Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
POUČEVANJE - PREDMETNO POUČEVANJE,
BIOLOGIJA - KEMIJA
INES URŠNIK
PRIPRAVA UČNIH GRADIV ZA POSKUS
FERMENTACIJE BOZE – PIJAČE IZ ŽIT
MAGISTRSKO DELO
LJUBLJANA, 2018
UNIVERZA V LJUBLJANI
PEDAGOŠKA FAKULTETA
POUČEVANJE - PREDMETNO POUČEVANJE,
BIOLOGIJA - KEMIJA
INES URŠNIK
PRIPRAVA UČNIH GRADIV ZA POSKUS
FERMENTACIJE BOZE – PIJAČE IZ ŽIT
MAGISTRSKO DELO
Mentor: PROF. DR. MARKO KREFT
Somentor: IZR. PROF. DR. DAMJAN JANEŠ
LJUBLJANA, 2018
I
Zahvala
Ob zaključnem pisanju magistrske naloge se najlepše zahvaljujem svojemu mentorju, prof.
dr. Marku Kreftu, za vso pomoč, hitro odzivnost, strokovne nasvete in spodbudne besede, ki
so pripomogle h končanju te magistrske naloge. Prav tako bi se rada zahvalila somentorju,
prof. dr. Damjanu Janešu, za vso pomoč pri delu.
Velika zahvala velja tudi družini, ki me je podpirala in mi ob težkih trenutkih stala ob strani.
Hvala tudi fantu, prijateljem, sošolkam in sošolcu, ki so verjeli vame; brez vaše pomoči mi
nebi uspelo.
Hvala!
II
POVZETEK
Boza je gosta pijača kiselkastega okusa. Okus vahko variira zaradi količine dodanega
sladkorja, vrste žita, mikroorganizmov in dolžine fermentacije. Značilna je za Albanijo,
Bolgarijo, Romunijo, Turčijo in druge balkanske države. V Turčiji se pije toplo pripravljena
boza predvsem v zimskem času, saj segreje telo, zaradi česar naj bi pomagala proti sezonskim
okužbam dihal. V Romuniji pijejo ohlajeno, osvežilno bozo predvsem v poletnih mesecih.
Zaradi vsebnosti vitaminov A, C, E in štirih vrst vitamina B, je dragoceno hranilo telesno
dejavnih ljudi. Še posebej primerna je za vegetarijance in vegane, saj je v celoti rastlinskega
izvora in je dober vir vitaminov in dober nadomestek mlečnih napitkov. V magistrski nalogi
smo spremljali spremembo pH zmesi za bozo, pripravljene iz moke in bakterij, z namenom
ugotoviti, kako hitro se pH v omenjeni zmesi niža. Ugotovili smo, da nižanje pH v zmeseh iz
različnih mok in ob dodatku različnih bakterij ni enako hitro. Prav tako smo ugotovili, da se
pH po 48 urah po dodanih bakterijah v zmes razlikuje glede na dodane bakterije. Izvedli smo
tudi titracijo zmesi za bozo z namenom določiti količino nastale kisline med procesom
fermentacije. Ugotovili smo, da za zmesi iz škroba od dodatku katerihkoli bakterij ni potrebno
veliko baze za nevtralizacijo kisline, ki je nastala med procesom fermentacije. Zanimala nas je
tudi rast bakterij v vzorcu, ki smo jo ocenili s pomočjo plošč Petrifilm®. Ugotovili smo,
kakšno rastno krivuljo imajo bakterije iz kisle smetane v proseni moki. S plinsko
kromatografijo in masno spektrometrijo smo kvalitativno in kvantitativno določili
lahkohlapne snovi v vzorcih boze v različnih časih po dodatku bakterij v zmes, z namenom
ugotoviti, ali in kako se te lahkohlapne snovi med fermentacijo spreminjajo. Ugotovili smo,
da se vsebnost nekaterih analiziranih spojin med fermentacijo značilno spreminja. Nazadnje
smo v učnem načrtu za osnovne šole pregledali cilje, ki se nanašajo na našo temo in jih
analizirali, da bi ugotovili, kako so te teme zastopane v potrjenih učbenikih. Na osnovi našega
raziskovalnega dela smo razvili dva delovna lista za učence, kot alternativo dosedaj opisanim
poskusom (t.j. kisanje mleka) s področja fermentacije.
Ključne besede: boza, rast bakterij, GC-MS, priprava poskusa
III
ABSTRACT
Boza is a dense beverage of sour taste. The taste may vary according to the amount of added
sugar, the type of cereals and micro-organisms used, and the length of fermentation. It is a
typical beverage found in Albania, Bulgaria, Romania, Turkey and other Balkan countries. In
Turkey, warm boza is consumed primarily during the winter due to the effect of warming of
the body and as a result it is expected to help against seasonal respiratory infections. In
Romania, they drink chilled, refreshing boza, especially during the summer months. As it
contains vitamins A, C, E and four types of vitamin B, it is a valuable nutrient for physically
active people. It is especially suitable for vegetarians and vegans, since it is entirely plant-
based, and is a good source of vitamins and a good substitute for milk drinks. In the present
Master's degree thesis, a change in pH of the mixture of flour and bacteria was monitored in
order to determine how quickly the pH of mixture decreases. We found that the rate of pH
decrease of mixtures from various types of flour and also with the addition of different
bacteria types differs. We also found that the pH of the mixtures 48 hours after the addition of
bacteria differs according to the type of bacteria added. We also carried out titration of the
boza mixture in order to determine the amount of acid produced during the fermentation
process. We found that for a boza mixture prepared with starch, the addition of any type of
bacteria does not require a lot of base in order to neutralize the acid produced during the
fermentation process. We were also interested in the growth of bacteria in the sample, which
was assessed with the Petrifilm® plate. We described the growth curve of bacteria obtained
from sour cream in an millet flour. By means of gas chromatography and mass spectrometry,
the volatile substances in the boza samples were determined qualitatively and quantitatively
on several occasions, in order to evaluate if and how these volatile substances change during
fermentation. We demonstrated that the content of some of the analyzed volatile substances
varies significantly during fermentation. Finally, we reviewed and analyzed the objectives that
pertain to our topic in the curriculum for primary schools, to assess how these topics are
represented in certified textbooks. On the basis of our experimental work, we developed two
worksheets for pupils, as an alternative to the previously described experiments (i.e.
acidification of milk) on the topic of fermentation.
Key words: boza, bacterial growth, GC-MS, experiment preparation
IV
KAZALO
POVZETEK ............................................................................................................................... II ABSTRACT .............................................................................................................................. III KAZALO .................................................................................................................................. IV
UVOD ........................................................................................................................................ 1
1. TEORETIČNI DEL ............................................................................................................ 2
1.1 Boza ............................................................................................................................. 2
1.2 Splošna priprava boze .................................................................................................. 2
1.3 Mikrobiota boze ........................................................................................................... 5
1.4 Vitamini v bozi ............................................................................................................ 5
1.4.1 Folat ........................................................................................................................... 6
1.4.2 Vitamin B12 ................................................................................................................ 7
1.4.3 Drugi vitamini ............................................................................................................ 8
1.5 Metode za določanje lahkohlapnih snovi v bozi ......................................................... 8
1.5.1 Plinska kromatografija ............................................................................................... 8
1.5.2 Masna spektrometrija ................................................................................................. 9
2 EMPIRIČNI DEL ............................................................................................................. 10
2.1 Opredelitev raziskovalnega problema ....................................................................... 10
2.2 Cilji ............................................................................................................................ 10
2.3 Raziskovalna vprašanja ............................................................................................. 10
2.4 Metode dela ............................................................................................................... 11
2.4.1 Splošni postopek za pripravo boze ..................................................................... 11
2.4.2 Merjenje pH zmesi za bozo pred in po dodanih bakterijah v različnih časovnih
intervalih ........................................................................................................................... 13
2.4.3 Titracija zmesi za bozo v različnih časovnih intervalih ..................................... 13
2.4.4 Ocenjevanje rasti bakterij na plošči Petrifilm® .................................................. 15
2.4.5 Priprava vzorcev za plinsko kromatografijo ...................................................... 16
2.5 Rezultati s statistično analizo .................................................................................... 20
2.5.1 Merjenje pH in titracija ...................................................................................... 20
2.5.2 Rast bakterij ........................................................................................................ 26
2.5.3 Kromatografija ................................................................................................... 27
2.6 Pregled učbenikov in gradivo za učence ................................................................... 36
2.7 Priprava gradiv za šole .............................................................................................. 37
2.7.1 Merjenje pH osnove za bozo .................................................................................... 37
2.7.2 Titracija zmesi moke in bakterij v določenem času ................................................. 38
2.7.3 Ocenjevanje rasti bakterij ........................................................................................ 39
3. DISKUSIJA ...................................................................................................................... 42
4. SKLEP .............................................................................................................................. 45
5. SEZNAM LITERATURE ................................................................................................ 46
V
Kazalo grafov
Graf 1: Sprememba pH posameznih zmesi v času (z označenimi standardnimi napakami).
Vsaka točka je sestavljena iz treh meritev............................... Napaka! Zaznamek ni definiran.
Graf 2: Sprememba pH v zmesi za bozo v času. Posamezne točke so pridobljene tako, da smo
pH istovrstnih osnov za bozo združili (v eni točki so tako povprečni podatki o pH, pridobljeni
pri enaki osnovi, a z različnimi bakterijskimi kulturami; označene so tudi standardne napake);
v vsaki točki je tako vključenih devet meritev. ....................... Napaka! Zaznamek ni definiran.
Graf 3: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline
treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz kisle smetane. ................... 24
Graf 4: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline
treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz boze................................... 25
Graf 5: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline
treba dodati na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz Ljubljanskih mlekarn. ....... 25
Graf 6: Logaritemsko število bakterij v času v vzorcu iz prosene moke in z dodanimi
bakterijami iz kisle smetane. .................................................................................................... 26
Graf 7: Število cfu po 48 urah inkubiranja v različnih vzorcih boze. ...................................... 27
Graf 8: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
.................................................................................................................................................. 28
Graf 9: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v
času. .......................................................................................................................................... 28
Graf 10: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. ......... 29
Graf 11: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz
kisle smetane v času. ................................................................................................................ 30
Graf 12: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz
Ljubljanskih mlekarn v času. ..................................................................................................... 30
Graf 13: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz
boze v času. .............................................................................................................................. 31
Graf 14: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz
kisle smetane v času. ................................................................................................................ 31
Graf 15: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz
Ljubljanskih mlekarn v času. ................................................................................................... 32
Graf 16: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz
boze v času. .............................................................................................................................. 32
Graf 17: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v
času. .......................................................................................................................................... 33
Graf 18: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih
mlekarn v času. ......................................................................................................................... 33
Graf 19: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. ....... 34
Graf 20: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v
času. .......................................................................................................................................... 34
VI
Graf 21: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih
mlekarn v času. ......................................................................................................................... 35
Graf 22: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času. .... 35
Kazalo tabel
Tabela 1 Recepti za pripravo boze, uporabljeni v pričujoči magistrski nalogi ........................ 11
Tabela 2: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci po 36 urah
fermentacije zmesi za bozo. ..................................................................................................... 22
Tabela 3: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci z istovrstno
osnovo po 36 urah fermentacije ............................................................................................... 24
Tabela 4: Seznam s strani Zavoda RS za šolstvo potrjenih učbenikov za 9. razred osnovne
šole ........................................................................................................................................... 36
Kazalo slik
Slika 1: Postopek priprave boze. Povzeto po Tangueler (2014). ................................................ 4
Slika 2: Označevanje lončkov. ................................................................................................. 12
Slika 3: Ohlajene zmesi (škrob (spodaj), koruzna (zgoraj desno) in prosena (zgoraj levo)
moka), pripravljene za nacepitev z bakterijskimi kulturami. ................................................... 13
Slika 4: Titracija zmesi za bozo ob dodatku fenolftaleina na magnetnem mešalu................... 14
Slika 5: plošča Petrifilm® (plošča z rumenim karo vzorcem) s plastičnim pripomočkom, ki je
položen na ploščo Petrifilm®. ................................................................................................... 16
Slika 6: Četrtina začetnega 100 mL vzorca boze z dodanimi bakterijami po dodatku topila
dietilni eter in po centrifugiranju v 50 mL epruveti. ................................................................ 17
Slika 7: Sušenje centrifugiranega vzorca. ................................................................................ 17
Slika 8: Koncentriranje vzorca na 1 mL v bučki v vodni kopeli. ............................................. 18
Slika 9: Koncentrirani vzorci v epicah za analizo s plinsko kromatografijo in masno
spektrometrijo (GC-MS). ......................................................................................................... 18
1
UVOD
Fermentacija je proces, pri katerem mikroorganizmi, kot so bakterije ali kvasovke, pretvarjajo
ogljikove hidrate v alkohol ali organske kisline brez prisotnosti kisika. Poznamo dve vrsti
fermentacije. Prva je alkoholna fermentacija (vrenje), pri kateri piruvat (od presnove glukoze)
razpade na ogljikov dioksid in etanol s pomočjo bakterij ali kvasovk. Druga vrsta fermentacije
je mlečnokislinska fermentacija (vrenje), kjer se laktoza pretvori v mlečno kislino ob
delovanju bakterij (What Is Fermentation? Benefits of Fermentation + How to Ferment
Foods, b.d.). Fermentacija je ena najstarejših in najbolj ekonomičnih metod uporabljenih za
podaljševanje roka uporabnosti. Fermentacija povečuje dostopnost mineralov, razgradnjo
proteinov in izboljša organoleptične lastnosti (Todorov idr., 2008). Fermentirana hrana je
zaradi svojih prednosti pomembna za številne ljudi po svetu. Mlečnokislinske bakterije se
uporabljajo v različnih fermentiranih produktih in njihov pozitiven učinek na organizem je
poznan že dolgo (Uršnik, 2015). Eden izmed mnogih fermentiranih produktov je tudi boza.
