HAL Id: hal-00929247https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00929247

Submitted on 1 Jan 1991

HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinée au dépôt et à la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publiés ou non,émanant des établissements d’enseignement et derecherche français ou étrangers, des laboratoirespublics ou privés.

Induction de la précipitation phosphocalcique dans leperméat de lactosérum de fromagerie

Y Pouliot, J Landry, J Giasson

To cite this version:Y Pouliot, J Landry, J Giasson. Induction de la précipitation phosphocalcique dans le perméat delactosérum de fromagerie. Le Lait, INRA Editions, 1991, 71 (3), pp.313-320. �hal-00929247�

Lait (1991) 71, 313-320© Elsevier/INRA

313

Article original

Induction de la précipitation phosphocalcique dansle perméat de lactosérum de fromagerie

y Pouliot, J Landry, J Giasson

Centre STELA, Université Laval, Département de sciences et technologie des aliments,Québec, G 1K 7P4 Canada

(Reçu le 20 septembre 1990; accepté le 31 décembre 1990)

Résumé - La précipitation phosphocalcique a été induite de 2 façons dans le perméat de lactosé-rum de fromagerie : soit par alcalinisation simple, soit par effet combiné alcalinisation-ensemencement du milieu par des cristaux de phosphate dicalcique. L'alcalinisation simple s'estavérée inefficace, alors que l'ensemencement a provoqué une cristallisation intense, accompagnéed'une baisse de calcium et de phosphate solubles du perméat. Sur une zone de pH comprise entre6,6 et 8,0, à 25 et 50 "C, il est apparu que les conditions pH 8,0 et 50 oC provoquaient la précipita-tion la plus complète, soit 61 % du calcium et 32% du phosphate solubles. L'observation microscopi-que et la stoechiométrie du précipité obtenu dans ces conditions suggèrent qu'un précipité amorpheet plus alcalin que la phase de nucléation est formé.

perméat de lactosérum 1 phosphate de calcium / précipitation / nucléation

Summary - Induction of calcium phosphate precipitation in sweet whey permeate. Calciumphosphate precipitation was induced in cheese whey permeate using 2 techniques: simple alkalini-zation, and a combination of alcalinization and of seeding of the permeate with dicalcium phosphateas nuclei. Simple alkalinization did not give satisfactory results while the alcalinization-seeding com-bination induced an extensive crystallization as shown by decreases in soluble calcium and phos-phate in the media. Over a pH range between 6.6 and 8.0, at 25 and 50 "C, it was found that pH 8.0and 50 "C induced the most extensive precipitation. Under these conditions, decreases of 61% insoluble calcium and 32% in soluble phosphate were found. The microscopical examination and cal-culated stoichiometry of the calcium phosphate precipitate indicated that a more alkaline form thanthe seeding material is produced using this technique.

whey permeate / calcium phosphate / precipitation / nuc/eation

314

et Marier (1961) ont démontré l'effet du pHsur la formation du phosphate de calciumen solution synthétique. Il a alors été ob-servé que l'alcalinisation induit 2 types deprécipité, le gélatineux et le granulaire. Lepremier se formerait sans aucune appa-rence de sursaturation et son rapport CaiPvarie entre 1,33 et 1,67, en fonction de laconcentration de l'ion CaOH- dans le sur-nageant. Le phosphate de type granulairese forme lentement, à la suite d'une pé-riode d'induction de quelques min à quel-ques h et son rapport CaiP varie entre2,00 et 1,40. Ce précipité serait formé parrecristallisation du phosphate dicalcique(précurseur) en un phosphate plus alcalin,probablement le phosphate octacalcique.Le mode de formation caractérise de façonplus sûre que le rapport CalP, la nature duphosphate de calcium précipité.

