Infection – Inflammation

Journées de recherche respiratoire 33

64

and hyperresponsiveness y he e a opro einase

G. Paulissen1, M. El Hour1, N. Rocks1, M. Gueders Phd1, F. Bureau Phd2, J.- M. Foidart1, C. Lopez- Otin3, A. Noel1, D. Cataldo1

1Laboratory of Tumor and Developmental Biology, GIGA- Cancer (Groupe Interdisciplinaire de Génoprotéomique Appliquée), University of Liege and CHU of Liege, Belgium,2GIGA- 3I, University of Liege, Belgium3Departamento de Bioquimica y Biologia Molecular, Instituto Universitario de Oncologia, Universidad de Oviedo, [email protected]

Introduction. – ADAMTS (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs) constitute a family of endopeptidases related to matrix metallo-proteinases (MMPs). These proteinases have been largely implicated in tissue remodelling associated with patholo-gical processes. Among them, ADAMTS12an asthma- associated gene in a human genome screening program. However, its functional implication in asthma is not yet documented. The present study aims at investigating potential ADAMTS- 12 functions in experimental models of allergic airways disease.

Methods. – Two different in vivo protocols of allergen- induced airways disease were applied to the recently generated Adamts12wild- type mice.

Results. – We provide evidence for a protective effect of ADAMTS- 12 against bronchial inflammation and hyperresponsiveness. In the absence of Adamts12, challenge with different allergens (ovalbumin and house

tissue, along with airway dysfunction assessed by increased airway responsiveness following methacholine exposure. Furthermore, mast cell counts, ST2 receptor, and IL- 33 levels were higher in the lungs of allergen- challenged Adamts12

Conclusions.experimental evidence for a contribution of ADAMTS- 12 as a key mediator in airways disease, interfering with immu-

hyperresponsiveness.Keyword. –

and increased ALK1 and ENG expressions in lung tissue and PECs. Incubating PECs with TGF- β led to Smad1/5/8 phos-phorylation and to FGF2, PDGFb and ET- 1 induction with

mice from hypoxic PAH. Chronically hypoxic Eng+/- mice

higher pulmonary expressions of interleukin- 6 and monocyte chemoattractant protein- 1, decreased pulmonary vessel den-

wild- type mice. The TGF- ALK1/ENG signaling pathway plays a key role in iPAH and experimental hypoxic PAH via a direct effect on PECs leading to production of growth factors and

Keyword. – Circulation

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Bene cial e ect o sura in on onocrotaline- induced pulmonary hypertension in rats

M. Izikki, O. Mercier, F. Lecerf, M. Hum ert, G. Simonneau, P. Dartevelle, E. Fadel, S. Eddahi i

INSERM U999 and Centre Chirurgical Marie Lannelongue, Le Plessis- Robinson, [email protected]

Background. – Pulmonary hypertension (PH) is a pro-gressive disorder characterized by an increase in pulmonary artery pressure and structural changes in the pulmonary vasculature. Several observations indicate that growth fac-tors play a key role in PH by modulating pulmonary- artery smooth muscle cell (PA- SMC) function. In rats, established monocrotaline- induced PH (MCT- PH) can be reversed by blocking platelet- derived growth factor receptors (PDGF- R),

growth factor receptors (FGF- R). All these receptors belong to the receptor tyrosine kinase (RTK) family.

Methods and Results. – We evaluated whether RTK blockade

advanced MCT- PH in rats, via effects on growth- factor signaling pathways. We found that suramin inhibited RTK and ERK1/2 phosphorylation in cultured human PA- SMCs. Suramin inhibited PA- SMC apoptosis and proliferation induced by PDGF, EGF, or FGF2. After monocrotaline injection to rats, suramin for 3 weeks attenuated the development of PH, as shown by lower values for pulmonary artery pressure, right ventricular hypertrophy, and distal vessel muscularization on day 21 compared to control rats. Suramin from day 21 to 42 after monocrotaline injection reversed established PH, normalizing the pulmonary artery pressure values and vessel structure. Suramin treatment sup-pressed PA- response and deposition of collagen.

Conclusions. – RTK blockade by suramin can both prevent MCT- PH and reverse established MCT- PH in rats. These effects are related to RTK blockade.

Keyword. – Circulation

34 Résumés

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ANO1 expression, localization and activity in cystic rosis air ays

M. Ruf n, S. Marie, L. Guillot, P. Le Rouzic, A. Clement, H. Corvol, O. a ary

CDR St Antoine, UMR 938, UPMC Paris 06, Paris France

Defective CFTR function in the airway epithelium is responsible for CF patient lung disease. In CF airways,

-cesses contribute to airways degradation leading to a decreased lung function. ANO1 (Anoctamin 1) also called TMEM16a (Transmembrane protein 16 a) is a calcium- activated chloride channel (CaCC) recently described. This chloride (Cl –) channel is expressed in secretory epithelia as airway epithelium. Mice lacking ANO1 show a decreased in calcium- dependent Cl – secretion associated with a reduced mucociliary clearance demonstrating the substantial physiological role of ANO1 in the airways. ANO1 is an eight transmembrane protein with two predicted sites for phosphorylation by extracellular regulated kinase 1,2 (ERK1,2) in intracellular C terminus.

Here, we would characterize ANO1 in CF versus non CF context by analyzing ANO1 expression, localization and acti-vity, and determine whether ERK1,2 regulate ANO1 chloride activity.

For this study, we used different CF and non CF models whose bronchial epithelial cell lines CFBE41o- vs 16HBE14o- , lung explants from mice homozygous for the F508del mutation or KO for CFTR and their own littermates controls, and lung explants from CF and non CF patients. ANO1 mRNA and protein expression were determined respectively by qPCR and western blot. ANO1 localization was determined in bronchial epithelial cells

a plasmid containing human ANO1 gene coupled to the

(wheat germ agglutinin) as a plasma membrane label. ANO1 chloride activity was determined by halide sensor

regulation mechanism, we used the PD98059 which is a MEK1 inhibitor.

Our results show that ANO1 activity is significantly decreased in CF compared to non CF bronchial epithelial cells. ANO1 mRNA and protein expression are also signi-

there is no difference in localization between CF and non CF cells. Finally, we show that ANO1 activity is decreased in presence of MEK1 inhibitor.

We conclude that the decrease of ANO1 activity in CF cells could be explained by decreased ANO1 ARNm and protein expression found in all tested CF models and may contribute to the worsening of ionic imbalance in CF

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A role for TLR9 in Pseudomonas aeruginosa- induced lun in ammation

F. BenMohamed1,2, M. Medina1,2, Y. Wu1,2, S. Mashalidi3, M. Chignard1,2, B. Manoury3, L. Touqui1,2

1

France2U874 – INSERM, Paris, France3Inserm U. 1013 Hôpital Necker, Paris, [email protected]

Background. – Pseudomonas aeruginosa (PA) is present in

cleavage by asparagine endopeptidase (AEP) but its role in host response to P.A. is unknown.

Aims. – determine the roles of TLR9 in host defense during acute lung infection by P.A.

Methods. – Wild type (WT) and TLR9 – /– mice were infected i.n. with 107 CFU of a laboratory strain of P.A.

(BALs), alveolar macrophages (AMs) and PMN recruitment and P.A loads in lungs, cytokine secretion by a macrophage cell line (MHS) and primary AMs.

Results. – i) TLR9 – /– showed less mortality than WT mice, ii -ria were detected in BALs of TLR9 – /– compared to WT mice; iii) decreased levels of IL- 6, KC and TNFα were detected in BALs of TLR9 – /– mice; iv) stimulation of MHS by either PAK DNA or CpG triggered both TLR9 cleavage and cytokine secretion; v) both an AEP inhibitor and concanamycin B, a vacuolar H(+)- ATPase inhibitor that increases endosomal pH, reduced CpG- and PAK DNA- induced IL- 6 and TNFα secretion by MHS.

Conclusions. – Signalling through TLR9 plays a role in PA acute lung infection. This may

help to better understand the mechanisms involved in PA-

for the treatment of CF.Acknowledgments.- “Vaincre la Mucoviscidose” (VLM)

and the “Agence Nationale de la Recherche” (ANR) supported this work.


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La petite protéine de choc thermique αB- crystallin a un r le clé dans la rogen se pulmonaire par son action sur la SMAD4

P.- S. Bellaye1, G. Wettstein1, O. Burgy1, B. Crestani3, J. Marchal- Somme3, A. Fa re3, C. Garrido1, P. Camus1,2, P. Bonniaud1,2

1Protéine de stress et cancer, INSERM U866, Dijon,2Service de Pneumologie et réanimation respiratoire, CHU, Dijon3 INSERM U700, Faculté de Médecine Xavier Bichat, Parisphilippe.bonniaud@chu- dijon.fr

Introduction. –

présence de TGF- β1, les cellules épithéliales pulmonaires

α- SMA, lors d’un processus appelé transition épithélio- mésenchymateuse (TEM).