Boza je fermentirana pijača izdelana na osnovi žit. Ne vsebuje mleka, pa v njej vseeno poteka
mlečnokislinska fermentacija (mlečnokislinsko vrenje). Zaradi številnih koristnih lastnosti, ki
jih ima boza, je zanimiva ne samo za uporabnike, temveč tudi za znanstvenike. Poleg visoke
vsebnosti vitaminov vsebuje še maščobe, beljakovine, ogljikove hidrate, vlaknine,
aminokisline in mlečno kislino. Nedavno je bilo dokazano tudi, da je boza vir inhibitornih
peptidov ACE (ACE-inhibitorni peptidi uravnavajo krvni tlak s tem, da inhibirajo
angiotenzijsko kontravertazo ter tako znižujejo krvni tlak) (Osimani, Grofalo, Aquilanti,
Milanović in Clementi 2014). Ta zdrava in hranljiva pijača ima tako velik potencial v
prehrambni industriji (Osimani idr., 2014). Zaradi navedenega je boza zanimiva tudi za šolski
pouk. S pomočjo boze bi učenci lahko spoznali pojem fermentacije, ter se srečali z
mikrobiologijo.
V magistrski nalogi smo raziskali, kako se spreminja pH pripravljene pijače glede na izbrano
osnovo za bozo in dodane bakterije z namenom ugotoviti, katera kombinacija osnove in
bakterij je najbolj optimalna. Vzorce pijače smo tudi titrirali za ugotavljanje količine nastale
kisline med procesom fermentacije. Ker nas je zanimala rastna krivulja bakterij v zmesi moke
in bakterij, smo spremljali proces rasti bakterij v vzorcih. Kvalitativno in kvantitativno smo
analizirali tudi lahkohlapne snovi s pomočjo plinske kromatografije in masne spektrometrije z
namenom ugotoviti, kako se količina določene spojine med fermentacijo spreminja.
Pregledali smo učni načrt, v katerem smo se osredotočili na biotehnologijo in pregledali
potrjene učbenike, da bi ovrednotili, v kakšni meri je ta tema v učbenikih zastopana. Na
podlagi rezultatov smo oblikovali dejavnost za učence v osnovnih in srednjih šolah na temo
biotehnologija in mikrobiologija, ki predstavlja alternativo trenutno opisanim poskusom na
temo biotehnologija (npr. kisanje mleka).
2
1. TEORETIČNI DEL
1.1 Boza
Začetki boze segajo osem do devet tisoč let nazaj. Bozo so poznala antična ljudstva, ki so
živela v Mezopotamiji in Anatoliji. Od tod so jo Otomani razširili na vsa osvojena območja.
Antični grški pisec Ksenofont je pisal o bozi in o tem, kako je bila shranjena v glinenih
posodah, ki so bile zakopane pod zemljo (History of Boza, 2015). Boza je razcvet doživela
pod Turki in je postala eden od glavnih trgovskih dobrin v mestih zgodnjih turških dob
(LeBlanc in Todorov, 2011). Odvisno od verske usmeritve vsakokratnega vladarja je bila
boza bolj ali manj priljubljena. V času vladanja Selimana ll so vrednosti alkohola v bozi
dosegale od štiri do devet odstotkov, medtem ko je za časa vladanja sultana Mehmeda lV bila
kakršnakoli vsebnost alkohola v bozi prepovedana (Gamm, 2015).
Boza je gosta pijača, kislo sladkega okusa, z malo alkohola. Okus vahko variira zaradi
različnih žit, mikroorganizmov, količine dodanega sladkorja in dolžine fermentacije. Značilna
je za Albanijo, Bolgarijo, Romunijo, Turčijo in druge balkanske države. V Turčiji jo toplo
pijejo predvsem v zimskem času, ker ogreje telo in ker naj bi pomagala v boju proti virusnim
obolenjem (How to Make Boza Drink, 2018). V Romuniji pijejo osvežilno, hladno bozo
predvsem v poletnih mesecih. Pitje te pijače pa je vedno manj priljubljeno, zato majhne
trgovine z bozo izginjajo tako v Turčiji, kot tudi v Romuniji. Prodaja boze izginja tudi v
drugih državah, kjer je bila v preteklosti priljubljena (How to Make Boza Drink, 2018).
Bolgarija in druge balkanske države prodajajo industrijsko pripravljeno bozo, vendar pa
mnogi ustekleničeni izdelki zaradi dodajanja konzervansov za podaljševanje roka uporabnosti
niso enakega okusa kot sveže pripravljeni (How to Make Boza Drink, 2018).
Boza vsebuje probiotične bakterije, ki pomagajo lajšati prebavo, folno kislino, ki pomaga pri
laktaciji doječih mater, vsebuje štiri vrste vitaminov (A, C, E in štiri vrste vitamina B) in zato
predstavlja dober vir vitaminov. Primerna je tudi za vegetarijance in vegane, saj je v celoti iz
sestavin naravnega rastlinskega izvora (Uršnik, 2015).
1.2 Splošna priprava boze
Boza se pripravlja predvsem za domačo uporabo in tudi za prodajo. Čeprav je načinov
proizvodnje več, so glavna sestavina vedno žita (Akpınar-Bayizit, Yılmaz-Ersan in Özcan,
2010). Bozo lahko pripravimo iz različnih vrst žit, kot so proso, koruza, pšenica ali z
različnimi kombinacijami med njimi. Bozo najboljše kakovosti in okusa dobimo s proseno
osnovo. Najbolj pomembni dejavniki, ki vplivajo na fizikalno-kemijske lastnosti boze, so
vrsta in količina žita in žitnih proizvodov kot osnove, čas fermentacije in temperatura.
Podaljšan čas fermentacije poveča količino celokupne kisline in zniža pH (Altay,
Karbancioglu-Guler, Daskaya-Dikmen in Heperkan, 2013). Akpinar-Bayizit (2010) navaja, da
surovine, kot so riž, proso in pšenica še posebej vplivajo na kemijsko sestavo boze.
3
Žito mora biti očiščeno in imeti velikost zdroba med 300 in 800 µm. Po dodatku pitne vode je
naslednji korak kuhanje žita od dveh do osmih ur (slika 1). Med vrenjem zmes absorbira
vodo, zato je dodajanje vode nujno, vse dokler ne dobimo homogene zmesi. Tako
pripravljeno zmes prenesemo v primerne posode za ohlajanje. Za odstranitev otrobov in
drugih tujih snovi ohlajeno zmes precedimo. Po dodajanju sladkorja (15-20 % saharoze od
celotnega volumna) v tako pripravljeno zmes nacepimo izbrano bakterijsko kulturo.
Bakterijsko kulturo lahko predstavljajo bakterije iz predhodno fermentirane boze (2-3 %
fermentirane boze na celoten volumen željene boze), kislega kruha ali probiotičnega jogurta.
Količina začetne bakterijske kulture je odvisna od temperature (Arıcı in Dağlıoğlu, 2002).
Postopek fermentacije se v proizvodnji boze ne zaključi popolnoma. Po 24 urah fermentacije
delno fermentirano bozo hranijo ohlajeno v hladilniku v plastičnih posodah. Tako
pripravljeno bozo je treba zaužiti v 3-5 dneh (Arıcı in Dağlıoğlu, 2002).
4
Izbor žitne osnove
Izbor žitne osnove
Priprava žitne osnove: čiščenje in mletje
Priprava žitne osnove: čiščenje in mletje Dodatek vode
Dodatek vode Kuhanje (2h-8h)
Kuhanje (2h-8h) Dodatek vroče vode
Dodatek vroče vode Homogena zmes
Homogena zmes
Hlajenje v primernih posodah
Hlajenje v primernih posodah
Dodatek sladkorja (15-20 % saharoze)
Dodatek sladkorja (15-20 % saharoze) Dodajanje začetne bakterijske kulture
Dodajanje začetne bakterijske kulture Fermentacija
Fermentacija
Ohlajanje
Ohlajanje
Polnjenje in shranjevanje
Polnjenje in shranjevanje Slika 1: Postopek priprave boze. Povzeto po Tangueler (2014).
5
1.3 Mikrobiota boze
Boza velja za zdravo in hranljivo pijačo zaradi vsebnosti maščob, beljakovin, ogljikovih
hidratov, vlaknin, vitaminov, aminokislin in mlečne kisline (Todorov in drugi, 2008). Slednja
spojina je splošno priznana kot koristna za človeško mikrofloro in zdravo prebavo (Arıcı in
Dağlıoğlu, 2002). Poleg tega se pri fermentaciji boze pH pijače zmanjša, s čimer se
vzpostavijo optimalne razmere za encimsko razgradnjo fitata (t.j. sol ali ester fitične kisline,
ki je prisotna v rastlinah, še posebej v žitnih zrnih, in ima sposobnost tvoriti netopne
komplekse s kalcijem, cinkom, železom in drugimi mikrohranili in pripomore k absorpciji le-
teh v telo), nizek pH boze pa bozi daje tudi tipičen okus ter preprečuje rast patogenim in
kvarnim bakterijam (Osimani idr., 2014). Preprečevanje rasti patogenim in kvarnim
bakterijam je okrepljeno tudi s protimikrobnimi snovi v bozi, kot so bakteriocini, ki jih
sintetizirajo mlečnokislinske bakterije (LeBlanc in Todorov, 2011). Kancabaş in Karakaya
(2012) sta dokazala, da je lahko boza tudi vir inhibitornih peptidov ACE (t.j. angiotenziska
konvertaza; to je eksopeptidaza, peptidil-dipeptid hidrolaza, ki odceplja dipeptide s C-konca
različnih proteinskih substratov). Raziskave kažejo, da je mikrobiota, ki je odgovorna za
fermentacijo boze, heterogena, vključuje pa tako homo- kot heterofermentativne
mlečnokislinske bakterije in kvasovke (Osimani idr., 2014).
V zadnjem desetletju je bila uporabljena vrsta molekularnih pristopov, ki temeljijo na analizi
sekvenc DNA, za identifikacijo vrst in seva mikroorganizmov v hrani. Med njimi je tehnika
verižne reakcije s polimerzo - denaturacijsko gradientna gelska elektrofereza (polyerase chain
reaction - denaturing gradient gel electrophoresis (PCR – DGGE)), ki je pokazala velik
potencial za predstavitev mikrobne raznolikosti fermentiranih živil, vključno s proizvodi na
osnovi žit (Osimani idr., 2014).
Do razlike v mikrobioti po fermentaciji lahko pride zaradi uporabe različnih sestavin in
različne količine uporabljenih sestavin pred fermentacijo (npr. različne količine moke,
sladkorja), samega procesa fermentacije in razmer shranjevanja (Altay, Karbancioglu-Guler,
Daskaya-Dikmen in Heperkan, 2013).
1.4 Vitamini v bozi
Čeprav so v raznovrstni hrani vsi vitamini, je pomanjkanje vitaminov še vedno velik problem
ljudi v različnih državah po svetu. Razlog za pomanjkanje vitaminov pri posameznikih ni
samo nezadosten vnos hrane, temveč tudi neuravnotežena prehrana. Čeprav je veliko
mlečnokislinskih bakterij nezmožnih sinteze nekaterih vitaminov, je znano, da imajo določeni
sevi zmožnost sinteze vodotopnih vitaminov, med katere spadajo tudi vitamini iz B skupine
(folat, riboflavin, vitamin B12) (LeBlanc idr., 2011).