Ces observations portant sur des solu-tions synthétiques n'ont pu être confirméesdans le lait et son ultrafiltrat. Il avait alorsété proposé par Boulet (1966) que le laitcontenait des inhibiteurs de nucléation duphosphate de calcium. Des travaux plusrécents (Schmidt et Bath, 1987; Schmidt etal, 1987) ont démontré l'effet inhibiteur decertains résidus protéiques sur la crois-sance du phosphate de calcium. Selon cesauteurs, les fragments 1-105 de la caséine~, un· extrait protéique de lactosérumacide, et même la caséine entière inhibentla nucléation. Cette inhibition se produiraitprobablement par adsorption des résidusphosphoséryles des caséines sur le phos-phate de calcium. Cette observation a étéconfirmée par Van Kemenade (1988) avecles fractions caséiniques as, ~ et x,

La précipitation du phosphate de cal-cium peut aussi être induite par la chaleur.Ce phénomène a pu être observé directe-ment en solution synthétique (Schmidt etal, 1987). Cependant, dans le lait la préci-pitation du phosphate de calcium a jusqu'àprésent été étudiée indirectement par la

y Pouliotet al

INTRODUCTION

L'utilisation grandissante de l'ultrafiltrationcomme technique de traitement du lacto-sérum de fromagerie a permis à l'industrielaitière de valoriser les protéines sériquesdu lait. Cependant, cette technologieconduit à l'obtention d'un sous-produit : leperméat de lactosérum.

Issu de l'ultrafiltration du lactosérum surmembrane dont le seuil de coupure est del'ordre de 10 000 à 50 000 Da, le perméatprésente une faible teneur en protéines(0,2-0,3%) et une teneur en lactose équi-valente à celle du lactosérum, soit 5%(Modler, 1987). La valorisation du perméatde lactosérum porte essentiellement sur lelactose et peut se faire par voie biotechno-logique (ex: ferm314 --tlon, hydrolyse) ouchimique (ex: préparation de lactulose).Ces diverses conversions sont toutefois li-mitées par la sensibilité du perméat de lac-tosérum à la précipitation du phosphate decalcium, consécutive à une hausse de pHou à un traitement thermique (ex: pour mi-lieu de culture). Ces phénomènes peuventêtre contournés par l'utilisation de séques-trants (citrate de sodium, EDTA), afin dediminuer la teneur en calcium ionique duperméat. Une approche alternative consis-terait à induire la précipitation phosphocal-cique dans le perméat, afin d'en diminuersimultanément la teneur en calcium et enphosphore.

En solution, le phosphate de calcium seretrouve généralement dans un état mé-tastable, entre la forme soluble et le préci-pité, dépendant principalement du pH(Neuman et Neuman, 1953). Il existe ainsides sels de phosphate de calcium plusacides, tel le dicalcique formé par précipi-tation à pH 6,2 et des sels plus alcalins, tell'apatite (hydroxy- ou fluoro-) formé par re-cristallisation à partir de sels plus acidesqui s'enrichissent alors en calcium. Boulet

Précipitation phosphocalcique 315

mesure du calcium et phosphate solubledu lait en cours de chauffage (Holt, 1985).Brulé et al (1978) ont démontré qu'il étaitpossible d'induire la précipitation du phos-phate de calcium dans le perméat de lacto-sérum par simple chauffage entre 30 et90 oC. Les auteurs ont aussi noté une rela-tion directe entre le pH avant chauffage etla quantité de précipité formé.

Dans la présente étude, la précipitationphosphocalcique a été induite dans le per-méat de lactosérum en utilisant 2 mé-thodes : l'alcalinisation simple et l'alcali ni-sation avec ensemencement de cristaux.L'effet de la température et du degré d'al-calinisation sur la stoechiométrie du préci-pité a aussi été étudié en effectuant la pré-cipitation à 20 et 50 -c.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Préparation du perméat

Le perméat de lactosérum a été préparé par ul-trafiltration d'un lactosérum doux reconstitué àpartir d'une poudre (6% PN) à pH 5,90 (Agri-nove, Sainte-Claire, Québec) sur membraneRomicon PM 50 (Romicon Inc, Woburn, MA) à20 oC. Le perméat obtenu a été entreposé à4 "C jusqu'à son utilisation.

Préparation des cristauxpour l'ensemencement

Les cristaux de phosphate dicalcique ont étépréparés à 20 "C en solution synthétique selonBoulet et Marier (1961). Une solution de départcontenant 6,2 mmol de calcium et 8,0 mmol dephosphore par litre a été amenée à pH 6,20 àl'aide de NaOH 0,2 N, pour un ratio équivalentbase/mole P de 1,24. Les cristaux de phosphatede calcium ont ainsi été préparés et recueillis àl'aide d'un filtre Whatman # 1, après une cristalli-sation de 60 min.