Nous avons récemment montré qu’HSP27, une petite protéine de stress (sHSP), avait un rôle important dans la TEM (J2R 2011). αB- crystallin, une autre sHSP est exprimée dans de nombreux tissus dont les poumons. L’expression d’αB- crystallin est induite par différents stress cellulaires et a un rôle majeur dans la réorganisation du cytosquelette. Le rôle d’αétudié.

Méthodes. – In vivo, des souris SV129 WT ou KO pour αB- crystallin recevaient une injection intra- trachéale de bléomycine (0,07 U/souris) ou du NaCl (CT). Les lavages broncho alvéolaires (LBA) et les poumons étaient prélevés à J7 et J21. In vitro des cellules A549 étaient traitées par rTGF- β1 pour induire une TEM.

Résultats. – In vivo aB- crystallin était surexprimée sur des biopsies de poumons de patients atteints de FPI. Après

1) Les souris WT comme KO subissaient une perte de poids -

daient aucun poids.--

menté chez les souris KO que chez les WT (× 2,5 et × 4 p < 0,05 respectivement par rapport aux CT).

β1 dans le LBA des souris KO était

In vitro en condition de TEM induite par rTGF- β1) αB- crystallin était surexprimée précocement (WB) ;2) αB- crystallin co- localisait avec α -cence) ;3) αB- crystallin avait un rôle direct sur la voie des SMADs, voie de signalisation du TGF- β1. L’inhibition d’αB- crystallin par des SiRNA bloquait la translocation nucléaire de SMAD4 inhibant ainsi la TEM induite par TGF- β1. A l’inverse, la surexpression d’αB- crystallin par transfection de plasmide induisait une translocation nucléaire de SMAD4 favorisant ainsi la TEM ;

membrane of bronchial epithelial cell lines. Moreover, ANO1 seems to be regulated by ERK1,2 signaling pathway. All of these results lead us to think that ANO1 could be potentialize to increase Cl –

transports in CF airways. Given together, ANO1 might be a potential pharmacological target for the treatment of

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Activation of macrophages y uric acid crystals engage NLRP3- in ammasome path ay and purinergic receptors

T. Gicquel1, T. Victoni1, A. Fautrel1,2, F. Gleonnec1, C. Lam ert1, I. Couillin3, E. Boichot1, V. Lagente1

1

2H2P2 Histopathological platform, IFR140, Université de Rennes 1, Rennes, France;3UMR- IEM CNRS6218, Université d’Orléans, [email protected]

Introduction. – Monosodium Urate (MSU) has been des-

pathway. We investigated the role of ATP and P2 purinergic

after MSU treatment in human macrophages. Moreover, we

between matrix metalloproteinases (MMPs) and their endo-genous inhibitors (TIMPs).

Methods. – Monocytes from healthy donors were obtained from buffy coat using human CD14 Microbeads separation kit. Macrophages were obtained after differentiation from monocytes by incubation with rhGM- CSF for 7 days. Cytokines and MMPs production was measured in the supernatant using ELISA or Antibody arrays. NLRP3 and P2X7R expression was evaluated by immunocytochemistry.

Results. – Lipopolysaccharide (LPS) and MSU elicited an increased production of IL- 1β, IL- 1α, IL- 6 at 6h and

β secre-tion in supernatant and showed an increased production of Endothelin- 1, GM- CSF and MMP- 8 production at 24h.

not increased at 6h and 24h after LPS + MSU treatment. Immunohistochemistry showed P2X7R and NLRP3 protein were expressed in macrophages. Suramin, a P2 purinergic receptor antagonist, decreased LPS + MSU production of IL- 1β at 6h.

Conclusion. – These results showed that LPS + MSU treat-ment engages NLRP3 and P2 receptor leading to cytokine

Keywords. – Infection;

36 Résumés

dans les liquides de lavage broncho- alvéolaires (LBA) de

Parallèlement l’inhibition des cathepsines intracellulaires provoque une diminution de l’expression d’α- SMA et du collagène soluble. L’inactivation du gène de la cystatine C par des ARN interférents restaure l’activité des cathepsines extracellulaires.

Conclusion. – Dans le modèle cellulaire utilisé pour cette

ce qui permettrait de réguler l’activité collagénolytique des cathepsines extracellulaires. D’autre part les cathepsines

Mots- clés. – Infection ; Référence. – [1] Moles A, Tarrats N, Fernández- Checa JC,

Marí M. Cathepsins B and D drive hepatic stellate cell proli-

70

Implication de la plèvre et des cellules mésothéliales lors de la rose pulmonaire induite par la léomycine administrée par voie générale

O. Burgy1, P.S. Bellaye1, G. Wettstein1, C. Garrido1, P. Camus1,2, P. Bonniaud1,2

1Protéine de stress et cancer, INSERM U866, Dijon ;2Service de Pneumologie et réanimation respiratoire, CHU, Dijonphilippe.bonniaud@chu- dijon.fr

Introduction. est une maladie rare d’étiologie inconnue débutant classi-quement dans les régions sous- pleurales. La bléomycine est un agent anticancéreux dont l’effet secondaire principal chez l’homme est une FP. Le Transforming Growth Factor (TGF)- β1 induit la transformation des cellules épithéliales

via un processus nommée transition épithélio- mésenchymateuse (TEM). La littérature suggère aussi l’importance de la mort cellulaire des cellules

plèvre et des cellules mésothéliales dans la toxicité de la bléomycine reste peu étudié.

Méthodes. – In vivo, des souris C57/BL6 étaient traitées par injection intraveineuse (IV) de bléomycine (20 mg/kg/2jours) ou de NaCl (CT). Les poumons, les liquides de lavage pleural (LLP) et broncho- alvéolaire (LBA) étaient collectés à J14. In vitro, des cellules mésothéliales pleu-rales humaines (Met5A) étaient cultivées en présence de bléomycine.

Résultats. – In vivo, après administration IV de bléomy-

(- 30 % comparé au CT à J14). La plèvre et les structures alvéolaires sous- pleurales étaient pathologiques (H & E) avec

4) αB- crystallin pouvait moduler le taux d’ubiquitination de SMAD4, régulant ainsi sa localisation via une action sur la protéine E3- ubiquitin ligase TIF1γ.

Conclusion. – La présence d’αB- crystallin sur des biopsies

induite par la bléomycine observée chez les souris KO suggè-rent un rôle d’αrégule la localisation cellulaire de SMAD4 en changeant son statut d’ubiquitination via son action sur la protéine TIF1γ et pourrait ainsi moduler la voie du TGF- β1 et la TEM lors de la FP.

Mots- clés. – Infection ; Ce travail est supporté par l’UE, 7th FP, HEALTH- F2-

2007- 202224 eurIPFnet

69

La cystatine C régule l’activité protéolytique des cathepsines cystéine lors de la rose pulmonaire

M. asa ova1,2, A. Saidi1,2, A. Joulin- Giet1,2, F. Lecaille1,2, S. Marchand- Adam1,2, G. Lalmanach1,2

1Centre d’Etude des Pathologies Respiratoires, Université François Rabelais, Tours, France2INSERM U1100 « Pathologies Pulmonaires: Protéolyse et Aérosolthérapie », Equipe 2: « Mécanismes

[email protected] tours.fr

Introduction. -

à une synthèse excessive des composants de la matrice extracellulaire ainsi qu’à un dérèglement de la balance protéases- antiprotéases. Les cathepsines à cystéine sont des protéases ayant un rôle essentiel dans l’homéostasie pulmonaire et la dégradation des constituants matriciels. Sachant que ces enzymes participeraient à la transformation

[1], l’objectif de cette étude était d’évaluer leur rôle dans

Méthodes. –que de leurs inhibiteurs naturels a été étudié dans un modèle

le TGF- β1). La contribution individuelle des différentes

cathepsines intracellulaires et par des expériences d’ARN interférents.

Résultats.cathepsines B, K et L est fortement augmentée par rapport

-tique s’accompagne d’une perte de l’activité protéolytique des cathepsines extracellulaires et d’une forte induction de l’expression de la cystatine C (inhibiteur naturel des pro-téases à cystéine). La cystatine C est également surexprimée


d’autre part ont été évalué par RT- qPCR. La production des cytokines dans les surnageants de macrophages pulmonaires

Résultats. – Les macrophages pulmonaires humains expriment les récepteurs α7nAChR mais pas les récepteurs nicotiniques α4. Le GTS- 21, induit de manière concentration dépendante une inhibition transcriptionelle et protéique des cytokines M1 après stimulation par LPS et des cytokines M2 après stimulation par l’IL- 13. Cependant, l’α- bungarotoxine (100 μM), ne bloque pas l’effet du GTS- 21 mais induit une augmentation transcriptionnelle et protéique des cytokines M1, à l’état basal et après stimulation par du LPS (1 ng/ml).