Vitamini so mikrohranila, ki so nujna (esencialna) za pravilno delovanje vseh živih
organizmov. So prekurzorji intracelularnih koencimov, nujnih za uravnavanje vitalnih
biokemijskih reakcij v celici. Človeško telo je nezmožno sinteze večine vitaminov, zato jih je
treba pridobiti eksogeno (t.j. iz zunanjega okolja). Med vitamine skupine B (B-kompleks)
uvrščamo tiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), piridoksin (B6), pantotensko kislino (B5),
6
biotin (B7 ali H), folat (B11-B9 ali M) in kobalamin (B12). Vsak vitamin skupine B se kemijsko
razlikuje od drugega, igrajo pa veliko vlogo v metabolnih procesih za sproščanje energije in
pri nastajanju rdečih krvnih celic. Vitamine skupine B lahko najdemo v več različnih vrstah
hrane, vendar jih med procesiranjem hrane lahko uničimo, zaradi česar lahko pride do
nezadostnega vnosa teh vitaminov v telo (LeBlanc idr., 2011). V izogib pomanjkanju
vitaminov so nekatere države sprejele zakone za bogatitev hrane z dodajanjem določenih
vitaminov in mineralov. V Argentini so, denimo, sprejeli zakon za obvezno bogatitev
pšenične moke z železom, folno kislino, tiaminom, riboflavinom in niacinom z namenom
zmanjšanja pojavnosti anemij in okvar nevralnih cevi (LeBlanc idr., 2011). Čeprav je
bogatitev hrane z vitamini pokazala pozitivne učinke, številne države dodajanja vitaminov v
hrano niso predpisale zaradi možnih neželenih učinkov. Težko je namreč zadostiti zahtevi, da
je količina dodanih vitaminov v obogateni hrani takšna, da ljudem z nizkim vnosom teh
vitaminov pomaga doseči priporočljiv dnevni vnos, obenem pa količina dodanih vitaminov ne
sme biti tako visoka, da bi ljudje, ki ne trpijo pomanjkanja vitaminov, zaradi dodatka le-teh v
hrani, presegli zgornjo mejo vnosa. Težave z z vitamini obogateno hrano so tudi drugačne;
prevelik vnos folne kisline v telo lahko na primer zakrije znake pomanjkanja vitamina B12.
Ocenili so, da 10-30 % ljudi starejših od 50 let trpi zaradi zmanjšanja sposobnosti naravne
absorpcije vitamina B12 (Asrar in O`Connor, 2005). Rešitev tega problema je vnos naravnega
folata (5-metiltetrahidrofolata), ki je prisoten v hrani, proizvajajo pa ga tudi nekateri
mikroorganizmi, njegova prisotnost pa ne zakriva znakov pomanjkanja vitamina B12. Vnos te,
naravne oblike folata bi bila glede na navedbe nekaterih avtorjev bolj učinkovita in varna
alternativa dodajanju folne kisline v prehrano (Lamers, Prinz-Langenohl, Bramswig in
Pietrzik, 2006). Uporaba mikroorganizmov, kot proizvajalcev vitaminov v prehrani, je
naravnejša in ekonomsko dostopnejša alternativa bogatenju hrane s kemijsko sintetiziranimi
(proto)vitamini in ima manjšo verjetnost povzročanja neželenih učinkov, kot bogatenje hrane
(LeBlanc idr., 2011).
1.4.1 Folat
Folat sodeluje pri pomembnih funkcijah celičnega metabolizma, kot so replikacija,
popravljanje, metilacija DNA in sinteza nukleotidov, vitaminov in nekaterih aminokislin, zato
brez njega človeško življenje ne bi bilo mogoče. Motenj zaradi pomanjkanja folata je veliko.
Pomanjkanje folata so povezali z Alzheimerjevo boleznijo, koronarnimi srčnimi boleznimi,
osteoporozo, povečanim tveganjem za nastanek rakavih bolezni (debelega črevesa, danke in
dojk), izgubo sluha in slabimi kognitivnimi sposobnostmi (LeBlanc, Savoy de Giori, Smid,
Hugenholtz in Sesma, 2007). Če upoštevamo, da mleko vsebuje med 20 in 50 µg/L folata, bi
morali v povprečju popiti 6-12 L mleka dnevno, da bi zadostili dnevno priporočenemu vnosu
folata, ki znaša 180 µg za otroke in 300µg za odrasle (Referečne vrednosti za energijski vnos
ter vnos hranil, 2016). Veliko industrijsko pomembnih mlečnokislinskih bakterij je sposobnih
sintetizirati folat, taki sta na primer Lactococcus lactis in Streptococcus thermophilus
(Papastoyiannidis, Plychroniadou, Michaelidou in Alichanidis, 2006). To pojasni, zakaj
vsebujejo nekateri fermentirani produkti, vključno z jogurtom, višjo količino folata v
primerjavi z nefermentiranimi produkti. Raziskave so, denimo, pokazale, da lahko vsebnost
folata v jogurtih preseže 200 µg/L (Wouters, Ayad, Hugenholtz in Smit, 2002). Sposobnost
7
mikrobnih kultur za proizvodnjo ali porabo folata občutno variira glede na lastnosti seva.
Večina znanstvenikov trdi, da je bakterija Streptococcus thermophilus proizvajalec folata,
medtem ko je bakterija Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgarus njegov porabnik, zato je za
razvoj fermentirane hrane z visoko vsebnostjo folata pomembno izbrati primerno kombinacijo
sevov (LeBlanc in drugi, 2011). Folata pa ne proizvajata samo bakteriji Lactoccocus lactis in
Streptococcus thermophilus, temveč tudi nekatere druge mlečnokislinske bakterije, kot so
Lactobacillus acidophilus in Lactobacillus plantarum (LeBlac, Taranto, Molina in Sesma,
2010), Leuconostoc lactis, Bifidobacterium longum in Lactobacillus reuteri, ki je tudi dobro
raziskan proizvajalec vitamina B12 in lahko potencialno poveča raven folata v mleku (Santos,
Wegkamp, de Vos, Smid in Hugenholtz, 2008). Ti mikroorganizmi imajo zmožnost povečanja
ravni folata ne samo v mleku, ampak tudi v drugi hrani. Tako fermentacijo rženega testa za
proizvodnjo kruha pogosto spremlja povečana koncentracija folata. Prav tako so odkrili, da
lahko z izbrano začetno kulturo bakterij bistveno povečajo vsebnost folata (tudi za dvakratno
vrednost) med fermentacijo zelenjave. Drug primer uporabe mlečnokislinskih bakterij za
izboljšanje vsebnosti folata v fermentiranih produktih je fermentacija koruzne moke, kjer je
bil porast folata po 4 dneh fermentacije na 30 °C kar trikraten (LeBlanc idr., 2011).
1.4.2 Vitamin B12
Omenjeni vitamin sodi med vitamine, ki so topni v vodi. Je najbolj kompleksen in po
molekulski masi največji vitamin. Vitamin sestavlja tetrapirolni obroč in centralni kobaltov
atom (Kozyraki in Cases, 2013). Glede na molekulo, ki je vezana na centralni atom, poznamo
štiri vrste oblika vitamina B12. V človeškem telesu sta aktivni obliki adenozilkobalamin in
metilkobalamin. V prehranskih dopolnilih pa se uporablja neaktivna oblika cianokobalamin,
saj cianid stabilizira molekulo kobalamina, ki bi nasprotnem primeru v stiku s svetlobo
razpadla. Druga neaktivna oblika je hidroksikobalamin (Černe, 2017). Živali, rastline in glive
niso sposobne proizvajanja kobalamina; to je edini vitamin, ki ga proizvajajo izključno
mikroorganizmi, zlasti aerobi (Smith, Croft in Webb, 2007). Biokemijske in genetske
raziskave so pokazale, da imajo le nekatere bakterije in arheje gen za proizvodnjo tega
vitamina. Odrasle živali prežvekovalcev lahko pridobijo vitamin od specializiranih bakterij,
prisotnih v vampu. Ljudje pa takšnih bakterij v tankem črevesu ne gostimo, zato je nujna
absorpcija koencima B12 (koencim B12 je splošno ime za molekulo, ki nastane iz vitamina B12)
iz naravnih virov ali pa iz farmacevtskih pripravkov, saj rastlinska hrana vitamina B12 ne
vsebuje. Pomanjkanje vitamina B12 lahko povzroči različne patološke pojave, ki vplivajo na
hematopoetske in nevrološke procese ter na srčno-žilni sistem. Ena izmed najbolj skrajnih
oblik pomanjkanja vitamina B12 je slabokrvnost, ki običajno ni povezana s prehrano, pač pa s
pomanjkanjem proizvodnje želodčnega glikoproteina, imenovanega intrinzični faktor, ki
pospešuje absorpcijo vitamina v tankem črevesu (Beck, 2001).
8
1.4.3 Drugi vitamini
Raziskave kažejo, da tudi nekatere druge vodotopne vitamine izdelujejo mlečnokislinske
bakterije. V eni izmed teh raziskav so preučevali mlečnokislinske bakterije in njihovo
sposobnost za proizvodnjo kinonskih spojin, kot je vitamin K, ki se v naravi pojavlja v dveh
oblikah, in sicer kot vitamin K1 (filokinon) v zelenih rastlinah in K2 (menakinon) v živalih in
nekaterih bakterijah (Morishita, Tamura, Makino in Kudo, 1999). Raziskave so pokazale, da
so pri proizvodnji vitamina K najuspešnejši sevi bakterij Lactococcus lactis ssp. cremoris
(trije sevi), Lactococcus lactis ssp. lactis (dva seva) in Leucanostoc lactis, ki so proizvedli več
kot 230 nmol kinona na gram posušenih celic (LeBlanc in drugi, 2011). Ti sevi, ki lahko
rastejo v nemastnem ali v sojinem mleku, proizvedejo zadostno količino vitamina K za
dodatek prehrani (proizvedejo 29-123 µg menokinona na liter fermentiranega medija)
(Morishita idr., 1999). Vitamin K je esencialen kofaktor za tvorbo ostankov γ-
karboksiglutaminske kisline v proteinih, ki vplivajo na koagulacijo krvi in kalcifikacijo tkiva
(LeBlanc in drugi, 2011). Zaradi pomanjkanja vitamina K so zabeležili več kliničnih bolezni,
kot so intrakranialna krvavitev pri novorojenčkih in možnost zlomov kosti, ki so posledica
osteoporoze (LeBlanc in drugi, 2011).
1.5 Metode za določanje lahkohlapnih snovi v bozi
Plinska kromatografija, sklopljena z masno spektrometrijo (gas cromatography - mass
spectrometry (GC-MS)) je metoda za identifikacijo lahkohlapnih snovi, ki je sestavljena iz
dveh analiznih postopkov, ki si sledita v zaporedju. Prvi analizni postopek je plinska
kromatografija (GC), ki ločuje hlapne komponente z veliko natančnostjo, vendar jih ne more
identificirati. Druga tehnika je masna spektrometrija (MS), ki zagotavlja podrobne strukturne
podatke o večini spojin, tako da jih je mogoče natančno identificirati, vendar jih ni mogoče
zlahka ločiti. GC-MS sta kompatibilni na več področjih, uporabimo ju lahko tudi za analizo
lahkohlapnih snovi v bozi. Pri obeh tehnikah je vzorec v parni fazi in obe tehniki obravnavata
približno enako količino vzorca, ki je navadno manj kot 1 µl. Problem GC-MS metode je
razlika v tlakih parnega vzorca, ki ju potrebujeta tehniki za svoje delovanje, zato so rešitev
našli v uporabi vakuumske črpalke. Namen GC je torej ločitev več spojin v vzorcu z
namenom, da dosežejo MS detektor ena za drugo (Gas Chromatography-Mass Spectroscopy,
b.d.).
1.5.1 Plinska kromatografija
Plinska kromatografija sodi med fizikalne separacijske metode, pri kateri analiziramo
termično stabilen, uparjen vzorec v plinski mobilni fazi, ki je najpogosteje inerten plin (helij,
dušik, vodik) (Potočnik, 2016). Molekule vzorca tako ne tvorijo interakcij z mobilno fazo,
temveč samo potujejo z njo vse do kolone, kjer je stacionarna faza. Komponente vzorca
tvorijo interakcije s stacionarno fazo, v kateri se zato različno dolgo zadržujejo in na podlagi
tega tudi ločijo. Na koncu naprave je detektor, ki zazna vzorec. Prednosti plinske
9
kromatografije so hitra ločitev komponent (min), velika občutljivost (ppm, ppb), sama ločitev
komponent vzorca je nedestruktivna, kar omogoča nadaljnjo analizo vzorca, za analizo
potrebujemo majhno količino vzorca (mikrolitri), je zanesljiva in dokaj preprosta metoda za
uporabo ter je cenovno dostopna. Slabosti metode se kažejo v omejenosti na izključno hlapne
spojine, metoda je neprimerna za termolabilne vzorce ter manj primerna za ločevanje večjih
količin vzorcev (Štalcar, 2015)
1.5.2 Masna spektrometrija
Masna spektrometrija sodi med analizne tehnike, ki nam omogočajo, da z minimalno količino
vzorca ugotovimo relativno molekulsko maso, molekulsko formulo ter strukturo molekul,
prisotnih v vzorcu (Potočnik, 2016). V masnem spektrometru molekule ioniziramo v
vakuumu z elektronskim žarkom, kar vodi do nastanka pozitivnih ali negativnih ionov. Masa
iona je ekvivalenta masi originalne molekule, saj lahko maso elektrona zanemarimo. V
masnem analizatorju se ioni ločijo v magnetnem oz. elektrostatskem polju glede na njihovo
maso in naboj (Štalcar, 2015). Spektrometer zazna njihovo število oziroma pogostost
njihovega pojavljanja. Z ustrezno računalniško opremo dobimo masni spekter molekul.
