INFORMACIÓN Y MANUAL DEL - ibl-international.com · Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero, il plasma (EDTA, citrato, eparina) e

Istruzioni per l’Uso

Interleukin-17A ELISA

Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di IL-17A

umana.

BE53171

96

2-8°C

For research use only.

Not for use in diagnostic procedures.

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 [email protected] D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com

Interleukin-17A ELISA (BE53171) ITALIANO

20.11.14 (25) [V1] 1/18

INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE

1. USO PREVISTO 2

2. SOMMARIO 2

3. PRINCIPIO DEL TEST 3

4. REAGENTI FORNITI 4

5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4

6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 4

7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 5

8. PRECAUZIONI PER L’USO 5

9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 6

10. PROCEDURA DEL TEST 8

11. CALCOLO DEI RISULTATI 10

12. LIMITI DELLA PROCEDURA 12

13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 12

14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI 14

15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI 15

16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 16

17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 17


20.11.14 (25) [V1] 2/18

1. Uso Previsto

Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di IL-17A umana. IL-17A ELISA umano è solo per ricerca. Non per procedure diagnostiche o terapeutiche.

2. Sommario

Recentemente è stata definita una nuova famiglia di citochine, Interleukin-17, che rivela un distinto sistema di segnalazione del recettore e del ligando. Esistono elevate evidenze per la sua importanza nella regolazione delle risposte immunitarie. Successivamente sono state descritte le componenti familiari (IL-17A-F). L'IL-17A, una citochina omodimerica a di circa 32 kDa, è in gran parte prodotta dai linfociti T di memoria attiva, ma stimola l'immunità innata e la difesa dell'ospite. Entrambe IL-17A e IL-17F mobilizzano neutrofili in parte attraverso la granulo poiezione e l'induzione della chemokina CXC, nonché una maggiore sopravvivenza locale. La produzione di IL-17A e IL-17F attraverso i linfociti T è regolata da IL-23 indipendentemente dall'attivazione del recettore cellulare T. La classificazione delle cellule Th 1 (Th1) e Th2 ha fino ad ora fornito il quadro per la comprensione della biologia delle cellule CD4 (+) e dell'interazione tra l'immunità innata e adattativa. Recenti studi hanno definito un precedentemente sconosciuto legame tra le cellule CD4 (+) T e la risposta Th17.Il sottoinsieme di cellule T produttrici di interleukin17, sono pro-infiammatorie e inducono una grave autoimmunità. Quando l'IL-23 serve a espandere le cellule di T (H) -17 precedentemente differenziate, IL-6 e il fattore di crescita di trasformazione beta (TGFbeta) inducono la differenziazione delle cellule T (H) -17 dal loro precursore nativo.


20.11.14 (25) [V1] 3/18

3. Principio del Test

I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-IL-17A umana.

Figura 1

L’IL-17A umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-IL-17A umana coniugato di biotina, che si lega con l’IL-1beta umana catturata dal primo anticorpo.

Figura 2

Dopo l’incubazione degli anticorpi di anti-IL-17A umana coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-HRP che si lega all’anticorpo anti-IL-1A umana coniugato alla biotina.

Figura 3

Dopo l’incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all’HRP.

Figura 4

In proporzione alla quantità di IL-1beta umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l’acido e l’assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IL-1beta umana e si determina la concentrazione del campione di IL-1beta umana.

Figura 5

Substrato post-reazione

Substrato

Streptavidina-HRP -

Standard o Campione

Coniugato di Biotina

Prima Incubazione

Anticorpo di Rivestimento

Micropozzetto Rivestito

Seconda Incubazione

Terza Incubazione


20.11.14 (25) [V1] 4/18

4. Reagenti Forniti

1 busta d´alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonale anti-IL-17A umana

1 flaconcino (70 µL) con Coniugato di Biotina (anticorpi monoclonale anti-IL-17A)

1 flaconcino (150 µL) con Streptavidina-HRP

2 flaconcini con Standard IL-17A umana liofilizzato, 200 pg/mL dopo ricostituzione

1 flaconcino Controllo alto, liofilizzato

1 flaconcino Controllo basso, liofilizzato

1 flaconcino (12 mL) Diluente dei Campioni

1 flaconcino (5 mL) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20, 10 % BSA)

1 flaconcino (50 mL) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20)

1 flaconcino (15 mL) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina)

1 flaconcino (15 mL) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M)

4 Copripiastra adesivi

5. Istruzioni di Conservazione

Conservare i reagenti del kit a 2-8 °C, ecetto gli controlli. Conservare i controlli liofilizzatti a -20 °C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 °C, gli controlli a -20 °C rispettativamente. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione.