Précipitation par alcalinisation simple

La précipitation a été induite par une montée dupH à une valeur plus alcaline. Cette valeur ap-pelée pH; (pH initial) a caractérisé chaque réac-tion de précipitation.

Le perméat de lactosérum a donc été alcali-nisé à des pH compris entre 6,50 et 8,00 à l'aidede NaOH 0,2 N, sous agitation constante à tem-pérature contrôlée (20 ou 50 OC).La formationdu précipité débutait dès l'addition de la base etla baisse de pH de la solution, en cours de pré-cipitation, a servi d'indice du degré d'avance-ment de la réaction.

Précipitation par effet combinéensemencement-alcalinisation

Le perméat de lactosérum a tout d'abord étéamené à la température de l'étude (20 ou50 OC),les cristaux synthétiques ont été ajoutés(rapport g cristaux/kg perméat = 0,2), puis le pHdu perméat a été ajusté à des valeurs de pH;comprises entre 6,50 et 8,00 afin d'induire laprécipitation.

Analyses

Des échantillons de solution en cours de précipi-tation ont été prélevés à t = 20, 40, 60 min, etcentrifugés (tEC International Centrifuge) 10 minà 450 g. Les surnageants recueillis ont été ana-lysés pour leur contenu en calcium par absorp-tion atomique (Brooks et al, 1970) et en phos-phore par méthode colorimétrique (Allen, 1940).Tous les essais ont été effectués en triple et lesméthodes d'analyse présentaient un coefficientde variation de l'ordre de 1%.

Examen des précipités

Les précipités recueillis ont été observés en mi-croscopie photonique à contraste de phase (40x) sur un appareil de type Zeiss 63500. Uneobservation a aussi été effectuée en microsco-pie électronique à balayage (8000 x), sur un ap-pareil de type Cambridge S-150.

316 y Pouliot et al

Précipitation par alcalinisation simple

L'induction de la précipitation phosphocal-cique par alcalinisation simple s'est révé-lée inefficace. Les échantillons alcalinisésont montré une faible turbidité, indiquantun faible degré de sursaturation. Des ana-lyses préliminaires nous ont aussi donnéque de très faibles variations en calcium eten phosphate solubles. Les observationsqualitatives rapportées au tableau 1 mon-trent cependant qu'une hausse du pH etde la température permettent la productiond'un précipité plus abondant. Il a aussi éténoté qu'il était impossible d'obtenir un pré-cipité granulaire à 20 oC. Étant donné lesrésultats obtenus, cette approche a étéabandonnée au profit de la technique com-binée alcalinisation-ensemencement.

Précipitation par effet combinéalcalinisation-ensemencement

La préparation des cristaux pour l'ense- '.imencement a été réalisée à partir d'unesolution synthétique. Tel que montré à lafigure 1, la précipité s'est formé après unepériode d'induction de 40 min, au cours delaquelle aucune apparence de formationde cristaux n'était observable. Après 40min, la formation d'un précipité apparent aété accompagnée par une baisse de pH.Nos résultats expérimentaux s'ajustentbien à la courbe de référence obtenue destravaux de Boulet et Marier (1961), bienque nos valeurs de pH soient légèrementsupérieures à celles de ces auteurs. Unequantité approximative de 2 g de précipitéa été produite par litre de solution synthéti-que.

La figure 2 montre l'évolution du pH desperméats après ensemencement et alcali-

Tableau 1. Observations sur les précipités for-més après 60 min d'alcalinisation simple dans leperméat de lactosérum. 1. - : aucun précipité,+: très léger précipité, ++ : léger précipité. 2.gel: précipité gélatineux; cristaux: précipité gra-nulaire.Observations on the precipitation induced bysimple alkalinization in whey permeate. 1. -: noprecipitate; + : very Iight precipita te; ++: Iightprecipitate. 2. gel : gelatinous precipitate; crys-tais: granular precipitation.