Prednosti masne spektrometrije so velika občutljivost (ppm) ter selektivnost, analiza je tako
kvalitativna kot kvantitativna, potrebujemo minimalne količine snovi (mikrogrami), metoda
omogoča ugotavljanje sestave in molekulske mase molekul vzorca. Slabosti metode se kažejo
v nezmožnosti ločevanja izomerov ter v destruktivnosti metode, saj vzorca po analizi ne
moremo več uporabiti (Potočnik, 2016).
10
2 EMPIRIČNI DEL
2.1 Opredelitev raziskovalnega problema
Raziskovalnih člankov na temo pijače boza ni veliko, obstoječi članki pa govorijo večinoma o
identifikaciji mlečnokislinskih bakterij in kvasovk v bozi. Prav zaradi pomanjkljivih
informacij bi bilo dobro to pijačo raziskati tudi z vidika mikrobiologije in biotehnologije.
Hitrost rasti mlečnokislinskih bakterij v različnih žitnih osnovah namreč ni znana, prav tako
ni znana količina celokupne mlečne kisline, ki nastane v procesu fermentacije. Glede na
vsebnost kisline in puferske kapacitete žitne osnove se med fermentacijo spreminja pH
pripravljene boze. Tudi dinamika teh sprememb ni znana, zato smo navedeno preučili v naši
magistrski nalogi. Glede na rezultate prvega dela naše raziskave, v kateri smo preučili
navedeno, smo lahko v drugem koraku pripravili gradiva za pouk v osnovni šoli. Pripravljena
gradiva na temo biotehnologije in mikrobiologije bodo učiteljem zagotovila alternativo
poskusom, opisanim v obstoječih potrjenih učbenikih, t.j. kisanju mleka in pripravi kefirja.
Glede na raziskavo diplomskega dela (Uršnik, 2015) je priprava boze učencem bolj zanimiva,
kot kisanje mleka).
2.2 Cilji
• pregled mikrobioloških in biotehnoloških tem v učnem načrtu in učbenikih za osnovne
šole, potrjenih s strani Zavoda RS za šolstvo;
• optimizacija postopka priprave boze;
• priprava postopka za merjenje rasti bakterij na Petrifilmu®;
• priprava vzorcev boze in izvedba plinske kromatografije;
• priprava učnih gradiv o fermentaciji boze za osnovno šolo.
2.3 Raziskovalna vprašanja
• Kako in s kakšnimi primeri je predstavljena fermentacija v učbenikih za osnovno šolo,
potrjenih s strani Zavoda RS za šolstvo?
• Kakšno rastno krivuljo imajo mlečnokislinske bakterije v bozi pri sobni temperaturi?
Ali se vrednost pH boze niža z enako dinamiko?
• Ali se vsebnost dišečih lahkohlapnih snovi v bozi med fermentacijo spreminja?
• Kako bi na za učence čim bolj zanimiv način v šoli predstavili fermentacijo boze?
11
2.4 Metode dela
2.4.1 Splošni postopek za pripravo boze
Pri našem delu smo uporabili zmesi iz različnih žitnih osnov. Za osnovo smo vzeli koruzno
moko, proseno moko ali koruzni škrob. Vsako izmed treh različnih osnov za bozo smo
pripravili samo iz enega tipa moke.
Recepti za posamezne zmesi so podani v razpredelnici 1.
Zmes za bozo 1 Zmes za bozo 2 Zmes za bozo 3
1344 mL vode
60 g koruzne moke
99 g sladkorja
1323 mL vode
78 g prosene moke
99 g sladkorja
1359 mL vode
45 g koruznega škroba
99 g sladkorja
1503 g 1500 g 1503 g
Tabela 1: Recepti za pripravo boze, uporabljeni v pričujoči magistrski nalogi.
V vsaki zmesi za bozo je bilo 7 % sladkorja glede na celotno maso zmesi (cca. 1500g). Pri
pripravi zmesi smo pazili, da je bila viskoznost tako pripravljenih ohlajenih zmesi primerljiva.
Določanje viskoznosti smo opisali že v diplomskem delu (Uršnik, 2015).
V posodi smo po receptu iz razpredelnice 1 pripravili moko (60g koruzne moke) in sladkor
(99 g). V večjo posodo za kuhanje smo vlili ustrezen volumen vode (v našem primeru 1344
mL). Nekaj vode smo odvzeli in dali v posodo z moko in sladkorjem. Premešali smo, da smo
preprečili nastajanje grudic in da smo dobili suspenzijo. Posodo z vodo smo segreli do vretja.
Ko je voda zavrela, smo dodali suspenzijo z moko, sladkorjem in vodo). Temperaturo zmesi
smo nastavili na tik pod vreliščem in kuhali ob neprestanem mešanju 10 min. Nato smo zmes
odstavili, jo razdelili v 3 čaše na približno enake dele z volumnom približno 500 mL in pokrili
z alu folijo, da smo preprečili kontaminacijo z bakterijami iz zraka, ter označili čaše. Čaše
smo postavili na ledeno kopel, da se je zmes hitreje ohladila. Pomerili smo pH ohlajene zmesi
s pH-metrom (Metrel Ma 5736). Meritve smo vedno poskušali narediti na sredini čaše, da
smo zmanjšali napake pri merjenju.
V vsako čašo smo dodali eno izmed treh različnih kultur bakterij. V prvo čašo zmesi za bozo
smo dodali 3 mL kisle smetane Ljubljanskih mlekarn; v drugo čašo smo dodali 0,33 mL
kulture mezofilnih aromatskih bakterij (mešanica Lactococcus lactis podvrsta ceremoris,
Lactococcus lactis podvrsta lactis, Leuconostoc mesenteorides podvrsta crenoris in
Leuconostoc pseudomesenteorides), ki smo jih dobili v Ljubljanskih mlekarnah in jih
uporabljajo za izdelavo kisle smetane; v tretjo čašo smo dodali 3 mL kulture bakterij iz boze,
ki je bila prinešena iz Turčije (iz Carigrada). Dobro smo premešali, da so se bakterije
porazdelile po celotnem volumnu zmesi. Pomerili smo pH in vsako zmes enakomerno
porazdelili v tri sterilne lončke (z volumnom približno 120 mL), jih pokrili z alu folijo ter
lončke označili (slika 2). Bakterijsko kulturo smo najprej nacepili v čaše zato, da smo čim bolj
12
optimalno nacepili bakterije, da smo torej zmanjšali razlike v končni količini bakterij v
posameznem lončku.
Slika 2: Označevanje lončkov.
Enak postopek smo ponovili še za drugi dve osnovi (slika 3).
13
Slika 3: Ohlajene zmesi (škrob (spodaj), koruzna (zgoraj desno) in prosena (zgoraj levo) moka),
pripravljene za nacepitev z bakterijskimi kulturami.
Ker smo uporabili 3 različne žitne osnove za bozo (koruzno moko, proseno moko in koruzni
škrob), vsako izmed njih pa smo razdelili na 3 dele in v vsak del nacepili različno bakterijsko
kulturo, smo dobili 9 različnih kombinacij osnov za bozo in kultur bakterij.
2.4.2 Merjenje pH zmesi za bozo pred in po dodanih bakterijah v
različnih časovnih intervalih
pH zmesi za bozo smo določali z namenom, da ugotovimo, kako hitro se pH spreminja v
različnih osnovah za bozo ob dodatku različnih bakterij.
Določanje pH vrednosti zmesi je potekalo s pomočjo pH-metra (Metrel Ma 5736). Merjenje je
vedno potekalo v enakih razmerah (v ohlajeni zmesi, ob stalni sobni temperaturi, vedno na
sredini vzorca in čas merjenja je bil eno minuto). Pri merjenju smo pazili, da je bil pH-meter
po vsaki uporabi pravilno in temeljito očiščen (najprej spran z destilirano vodo nato še z 70 %
etanolom), da se kulture v vzorcih niso prenašale iz lončka v lonček. pH smo merili pred
dodanimi bakterijami v vzorec, tik po dodanih bakterijah, 6 ur po dodanih bakterijah, 12, 24,
36 in 48 ur po dodanih bakterijah. Tako smo za vsak vzorec zbrali 7 meritev pH.
2.4.3 Titracija zmesi za bozo v različnih časovnih intervalih
Zmesi za bozo smo titrirali z namenom, da ugotovimo, koliko kisline je nastalo med
fermentacijo v različnih osnovah za bozo ob dodatku različnih bakterij.
14
Titracijo zmesi smo izvedli tik po dodanih bakterijah, nato 24 in 48 ur po dodanih bakterijah.
Zmesi smo titrirali z bazo natrijevega hidroksida (NaOH) z namenom, da ugotovimo koliko
kisline je nastalo med procesom fermentacije.
Vsakokrat smo pet mililitrov zmesi dali v čašo ter jo razredčili s 25 mL destilirane vode. V
čašo smo dodali magnet in zmes postavili na magnetno mešalo. V zmes smo dodali še nekaj
kapljic indikatorja fenolftaleina, da smo lažje videli prehod iz kislega v bazično (slika 4). Ob
počasnem mešanju smo v čašo dali pH meter in titrirali s pomočjo avtomatske pipete.
Slika 4: Titracija zmesi za bozo ob dodatku fenolftaleina na magnetnem mešalu.
15
2.4.4 Ocenjevanje rasti bakterij na plošči Petrifilm®
Ocenjevanje rasti bakterij smo izvedli z namenom, da ugotovimo, kakšno rastno krivuljo
imajo te bakterije v bozi. Najprej smo pripravili zadostno količino sterilne vode, ki smo jo
potrebovali za redčenje zmesi z bakterijami. To smo pripravili tako, da smo pripravili 7-
odstotno raztopino sladkorja in vodovodne vode; uporabili smo torej 1500 mL vode in 105 g
sladkorja. Raztopino sladkorja smo segrevali do vrelišča, nato jo še 10 minut kuhali tik pod
vreliščem, da voda ni preveč izhlapevala. Nato smo raztopino pokrili z aluminijasto folijo.
Inventar, ki smo ga potrebovali za redčenje zmesi z bakterijami, smo sterilizirali s 70-
odstotnim etanolom in pokrili/zavili v aluminijasto folijo.
S pomočjo sterilne avtomatske pipete smo odvzeli 1 mL zmesi za bozo z dodanimi
bakterijami in ga dali v sterilno čašo. Nato smo vzorec v čaši redčili toliko časa, da smo dobili
želeno redčitev. Če smo želeli vzorec razredčiti na 1:10-6, smo ob določenem času vzeli 1 mL
zmesi za bozo z dodanimi bakterijami in dodali 100 mL sterilne vode (tako smo dobili
razredčitev 1:10-2), nato smo 1 mL tako pripravljenega vzorca ponovno odvzeli in dali v
drugo sterilno prazno čašo ter dodali 100 mL sterilne vode (tako smo dobili razredčitev 1:10-
4), 1 mL tako pripravljenega vzorca smo nato ponovno odvzeli in ga dali v prazno sterilno
čašo ter dodali 100 mL sterilne vode (tako smo dobili razredčitev 1:10-6). Nato smo odvzeli 1
mL ustrezno razredčenega vzorca ter ga dali na ploščo Petrifilm® za inkubacijo in določanje
števila bakterij. To smo naredili tako, da smo dvignili zgornjo folijo plošče in odpipetirali
celotno količino vzorca na sredino plošče. Spustili smo folijo in pustili, da prosto pade. S
plastičnim pripomočkom (slika 5) ki je priložen vsakemu kompletu Petrifilm®, smo (z
grebenasto stranjo navzdol) previdno pritisnili na folijo, da se vzorec pravilno porazdeli po
plošči. Nato smo aerobno inkubirali plošče tako, da smo vstavili ne več kot 20 plošč
Petrifilm® s prozorno stranjo navzgor v aerobno posodo. Več takih nizov s po 20 ploščami
Petrifilm® lahko inkubiramo v isti posodi, če je vsak niz od drugih ločen s trdo pregrado.
Posodo s ploščami Petrifilm® smo vstavili v inkubator in inkubirali 48 ur pri temperaturi 24
°C. Nato smo prešteli kolonije (cfu - colony forming unit).