6. Prelievo e conservazione dei Campioni

Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero, il plasma (EDTA, citrato, eparina) e la urina. Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all’uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 °C, per evitare la perdita di IL-1beta umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 °C ed 8 °C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev’essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. No scongelare i campioni in un bagnomaria a 37 °C. Non vortice o agitare bruscamente i campioni.


20.11.14 (25) [V1] 5/18

7. Materiali necessari ma non forniti

Pipette graduate da 5 mL e 10 mL

Micropipette adattabili da 5 µL a 1000 µL a canale singolo, con punte usa e getta

Micropipette adattabili da 50 µL to 300 µL multicanale con punte usa e getta

Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti

Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti

Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico.

Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d’onda di riferimento 620 nm)

Acqua bidistillata o deionizzata

Calcolatore statistico con programma che esegua l’analisi di regressione

8. Precauzioni per l’Uso

- Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli.

- I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico.

- Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza.

- Non usare i kit dopo la data di scadenza.

- Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce.

- Non pipettare utilizzando la bocca.

- Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni.

- Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose.

- Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni.

- Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo.

- Evitare schizzi o produzione di aereosol.

- Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso.

- Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato.

- L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato.

- Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti.

- La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo.

- Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a 121.5 °C.

- Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido.


20.11.14 (25) [V1] 6/18

9. Preparazione dei Reagenti

Prima di cominciare con le procedure del test i concentrati dei tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i concentrati dei tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli.

9.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x)

Versare l'intero contenuto (50 mL) del Tampone di Lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 mL. Portare il volume finale a 1000 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 °C e 25 °C. Il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente:

Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio

Concentrado (20x) (mL) Acqua Distillata (mL)

1 - 6 25 475

1 - 12 50 950

9.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)

Versare l'intero contenuto (5 mL) del Tampone di Dosaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 mL. Portare il volume finale a 100 mL utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperature comprese fra 2 °C e 8 °C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente;

Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio

Concentrado (20x) (mL) Acqua Distillata (mL)

1 - 6 2.5 47.5

1 - 12 5.0 95.0

9.3. Preparazione di Coniugato di Biotina

Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente:

Numero di Strisce Coniugato di Biotiona (mL) Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1 - 6 0.03 2.97

1 - 12 0.06 5.94

9.4. Streptavidina-HRP

La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:200 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente:

Numero di Strisce Streptavidina-HRP (mL) Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1 - 6 0.03 5.97

1 - 12 0.06 11.94


20.11.14 (25) [V1] 7/18

9.5. Standard IL-17A Umana

Ricostituire lo Standard IL-1beta umana aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 200 pg/mL). Lasciare lo standard a ricostituire per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.5.1).

9.5.1. Diluzione Standard Esterna

Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard.

S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.

Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo:

Pipettare 225 uL di Diluente dei Campioni a tutti tubi.

Pipettare 225 µL di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 200 pg/mL) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 100 pg/mL).

Pipettare 225 µL di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento.

Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 6).

Il Diluente dei Campioni serve come bianco.

Figura 6

9.6. Controlli

Ricostituire aggiungendo 250 μL di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all’etichetta del flaconcino. Conservare i controlli ricostituiti aliquotati a -20 °C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.

Transferire 225 µL

IL-17A Umana Standard Ricostituito

S1 S2 S3 S4 - S7

Diluente dei Campioni 225 µL

Buttare 225 µL


20.11.14 (25) [V1] 8/18

10. Procedura del Test

a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 °C e perfettamente sigillate.

b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µL di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 10-15 secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti.

c. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi – vedi 9.5.1) Aggiungere 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µL standard preparato (vedi 9.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 500 pg/mL) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = 250.0 pg/mL) e trasferire 100 µL, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 7). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da 100.0 a 1.6 pg/mL. Buttare 100 µL del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2).