Conclusions. – Ces résultats montrent que les récepteurs α7nAChRs des macrophages pulmonaires humains pourraient

-toire. Leur stimulation par l’ACh neuronale ou non neuronale conduirait à une inhibition de l’activation des macrophages et de la production des cytokines M1 et M2. Ces observations soulignent l’intérêt potentiel des récepteurs nicotiniques α7 comme cible pharmacologique dans le traitement des

Mots- clés. – Infection ;

72

La régénération de l’épithélium respiratoire est anormale chez les patients mucoviscidosiques en a sence d’infection et in ammation endogènes

D. Adam, J. Roux, S. Lingée, B. Ra y- Na orcki, P. Birem aut, C. Coraux

Inserm UMRS903, CHU Maison Blanche, IFR53, URCA, Reims, France ; Laboratoire Pol Bouin, CHU Maison Blanche, Reims, [email protected]

Introduction. – Chez les patients mucoviscidosiques (CF), l’épithélium des voies aériennes est souvent lésé, et remodelé et doit rapidement régénérer sa structure. Que les

dérégulée reste à déterminer. Nous avons précédemment montré dans un modèle de xénogreffe que la régénération à partir de cellules épithéliales CF exemptes d’infection est retardée et reconstitue un épithélium remodelé.

Le but de la présente étude est de déterminer si la régénération de l’épithélium bronchique CF est anormale

Méthodes. – Les cellules épithéliales CF et non- CF ont été obtenues après dissociation de polypes nasaux et cultivées à l’interface air- liquide. L’histologie et la prolifération cellulaire ont été examinées sur des sections de culture après coloration histologique ou détection immunologique. La fonctionnalité des epithelia a été évaluée en termes de propriétés électriques, et d’acti-vité bactéricide des sécrétions épithéliales vis- à- vis de Staphylococcus aureus.

une augmentation du taux de collagène (histomorphomé-trie) au niveau pleural (+30 % comparé au CT. p < 0,05). La bléomycine induisait i) un recrutement de polynucléaires neutrophiles dans les LLP (May- Grünwald Giemsa) et ii) une augmentation du taux de TGF- β1 dans les LBA et LLP (respectivement × 3 et × 8 comparé au CT, p < 0,05). Des cellules positives au marquage TUNEL étaient observées dans les zones malades sans augmentation de l’activité caspase- 3 (immunohistochimie). In vitro, le traitement à la bléomycine 1) diminuait la viabilité des cellules Met5A (- 20%, doubles marquages AnnexineV/7- AAD), et 2) augmentait l’activité caspase- 1 (WB). La bléomycine induisait la TEM avec une diminution de l’expression de l’E- cadhérine et l’apparition de l’expression d’α- SMA.

Conclusion. – L’administration systémique de bléomycine chez le rongeur induit une FP impliquant la plèvre et la région sous- pleurale comme cela est observé dans la FPI chez l’homme. Nous montrons l’implication de la mort cellulaire, notamment avec la caspase- 1, et de la TEM des cellules mésothéliales dans l’initiation de cette FP.


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Rôle des récepteurs nicotiniques dans la régulation de la production des cytokines par les macrophages pulmonaires humains

C. A rial1, S. Grassin- Delyle1, A. Buenestado1, M. Brollo1, E. Naline1, R.L. Papke2, P. Devillier1

1Laboratoire UPRES EA220 Hôpital FOCH, Suresnes, Université de Versailles St Quentin, Yvelines, France2 Departments of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida, College of Medicine, Gainesville, Florida, [email protected]

Introduction. – L’acétylcholine d’origine vagale joue un rôle sur le tonus musculaire lisse bronchique. Il a récemment été mis en évidence un système cholinergique non neuronal

aucune étude n’a porté sur le rôle de ce système dans la -

latrice) des macrophages pulmonaires humains. Ainsi, les objectifs de cette étude ont été de déterminer si les récepteurs nicotiniques sont impliqués dans la régulation de la production des cytokines M1 et M2 par les macrophages pulmonaires humains.

Méthodes. – Les macrophages pulmonaires humains sont isolés à partir de pièces de résection pulmonaire et

du récepteur nicotinique α7 (α7nAChR), le GTS- 21 et un α- bungarotoxine suivi ou non d’une

stimulation par LPS (10 ng/ml) pour induire une polarisation M1 ou par l’IL- 13 (50 ng/ml) pour induire une polarisation M2. L’expression des chaînes α4 et α7 des récepteurs nicotiniques d’une part ainsi que les transcrits des cytokines M1/M2

38 Résumés

Alum in presence or not of apyrases, adenosine deaminase

purinergic receptors. Mature IL- 1β and eATP levels in the

analysis.Results. – We show that hydrolysis of both ATP and ADP

by apyrases impairs IL- 1β secretion upon silica but not with MSU or Alum particles. Moreover hydrolysis of adenosine by ADA attenuates or abrogates IL- 1β secretion by silica or Alum respectively without effect on MSU- mediated IL- 1β. In addition exogenous adenosine potentiates the IL- 1β secretion upon silica or Alum while selective P1 receptor blockade inhibits IL- 1β.

Conclusions. – These results suggest that ATP, ADP but also adenosine play a crucial role in secretion of mature IL- 1β by macrophages upon MSU, Alum or silica crystals probably through both P2 and P1 receptor signaling.

receptor signaling. These data provide new molecular mechanisms to explain how danger signals involved in

Keywords. – Infection ;

74

Action du SAHA (iHDAC) sur les epithelia CF et non- CF: Impact sur la différenciation cellulaire ?

A. Bergougnoux1,2,3,4,5, R. Chiron2, E. Bri es1,5, A. De Sario4,5, M. Claustres3,4,5, M. Taulan4,5, I. Vachier1, A. Bourdin1,6

1Département des Maladies Respiratoires, CHU Montpellier2CRCM, CHU Montpellier3Laboratoire de Génétique Moléculaire, CHU Montpellier4INSERM U827, IURC, Montpellier5Université Montpellier I, Montpellier6INSERM U1046, [email protected]

Introduction. – La mucoviscidose reste une affection incurable causée par un défaut quantitatif ou qualitatif d’expression membranaire de protéine CFTR. Les Histones DéACétylases (HDAC) pourraient, en induisant la compaction chromatinienne, contribuer à la physiopathologie de la maladie (mécanismes transcriptionnels au locus CFTR et/ou traductionnel via les protéines chaperonnes).

Le SAHA (Vorinostat®), inhibiteur d’HDAC (iHDAC), actuel-lement utilisé comme chimiothérapie contre les lymphomes T cutanés, est capable de restaurer une protéine CFTR mature et active dans la lignée cellulaire CFBe41o- (F508del homozygote) [1].

Nous avons évalué l’action du SAHA sur le taux de pro-téine CFTR ainsi que sur la sécrétion de mucines, dans un modèle ex vivo d’épithélium nasal de patients CF (F508del

Résultats. -nération épithéliale CF est retardée. L’épithélium régénéré est remodelé, présente une hyperplasie de cellules basales

non- CF. Toutefois, un retard dans la prolifération cellulaire

l’épithélium CF régénéré n’est pas fonctionnel.Conclusion. – Nous montrons ici qu’en absence d’infec-

CF est anormale et que l’épithélium régénéré est remodelé. Cela suggère fortement l’implication du défaut de la protéine

nous examinerons le processus de régénération des cellules épithéliales respiratoires i) après traitement avec un cor-

de corriger les cellules CF, ii) après traitement avec des siRNA pour éteindre l’expression protéique de CFTR dans les cellules non- CF.

Mots- clés. – Infection ; Ce travail fait l’objet d’un soutien par l’Association

Vaincre la Mucoviscidose, la région Champagne- Ardenne et l’INSERM.