Za zmes s proseno moko in z bakterijami iz kisle smetane Ljubljanskih mlekarn je
spremljanje rasti bakterij na Petrifilm® ploščah potekalo v enakih intervalih, kot meritve pH
(torej takoj po dodanih bakterijah, nato 12, 24 in 48 ur po dodanih bakterijah). 48 ur po
dodanih bakterijah k zmesi za bozo smo preverili vsebnost bakterij iz vseh devetih vzorcev
(vse 3 moke ob dodatku vseh 3 vrst bakterij). Ob koncu inkubacije (po 48 urah inkubiranja)
smo prešteli kolonije (cfu) v kvadrantih (v rumenih karo razdelkih na plošči) ter število
pomnožili s številom redčitev, ki smo jo izvedli za inkubacijo. Nato smo vrednosti pretvorili v
logaritemska števila ter izrisali graf.
16
Slika 5: plošča Petrifilm® (plošča z rumenim karo vzorcem) s plastičnim pripomočkom, ki je položen na
ploščo Petrifilm®.
2.4.5 Priprava vzorcev za plinsko kromatografijo
Analizo lahkohlapnih snovi smo izvedli z namenom, da ugotovimo, ali se vsebnost omenjenih
snovi v vzorcih boze med fermentacijo spreminja. Analiza lahkohlapnih snovi s plinsko
kromatografijo in z masnim spektrometrom je potekala na Fakulteti za farmacijo. Odmrznili
smo 100 mL vzorca, ki smo ga odvzeli iz lončka takoj po dodanih bakterijah k zmesi za bozo,
nato še vzorca, ki smo ju odvzeli iz lončka 24 in 48 ur po dodanih bakterijah. Vsak
posamezen vzorec (100 mL) smo razdelili na štiri enake dele (po 25 mL) in jih dali v epruvete
z volumnom 50 mL. Tako smo imeli štiri 50 mL epruvete s po 25 mL odmrznjenega vzorca
(skupno 100 mL vzorca). V vsako epruveto smo dodali topilo (25 mL dietilnega etra) ter
stresali 3 minute. Nato smo vstavili vse štiri epruvete v centrifugo ter 5 min centrifugirali na
3000 obratih in 25 °C (slika 6). Po centrifugiranju smo previdno odpipetirali zgornji (bistri)
del v erlenmajerico, dodali 5 g brezvodnega natrijevega sulfata, da smo vzorec po
centrifugiranju posušili, nato smo erlenmajerico zamašili in pustili 2 uri (slika 7). Nato smo
pripravili aparaturo za izparevanje (koncentriranje) vzorca. V čašo smo nalili vodo, vanjo dali
magnet in jo postavili na magnetno mešalo. Pripravili smo stojalo in bučko. Po dveh urah
sušenja smo vzorec iz erlenmajerice previdno odpipetirali v bučko. Bučko smo postavili na
vodno kopel (kopel 50 °C in 300 obratov) in tako vzorec koncentrirali (slika 8). Ko smo v
bučko dodali ves vzorec iz erlenmajerice, smo sušilno sredstvo brezvodni natrijev sulfat sprali
s topilom. Pri pipetiranju vzorca iz erlenmajerice v bučko smo pazili, da so trdni delci ostali v
erlenmajerici. Vzorec v bučki smo izparili na 1 mL. S kapalko smo dali vzorec v vnaprej
označeno posodico (epico) (slika 9). V primeru, da vzorec ni bil skoncentriran na 1 mL, smo
ga prepihali še z argonom in tako pospešili izhlapevanje topila. Za čim bolj zanesljive podatke
smo opravili tri vzporedne ponovitve te meritve.
17
Slika 6: Četrtina začetnega 100 mL vzorca boze z dodanimi bakterijami po dodatku topila dietilni eter in
po centrifugiranju v 50 mL epruveti.
Slika 7: Sušenje centrifugiranega vzorca.
18
Slika 8: Koncentriranje vzorca na 1 mL v bučki v vodni kopeli.
Slika 9: Koncentrirani vzorci v epicah za analizo s plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (GC-
MS).
Kromatografske razmere za GC-MS, ki smo jih uporabili, so bile:
sistem: GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska)
računalniški program: GCMS Solution 4.2 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska)
podatkovni GC-MS knjižnici: NIST 14 in FFNSC 3 (obe Shimadzu Corporation,
Kyoto, Japonska)
kolona: nepolarna kapilarna, Rxi-5Sil MS, 30 m × 0,25 mm, df = 0,25 µm, SF: 1,4-
bis(dimetilsiloksi)fenilendimetilpolisiloksan (Restek, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA)
nosilni plin: helij
pretok plina: 1 mL/min (linearna hitrost)
način injiciranja: »split« 1:20
19
temperaturni program: 50 °C (5 min), 50→200 °C (3 °C/min), 200→300 °C (20
°C/min), 300 °C (10 min)
temperatura injektorja: 250 °C
temperatura ionskega izvora: 200 °C
temperatura vmesnika: 300 °C
volumen injiciranja: 1 µL
napetost na detektorju: 1 kV
način ionizacije: EI
energija ionizacije: -70 eV
frekvenca zajemanja podatkov: 5 Hz
območje merjenja relativne molekulske mase (m/z): 35-500
začetek snemanja pri 3,0 min
vklop filamenta pri 2,8 min
celoten čas analize: 70,0 min
kolona: polarna kapilarna, Stabilwax, 30 m × 0,25 mm, df = 0,25 µm, SF:
polietilenglikol - Crossbond Carbowax (Restek, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA)
nosilni plin: helij
pretok plina: 1 mL/min (linearna hitrost)
način injiciranja: »split« 1:20
temperaturni program: 50 °C (5 min), 50→250 °C (3 °C/min), 250 °C (5 min)
temperatura injektorja: 250 °C
temperatura ionskega izvora: 200 °C
temperatura vmesnika: 250 °C
volumen injiciranja: 1 µL
napetost na detektorju: 1 kV
način ionizacije: EI
energija ionizacije: -70 eV
frekvenca zajemanja podatkov: 5 Hz
območje merjenja relativne molekulske mase (m/z): 40-400
začetek snemanja pri 3,0 min
vklop filamenta pri 2,8 min
celoten čas analize: 76,6 min
Pri kromatografiji smo ugotavljali vsebnost 14 različnih spojin. To so: acetoin,
dietilacetal, izopentilalkohol, 2,3-butandiol - izomer 1, 2,3-butandiol - izomer 2, heksanal,
izovalerianska kislina, 1-heksanol, 1-okten-3-ol, heksanojska kislina, benzojska kislina,
oktanojska kislina, pelargol (tetrahidrogeraniol) ter vanilin.
20
2.5 Rezultati s statistično analizo
2.5.1 Merjenje pH in titracija
Za bolj natančne rezultate smo celoten postopek izvedli trikrat. V nadaljevanju bodo
predstavljena povprečja vseh treh ponovitev.
Merjenje pH
Legenda oznak v sledečih grafih:
- lj--------bakterije pridobljene v Ljubljanskih mlekarnah
- bo------bakterije boze
- ki-------bakterije kisle smetane
- p--------prosena moka
- k--------koruzna moka
- š--------škrob
21
Na osnovi podatkov o pH združenih istovrstnih osnov za bozo (glej graf 2) smo ocenili, da je
v prvih 36 urah prišlo do najbolj intenzivnih sprememb v pH (t.j. do največjega naklona pH
krivulje), zato smo statistično analizo podatkov naredili za čas 36 ur po dodanih bakterijah.
Graf 1: Sprememba pH posameznih zmesi v času (z označenimi standardnimi napakami). Vsaka točka je sestavljena
iz treh meritev.
22
Vrednosti z zvezdico v tabeli pomenijo statistično pomembne razlike. Zaradi ponovljenih
primerjav med vzorci je upoštevan Bonferronijev popravek (p < 0,001424).
p-
vrednost
i
k-ki š-ki p-ki k-bo š-bo p-bo k-lj p-lj š-lj
k-ki 4,0E-
11*
2,5E-
04*
5,1E-
08*
1,9E-
15*
1,7E-
11*
1,4E-
02
4,1E-
07*
1,3E-
12*
š-ki 4,0E-
11*
4,6E-
06*
1,7E-
08*
2,7E-
01
4,1E-
05*
2,0E-
07*
6,5E-
07*
7,8E-03
p-ki 2,5E-
04*
4,6E-
06*
7,4E-
01
1,0E-
07*
3,6E-
03
1,4E-
01
5,9E-
01
6,1E-
08*
k-bo 5,1E-
08*
1,7E-
08*
1,7E-
08*
7,8E-
13*
9,5E-
07*
7,9E-
02
1,4E-
01
1,5E-
10*
š-bo 1,9E-
15*
2,7E-
01
1,0E-
07*
7,8E-
13*
5,4E-
09*
3,6E-
09*
9,0E-
10*
1,3E-02
p-bo 1,7E-
11*
4,1E-
05*
3,6E-
03
9,5E-
07*
5,4E-
09*
4,0E-
05*
9,2E-
04
6,1E-
08*
k-lj 1,4E-
02
2,0E-
07*
1,4E-
01
9,8E-
02
3,6E-
09*
4,0E-
05*
2,2E-
02
4,3E-
09*
p-lj 4,1E-
07*
6,5E-
07*
5,4E-
01
1,4E-
01
9,0E-
10*
9,2E-
04*
2,2E-
02
4,7E-
09*
š-lj 1,3E-
12*
7,8E-
03
6,1E-
08*
1,5E-
10*
1,3E-
02
6,1E-
08*
4,3E-
09*
4,7E-
09*
Tabela 2: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci po 36 urah fermentacije
zmesi za bozo.
Pri bozi narejeni iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz turške boze smo po 36 urah
izmerili značilno višji pH, kot pri bozi narejeni iz prosene moke in z dodanimi bakterijami
Ljubljanskih mlekarn.
Pri osnovi iz koruzne moke je bil pH zmesi z dodanimi bakterijami iz boze po 36 urah
značilno višji kot pH boze iz koruzne moke, narejene z dodanimi bakterijami iz kisle smetane,
ne pa tudi kot pH boze iz koruzne moke z dodanimi bakterijami Ljubljanskih mlekarn.
pH boze iz škroba ni pokazal statistično pomembnih razlik 36 ur po dodatku katerihkoli
bakterij.
23
Graf 2 prikazuje spremembe pH treh zmesi za bozo, ki so združene glede na izhodiščno
osnovo, v času. Najbolj strmo krivuljo, torej največjo spremembo v pH boze, lahko opazimo v
obdobju med dvanajstimi in šestintridesetimi urami po dodanih izbranih bakterijah. pH je bil
takoj po dodatku bakterij najvišji v osnovi za bozo iz koruzne moke, a po 36 urah značilno
nižji kot pH osnove za bozo iz prosene moke in škroba. Po 36 urah je bil pH v bozi iz škroba
značilno višji od pH boze iz prosene oz. koruzne moke.
Graf 2: Sprememba pH v zmesi za bozo v času. Posamezne točke so pridobljene tako, da smo pH istovrstnih osnov
za bozo združili (v eni točki so tako povprečni podatki o pH, pridobljeni pri enaki osnovi, a z različnimi bakterijskimi
kulturami; označene so tudi s standardne napake); v vsaki točki je tako vključenih devet meritev.
24
Vrednosti, ki so v tabeli 3 označene z zvezdico, pomenijo statistično pomembne razlike.
Zaradi ponovljenih primerjav med vzorci je upoštevan Bonferronijev popravek (p
<0,008512).
p-vrednosti k-ki š-ki p-ki
k-ki 3,2E-24* 1,0E-06*
š-ki 3,2E-24* 2,4E-17*
p-ki 1,0E-06* 2,4E-17*
Tabela 3: P-vrednosti Studentovega t-testa za razlike v pH med različnimi vzorci z istovrstno osnovo po 36
urah fermentacije
Titracija
Titracijo smo izvedli trikrat. Najprej ob času, ko smo v zmes za bozo dodali bakterije, nato 24
ur po dodanih bakterijah in nazadnje 48 ur po dodanih bakterijah.
Iz dobljenih podatkov smo izračunali srednje vrednosti ter preračunali, koliko milimolov baze
je treba dodati na en kilogram boze za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline.
Rezultati so predstavljeni v spodnjih grafih.
Graf 3: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati
na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz kisle smetane.
25
Graf 4: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati
na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz boze.
Graf 5: Količina baze (v milimolih), ki jo je za nevtralizacijo med fermentacijo nastale kisline treba dodati
na kilogram boze, narejene z dodajanjem bakterij iz Ljubljanskih mlekarn.
Iz grafov št. 3 4 in 5 lahko vidimo, da je bila začetna količina kisline, ki smo jo porabili za
titracijo vzorca, v vseh vzorcih približno enaka. Vidimo lahko tudi, da količina kisline (in s
tem baze, ki smo jo uporabili za titracijo) narašča v vzorcih z osnovo iz koruzne in prosene
moke in dodanimi katerimikoli bakterijami, medtem ko pri vzorcih z osnovo iz škroba in
dodanimi katerimikoli bakterijami koncentracija kisline v času ne narašča.