Figura 7

In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1) pipettare 100 µL di queste diluizioni standard (S1–S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1.

Transferire 100 µL

IL-17A Umana Standard Ricostituito

S1 S2 S3 S4 - S7

Diluente dei Campioni 100 µL

Buttare 100 µL


20.11.14 (25) [V1] 9/18

Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti:

1 2 3 4

A Standard 1

(100.0 pg/mL) Standard 1

(100.0 pg/mL) Campione 1 Campione 1

B Standard 2



C Standard 3



D Standard 4



E Standard 5 (6.3 pg/mL)

Standard 5 (6.3 pg/mL)

Campione 5 Campione 5

F Standard 6 (3.1 pg/mL)



G Standard 7 (1.6 pg/mL)



H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8

d. Dispensare 100 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco.

e. Dispensare 50 µL di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni.

f. Dispensare 50 µL di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni.

g. Preparare il Coniugato di Biotina (vedere la preparazione del Coniugato di Biotina 9.3)

h. Dispensare 50 µL di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto.

i. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm.

j. Preparare la Streptavidina-HRP diluita (vedere la Preparazione di Streptavidina-HRP 9.4).

k. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 4 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.

l. Dispensare 100 µL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco.

m. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 °C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm.

n Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 4 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo.

o. Pipettare 100 µL di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti.

p. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 °C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense.

È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro.

Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di 0.9-0.95.


20.11.14 (25) [V1] 10/18

q. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µL di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 °C.

r. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard.

Note: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi.

11. CALCOLO DEI RISULTATI

- Calcolare i valori medi dell’assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio.

- Creare una curva standard segnando l’assorbanza media di ogni concentrazione standard

sull’ordinata contro la concentrazione di IL-17A umana sull’ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri).

- Per determinare la concentrazione di IL-17A umana circolante per ogni campione, trovare prima il

valore medio di assorbanza sull’ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d’intersezione estendere una linea verticale fino all’ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IL-17A umana.

- Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulai sono

stati diluiti 1:2 (50 µL campione + 50 µL Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).

- Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per

risultato livelli scorretti e bassi di IL-17A umana (Effetto Gancio). Questi campioni richiedono un’ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell’ IL-17A umana, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IL-17A umana.

- Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione

di IL-17A umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi.

- La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per

dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.


20.11.14 (25) [V1] 11/18

Figura 8

Curva standard rappresentativa per l’IL-1beta umana ELISA. L’IL-1beta umana è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev’essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio.

Tavola 2

Dati tipici relativi all’uso dell’IL-1beta umana ELISA Lunghezza d’onda: 450 nm Lunghezza d’onda di riferimento: 620 nm

Standard Concentrazione IL-17A Umana

(pg/mL)

D.O. (450 nm)

D.O. Media (450 nm)

C.V. (%)

1 100.0 2.362 2.458

2.377 2.0

2 50.0 1.263 1.260

1.228 0.1

3 25.0 0.644 0.610

0.594 2.7

4 12.5 0.364 0.345

0.321 2.8

5 6.3 0.198 0.185

0.159 3.6

6 3.1 0.112 0.115

0.080 1.3

7 1.6 0.074 0.178

0.043 2.2

Bianco 0 0.034 0.035

0.035 1.2

I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l’attività enzimatica e quindi l’intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.


20.11.14 (25) [V1] 12/18

12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva

standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione

crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro

riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell’uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o

falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati.

- L’uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi

umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione.

13. Caratteristiche di Prestazione

13.1. Sensibilità Il limite di rilevamento dell’IL-1beta umana definito come la concentrazione dell’analita, risultante in un’assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 0.5 pg/mL (media di 6 dosaggi indipendenti).

13.2. Riproducibilità

13.2.1. Intra-Dosaggio

La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-17A umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-17A umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 7.1 %.