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ATP, ADP and adenosine play a role in mature IL- 1β secretion to Nlrp3 in ammasome activators

A. Gom ault1*, B. Villeret1*, L. Baron1, N. Guillou1, M. Le Bert1, V. Lagente2, F. Rassendren F3, I. Couillin1

1

2

3IGF, CNRS UMR5203, INSERM U661, University of Montpellier I & II, France*These authors contributed equally to this workagombaul@cnrs- orleans.fr

Introduction. – Endogenous or exogenous danger signals such as uric acid (MSU) and silica crystals are involved in chro-

salts are as vaccine adjuvant. All induce innate immunity

that crystals induce maturation and secretion of IL- 1β through a process that involves extracellular release of endogenous ATP by hemichannel opening in macrophages (manuscript in revision). After release, extracellular ATP (eATP) interacts

via different ecto- ATPases to di- and monophosphates and then to ade-nosine. Those nucleotides are attracting interest as a new class of extracellular mediators, since they can be produced in the extracellular milieu and activate different purinergic receptors (P2X, P2Y or adenosine P1 receptors). We investi-gated the role of those nucleotides and purinergic signaling

Methods. – Macrophage cell lines or bone marrow- derived macrophages were stimulated in vitro with MSU, silica or


similaire et si leur caractère cationique peut leur conférer un pouvoir antimicrobien.

Méthodes. – Des expectorations de patients mucovisci-dosiques ont été traitées par de la pLK, pLK PEGylée (PEG- g- pLK) ou DNase puis l’activité des protéases du neutrophile a été mesurée en absence ou en présence de leurs inhibiteurs

pLK vis- à- vis des pathogènes de la mucoviscidose S. aureus et P. aeruginosa a été évaluée par dénombrement des CFU, microscopie électronique et mesure de perméabilité. Leur toxicité vis- à- vis de cellules bronchiques humaines (BEAS- 2B) a été étudiée par test MTS.

Résultats. – La pLK et la PEG- g- pLK compactent l’ADN et

des agrégats denses. Tout comme la DNase, les pLK augmen-tent l’activité de l’HNE et permettent son inhibition totale. Elles permettent également d’inhiber la CG ce qui n’est pas le cas de la DNase. De plus, les pLK présentent un effet bactéricide vis- à- vis des pathogènes de la mucoviscidose par une perméabilisation dans le cas de P. aeruginosa. La toxicité des pLK sur cellules bronchiques est diminuée en présence d’ADN, présageant une protection de l’épithélium par les sécrétions bronchiques chez les patients.

Conclusions. – Nos résultats suggèrent que l’adminis-tration par aérosol de polypeptides cationiques de type pLK permettrait de i) diminuer la protéolyse du tissu pulmonaire lors d’une co- administration d’antiprotéases, ii) tuer des pathogènes présents dans les poumons, et iii) améliorer la

pLK et leurs dérivés pourraient ainsi réduire les 3 symptômes

Mots- clés. – Infection ; Références. – [1] Dubois AV, Gauthier A, Bréa D, Varaigne

[2] Brevet EP12169547

76

IL- 33 ST2 axis regulates air ay in ammation to nanoparticles

L. Baron*, N. Guillou*, A. Gom ault, B. Villeret, B. Ryffel, I. Couillin

University of Orleans and CNRS, INEM- UMR7355 (ex IEM- UMR6218), Orleans, France1

*These authors contributed equally to this worklbaron@cnrs- orleans.fr

Introduction. – Nanomaterials are increasingly used for manufacturing industrial items, such as antibacterial surface coatings and semiconductors. The most frequently used nanoparticles are inorganic metaloxides such as silica dioxide (SiO2) and titanium dioxide (TiO2), due to their large surface- to- volume ratio. We showed recently that nano- TiO2 and nano- SiO2

homozygote) ou de témoins reconstitué en interface air- liquide à partir de grattage nasal.

Méthodes. – A 28 jours de différenciation des epithélia (8 CF et 8 non- CF), un traitement baso- latéral de SAHA

transcrits CFTR, MUC5AC et MUC5B (RT- qPCR) ainsi que la protéine CFTR et l’hyperacétylation protéique (Western

structurelles. L’analyse des interactions CFTR- HSP90 mais aussi le dosage des mucines totales (ELLA) et de la mortalité cellulaire (LDH) sont en cours.

Résultats. – Le SAHA diminue significativement l’expression de CFTR (ARNm et protéine), de MUC5AC et MUC5B (ARNm) tant chez les CF que chez les non- CF, alors que l’inhibition d’HDAC est effective. Après traitement, seules les cellules basales semblent encore présentes. Cinq jours après l’arrêt du traitement, ces phénomènes sont réversibles; l’expression de CFTR, MUC5AC et MUC5B (ARNm) s’en voit même potentialisée. Conclusions. – Sur l’épithélium humain reconstitué ex vivo, le SAHA diminue l’expression de CFTR contrairement à l’effet observé sur un modèle cellulaire, mais l’arrêt du traitement permet la restauration de l’expression de ces protéines. L’étude de l’action des iHDAC sur des cultures primaires d’épithélium respiratoire permettra de mieux comprendre les méca-nismes de la différenciation épithéliale dans les pathologies pulmonaires.

Référence. – [1] Hutt DM, Herman D, Rodrigues AP, Noel S, Pilewski JM, Matteson J, et al. Reduced histone deacetylase 7

75

Intérêt des polypeptidiques cationiques dans le traitement des symptômes de la mucoviscidose

A. Du ois1, D. Brea1, V. Herve1, P. Midoux2, M. Si- Tahar1, S. Attucci1, F. Gauthier1

1Centre d’Etude des Pathologies Respiratoires, Tours, France ;2Centre de Biophysique Moléculaire et Université d’Orléans, Orléans, [email protected] tours.fr

Introduction. – La mucoviscidose est caractérisée par une obstruction pulmonaire due à un mucus déshydraté,

en majorité due à la dégradation du tissu pulmonaire par 3 protéases du neutrophile (HNE, Pr3, CG). Nos travaux récents montrent que l’association de ces protéases à des macromolécules telles que l’ADN empêche leur inhibition par des inhibiteurs exogènes et qu’un co- traitement par la DNase améliore celle de l’HNE [1]. Le but de ce travail est d’évaluer si des polypeptides cationiques comme la poly- L- lysine (pLK), capable de compacter l’ADN, ont un effet

40 Résumés

one, and thus independent of most of Toll- like receptors, leading to IL- 8 synthesis via PI3 kinase, p38 MAPK, ERK1/2,

more details those two pathways of the innate response induced by A.f.

Methods. – The human epithelial cell line BEAS- 2B was infected with A.f conidia. Cytokine concentrations in cell culture medium were determined by ELISA or multiplex analysis. To assess the role of different pathways, target

-logical activities dampened by pharmacological inhibitors.

Results. – -tory mediators, we observed that only IL- 8, IL- 6 and MCP- 1

A.f- stimulated REC and this independently of the MyD88 pathway as deduced from the

We then looked for the involvement of Syk, a immunore-gulatory protein tyrosine kinase involved in most antifungal responses. We observed that Syk was required (siRNA and piceatanol) for A.f - induced PI3 kinase, p38 MAPK, ERK1/2,

to the Syk pathway and essential for the protection against fungal infections, was also involved for cytokine synthesis as demonstrated with siRNA.

Conclusions. – The study demonstrates that Syk mediates A.f- -

stimulated REC. This pathway is independent of MyD88, and involves CARD9.

As the Syk pathway is known to be associated with C- type lectin- like receptors such as Dectin- 1, Dectin- 2 or Mincle, future studies will look for which receptor is involved in the recognition of A.f and induces cytokine synthesis and which fungal molecule is recognized by this receptor. Results could provide potential targets for designing therapeutic agents against A.f infection.


78

Les facteurs de transcription GLI de la voie Sonic Hedgehog contrôlent la différenciation myo ro lastique induite par le TGF- β1

E. Farrokhi Moshai1, N. Cigna1, S. Brayer1, J. Marchal- Somme1, L. Wemeau- Stervinou1, M. Dehoux2, B. Crestani1,2,3, A.- A. Mailleux1

1Inserm U700, UFR de Médecine Xavier Bichat, Paris2Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat, Paris3Service de Pneumologie, Hôpital Bichat, [email protected]

Introduction. – La voie Sonic Hedgehog (SHH) joue un

cours de l’ontogenèse pulmonaire. Nous avons montré que

idiopathique (FPI). Le TGF- β1 est un médiateur clé de la

IL- 1β and IL- 1α release and that inhalation of nano- TiO2

and IL- 1α

the IL- 1 family cytokine signaling through the ST2 receptor, in nano- SiO2- induced

Methods. – In vivo, C57Bl/6 wild- type mice or mice

were administered intranasally with nano- SiO2 particles. In addition wild- type mice instillated with saline or nano- SiO2 particles were treated with murine rIL- 33 protein. Mice were

-

of metalloproteinase 1 (TIMP- 1) levels in the airways. In vitro, bone marrow- derived macrophages from wild- type or