Največ kisline smo namerili v vzorcu z osnovo iz prosene moke ter z dodanimi bakterijami iz
kisle smetane. V bozi iz prosene moke je bila količina kisline po 48 urah po dodatku bakterij
najvišja v vzorcu z dodanimi bakterijami iz kisle smetane, sledi vzorec z bakterijami iz
Ljubljanskih mlekarn in nato vzorec z bakterijami iz boze. V bozi iz koruzne moke je bila
26
količina kisline po 48 urah po dodatku bakterij najvišja takrat, ko smo dodali bakterije iz kisle
smetane, sledi vzorec z bakterijami Ljubljanskih mlekarn in nato vzorec z bakterijami iz boze.
2.5.2 Rast bakterij
Število bakterijskih kolonij (cfu) v času v zmesi za bozo iz prosene moke in z dodanimi
bakterijami iz kisle smetane smo predstavili v grafu 5.
Število bakterij v bozi iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane se je v
prvem dnevu eksponentno povečevalo.
Graf 6: Logaritemsko število bakterij v času v vzorcu iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle
smetane.
27
Graf 7: Število cfu po 48 urah inkubiranja v različnih vzorcih boze.
Po 48 urah smo največ bakterij našteli v vzorcu, pri katerem smo za osnovo uporabili koruzni
škrob ter dodali bakterije iz Ljubljanskih mlekarn.
2.5.3 Kromatografija
Stolpci na grafih, označenih z eno zvezdico (*) pomenijo statistično pomembne razlike med
rezultati, pridobljenimi v času 0 in 48 ur po dodanih bakterijah. Stolpci označeni z dvema
zvezdicama (**) pomenijo statistično pomembne razlike med rezultati, pridobljenimi v času
24 in 48 ur fermentacije po dodanih bakterijah. Za primerjavo smo vedno uporabili podatke
enake osnove za bozo (moke) in z inokulacijo enakih bakterij.
28
Acetoin:
Graf 8: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
Graf 9: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času.
29
Statistično pomembne razlike v vsebnosti acetoina v bozi smo opazili pri bozi iz prosene
moke ob dodanih bakterijah iz kisle smetane v času 0 in 48 ur. Prav tako smo opazili
statistično pomembne razlike v vsebnosti acetoina v bozi pri bozi iz koruzne moke z dodanimi
bakterijami iz boze v času 0 in po 48 urah, ter v času 24 ur in 48 ur po dodanih bakterijah.
Statistična obdelava ostalih podatkov za vsebnost acetoina ni pokazala drugih statistično
pomembnih razlik.
Graf 10: Vsebnost acetoina v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
30
2,3-butandiol - izomer 1
Graf 11: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v
času.
Graf 12: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih
mlekarn v času.
31
Statistično pomembne razlike v vsebnosti 2,3-butandiola - izomera 1 so se pojavile pri bozi iz
prosene moke z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 24 ur in 48 ur. Prav tako smo
zaznali razliko v vsebnosti omenjene spojine v bozi iz koruzne moke in z dodanimi
bakterijami iz kisle smetane v času 0 in 48 ur po dodanih bakterijah. Spremembe v vsebnosti
spojine 2,3-butandiol - izomer 1 smo opazili tudi v bozi iz koruzne moke in z dodanimi
bakterijami iz boze v času 0 ur in 24 ur po dodanih bakterijah in v času 24 ur in 48 ur po
dodanih bakterijah. Prav tako smo pomembne razlike zasledili tudi pri bozi iz koruzne moke z
dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času 24 ur in 48 ur ter v bozi iz koruzne moke
in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 0 in 24 ur.
2,3-butandiol - izomer 2
Graf 13: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 1 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
Graf 14: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane
v času.
32
Statistično pomembne razlike v vsebnosti 2,3-butandiola - izomera 2 so se pojavile pri
bozi iz prosene moke z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 0 ur in 24 ur. Prav
tako so se pokazale statistično pomembne razlike v vsebnosti omenjenega izomera pri
bozi iz koruzne moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času 0 ur in 24 ur, ter v
času 24 ur in 48 ur.
Graf 15: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih
mlekarn v času.
Graf 16: Vsebnost 2,3-butandiola - izomera 2 v osnovah za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
33
1-heksanol
Graf 17: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
Graf 18: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v času.
34
Statistična obdelava je pokazala, da se je vsebnost 1-heksanola v času 0 ur in 24 ur po
dodanih bakterijah pomembno razlikovala pri bozi iz prosene moke z dodanimi
bakterijami iz boze ter z dodanimi bakterijami iz kisle smetane. Pri drugih primerjavah
statistično pomembnih razlik v času ni bilo.
1-okten-3-ol
Graf 20: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v času.
Graf 19: Vsebnost 1-heksanola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
35
Statistična obdelava podatkov je pokazala, da so se statistično pomembne razlike pojavile
samo pri bozi iz prosene moke. V zmesi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih
mlekarn v času 0 ur in 24 ur po dodanih bakterijah smo zaznali statistično pomembne
razlike v vsebnosti omenjenega alkohola. Prav tako smo značilne razlike opazili pri zmesi
iz prosene moke z dodanimi bakterijami iz kisle smetane ob času 0 ur in 24 ur, ter 24 ur in
48 ur po dodanih bakterijah.
Pri vsebnostih spojin: dietilacetal, izopentilalkohol, heksanal, izovalerianska kislina,
heksanojska kislina, benzojska kislina, oktanojska kislina, pelargol in vanilin med
fermentacijo nismo zaznali statistično pomembnih razlik.
Graf 21: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v
času.
Graf 22: Vsebnost 1-okten-3-ola v osnovi za bozo z dodanimi bakterijami iz boze v času.
36
2.6 Pregled učbenikov in gradivo za učence
S pojmom »biotehnologija« se učenci v osnovni šoli srečajo v devetem razredu. V učnem
načrtu za deveti razred osnovne šole je sklop z istoimenskim naslovom, pod katerim najdemo
osem ciljev. Pri pregledu učbenikov se bomo osredotočili predvsem na prvi cilj, ki pravi:
»Učenci spoznajo, da je človek že zelo zgodaj uporabljal organizme za proizvodnjo različnih
dobrin (npr. uporaba kvasovk pri proizvodnji kruha, piva in vina; uporaba mikroorganizmov
pri proizvodnji mlečnih izdelkov)«.
Spodaj je predstavljen seznam s strani Zavoda RS za šolstvo potrjenih učbenikov za osnovno
šolo za šolsko leto 2017/2018.
Učbeniki za osnovnošolsko izobraževanje – 9.razred BIOLOGIJA
V. Klokočovnik, M. Starčič Erjavec
DOTIK ŽIVLJENJA 9, učbenik za biologijo v devetem razredu osnovne šole, ROKUS
KLETT
Leto potrditve: 2013
L. Javoršek
RAZIŠČI SKRIVNOSTI ŽIVEGA 9, učbenik za biologijo v 9. razredu osnovne šole,
Pipinova knjiga
Leto potrditve: 2013
M. Svečko, A. Gorjan
SPOZNAVAM ŽIVI SVET, učbenik za biologijo v 9. razredu osnovne šole, DZS
Leto potrditve: 2012
Tabela 4: Seznam s strani Zavoda RS za šolstvo potrjenih učbenikov za 9. razred osnovne šole
Učbenik: Dotik življenja 9
V kazalu učbenika lahko pod četrto temo najdemo naslov Biotehnologija. V uvodnem delu
avtorici razložita pojem biotehnologija. Razložita, da je biotehnologija povezava bioloških in
inženirskih znanosti z namenom uporabe organizmov, celic ali njihovih delov v proizvodnji in
storitvah. Majhen del namenita tudi temu, da so ljudje že v kameni dobi udomačili prve
rastline in živali ter začeli zbirati organizme, ki so imeli zaželene lastnosti, in jih med seboj
načrtno križati, tako da so dobili potomce, ki so združevali za človeka želene lastnosti obeh
starševskih osebkov. Omenita tudi, da so pred 9.500 leti pridobivali prvo alkoholno pijačo –
pivo, pred okoli 8.000 leti pa so iz grozdja začeli pridobivati vino, iz mleka sir in iz moke
vzhajan kruh. Omenita tudi, da je spoznanje o obstoju mikroorganizmov iz 19. stoletja tisto,
37
ki je pripomoglo k industrijski uporabi mikroorganizmov z namenom predelave hrane. Nato
se avtorici v sklopu Biotehnologija bolj posvetita genskemu inženirstvu, kloniranju in
prednostim ter slabostim gensko spremenjenih organizmov (GSO) in biotehnologije.
Učbenik: Razišči skrivnosti živega
Sklop Biotehnologija lahko v tem učbeniku najdemo v poglavju 5. Avtorica prične uvod v
biotehnologijo z nalogo, pri kateri morajo učenci ugotoviti, kaj imajo skupnega živila na sliki,
na kateri sta kruh in pivo. Nato se naveže na kvasovke in vpelje pojme, kot so alkoholno
vrenje, mlečnokislinske bakterije, mlečnokislinsko vrenje in fermentacija. Avtorica predstavi
tudi poskus, pri katerem učenci doma pripravijo kefir, ter svoje izkušnje delijo med seboj.
Nato razloži pojem biotehnologija in se naveže na genski inženiring.
Učbenik: Spoznavam živi svet 9
V tem učbeniku najdemo sklop Biotehnologija v poglavju 6. Avtorici se na začetku navežeta
na uspešnost osebka pri preživetju ter na pomembnost hrane. Iz tega izpeljeta, da se človek že
od nekdaj zaveda pomembnosti kakovosti hrane, kar je razlog za udomačevanje ter gojenje
rastlin in živali. Tukaj tudi omenita, da so ljudje že v preteklosti uporabljali kvasovke pri
pripravi kruha ter pridobivanju piva in vina, mikroorganizme pa pri proizvodnji mlečnih
izdelkov. Omenita tudi, da so poznali recepte in postopke, niso pa še vedeli, da pri teh
postopkih sodelujejo številni mikroorganizmi. Nato se navežeta na pojem genskega
inženiringa. V nadaljevanju se osredotočita na genski inženiring, kloniranje ipd.
Pri temi biotehnologija v učbenikih za osnovno šolo torej večinoma omenjajo kvasovke, kot
mikroorganizme, ki opravljajo pomembno vlogo pri fermentaciji raznih živilskih produktov.
Na hitro omenijo tudi, da so ljudje že v preteklosti nevede uporabljali mikroorganizme za
fermentacijo živil in da je ta postopek v človeški zgodovini prisoten že dolgo časa. Sama
biotehnologija je v učbenikih zastopana v zelo majhnem obsegu. V samo enem potrjenem
učbeniku lahko zasledimo dejavnost, pri kateri učenci doma po navodilih pripravijo kefir in
svoje izkušnje delijo v šoli. Prav zato je v nadaljevanju pričujoče naloge pripravljenih nekaj
gradiv za izvajanje poskusov v šoli na temo biotehnologije in mikrobiologije.
2.7 Priprava gradiv za šole
2.7.1 Merjenje pH osnove za bozo
Merjenje pH osnove za bozo in gradivo za učence smo predstavili že v diplomskem delu
(Uršnik, 2015). V pričujoči nalogi smo merjenje pH nadgradili ne samo z različnimi osnovami
za bozo (z različnimi mokami) temveč tudi z različnimi bakterijami, ki so ključne za
fermentacijo izbrane osnove za bozo. Za najbolj optimalno osnovo za pripravo pijače boza se
je izkazala koruzna moka z dodanimi bakterijami iz kisle smetane, saj je imela na začetku
38
najvišji pH in na koncu fermentacije pH najnižji; tako veliko razliko v pH bodo učenci lahko
opazili tudi pri samostojnem delu. Dodatnega gradiva za učence tokrat nismo pripravili, saj je
postopek natančno predstavljen v diplomskem delu.
2.7.2 Titracija zmesi moke in bakterij v določenem času
Za izvedbo titracije boze se je za najbolj optimalno izkazala zmes prosene moke z dodanimi
bakterijami iz kisle smetane, saj smo za nevtralizacijo kisline v tej zmesi porabili največ baze.
Učenci se s samim konceptom pH, titracijo in pojmom indikator srečajo pri predmetu Kemija,
zato dodatna razlaga teh pojmov ni nujna.
Predpriprava
Učitelj vnaprej pripravi zmesi moke in bakterij za bozo tako, da bo fermentacija v različnih
zmeseh potekala 0 ur, 24 ur in 48 ur. Vse tri vzorce ustrezno označi in jih pripravi za učence.
Če je namen naloge, da učenci spremljajo celotno fermentacijo (pH, rast bakterij …), učenci
sami v različnih dnevih pripravijo vzorce.
Delovni list za učenca:
TITRACIJA BOZE
Pripomočki:
- Magnetno mešalo z magnetom
- Kapalka
- Steklena palčka
- Čaša
- Tehtnica
- Žlička
- Halja
- Avtomatska pipeta
- Zaščitna očala
- Rokavice
Kemikalije:
- Destilirana voda
- Fenolftalein
- 0,1M NaOH
- Boza
Postopek:
- V čašo natehtaš 5mL vzorca (boza po 0 h) in dodaš 25 mL destilirane vode.