20.11.14 (25) [V1] 13/18

Tavola 3 La concentrazione media di IL-1beta umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione

Campione Esperimento Concentrazione media di IL-17A umana (pg/mL)

Coefficiente di Variazione (%)

1 1 2 3

59.0 55.6 59,6

3,9 4,5 6,5

2 1 2 3

64,2 53,7 60,0

5,9 4,9 6,0

3 1 2 3

27,2 24,0 27,8

3,0 4,9 6,0

4 1 2 3

29,6 24,9 26,6

4,7 11,2 10,9

5 1 2 3

16,6 14,1 15,5

4,4 10,3 11,4

6 1 2 3

18,5 13,3 14,9

6,6 11,1 10,7

13.2.2. Inter-Dosaggio

La riproducibilità nell’ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-17A umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-17A umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 9.1 %. Tavola 4 La concentrazione media di IL-17A umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione:

Campione Concentrazione media di IL-17A Umana (pg/mL)

Coefficiente di Variazione (%)

1 58.0 3.7

2 59.3 8.9

3 26.3 7.9

4 27.0 8.8

5 15.4 8.3

6 15.6 17.2


20.11.14 (25) [V1] 14/18

13.3. Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di IL-17A umana in un pool di siero umano normale e campioni di plasma citrato. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. In questi esperimenti il siero ed il plasma non addizionati sono stati usati come bianchi. I campioni inattivati sono stati usati come vuoti in questi esperimenti. Il recupero medio dei campioni di siero è stato del 107,0%, nei campioni di plasma (eparina) 50,8%, nel plasma (citrato) 75,5% e nei campioni di supernatante della coltura cellulare 113,6%.

13.4. Parallelismo della Diluizione I campioni di supernatante di coltura di sangue, plasma e cellule con diversi livelli di IL-17A umani sono stati analizzati a diluizioni seriali 2 volte con 4 repliche ciascuna. Il recupero dei campioni di siero variava dal 76,9% al 112,3% con un recupero complessivo del 101,5% (Tabella 5). Il recupero medio complessivo nei campioni di plasma era del 107,8% e nei campioni di supernatante della coltura cellulare 81,6%. Tavola 5

Campione Diluizione Concentrazione Attesa

di IL-17A umana (pg/mL)

Concentrazione Misurata di

IL-17A umana (pg/mL)

Recupero di Concentrazione Attesa di IL-17A umana (%)

1

1:2 1:4 1:8 1:16

-- 23.8 12.3 6.4

47.6 24.6 12.8 5.6

-- 103.4 103.7 88.3

2

1:2 1:4 1:8 1:16

-- 21.0 11.2 6.1

42. 22.3 12.2 5.9

-- 106.0 109.1 96.2

3

1:2 1:4 1:8 1:16

-- 4.7 2.6 1.3

9.4 5.3 2.5 1.0

-- 111.2 96,6 76.9

4

1:2 1:4 1:8 1:16

-- 31.6 17.8 9.5

63.2 35.5 19.1 10.2

-- 112.3 107.5 106.4

13.5. Stabilità dei Campioni

13.5.1. Stabilità a Congelamento - Scongelamento

Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 °C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di IL-17A umana. Si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-17A umana con altri congelamento e lo scongelamento.

13.5.2. Stabilità della Conservazione

Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 °C, 2-8 °C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37°C e il livello di IL-1beta umana ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione a -20°C non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello IL-1beta umana. Si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-1beta umana (50 %) durante la conservazione a TA e 37°C dopo 24 ore.

13.6. Specificità La reattività crociata e l’interferenza di fattori circolanti del sistema immunitario sono state valutate


20.11.14 (25) [V1] 15/18

addizionando queste proteine in concentrazioni fisiologicamente rilevanti ad un siero positivo di IL-17A umana. Non si è rilevata alcuna reattività crociata o interferenza.

13.7. Valori Attesi Non sono stati trovati livelli rilevabili di IL-17A umani. I livelli elevati di IL-17A dipendono dal tipo di disturbo immunologico.