Température re;pHi 20 50

6,607,007,508,00

+ (cristaux + gel)++ (cristaux + gel)++ (cristaux + gel)++ (cristaux + gel)

+ (gel)++ (gel)

O.<0r------------------,

6.30

p4riocI.d'baducUOIl-- .6.10

0.00

Temps (min)

Fig 1. Variations du pH lors de la préparation decristaux de phosphate dicalcique à partir d'unesolution synthétique alcalinisée à pH 6,20. (-)courbe de référence. 1 (Boulet et Marier, 1961),(e) : valeurs expérimentales. 1. 6,2 mmol.l-1CaCI2, 8 mmol.l-1 KH2P04, 20 mmol.f" KCI,0,07 mmol.l-1 K2S04, pH 4,54, Il = 0,08.pH variations during crystallization of dicalciumphosphate from a synthe tic solution alkalinizedat pH 6.20. (-) Reference curve. 1 (Boulet andMarier, 1961); (.) experimental data. 1. 6.2 mMGaG/2, 8 mmotr! KH2P04, 20 mmoir! KG/,0.07 mmol.r! KzS04, pH 4.54, Il = 0.08.

Précipitation phosphocalcique 317

Tableau Il. Teneurs en calcium et en phosphate dans le perméat de lactosérum ensemencé, encours de précipitation à 20 et 50 "C.Calcium and phosphate content of whey permeates during precipitation of alkalinized-seededsamples at 20 and 50 oC.

T(OC) Temps pHj=6,60 pHi = 7,00 pHi = 7,50 pHi = 8,00(min) Ca P04 Ca P04 Ca P04 Ca P04

mmol.r! mmol.r! mmotrt mmol.rt

20 0 8,75 11,55 8,75 11,55 8,75 11,55 8,75 11,5520 7,33 10,42 8,00 9,20 5,33 8,38 4,25 7,7640 7,50 10,62 7,42 9,82 5,58 8,61 4,75 7,1960 7,67 10,43 5,92 8,77 4,75 6,99

50 0 8,75 11,55 8,75 11,55 8,75 11,55 8,75 11,5520 7,00 11,04 6,67 10,48 4,92 9,09 4,42 7,4440 6,42 10,85 5,75 10,87 5,25 8,63 3,58 7,8560 6,17 10,29 5,58 9,70 4,25 8,27 3,58 7,88

"""----pH.:IU3 -~

pRl,'MI1

pHI: 7.00 - ---

pHl;UIZ -------------

8.10

'.007.907.007.707.&0

7.&0

7.40

i ~:::7.107.008.SlO

8.808.70..",'.00....

o 30 ..10

Temps (min)

Fig 2. Évolution du pH en cours de précipitationà 20 "C (-) et à 50 oC (- - -) dans le perméatde lactosérum ensemencé et alcalinisé.Variations in pH during precipitation at 20 oC(-) and 50 oC (- - -) in alkalinized-seededwhey permeate.

nisation. Lorsque la précipitation est effec-tuée à 50 oC, la baisse de pH a été supé-rieure de 0,05 unités à pHi 8,00 et de 0,20unités à pHi 6,60. Dans tous les cas, il estdifficile de déterminer la durée de la pé-

00

riode d'induction de façon précise, puisque. les variations de pH étaient faibles (envi-

ron 0,03 unités/10 min). Il semble cepen-dant que plus le pH est élevé, plus la pé-riode d'induction est courte. Aussi, on peutnoter une tendance à la diminution de lapériode d'induction lorsque le pHi passe de6,60 à 8,00.

L'évolution de la teneur en calcium et enphosphate des perméats en cours de pré-cipitation est rapportée au tableau II. Danstous les cas, la teneur en calcium et enphosphate a diminué (10 à 60%) en fonc-tion du temps. Les faibles écarts observésentre les valeurs à 20 et 60 min indiquentque la précipitation était pratiquementcomplète à 20 min. Les baisses en calciumont toujours été supérieures à celles enphosphate et cet effet était plus prononcélorsque la température de précipitationétait de 50 oC. Aux 2 températures del'étude, la teneur en calcium et en phos-phate du perméat a diminué avec l'aug-mentation du pHi'

318 y Pouliot et al

À partir des valeurs du tableau Il, laquantité de calcium et de phosphate préci-pitée après 60 min a été estimée en sous-trayant les valeurs aux temps 60 min, dela valeur initiale (t = 0). Le rapport molaireCalP04 a, par la suite, été calculé et lesvaleurs sont présentées au tableau III. Latempérature a eu un effet déterminant surla nature du précipité formé après 60 min.À 20 "C, les précipités présentent un ratioCalP04 voisin de 1,00 alors qu'à 50 oC,les valeurs sont supérieures à 1,30. Il està noter que le pHi d'alcalinisation n'a paseu d'effet marqué sur le ratio CalP04 à20 "C, alors qu'il tend à diminuer en fonc-tion du niveau croissant de pHi lorsque laprécipitation est effectuée à 50 oC.