- V čašo daš magnet in vse skupaj postaviš na magnetno mešalo.
39
- V čašo dodaš nekaj kapljic fenolftaleina.
- Z avtomatsko pipeto previdno dodajaj bazo (0,1 M NaOH), dokler zmes ne spremeni
barve.
- Volumen porabljene baze zapiši v spodnjo tabelo
- Postopek ponovi še z ostalima vzorcema (boza po 24 h, boza po 48 h)
Vzorec: Boza po 0 h Boza po 24 h Boza po 48 h
Količina NaOH (µL)
Odgovori na vprašanja:
1. Kakšna je vloga fenolftaleina in kako se je barva le-tega med poskusom spremenila?
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________.
2. Za kateri vzorec si porabil največ in za kateri najmanj baze?
____________________________________________________________________.
3. Količina katere spojine je narasla med fermentacijo?
____________________________________________________________________.
4. Kaj je fermentacija in kaj med tem procesom nastaja?
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________.
2.7.3 Ocenjevanje rasti bakterij
Ocenjevanje rasti bakterij lahko izvedemo tudi v osnovni šoli, saj nam to na enostaven način
omogoča plošča Petrifilm®. Plošče Petrifilm® je mogoče kupiti v paketih, v katerih je po 100
plošč, cena takšnega paketa pa je 100€.
Ocenjevanje rasti bakterij v bozi smo prikazali v eksperimentalnem delu pričujoče naloge
(Poglavje »Ocenjevanje rasti bakterij na plošči Petrifilm®«) in te informacije lahko uporabimo
tudi pri pouku.
40
Predpriprava
Učitelj vnaprej pripravi sterilni inventar ter ustrezne razredčitve boze v različnih stopnjah
fermentacije. Tako učenci samo nacepijo bakterije na ploščo Petrifilm®.
Potrebščine:
- Plošča Petrifilm®
- Avtomatska pipeta
Snovi:
- Ustrezne razredčitve boze
Postopek:
- Z avtomatsko pipeto odpipetiraš 1 mL vzorca. Pri tem poskušaš čim manj
kontaminirati vzorec.
- Vzameš Petrifilm® in dvigneš zgornjo folijo, ter odpipetiraš celotno količino vzorca na
sredino plošče. Spustiš folijo in pustiš da pade.
- S plastičnim pripomočkom ki je zraven vsakega Petrifilm® kompleta, previdno
pritisneš (z grebenasto stranjo navzdol) da se vzorec pravilno porazdeli po plošči.
- Inkubiraš plošče Petrifilm® na zraku 48 ur na sobni temperaturi.
- V spodnjo tabelo zapisuješ opažanja in prešteješ bakterijske kolonije.
Vzorec 0h 6h 12h 24h 36h 48h
48h
inkubacije
Odgovori na vprašanja:
1. Koliko kolonij si preštel v vzorcu takoj po dodanih bakterijah (0h)?
________________________________________________________________________.
2. Koliko bakterij je bilo v enem mililitru vzorca po 48 urah? Pri tem upoštevaj
razredčitve.
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________.
41
3. Kakšna je rast bakterij v prvih 36 urah? Opiši.
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________.
4. Nariši graf ki prikazuje rast bakterij.
42
3. DISKUSIJA
V magistrski nalogi smo optimizirali postopek priprave boze, ki smo ga predstavili v
diplomskem delu (Uršnik, 2015). Poleg uporabe različnih osnov za bozo (mok) smo
primerjali še dinamiko spreminjanja pH v prisotnosti različnih bakterij. Poleg bakterij iz kisle
smetane, ki smo jih uporabili v diplomski nalogi, smo fermentacijo izvedli še z bakterijami iz
Ljubljanskih mlekarn in bakterijami iz turške boze, za osnovo za pripravo boze pa smo
uporabili koruzno moko, proseno moko ali koruzni škrob.
Izbira osnove za bozo je za proces fermentacije zelo pomembna. V času med 24 ur in 36 ur po
dodanih bakterijah v osnovo za bozo so bile spremembe v pH med vsemi tremi osnovami za
bozo statistično pomembne. Kot najbolj optimalno kombinacijo osnove za bozo in bakterijske
kulture smo izbrali tisto, pri kateri je v procesu fermentacije prišlo do največje spremembe pH
boze, ker učenci veliko spremembo pri samostojnem delu lažje opazijo. Največjo spremembo
pH smo izmerili pri osnovi za bozo iz koruzne moke in z dodanimi bakterijami iz kisle
smetane.
Pričakovano smo opazili povezavo med nižanjem pH v posameznih osnovah za bozo iz
različnih mok, ki smo ga izmerili s pH metrom, ter količino nastale kisline, ki smo jo določili
s titracijo. Pri osnovi za bozo iz koruzne in prosene moke ob dodanih bakterijah se je pH
znižal za od 1,5 do 3 enote, medtem ko se je celokupna količina nastale kisline, ki smo jo
določili s titracijo, v času višala. Pri osnovi iz koruznega škroba, ob dodanih bakterijah, padec
pH ni bil velik, prav tako pa je bila količina prisotne kisline na začetku in na koncu
fermentacije približno enaka. Količina kisline, ki je nastala med fermentacijo, je bila na koncu
fermentacije najvišja v bozi iz prosene moke, medtem ko je bila količina kisline, nastale med
fermentacijo v koruznem škrobu znatno manjša. Zanimivo je, da smo, čeprav se tekom
fermentacije pH najbolj spremeni v osnovi za bozo iz koruzne moke, za nevtralizacijo v zmesi
prisotne kisline porabili največ baze v zmesi s proseno moko. Potemtakem je puferska
kapaciteta prosene moke večja kot puferska kapaciteta koruzne moke.
Iz grafa 6, ki prikazuje rast bakterij v času, lahko vidimo, da je bila rast bakterij eksponentna
v prvih 24 urah, nato se je hitrost rasti zmanjšala. Rezultati so bili v skladu s pričakovanji, saj
se bakterije med procesom fermentacije množijo eksponentno. Na koncu fermentacije, (kot
konec fermentacije smo izbrali čas 48 ur po dodanih bakterijah, čeprav je fermentacija v bozi
takrat dejansko še vedno potekala) smo ocenili tudi, kakšno je bilo število bakterij, ki so
tvorile kolonije (t.j. kolikšno je bilo število cfu). Ugotovili smo, da so se katerekoli bakterije v
osnovi za bozo iz koruznega škroba namnožile podobno kot bakterije v osnovi za bozo iz
prosene in koruzne moke. Potemtakem so imele bakterije v koruznem škrobu dovolj hranil za
namnožitev, predvidevamo pa, da jim je manjkala ena ali več spojin, ki so nujne, da bi te
baterije lahko izvedle fermentacijo v enaki meri, kot v drugih zmeseh.
Da bakterije v koruznem škrobu niso bile sposobne obsežnejše fermentacije, kaže tudi analiza
lahkohlapnih spojin izvedena s plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo. Analiza
rezultatov je pokazala, da v vzorcih osnove za bozo, izdelanih iz koruznega škroba, ni bilo
statistično pomembnih razlik v količini analiziranih lahkohlapnih spojin med začetkom in
koncem fermentacije.
43
Glede na rezultate pridobljene s plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo, se je
vsebnost dišečih lahkohlapnih snovi v bozi med fermentacijo spreminjala. Statistično
pomembne razlike v količini analiziranih lahkohlapnih spojin so se pojavile pri naslednjih
analiziranih spojinah: acetoin; 2,3-butandiol - izomer 1; 2,3-butandiol - izomer 2; 1-heksanol
in 1 -okten-3-ol. Pri drugih analiziranih lahkohlapnih spojinah ni bilo statistično pomembnih
razlik v njihovi koncentraciji med začetkom in koncem fermentacije (t.j. po 48 urah
fermentacije). Za vse spojine, pri katerih se je njihova vsebnost med fermentacijo povečala,
smo v literaturi preverili, ali lahko ta snov vpliva na organoleptične lastnosti (lastnosti, ki se
jih določi z vidom, okusom, otipom in vonjem) boze; te informacije so predstavljene v
nadaljevanju.
Acetoin (C4H8O2) je bledo rumenkasta tekočina s prijetnim vonjem kisle smetane ali jogurta in
okusom masla. Pogosto se uporablja kot dodatek za izboljšanje okusa hrane. Ta hlapna
spojina je v naravi zelo pogosta. Nekateri mikroorganizmi, višje rastline, žuželke in višje
živali imajo sposobnost sintetiziranja acetoina z uporabo različnih encimov in metabolnih poti
v določenih okoliščinah. Kot zelo aktivna molekula deluje acetoin kot prekurzor za več deset
spojin. Zato lahko pri analizi sestavin različnih živil s plinsko kromatografijo in masno
spektrometrijo pogosto odkrijemo acetoin in njegove derivate (Acetoin, 2017). Acetoin je
snov, ki velja za varno in se večinoma uporablja v prehrambni industriji za izboljšanje okusa
izdelkov. Ker na občutljivost zaznavanja te spojine vplivajo različne razmere, kot so
temperatura, substrat ter fiziološki in psihološki dejavniki preizkuševalca, lahko acetoin
zaznavamo različno močno. Acetoin se lahko sintetizira v različnih prehranskih izdelkih, kot
sta jogurt in sir, kjer mlečnokislinske bakterije pretvorijo laktozo in citrat v pomembne
metabolite, ki vključujejo acetoin in njegov analog diacetilom, ki daje izdelkom močno
maslen in sirast okus (Zijun in Jian , 2014). Statistično pomembne razlike v količini acetoina
so se pojavile pri osnovi za bozo iz prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane v
času med 0 in 48 urami. Prav tako smo zabeležili pomemben porast acetoina v osnovi iz
koruzne moke z dodanimi bakterijami iz boze, tako v času od 0 do 48 ur, kot tudi v času od 24
do 48 ur.
2,3-butandiol (C4H10O2) je snov, ki nastaja med procesom fermentacije melase sladkornega
trsa in ima tri stereoizomere (stereoizomeri so izomerne molekule, ki imajo enako molekulsko
formulo in zaporedje vezanih atomov, vendar se med seboj razlikujejo v tridimenzionalni
usmeritvi atomov v prostoru). Vsi izomeri so brez barve in viskozni. Med drugi je tudi
prekurzor za izdelavo pesticidov (2,3-butanediol, 2018). Pri 2,3-butandiol (C4H10O2) - izomer
1 smo zaznali pomemben porast spojine v osnovi za bozo iz prosene moke z dodanimi
bakterijami iz kisle smetane v času od 24 do 48 ur. Pri zmesi za bozo, pripravljeni s koruzno
moko in dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn smo opazili statistično pomemben
porast v količini te spojine v času od 24 do 48 ur, prav tako tudi v zmesi z dodanimi
bakterijami iz boze.
Statistična analiza iste spojine izomera 2 je pokazala porast količine te snovi samo pri osnovi
iz koruzne in prosene moke in pri dodanih bakterijah iz kisle smetane. Pri osnovi za bozo iz
koruzne moke je pomembno narasla koncentracija te spojine tako v času od 0 do 48 ur, kot
tudi v času od 24 do 48 ur. V osnovi za bozo iz prosene moke smo zabeležili porast samo v
času od 24 do 48 ur. 1-heksanol (C6H14O) je brezbarvna tekočina, rahlo topna v vodi, vendar
se lahko meša z dietiletrom in etanolom. Uporablja se v industrijski parfumeriji (1-Hexanol,
44
2017). Značilen porast spojine 1-heksanol (C6H14O) je bil opažen pri osnovi za bozo iz
prosene moke in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane ter z dodanimi bakterijami iz boze v
času od 24 do 48 ur.
1-okten-3-ol (C8H16O) je znan tudi kot gobov alkohol. Je kemikalija, ki privlači žuželke, kot
so komarji. Najdemo ga tudi v človeški sapi in znoju (1-Octen-3-ol, 2018). Statistična analiza
je pokazala, da se statistično pomembne razlike v koncentraciji gobovega alkohola (1-okten-
3-ola (C8H16O)) pojavile samo pri fermentaciji osnove za bozo iz prosene moke. V zmesi z
dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn smo v času med 0 ur in 24 ur po dodanih
bakterijah zaznali statistično pomembno povečanje vsebnosti omenjenega alkohola. Podoben
porast v koncentraciji gobovega alkohola je bil opazen tudi pri zmesi za bozo z dodanimi
bakterijami iz kisle smetane v času med 0 ur in 24 ur ter v času med 24 ur in 48 ur po dodanih
bakterijah.