2 or nano- SiO2. IL- 1β, IL- 1α

Results. – In vivo- SiO2 airway

instillation with increased production of the neutrophil chemoattractant KC, associated with enhanced neutrophil recruitment in BALF and lung. Moreover, levels of the pro-

- 1β, IL- 1α and IL- 33 and of the remodeling factor TIMP- 1 were importantly increased in BALF and/or lung. In vitro, IL- 1β secretion upon nanoparticles was

Conclusions. – These data suggest that IL- 33, signaling through the ST2 receptor, is an important endogenous regu-

constitute a new therapeutic approach to control pulmonary


77

Activation of the innate response of respiratory epithelial cells y Aspergillus fumigatus

V. Balloy1,2, M.- L. Fremond1,2, J.P. Latge3, M. Chignard1,2

1

France2U874 – INSERM, Paris, France3Unité des Aspergillus – Institut Pasteur, Paris, [email protected]

Introduction. – Aspergillus fumigatus (A.f) is an opportunistic fungus responsible for invasive pulmonary aspergillosis that occurs in immunocompromised patients. Inhalation of spores by those hosts results in fungal growth inside the lung and hematogenous dissemination. It is gene-rally accepted that alveolar macrophages phagocyte and kill conidia while neutrophils lyse hyphae of germinated spores. In a previous study (Balloy et al., 2008), we demonstrated that A.f activates respiratory epithelial cells (REC) at least


and networks involved at a late stage of pulmonary failure.Methods. – RNAs were isolated from blood cells of 19

patients diagnosed with PAH, 33 with CF, 12 with COPD and 38 healthy volunteers (HV). Then, Agilent genome- wide 60K microarrays were performed from 3 patients diagnosed with PAH, 23 with CF and 28 healthy volunteers (HV). Gene expression of the microarray analysis were validated by qPCR in new independent samples from patients with COPD, PAH, CF and HV.

Results. – Based on the 17,163 unique genes analyzed, a principal component analysis discriminated patients with CRF from HV. An unsupervised hierarchical clustering of these genes allow us to identify 5 clusters of genes associated either with CRF, PAH or CF. A cluster of 3,749 genes associated with CRF were enriched in gene ontology (GO) categories related to T cell signaling such as “T cell receptor signal-ling pathway” and “antigen receptor- mediated signaling pathway” ontologies. Using the genes included in these enriched GO categories, we found a network associated with lymphocyte activation and composed with 4 major

gamma (CD3G), CD3 Epsilon (CD3E), T- Cell Factor (TCF7) and Interleukine 7 Receptor (IL7R). Among these genes, TCF7 and IL7R genes were validated by qPCR on independent samples

Toll Like Receptor 4 (TLR4) in CF, and Midkine (MDK) and Lectine Galactoside- binding Soluble 3 (LGALS3) in PAH, two genes involved in angiogenesis.

Conclusion. – Our results showed an association of

in addition to nutritional care, immunological aspects and particularly T- Cell Factor (TCF7) and Interleukine 7 Receptor (IL7R) networks are involved in the physiopathology of CRF. This should be considered in order to improve outcome of patient with CRF.

Mots- clés. – Infection

80

Effet délétère du NLRC4- in ammasome dans un modèle murin de pneumonie aiguë à Pseudomonas aeruginosa

E. Faure, J.- B. Méar, B. Guery, M. Chamaillard, K. Faure, E. Kipnis

UMR8204 U1019 Ciil équipe 7 NLR in infection and [email protected]

Introduction. – Pseudomonas aeruginosa, responsable de pneumonie aiguë en réanimation, est reconnue grâce au système de sécrétion de type 3 (SST3) par les Nod- Like récepteurs (NLR), appartenant à la famille des Pattern Recognition récepteurs (PRR) et tout particulièrement

-some dans les pneumonies aiguës à P. aeruginosa n’est

l’interaction entre les voies SHH et TGF- β1 au cours de la

Méthodes -vés à partir de biopsies de sujets témoins ou de patients atteints de FPI ont été prétraités avec des inhibiteurs de la voie SHH (cyclopamine 5 μM, HPI- 4 20 μM, GANT61 5 μM), puis stimulés par le TGFβ- 1 (1 ng/ml) pendant 48 h. L’expression des différents acteurs de la voie SHH et de marqueurs de

lisse α α1COL1, α2COL1) ont été analysées par PCR quantitative et Western Blot.

Résultats. – Le TGF- β1 active la voie SHH dans les

composants clés de la voie SHH. Réciproquement, la pertur-bation du cil primaire par HPI- 4 ou l’inhibition des facteurs de transcription GLI dans le noyau par GANT61, inhibe l’effet du TGF- βFPI. En revanche, l’inhibition de Smoothened (un important transducteur de la voie SHH) par la cyclopamine inhibe la

β1 sur

sont résistants à l’action de la cyclopamine. Ce processus est régulé par la voie du TGF- β1 passant par SMAD3.

Conclusions. – Les facteurs de transcription GLI, activés depuis le cil primaire, sont nécessaires à la différenciation

β1 dans les deux types

facteurs de transcription GLI comme cibles thérapeutiques potentielles dans la FPI.


79

Genes expression modulations in lood from patients exhi iting Chronic Respiratory Failure

J. Chesné1, R. Danger2, M. Reynaud- Gau ert3, S. Mussot4, M. Stern5, I. Danner1, J.- F. Mornex, C. Pison, R. Guillemain, C. Dromer, K. Botturi1, S. Brouard2, A. Magnan1, et le consortium COLT

1UMR_S 1087, l’institut du Thorax, CHU de Nantes, Nantes, France;2UMR_S 643, ITUN, jean Monnet, Nantes, France3CHU de Marseille, Marseilles, France4Centre chirurgical Marie Lannelongue, Le Plessis Robinson, France5Service de Pneumologie, Hôpital Foch, Suresnes, FranceJulie.chesne@univ- nantes.fr

Introduction. – Cystic Fibrosis (CF), pulmonary arterial hypertension (PAH) and Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) are three broncho- pulmonary diseases leading to respiratory failure and for which lung transplantation is the only curative treatment. The comprehension of physio- pathological pathways involved in respiratory failure would be an important and challenging issue allowing for individualized therapy. We took advantage of the large COhort biocollection

42 Résumés

Methods. – We developed a triple coculture model in allogenic conditions melting BEC (16HBE14O- cell line), blood monocyte- derived dendritic cells (moDC) and TL sorted with anti- CD3 and anti- CD14 magnetic beads. BEC are cultured on a pore membrane (Transwell®). Monocytes are derived into dendritic cells with IL- 4 and GMCSF during 5 days, while TL are stimulated by anti- CD3. TL and moDC are then coated at the basal pole of the Transwell® for 4 days. Control conditions are represented by moDC co- cultured with TL only. RNA and Western blot analyses are performed on BEC in order to study mesenchymal markers expression (vimentin, α- SMA) and

cytometry to detect memory T- cell (CD45RO) and activated T- cell (ICOS, CD28).

Results. – An increase in vimentin expression is observed in BEC after 4 days of triple coculture. E- Cadherin and ZO- 1

and CD45RO expression is observed at the surface of co- cultured T cells.

Conclusion. – The triple coculture induces an increased expression of Vimentin, suggesting a mesenchymal differen-ciation of BEC upon allogenic stimulation. A kinetic of this process must be established and a loss of E- Cadherin and ZO- 1 explored in longer cultures. The mRNA analysis will further decipher this process. A shift of the CD4 low T cells towards a regulatory phenotype must be explored further as well.

This triple coculture model will be applied to donor- derived primary bronchial epithelial cell cultures from trans-planted patients in the frame of the COLT study to establish

Keywords. – Infection; Thanks to «fond de dotation recherche en santé res-

piratoire» «Vaincre la mucoviscidose» and « Agence de Biomédecine » for their support.

82

Inhi ition de la réponse in ammatoire induite par du Lipopolysaccharide (LPS) par un nouveau macrolide dépourvu d’activité anti iotique

A. Deveaux1, V. Balloy2,3, O. Ta ary1, P. le Rouzic1, A. Clement1, 4, M. Chignard2,3, H. Corvol1,4, M. Burnet5, L. Guillot1

1Inserm U938, CDR Saint- Antoine, Paris, France2Inserm U874, Paris, France3

Paris, France4Pneumologie pédiatrique, APHP, Hôpital Trousseau, Paris, France5Synovo, Tübingen, [email protected]

Introduction. – Les patients atteints de mucoviscidose sont traités par un antibiotique, l’azithromycine (AZM)

pas encore élucidé. Pour cela, nous comparons des souris sauvages et des souris IPAF – /– dans un modèle de pneu-monie aiguë.

