustancias estudiadas, es claro afirmar que todos los datos obtenidos cumplen la ley de lambert-beer ya que esta dice que la absorbancia de una sustancia no puede ser mayor a 1, por esta razón el margen de error que se obtiene de la gráfica con respecto a la regresión es completamente dependienta de esta, esto quiere decir que el error arrojado puede variar si la absorbancia tomada de las diluciones demuestra otros datos.

Por otra parte la gráfica permite determinar la distancia o max de las absorbancias obtenidas las cuales se pueden hallar por la ley de lambert-beer respectivamente (tabla 2 página 5):

A = dc

d= Aεc

9.6*10-4

2.19*10-4

6.88*10-5

4.62*10-5

Como es posible observar los son muy amplios en comparación al de la clorofila comercial la cual es mucho menor por su alto Coeficiente de extinción molar.

El análisis de la clorofila permite determinar la cantidad de pigmentos fotosintéticos en la planta de acelga sin embargo la exactitud de los cálculos depende de la calibración previa del aparato y de los patrones específicos tomados.


6


Para complementar el estudio de la clorofila se decidió pesar pasto y determinar la humedad de este los datos obtenidos se observan en la siguiente tabla:

Peso capsula sola (g)

Peso muestra

(g)

Peso con muestra seca (g)

% Humedad

58,6541 7,3118 59,5376 87,9253,4781 8,1658 54,5349 87,0156,0701 6,160 56,8985 86,6244,0728 4,3972 44,6451 86,97

Tabla 4. Porcentaje de humedad en la muestra de pasto seco.

En esta grafica podeos observar la longitud de onda de acuerdo a la Absorbancia de la solución patrón preparada para poder realizar las diluciones con las que se realizó l curva de calibración que se muestra en la figura 1.

VII CONCLUCIONES

Se estableció el espectro de absorción UV-Vis para la clorofila y así mismo su λmáx el cual es posible determinarlo como la maxima distancia = 9.6*10-4.

Utilizando la ley de Lambert- Beer se realizó una regresion lineal de calibrado

para la clorofila la cual no quedo recta por variaciones en la toma de la absorbancia de las diluciones.

Se calculó gráficamente el valor del coeficiente de extinción molar siendo x= 1642.5.

La determinación cuantitativa de clorofila de la muestra problema fue de: (0.008, 0.009, 0.014, 0.021) para la absorbancia, (4.142, 5.571, 12.714, 22.714) para el coeficiente de extinción molar y (9.6*10-4 ,2.19*10-4 ,6.88*10-5

,4.62*10-5) para el .

VIII ANEXOSCUESTIONARIO

1. La absortividad molar de cierto soluto es de 2.1x104. Calcular la transmitancia para una solución 2.00x10-6 M. utilizando una cubeta de 5.00 cm.

Ley de Lambert-Beer

A = dc

A=absorbancia =absortividad molar

d =camino ópticoc =concentración

T=10−εdc

T=10(−2.1×104)(5.00)(2.00 ×10−6 )

T=0.6165

2. Se sabe que una sustancia tiene una absortividad molar de 14 000 a su longitud de onda de máxima absorción. Calcular que molaridad de esta sustancia podrá medirse en un espectrofotómetro,


Grafica 2. Grafica de la solución patrón Absorbancia Vs longitud de Onda.

7


si se desea que la lectura de absorbancia sea de 0.850, en una cubeta de 1.00 cm.

A = dc

C= Aεd

C= 0.850(14000 ) (1.00 )

C=6.0714 × 10−5 M

3. El porcentaje de transmitancia de una solución acuosa de fumarato de sodio a 250 nm y 25ºC, es de 19.2% para una solución 5x10-4 M. en una celda de 1.00 cm. Calcular la absorbancia y la absortividad molar correspondiente.

A=−log10 (T )I = 250 nmd = 1.00 cmC = 5x10-4 M

A=−log10 (T )A=−log10 (0.192 )A=0,7166

ε= Adc

ε= 0,7166

(1.00)(5×10−4)

ε=1433.2

4. Una solución de concentración C de una sustancia coloreada tiene un %T de 82.0 si la concentración se cuadriplica en %T es de 45.2. Demostrar que la solución obedece la ley de

Lambert-Beer y calcular el %T para una concentración 2C.

T=10−A T=10-edc=0,820 T=10-4edc=(10-edc)4=(0,820)4=0,452 T=10-2edc=(10-edc)2=(0,820)2=0,672=67,4 %

5. Cuando se analiza una muestra que contiene hierro (II) por el método del α-α’ bipiridilo se obtiene una transmitancia de 57.5% contra un blanco de reactivos, en una cubeta de 1.00cm. Si la absortividad molar del α-α’ bipiridilo ferroso es de 8.650. ¿cuál será la concentración del hierro en la muestra, en moles/litro?