14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI

Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare:

e-mail: [email protected] www.IBL-International.com


20.11.14 (25) [V1] 16/18

15. Sommario: Preparazione dei Reagenti

15.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 mL) a 950 mL di acqua distillata.

Numero di strisce

Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (mL)

Acqua Distillata (mL)

1-6 25 475

1-12 50 950

15.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 mL) a 95 mL di acqua distillata.

Numero di strisce

Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (mL)

Acqua Distillata (mL)

1-6 2.5 47.5

1-12 5.0 95.0

15.3. Coniugato di Biotina

Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x):

Numero di strisce

Coniugato de Biotina (mL)

Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1-6 0.03 2.97

1-12 0.06 5.94

15.4. Estreptavidina-HRP

Fare una diluizione 1:200 di Streptavidina-HRP nel Tampone di Dosaggio (1x):

Numero di strisce

Streptavidina-HRP (mL)

Tampone di Dosaggio (1x) (mL)

1-6 0.03 5.97

1-12 0.06 11.94

15.5. Standard IL-1beta Umana Reconstituire il Standard liofilizzato di IL-1beta umana con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull’etichetta del flaconcino dello standard.)

15.6. Controlli Aggiungere 250 μL di acqua distillata ai controlli liofilizzati.


20.11.14 (25) [V1] 17/18

16. Sommario di Procedura del Test

1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto.

2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio.

3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μL di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μL di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μL da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μL dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.5.1.): Pipettare 100 μL di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti.

4. Aggiungere 100 μL di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco.

5. Aggiungere 50 μL di Diluente dei Campioni a tutti i pozzetti.

6. Aggiungere 50 μL di campione in duplicato a tutti i pozzetti.

7. Preparare il Coniugato di Biotina.

8. Aggiungere 50 μL di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti.

9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 °C).

10. Preparare la Streptavidina-HRP.

11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio.

12. Aggiungere 100 μL di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti.

13. Coprire le strisce e incubare 1 ore a temperatura ambiente (18-25 °C).

14. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio.

15. Aggiungere 100 μL di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti.

16. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).

17. Aggiungere 100 μL di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti.

18. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l’intensità del colore a 450 nm.

Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di supernatanti di colture cellulari sono stati diluiti 1:2 (50 µL di campione + 50 µL Diluente di Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev’essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x).

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα

Symbols Version 4.5 (it) / 2015-12-07

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή:

Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα

LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο

IVD In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:

Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.

Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.

Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.

CONTENUTI: I reclami possono essere presentati inizialmente scritti o vocali. Successivamente devono essere completati in modo scritto includendo le prestazioni del test ed i risultati se si riferiscono a reclami per ragioni analitiche.

GARANZIA: Il prodotto è garantito per essere esente da difetti dei materiali entro la specifica data di conservazione ed in modo conforme alle specifiche fornite con il prodotto. Il prodotto deve essere utilizzato secondo l'uso previsto, tutte le istruzioni riportate nelle istruzioni per l'uso e entro la data di scadenza del prodotto. Qualsiasi modifica della procedura di prova o lo scambio o la miscelazione di componenti di diversi lotti potrebbero avere effetti negativi sui risultati. Questi casi invalidano qualsiasi richiesta di sostituzione.

LIMITAZIONE DI RESPONSABILITÀ: IN TUTTE LE CIRCOSTANZE, LA RESPONSABILITÀ DEL FABBRICANTE È LIMITATA AL PREZZO D'ACQUISTO DEL/DEI KIT IN QUESTIONE. IN NESSUN CASO IL PRODUTTORE SARÀ RESPONSABILE PER QUALSIASI DANNO INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE, COMPRESI I DANNI PER PERDITA DI PROFITTO, SALUTE, DANNI PER PERSONE O PROPRIETÀ O ALCUNA ALTRA PERDITA INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE.

IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany

Tel.: + 49 (0) 40 532891 -0 Fax: -11 E-MAIL: [email protected] WEB: http://www.IBL-International.com

Documents

INFORMACIÓN Y MANUAL DEL - ibl-international.com · Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero, il plasma (EDTA, citrato, eparina) e