Méthodes. – Des souris sauvages et IPAF- /- de fond C57bl/6 sont instillées en intra nasal avec 107 CFU. Les souris

pulmonaire grâce à la perméabilité alvéolo- capillaire estimée par la fuite protéique dans les voies aériennes. L’étalement d’homogénats de poumon et de rate permet d’estimer la charge bactérienne pulmonaire ainsi que la dissémination

sont réalisés pour estimer la cellularité et doser les cytokines dans les surnageants par méthode ELISA.

Résultats. – Les souris IPAF – /– montrent une survie signi-vs 20% à 96 heures), une lésion

pulmonaire (p < 0,01) et une charge bactérienne (p < 0,05)

n’est observée au niveau de la dissémination bactérienne et la perte de poids. Les LBA montrent une augmentation

souris IPAF – /–. Aucune différence n’est observée sur les concentrations en TNFα.

Conclusions. – Les souris IPAF- /- montrent une augmen-tation de la clairance bactérienne associée à une diminution de la lésion pulmonaire induite à 24 heures. L’activation

-monies aigues à P. aeruginosa en déséquilibrant la réponse

Référence. – [1] Miao EA, Ernst RK, Dors M, Mao DP, Aderem A. Pseudomonas aeruginosa activates caspase 1

Mots- Clés. – Infection ;

81

Triple coculture model mimicking the Epithelial Mesenchymal Transition of Bronchiolitis O literans during lung transplantation

P. Lacoste1, M. Pain1, P. Au ert2, K. Botturi1, A. Magnan1

1Inserm UMR1087, CNRS UMR6291, l’institut du thorax, Université de Nantes, Nantes, France2Inserm UMR913, Institut des Maladies de l’Appareil Digestif, Nantes, [email protected]

Introduction. – Bronchiolitis obliterans (BO) is the manifestation of chronic lung allograft rejection. There is a key role of bronchial epithelial cells (BEC), allogenic target of Dendritic Cells and T Lymphocytes (TL), in this condition. Recent evidence suggests the implication of epithelial mesenchymal transition (EMT) characterized by loss of tight junctions and accumulation of mesenchymal markers, in the development of BO.


C. albicans airway colonization protects from P. aeruginosa induced lung injury [1]. The aim of this study was to charac-terize effector mechanisms responsible for this protective effect.

Méthode. – Mice were infected by intranasal instillation of P. aeruginosa PAO1 (10^7 CFU), following prior (48h) priming by C. albicans airway colonization (10^5 CFU) or not versus controls receiving sterile saline. Broncho- alveolar

for cellularity and ELISA for cytokine levels. Antimicrobial peptide expression was assessed by qPCR in the lung. In selected groups IL- 22, alveolar macrophages (MP) and polymorphonuclear neutrophils (PMN) were depleted (IL- 22 capture antibody, liposomal clodronate or cyclophosphamide respectively).

Résultats. – C. albicans airway colonization alone led

NK cells, IL- 22 increase, and an increase in β- defensin 2 & 3 and cathelicidin. Mice with attenuated pneumonia through C. albicansincreased IL- 17, IL- 22, TNFα and cathelicidin than mice only infected by P. aeruginosa. Anti- IL- 22 or alveolar MP depletion but not PMN depletion abrogated this protective effect.

Conclusion. – C. albicans airway colonization modulates innate immunity against P. aeruginosa through macrophages, IL- 17/IL- 22, and cathelicidin expression.

Reference. – [1] Ader F, Jawhara S, Nseir S, Kipnis E, Faure K, Vuotto F, et al. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa- related lung injury and

Mots- clés. – Infection;

84

Induction d’un phénotype M1 dans les macrophages exposés aux nanoparticules de fumée de soudage

A. Simon- Deckers1,3, P. Andu ar1,2, J. Boczkowski1, J.C. Pairon1,2, J. Doucet3, S. Lanone1,2

1Inserm U955, Équipe 4, Créteil, France2Service de pneumologie et de pathologie professionnelle, CHI Créteil, France3LPS, CNRS, Orsay, Franceangelique.simon- [email protected]

Introduction. – Une étude menée au laboratoire s’est intéressée à des patients soudeurs, en tant que modèle humain d’exposition à des nanoparticules (NP) d’oxyde métalliques émises dans les fumées de soudage. Il a été montré que chez ces patients, il existe des lésions de

macrophages et de NP d’oxydes métalliques composées essentiellement de Fe, Mn et Cr [1]. Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse dans cette étude in vitro que ces

qui participerait aux altérations pulmonaires observées chez les soudeurs.

décrits chez des patients avec ou sans infection, suggérant

l’utilisation d’AZM entraîne des phénomènes d’hypersensibi-lité et de résistance qui se développent vis- à- vis de certains

(colites, polyarthrite rhumatoïde) il a été montré qu’un

plus important que l’AZM et qu’il était dépourvu d’activité antibiotique [1]. L’objectif de cette étude est d’évaluer les

mode d’action cellulaire.Méthodes. – L’effet antibiotique de cette molécule a été

étudié vis- à- vis de P. aeruginosa et S. aureus. L’effet anti-

épithéliales pulmonaires (A549, BEAS- 2B) et des macrophages (murins alvéolaires, U937) stimulés par du LPS. Les produc-tions d’IL- 8 et de TNF- α ont été mesurées par ELISA.

Résultats. – Dans un premier temps nous avons observé qu’à l’inverse de l’AZM, le CSY0073 n’inhibait pas la crois-sance de P. aeruginosa et de S. aureus. Puis, nous avons observé que le CSY0073, comme l’AZM, n’avait pas d’effet inhibiteur sur la production d’IL- 8 induite par le LPS par les cellules épithéliales pulmonaires. En revanche le CSY0073 et l’AZM inhibent la production de TNF- α par des macrophages.

Conclusion. – Les premiers résultats sur le potentiel

in vivo. L’étude des mécanismes d’action de ce composé ouvre de larges champs d’études pour les pathologies respiratoires chroniques de l’enfant mais aussi de l’adulte. En effet, récemment une réduction des exacerbations à également été observée chez des patients atteints de BPCO suite au traitement par l’AZM

Mots- clés. – Infection ; Référence. – [1] Mencarelli A, Distrutti E, Renga B,

Cipriani S, Palladino G, Booth C, et al. Development of

immune dysfunction in models of inflammatory bowel

83

Lung Sensitization y Candida albicans Protects from Pseudomonas aeruginosa- Induced Lung In ury Through Expression of Antimicro ial Peptides

J.B. Méar1, E. Faure1, E. Kipnis2, K. Faure2, R. Dessein2, G. Schurtz2, P. Gosset3, B. Guery2

1Inserm U1019, équipe 7, France2

3Inserm U1019, équipe 8, Institut Pasteur de Lille ; Lille, [email protected]

Introduction. – Pseudomonas aeruginosa, responsible for hospital- acquired pneumonia in critically ill patients, is often isolated with Candida albicans. In a murine model,

44 Résumés

Matériels et Méthodes. – Des souris C57/Bl6 ont été instillées de façon répétée et hebdomadaire durant 1 jour, 1 mois et 3 mois avec 5 μg de NP de Fe2O3, Fe3O4, MnFe2O4, CrOOH et le mélange des 4NP ou avec 20 μg de NP, la dose

un lavage broncho- alvéolaire (LBA) est réalisé ainsi que, le prélèvement des poumons, de la rate, des reins et du sang.

ELISA (IL- 1β, TNF- α, TGF- β) et, des poumons pour des ana-

(μXRF) et microscopie optique (MO).Résultats. – La cellularité du LBA des souris instillées

1mois et 3mois de façon répétée, avec les NP de Fe3O4 et MnFe2O4 témoins ainsi que, la concentration de protéines totales des souris instillées 1mois avec les NP de MnFe2O4. Aucune

dosées dans le LBA. Les analyses par MO et μXRF ont permis d’observer des amas de particules dans les poumons des souris respectivement instillées de façon répétée durant 1mois avec des NP de MnFe2O4 et Fe3O4 et, avec 20 μg de NP de MnFe2O4n’a été observée. L’analyse par qRT- PCR de l’expression de cytokines et de marqueurs de stress oxydatif est en cours.

Conclusion. – L’administration répétée de faibles doses de NP n’induit que peu d’effets biologiques. Cependant, la présence d’amas de particules dans les poumons des souris exposées pourrait être associée à des effets à plus long terme.