T = 0.575d = 1.00 cm = 8650

A=−log10 (T )

A=−log10 (0.575 )

A=0.2403

C= Aεd

C= 0.2403(8650)(1.00)

C=0.02778 M

6. Utilizando una cubeta de absorción de 1.00 cm, se determinó la transmitancia de la luz de 436 nm (436 A) para una solución de bromo en tetracloruro de carbono, encontrándose los siguientes resultados:


8


Calcular la absortividad molar, Є.

C, moles/L

5.46x 10-

3

3.5x10

-3

2.1x10

-3

1.25x10-3

0.64x10-3

% transmit

.

1.0 3.0 16.0

34.3 57.0

Absorbancia

2 1.52

0.796

0.465

0.244

366.3

434.28

379.04

372 381.25

ε= Adc

7. Se sabe que las sales de VO+2 tienen una absortividad molar de 12.000 a su longitud de onda de máxima absorción. Si se utiliza celda de 10.00 cm, calcular cuántos mg/ml de VO+2 deberán estar presentes para producir una absorbancia de 0.573. (Pm VO+2 = 91.942).ε=12000d = 10.00 cmA = 0.573

C= Aεd

C= 0.573(12000 ) (10.00 )

C=4.775 ×10−6 mol

L×( 91.942 g

1mol )×( 1000 mg1 g )×( 1 L

1000 ml )¿4.3902 ×10−4 mg /ml

8. La absortividad molar (Є) del ácido benzoico en metanol es aproximadamente 1950 a 275nm. ¿cuál será la máxima concentración de ácido benzoico, en g/ml que puede usarse en una celda de 1.00 cm para que la absorbancia no exceda de 0.013?

ε=1950 d = 1.00cm A = 0.013

C= Aεd

C= 0.013(1950 ) (1.00 )

C=6.666 ×10−6

C=6.666 ×10−6 mol

L×( 122,12 g

1mol )×( 1l1000 ml )

C=8.1405 ×10−7 M

9. Una solución de permanganato de potasio de concentración C tiene una transmitancia de 60.0 % en una celda de 1.00 cm., a una determinada longitud de onda. Si se dobla la concentración, calcular. a. El % de T b. La absorbancia y la concentración de KMnO4 para dar 60.0 % de T en una celda de 10.00 cm de paso de luz.

T1 = 60%T=0,6A=log 1/0,60 = 0,22Ya que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración.

Para que haya un 60% de transmitancia se sabe que la


9


absorbancia debe ser de 0,22 y podemos generar un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas para determinar el valor de la concentración de KMnO4 y el coeficiente de extinción molar1) 0,22= 1cm *e*c2) 0,22=10cm *e*c

10. Una muestra de 1.000 g que contiene manganeso se determinó por espectrofotometría, se preparó un extracto de 250 ml de la solución de concentración desconocida, se tomó una alícuota de 5 ml y se diluyó en un balón aforado de 50 ml. Luego, para poder interpolar la curva estándar de manganeso a 535 nm de la última solución, se tomó una alícuota y se diluyó en una solución 1:2. La transmitancia de la solución medida en un espesor de 1 cm es de 40 %. Si la absortividad molar es 2300 L/mol.cm, determine: a) % de Mn en la muestra b) mg/Kg de Mn en la muestra.

A= log T= log (0,40) A= 0,4

C= A/ ed =0,4/(1,00)(2300)

Ccon / Vdil = Cdil /Vcon

Ccon1= (Cdil*Vcon1)/VdilCcon1= (2X10 -4 M) (2) /1 = 4X10-4 M

Ccon2= (4X10-4M) (50)/5= 4X10-3 M

Moles= 4X10-3M (0,250 L)=1X10-3 moles MnMasa=1X10-3 (54,9)= 0,0549 g

A) % Mn= (0,0549 g /1,000 g )*100 = 5,5 %

B) Mg/kg= 54,9mg / 1X10-3kg = 54900 mg/kg.

IX BIBLIOGRAFIA

Brown, Ch. 2000. Utraviolet, visible, and near-infrared spectrophotometers. Applied Spectroscopy Reviews, 35 (3), 151-173.

Christian, G. D. 1981. Química Analítica. 2a ed. Ed. Limusa.

Cross, D. G. and Fisher, H.F. 1970. The mechanism of glutamate dehydrogenase reaction. J. Biol. Chem. 245(10) 2612-2621.

Crowder, A. L., Barker, R. and Swenson, C. A. 1973. Ultraviolet difference spectroscopic studies of the binding of ligands to rabbit muscle aldolase. Biochemistry. 12(11), 2078-2083.

Freifelder, D. 1982. Physical Biochemistry. Chapter 14. Second Edition. Ed. W. H. Freeman and Company, New York. p. 494-536.

Harris D. C. 2001. Análisis Químico Cuantitativo 2a ed. Ed. Reverté.


10

Documents

Informe 1 Bioquimica.,,