Na osnovi pridobljenih rezultatov sklepamo, da so določene kombinacije vrst moke in bakterij
bolj primerne za fermentacijo, kot druge. Koruzni škrob očitno ni primerna osnova za proces
fermentacije. Največje razlike v opazovanih spremenljivkah smo opazili pri osnovi za bozo
pripravljeni s proseno moko in z dodanimi bakterijami iz kisle smetane ali iz boze. Pri
pregledu učbenikov smo ugotovili, da je področje biotehnologije v osnovni šoli zastopano
zelo malo. Priprava fermentirane pijače boza je tema, ki bi lahko povezovala predmete
biologija, kemija, gospodinjstvo in nenazadnje tudi fizika ter hkrati dosegala operativne cilje
vseh štirih predmetov. Smiselno bi jo bilo uporabiti tudi pri pripravi enega izmed
naravoslovnih dni.
V nadaljnjih raziskavah bi lahko ugotovili, zakaj se bakterije v koruznem škrobu lahko
namnožijo, medtem ko niso sposobne procesa fermentacije v tako obsežni obliki kot v
koruzni in proseni moki. Razvili bi lahko tudi postopek in poskus, pri katerem bi učenci
ugotavljali, kako se med procesom fermentacije spreminjajo organoleptične lastnosti. Učenci
bi si lahko tako pomagali z vidom, vonjem, tipom in ne nazadnje tudi z okušanjem.
45
4. SKLEP
V magistrski nalogi smo ugotovili, kako se spremeni pH osnove za fermentirano pijačo boza
med fermentacijo, kakšna je puferska kapaciteta boze, ali in kako se koncentracija nekaterih
lahkohlapnih snovi v zmesi za bozo med fermentacijo spreminja ter kakšna je rastna krivulja
bakterij v zmesi. Merjenje pH zmesi za bozo iz moke in bakterij smo izvedli že v diplomskem
delu (Uršnik, 2015) v pričujoči nalogi pa smo ga nadgradili z uporabo več različnih
bakterijskih sevov za fermentacijo osnove za bozo. Izkazalo se je, da je za uspešno izvedbo
fermentacije pri pripravi boze najbolj primerna koruzna moka, saj je bil začetni pH osnove za
bozo iz koruzne moke in dodanih bakterij višji, kot pH osnove iz prosene moke in z dodanimi
bakterijami, obenem pa je bil 48 ur po začetku fermentacije njen pH v povprečju najnižji.
Zaradi te največje spremembe v pH osnove za bozo iz koruzne moke, je le-ta za izvedbo
prikaza fermentacije v osnovni šoli najbolj primerna, saj otroci tako veliko razliko lahko
dobro opazijo.
Pri oceni rasti bakterij v zmesi za bozo po 48 urah fermentacije smo največ bakterijskih
kolonij prešteli v zmesi z dodanimi bakterijami iz Ljubljanskih mlekarn v osnovi za bozo iz
koruznega škroba. Tako smo dokazali, da se bakterije množijo tudi v zmesi za bozo, pri kateri
je bila osnova pripravljena iz koruznega škroba, četudi se pH te zmesi v 48 urah ni spremenil
veliko, prav tako za nevtralizacijo te zmesi nismo porabili veliko baze. Predvidevamo, da
zaradi pomanjkanja ene ali več ključnih spojin v koruznem škrobu bakterije niso mogle
izvesti obsežnejše fermentacije.
S kromatografijo smo ugotovili, da se vsebnost nekaterih lahkohlapnih spojin v zmesi za bozo
med fermentacijo spreminja. Največ statistično pomembnih razlik v količini lahkohlapnih
snovi med začetkom fermentacije in po 48 urah smo našli v zmeseh za bozo pripravljenih s
proseno moko.
Pri pregledu učbenikov in gradiv za učence v osnovnih šolah smo ugotovili, da je tema
biotehnologija v učbenikih zelo okrnjena. Zato smo kot dodatno gradivo na temo
biotehnologije pripravili dva poskusa. Pri prvem učenci titrirajo zmesi za bozo iz moke in
bakterij in tako na podlagi dodane baze ugotavljajo, v katerem vzorcu je med fermentacijo
nastalo največ kisline. Pri drugem poskusu se učenci seznanijo z mikrobiologijo in rastjo
bakterij. Predstavljena tema in poskusi so primerni za izvedbo v okviru naravoslovnega dne,
saj lahko učenci opravijo vse poskuse in se tako seznanijo ne samo z biologijo
(biotehnologija, mikrobiologija), temveč tudi s kemijo (titracija, določanje pH) in
gospodinjstvom (opazujejo, kako se spreminjajo organoleptične lastnosti hrane med
fermentacijo). Poleg vsega naštetega učenci dodobra spoznajo orientalsko pijačo bozo ter
razloge, zakaj je lahko ta pijača veganski nadomestek mlečnih izdelkov.
46
5. SEZNAM LITERATURE 1-Hexanol. (2017). Pridobljeno s Wikipedia the Free Encyclopedia:
https://en.wikipedia.org/wiki/1-Hexanol
1-Octen-3-ol. (2018). Pridobljeno s Wikipedia, the free encyclopedia:
https://en.wikipedia.org/wiki/1-Octen-3-ol
2,3-Butanediol. (2018). Pridobljeno s Wikipedia the Free Encyclopedia:
https://en.wikipedia.org/wiki/2%2C3-Butanediol
Acetoin. (2017). Pridobljeno s Wikipedia, the free Encyclopedia:
https://en.wikipedia.org/wiki/Acetoin
Akpınar-Bayizit, A., Yılmaz-Ersan, L. in Özcan, T. (2010). Determination of organic acid
composition of boza as affected by raw material and fermentation process.
International Journal of Food Properties, str. 646-648.
Altay, F., Daskaya-Dikmen, C., Heperkan, D. in Karbancioglu-Gueler, F. (2013). A review on
traditional Turkish fermented non-alcoholic beverages: Microbiota, fermentation
process and quality characteristics. International Journal of Food Microbiology, 44-
56.
Altay, F., Karbancioglu-Guler, F., Daskaya-Dikmen, C. in Heperkan, D. (2013). A review on
traditional Turkish fermented non-alcoholic beverages: Microbiota, fermentation
process andquality characteristics. International Journal of FoodMicrobiology, str. 44-
56. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2013.06.016.
Arıcı, M. in Dağlıoğlu, O. (2002). A lactic acid fermented cereal beverage as a traditional
Turkish food. Food Review International, str. 39-48.
Asrar, F. in O`Connor, D. (2005). Bacterially synthesized folate and supplemental folic acid
are absorbed across the large intestine of piglets. J Nutr Biochem, 587-593.
Beck, W. (2001). Cobalamin (Vitamin B12). New York: Marcell Dekker.
Černe, R. (2017). Vitamin B12 - viri in vpliv na zdravje. (Diplomsko delo, Biotehniška
fakulteta).
folna kislina. (2016). Pridobljeno s: https://prehrana.si/sestavine-zivil/vitamini/folna-kislina-
b9
Food safety. (2018). Pridobljeno s:
http://solutions.3m.co.uk/3MContentRetrievalAPI/BlobServlet?lmd=1325582970000
&locale=en_GB&assetType=MMM_Image&assetId=1319217387342&blobAttribute
=ImageFile
Gamm, N. (2015). The Ottomans’ favorite winter drink – boza. Pridobljeno s:
http://www.hurriyetdailynews.com/the-ottomans-favorite-winter-drink---
boza.aspx?PageID=238&NID=77350&NewsCatID=438
47
Gas Chromatography-Mass Spectroscopy. (brez datuma). Pridobljeno 2018 iz
http://cires1.colorado.edu/jimenez/CHEM-5181/Labs/Gas_Chromatography.pdf
History of Boza. (2015). Pridobljeno s: https://istanbulfoodies.weebly.com/boza/history-of-
boza#
How to Make Boza Drink . (2018). Pridobljeno s: http://www.fermented-
foods.com/content/how-make-boza-drink
Kancabaş , A. in Karakaya, S. (2012). Angiotensin-converting enzyme (ACE)-inhibitory
activity of boza, a traditional fermented beverage . Journal of the Science of Food and
Agriculture , 641-645.
Kozyraki , R. in Cases , O. (2013). Vitamin B12 absorption: Mammalian physiology and
acquired and inherited disorders. Biochimie, 1002-1007. Pridobljeno iz
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2012.11.004
Lamers, Y., Prinz-Langenohl, R., Bramswig, S. in Pietrzik, K. (2006). Red blood cell folate
concentrations increase more after supplementation with (6S)-5-
methyltetrahydrofolate than with folic acid in women of childbearing age. Am J Clin
Nutr, 156-161.
LeBlac, J., Taranto, M., Molina, V. in Sesma , F. (2010). B-group vitamins production by
probiotic lactic acid bacteria. Biotehnology of Lactic Acid Bacteria: Novel
Applications, 211-232.
LeBlanc, J. G. in Todorov, S. D. (2011). Bacteriocin producing lactic acid isolated from Boza,
a traditional fermented beverage from Balkan Peninsula – from isolation to
application. Science against microbial pathogens: communicating current research
and technological advances 1311-1320. Pridobljeno s
http://www.formatex.info/microbiology3/book/1311-1320.pdf
LeBlanc, J., Laino, J., Juarez del Valle, M., Vannini, V., van Sinderen, D., Taranto, M., . . .
Sesma, F. (2011). B-Group vitamin production by lactic acid bacteria - current
knowledge and potential applications. Journak of Applied Microbiology, 1297-1309.
LeBlanc, J., Savoy de Giori, G., Smid, E., Hugenholtz, J. in Sesma, F. (2007). Folate
production by lactic-acid bacteria and other food-grade microorganisms.
Communicating Current Reasarch and Educational Topics and Trends in Applied
Microbiology, 329-339.
Morishita, T., Tamura, N., Makino, T. in Kudo, S. (1999). Production of menaquinones by
lactic acid bacteria. Dairy Sci, 1897-1903.
Osimani, A., Grofalo, C., Aquilanti, L., Milanović, V. in Clementi, F. (2014). Unpasteurised
commercial boza as a source of microbial diversity. International Journal of Food
Microbiology, 6-70.
Pacara boza. (brez datuma). Pridobljeno s http://www.pacaraboza.com/eng/boza.php
48
Papastoyiannidis, G., Plychroniadou, A., Michaelidou, A. in Alichanidis, E. (2006).
Fermented milks fortified with B-group vitamin stability and effect on resulting
products. Food Sci Technol Int, 521-529.
Potočnik, M. (2016). ANALIZA HLAPNIH SPOJIN V ABSOLUTIH RASTLINSKIH DROG S
KUMARINI. (Magistrska naloga, Fakulteta za Farmacijo).
Referečne vrednosti za energijski vnos ter vnos hranil. (2016). Nacionalni inštitut za javno
zdravje. Pridobljeno s
http://www.nijz.si/sites/www.nijz.si/files/uploaded/referencne_vrednosti_za_energijsk
i_vnos_ter_vnos_hranil_obl.pdf
Rucker, R., Suttie, J., McCormick, D. in Machlin, L. (2001). Handbook of Vitamins. New
York: Marcel Dekker.
Santos, F., Wegkamp, A., de Vos, W., Smid, E. in Hugenholtz, J. (2008). High-level folate
production in fermented foods by the B12 producer LActobacillus reuteri JM1112.
Appl Environ Microbiol, 3291-3294.
Smith, A., Croft, M. in Webb, M. (2007). Plants need their vitamins too. Curr Opin Plant
Biol, str. 66-275.
Štalcar, A. (2015). Analiza hlapnih spojin v Japonskem Dresniku (Fallopia Japonica) in
Češkem Dresniku (Fallopia x Bohemica). (Magistrska naloga, Fakulteta za Farmacijo).
Tangueler, H. (2014). Tradicional Turkish Fermented Cereal Based Products: Tarhana, Boza
and Chickpea Bread. Turkish Journal of Agriculture-Food Science and Technology,
144-149.
Todorov , S., Botes, M., Guigas, C., Schilinger, U., Wiid, I., Wachsman, M., . . . Dicks, L.
(2008). Journal of Applied Microbiology. Boza, a natural source of probiotics lactic
acid bacteria. Pridobljeno s https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-
2672.2007.03558.x#references-section
Uršnik, I. (2015). PRIPRAVA POSKUSA FERMENTACIJE BOZE - PIJAČE Z BLIŽNJEGA
VZHODA. (Diplomsko delo, Pedagoška fakulteta). Pridobljeno s
http://pefprints.pef.uni-lj.si/3020/1/Diplomsko_delo-_Uršnik.pdf
What Is Fermentation? Benefits of Fermentation + How to Ferment Foods. (brez datuma).
Pridobljeno s: https://draxe.com/what-is-fermentation/
Wouters, J., Ayad, E., Hugenholtz, J. in Smit, G. (2002). Microbes from raw milk for
fermented diary products. Int Dairy, 91-109.
Zijun, X. in Jian , R. (2014). Generation of Acetoin and Its Derivatives in Foods. Journal of
Agricultural and food Chemistry, str. 6487-6497. doi:10.1021/jf5013902