86

Mechanisms of P. aeruginosa- induced expression of secretory phospholipase A2 type IIA in cystic rosis lung epithelial cells

E. Pernet, D. Leduc, M. Chignard, Y. Wu, L. Touqui

Institut Pasteur, [email protected]

Introduction. disease due to mutations of cftr gene and chronic bacterial infection by opportunistic pathogens such as Pseudomonas aeruginosa is a hallmark of this disease. Our preliminary data showed that in human CF epithelial cells P. aeruginosa stimulated expression of secretory phospholipase A2 type IIA (sPLA2- IIA). The latter has been shown to exhibit bactericidal property against Gram- positive bacteria like Staphylococcus aureus. However, the virulence factors of P. aeruginosa and signalling pathways involved in this expression are still unknown.

Methods. – Human bronchial CF epithelial cell line IB3- 1 was used in the present study. Cells were infected by P. aeruginosa and 24h later sPLA2- IIA expression was analyzed

Méthodes. – Des macrophages humains (lignée THP- 1) ont été exposés pendant 24 h à des NP représentatives de

2O3, Fe3O4, MnFe2O4 et CrOOH (diamètre 25 nm). La viabilité cellulaire a été

(ME) ont été récupérés et dosés en luminex pour différentes

chemoattractant de ces ME, des expériences de migration de macrophages THP- 1 ont été réalisées en chambre de Boyden.

Résultats. – Les NP n’entraînent pas de cytotoxité pour des concentrations allant jusque 25 μg/cm². Le dosage des cytokines dans les ME montre que les NP Fe2O3, MnFe2O4 et CrOOH induisent la sécrétion des cytokines IL- 1β, IL- 6, IL- 10 et TNF- α et des chémokines CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL- 7 et CCL- 22. Cette sécrétion de chémokine est associée à une induction de migration de macrophage en chambre de Boyden. Par ailleurs, aucune sécrétion d’IL- 4, IL- 5, IL- 12, IL- 13 n’a été détectée.

Les NP Fe3O4 induisent uniquement une augmentation de la sécrétion de IL- 1β et des chemokines CXCL8 et CCL7, ce qui montre que les effets sur le sécrétôme sont dépendants

TGF- α en comparaison du contrôle non exposé.Conclusions. – Les NP représentatives des fumées de sou-

dage induisent dans les THP- 1 essentiellement un phénotype

et de chémokines capables d’induire la migration de macro-phages. Elles pourraient donc avoir un rôle important dans les altérations pulmonaires observées chez les soudeurs.

Référence. – Mots- clés. – Infection ;

85

Effets respiratoires d’instillations répétées de nanoparticules d’oxydes de Fer, de Manganèse et de Chrome, chez la souris

M. Presume1, A. Simon- Deckers1,2, G. Beaune3, O. Durupty3, J. Boczkowski1, S. Lanone1

1Inserm U955, Équipe4, Créteil, France2LPS, CNRS, Orsay, France3Matériaux hybrides et nanomatériaux, Collège de France

[email protected]

Introduction. – La production croissante de nanopar-ticules (NP) soulève des inquiétudes quant à leur toxicité vis- à- vis de l’Homme. Du fait de la présence d’un grand nombre de NP dans les fumées de soudage, les soudeurs représentent un modèle humain d’exposition aux NP. Ces derniers développent des pathologies pulmonaires telles

d’évaluer le rôle potentiel des NP des fumées de soudage dans les altérations pulmonaires observées chez les soudeurs, l’objectif de notre étude est de déterminer les effets respi-ratoires d’instillations répétées de NP chez la souris.


émettre l’hypothèse qu’au cours d’un sepsis sévère endocan pourrait être dégradé, conduisant à une exacerbation de la diapédèse des leucocytes et au déclenchement d’une

Méthodes. – La dégradation d’endocan par les neu-trophiles est évaluée in vitro par incubation d’endocan avec un surnageant de PNNs activés, ou avec les protéases

-tence d’un fragment de clivage d’endocan chez l’homme, des immunoprécipitations, analysées par western blot, ont été réalisées sur les plasmas de 4 témoins et 5 patients

du fragment de clivage d’endocan a permis de comparer les taux circulants observés chez 32 sujets sains Vs 55 patients en sepsis sévère.

Résultats. – In vitro, nous montrons qu’endocan est dégradé par les PNNs et plus précisément par la sérine protéase Cathepsine G. Cette dernière clive endocan en un fragment protéique de 14 kDa, nommé p14. Par immuno-précipitation, nous avons mis en évidence dans le plasma de patients septiques la présence d’un p14 circulant. D’autre

montre une augmentation du taux de p14 plasmatique chez les patients en sepsis sévère (0,52 à 10,4 ng/mL), comparé aux sujets témoins (0 ng/mL).

Conclusion. – L’ensemble de ces résultats suggère que p14 représente un nouveau biomarqueur intéressant qui pourrait participer à la pathogenèse du sepsis et de la défaillance respiratoire.

Mots- clés. – Infection;

88

BAFF regulates IL- 1β and IL- 17A mediated pulmonary rosis in mice

B. Villeret1, A. Francois2, A. Gom ault1, S. Marchand Adam3, D. Wachsmann2, J.- E. Gotten erg2, I. Couillin1

1

2 EA4438, Université de Strasbourg, UFR Sciences Pharmaceutiques, France3Inserm U 618, faculté de médecine, Université François Rabelais, Tours, Francecouillin@cnrs- orleans.fr

Introduction.devastating as yet untreatable disease. We recently demons-

-

IL- 1 β and the existence of an early IL- 1β- IL- 23- IL- 17A axis

we analyze a potential role for the tumor necrosis factor (TNF) family members B cell activating factor (BAFF).

Methods. – (BALF) from IPF were evaluated by ELISA. In an experimental

by western blot and qPCR. In certain experiment, cells were pre- incubated with pharmacological inhibitors 1h before infection. Cells were also infected by bacteria for 30min and then protein phosphorylations were examined by western blot.

Results. – Various strains of P. aeruginosa including PAK, CHA, PAO1 and mucoid strain induced sPLA2- IIA expression in IB3 cells at almost similar levels. Two mutants of P.aeruginosa,

mutant not recognized by TLR5) induced sPLA2- IIA expression -

lin of P. aeruginosa failed to induce sPLA2- IIA expression. Incubation of cells with other P. aeruginosa components including LPS, CpG and quorum sensing (HSL) did not induce sPLA2- IIA expression. Interestingly, sPLA2- IIA expression

-

pili induced sPLA2- IIA expression. Application of receptor ligands, neutralizing antibodies or inhibitor indicated that TLR2, 4, 5 and intracellular receptors did not participate in P. aeruginosa- induced sPLA2- IIA expression. MAPK Erk and AP- 1, but not p38 and NF- xB, were proven to be involved in this process.

Conclusions. – P. aeruginosa induces sPLA2- IIA expres-sion in human bronchial CF epithelial IB3 cells and that the virulence factor pili plays a major role in this induction via a Erk MAPK and AP- 1 dependent process.

This work was supported by «Vaincre la Mucoviscidose» (VLM) and the « Region Ile- de- France » (DIM, MALINF).

87

Identi cation d’un fragment d’endocan circulant de 14 kDa, généré par la cathepsine G et augmenté chez les patients septiques

N. De Freitas Caires1,2, E. Parmentier3, A. Scherpereel1,3, M. Delehedde1,2, A. Tsicopoulos1, D. Mathieu3, P. Lassalle1

1 U1019 Equipe 11, Institut Pasteur de Lille, CIIL, Lille, France2Lunginnov, Lille, France3CHRU Lille, Hôpital Calmette, Lille, [email protected]

Introduction. – Endocan est un protéoglycane sécrété préférentiellement par les cellules endothéliales pulmo-

inhibe l’interaction LFA- 1/ICAM- 1 et bloquerait ainsi la diapédèse des leucocytes. Une étude a mis en évidence une augmentation des taux sériques d’endocan chez des patients en sepsis sévère, faisant de ce protéoglycane un marqueur de mauvais pronostic. Plus récemment, des travaux ont montré que le taux circulant d’endocan pourrait prédire la survenue

d’endocan élevé ne développent pas de défaillance pulmo-naire alors qu’un taux d’endocan bas prédit un haut risque de défaillance pulmonaire. Cette observation nous a amené à

46 Résumés

Résultats. – Après 5 jours de coculture, nous observons une diminution de l’expression des marqueurs de jonctions adhérentes (E- cadhérine) et serrées (zonula- occludens- 1) et une apparition de vimentine, lorsque l’épithélium est en contact avec les cellules immunitaires. Par microscopie confocale, nous remarquons que les cellules épithéliales

LT présentent une augmentation du marqueur de surface CD45RO ainsi que des molécules de co- stimulation activa-trices (CD28, ICOS).

Conclusion. – Le contexte allogénique est capable de

par une diminution des marqueurs de l’épithélium et une augmentation des marqueurs mésenchymateux. Dans ce contexte les cellules épithéliales sont capables de migrer à travers le Transwell®. Ceci démontre que le contexte allo-

partir des anneaux trachéaux du donneur prélevé le jour de la transplantation, les cellules épithéliales seront cultivées en interface air- liquide puis mis en contact avec les monocytes et les LT du receveur préalablement isolées de prélèvements sanguins.


90

The G Glycoprotein of Human Respiratory Syncytial Virus Facilitates Virus Attachment and Infectivity via an Interaction with Cellular CCR3 Receptor

V. Wellemans1, H. Ait Benhassou2, S. Dury3, F. Le argy3, F. Bellesort1, S. Gangloff2, N. Heveker1, S. La erge1, B. Lamkhioued2

1

Québec H3T 1C5, Canada2Laboratoire d’Immunologie et de Microbiologie, EA4303, Faculté de Pharmacie, IFR53 Biomolécules, Reims, France3Service des maladies respiratoires et allergiques, CHU de la Maison Blanche, 51092 Reims, Francebouchaib.lamkhioued@univ- reims.fr

Respiratory syncytial virus (RSV) infection is the principal cause of serious lower respiratory tract disease and accounts

studies have shown an increase in airway responsiveness and a concomitant Th2 response in the lungs of RSV infected patients. These indications suggest that RSV may modulate aspects of the immune response to promote virus replication. In this study, we show that secreted RSV G glycoprotein (sG

and has a selective chemotaxis of polarized Th2 cells and eosinophils. Preincubation of Th2 cells and eosinophils with

of these cells toward sG protein and eotaxin, indicating that RSV G protein bound to the cell surface of these cells mainly via CCR3. This was consistent with the data showing that

model of IPF, C57Bl/6 wild- type mice were instillated with saline or bleomycin and treated or not intraperitoneally with

14 days after bleomycin instillation and different parameters

airways. BAFF, IL- 1β, latent TGF- β1, MMP- 9 and TIMP- 1 levels in BALF and lung homogenate were determined using ELISA

Results. -cerbated IPF present increased level of BAFF in the BALF as compared with control individuals. Using the bleomycin

lung injury induces a high production of BAFF into the bron-choalveolar space and the lungs, correlated with lymphocyte

mice for IL- 1R1, IL- 17A and IL- 17RA, we show that BAFF expression is dependent on IL- 1 and IL- 17A signaling.

Conclusions. – These data suggest that BAFF is a critical mediator in IPF and support a link between IL- 1, BAFF and


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Modèle de triple coculture in vitro : cellules épithéliales ronchiques monocytes et lymphocytes T a n d’étudier le re et chronique pulmonaire

M. Pain1, P. Lacoste1, P. Au ert2, D. Re oulleau1, K. Botturi1, A. Magnan1,3

1Institut du Thorax – INSERM UMR 1087, Nantes – France2INSERM UMR 913, Nantes – France3Institut du Thorax – Service de Pneumologie – CHU de Nantes, Nantes – Francemallory.pain@univ- nantes.fr

Introduction. – La principale complication à long terme de la transplantation pulmonaire est la survenue d’une dysfonc-tion chronique du greffon ou bronchiolite oblitérante (BO). De récentes études suggèrent l’implication d’une transition de l’épithélium en cellules mésenchymateuses. L’objectif de cette étude est de tester si le contexte allogénique de greffe peut induire une transition épithélio- mésenchymateuse (TEM).

Méthodes. – La mise en place de ce modèle est réalisée à partir de recoupes bronchiques du donneur sain, au cours d’une transplantation pulmonaire. Ces cellules épithéliales sont cultivées sur un Transwell® en interface air- liquide (ALI). Une fois l’épithélium constitué, les monocytes et

sur les protéines de jonctions et les marqueurs de cellules

marqueurs est également réalisé par western blot et qPCR. L’analyse des surnageants de culture s’effectue par ELISA. Le


JCpulmonaire (VLPS C LPS Cétait aussi majorée chez les souris VLPS par rapport aux JLPS. Au plan hémodynamique, aucune différence n’était consta-tée entre JLPS et VLPS.

Conclusions. – Les souris vieilles présentaient une susceptibilité accrue au LPS et à la ventilation mécanique à bas volume courant, avec en particulier une mécanique ventilatoire très dégradée et une fuite alvéolocapillaire majorée.


Physiologie – Dyspnée – Contrôle ventilatoire

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La dyspnée des pneumopathies in ltrantes diffuses est liée à la commande ventilatoire

C. Londner1, G. Al Dandachi1, L. Plantier1, K. Gillet- Juvin1–2, B. Chevalier- Bidaud1, B. Mahut1, D. Israel- Biet2, C. Delclaux1

1 Service de Physiologie- Explorations Fonctionnelles, Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris, France2 Service de Pneumologie, Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris, [email protected]

Introduction. – La dyspnée d’exercice est la plainte

diffuse (PID) et altère de façon importante leur qualité de vie physique et mentale. Les mécanismes responsables de ce symptôme sont multiples et il n’en existe pas à ce jour

déséquilibre entre la demande et la réponse ventilatoires [1], qui serait intégré au niveau central, où seraient élaborés des mécanismes d’adaptation [2]. L’objectif de ce travail était d’analyser de façon simultanée les déter-

respectives.Méthodes. – Les sujets inclus étaient les patients atteints

de PID adressés au service des explorations fonctionnelles respiratoires (EFR). La dyspnée était évaluée par les scores MRC (Medical Research Council) et BDI (Baseline Dyspnea Index). Les examens réalisés comportaient, en plus des EFR habituelles et du test de marche de 6 minutes, l’évaluation des muscles respiratoires par les pressions inspiratoire et expiratoire maximales (PImax et PEmax), l’étude de la com-mande ventilatoire par la pression d’occlusion à 0,1s (P0.1), une mesure du rapport espace- mort physiologique sur volume courant et un enregistrement de la ventilation courante par pléthysmographie d’inductance permettant d’estimer la variabilité respiratoire.

CCR3 facilitates RSV infection of airway epithelial cells and eosinophils that was inhibited by eotaxin or siRNA that targets CCR3. Moreover, CCR3 - /- mice show reduced pulmonary disease and was associated with reduced eosinophils and T

new and important mechanism by which sG protein may

of eosinophils and a less potent anti- viral Th2 cells.CIHR grant # MOP38011 and FRSQ, Canada; Fondation

pour la Recherche Médicale (FRM), France.

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Étude de la sévérité âge- dépendante au cours de l’agression pulmonaire aiguë chez la souris

G. Voiriot1, D. Contou1, J. Tran Van Nhieu2, S. Adnot1, B. Maitre1, A. Mekontso Dessap1

1Inserm U955, Faculté de Médecine, Université Paris Est, Créteil, France.2Service d’Histologie- Cytologie, Hôpital Henri Mondor, APHP, Créteil, [email protected]

Introduction. – l’unique facteur indépendamment associé à la mortalité au cours du syndrome de détresse respiratoire aigue. Cette sévérité âge- dépendante a été décrite dans plusieurs travaux

i) modèle éloigné du scenario clinique humain d’agression- ventilation protectrice, ii) pas d’exploration de la mécanique ventilatoire ni de l’hémodynamique pulmonaire.

Méthodes. – Chez des souris jeunes (J, 2 mois) et vieilles (V, 12 mois) était réalisé une instillation intratrachéale de lipopolysaccharide (LPS) ou de sérum salé (contrôle = C). Vingt heures plus tard, une ventilation mécanique (VM) à bas volume courant (8 ml/kg) de 3 heures était réalisée. La mécanique ventilatoire était explorée chaque heure. L’hémodynamique était explorée au terme de la VM puis

était réalisé puis poumons et sang étaient prélevés. Quatre groupes (n = 10- 15/groupe) étaient étudiés (JC, VC, JLPS et VLPS). Les données continues étaient exprimées en médiane.

Résultats. – A l’initiation de la VM, la compliance res-piratoire (μL/cmH2O) était plus élevée chez les souris VC par rapport aux JC, respectivement 126 vs 77 (p < 0,001). L’exposition au LPS altérait cette compliance basale chez les souris vieilles (VLPS vs VCdes jeunes (JLPS vs. JCVM, les souris vieilles avaient une baisse de compliance plus marquée que les jeunes (VLPS C LPSJCLBA était accrue chez les souris VLPS par rapport aux JLPS, respectivement 5500 vs 2800 (p < 0,001), de même que les taux sanguin d’IL- 6 et plasmatiques de TNFα, MIP- 2 et IL- 6.

en protéines (μg/mL) du LBA (VLPS C LPS

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Infection – Inflammation