La figure 3 illustre la nature morphologi-que des précipités obtenus. Les cristauxpréparés en solution synthétique et utiliséspour l'ensemencement du perméat (3A,C)présentent une forme triangulaire régulièreet bien définie. Le précipité total obtenuaprès ensemencement présente aussi cescristaux de forme triangulaire, mais recou-verts d'un dépôt plutôt amorphe. Lesplanches 3B et 3D montrent bien la naturehétérogène du précipité total.

Tableau III. Rapport molaire CalP04 calculépour les précipités formés après 60 min par en-semencement à 20 et 50 oC.Ca/PO4 mo/ar ratio as ca/cu/ated for the precipi-tates formed at 60 min in a/kalinized-seededwheypermeates at 20 and 50 oC.

pH; "' Ratio Ca/PO4

T=20°C T=50°C

0,960,76·1,010,88

2,131,711,371,41

6,607,007,508,00

• Après 40 min

DISCUSSION

Les résultats obtenus par alcalinisationsimple mettent en évidence le rôle des pro-téines ou matières azotées du perméat delactosérum dans l'inhibition de la nucléa-tian du phosphate de calcium. Cette sug-gestion, déjà avancée par Brulé et. ~'(1978), était basée sur une teneur rruru-male de 0,7% de protéines sériques, au-dessus de laquelle l'effet inhibiteur n'étaitpas observé. Dans notre cas la teneur enprotéines était de 0,2%, mais la tempéra-ture n'a pas dépassé 50 oC, alors que cesauteurs ont observé le phénomène à80 oC. Il est alors possible qu'une plusgïande teneur en matière azotée ait éténécessaire en raison de la dénaturationthermique des protéines du sérum.

L'introduction d'une phase de nucléa-tian, ie de cristaux de phosphate dicalci-que, a donné lieu à une précipitation plusextensive. Cette observation peut être ex-pliquée de 2 manières. Premièrement, dupoint de vue thermodynamique, l'introduc-tion d'une phase solide dans un tel sys-tème augmente le niveau d'énergie libre(~G) et accélère d'autant l'étape de nucléa-tian (Adamson, 1982). Deuxièmement,comme la phase solide est constituée dephosphate dicalcique, il est possible ~uecette phase ait servi de site d'adsorptionpour les inhibiteurs de nucléation, laissantalors libre cours à la précipitation phospho-calcique des éléments alors en solution.L'observation de la nature du précipitéformé, différente de la phase de nucléation(dicalcique), suggère que la cristallisationpuisse procéder via l'adsorption de phos-phate de calcium sur la phase solide exis-tante. Ainsi, les facteurs tels le pH et latempérature joueraient un rôle déterminantsur la nature du précipité formé. Ceci estbien reflété par les différences dans les ra-tios CalP04 entre 20 et 50 -c. Des tra-vaux antérieurs (Pouliot et al, 1989)

Précipitation phosphocalcique 319

Fig 3. Morphologie des cristaux préparés en solution synthétique [A (40 x), C (8 000 x)] et du précipitéobtenu après alcalination à pH 8,00, à 50 oC [B (40 x), D (8 000 x)]. Barre = 10 um,Morph%gy of crysta/s prepared from synthetic solution [A: (40 x), C: (8 000 x)] and of the precipitatecrystallization in whey permeate at pH 8.00 and 50 oC [B: (40 x), 0: (8 000 x)]. Bar = 10 J1m.

avaient démontré que la précipitationphosphocalcique dans le lait se faisait à unratio approximatif de 1,00 à 85 oC, soitcelui du phosphate dicalcique. Les ratiosapparents supérieurs à 1,30 obtenus à50 oC indiqueraient la formation de phos-phate de calcium plus alcalins tels le phos-phates tricalcique et octacalcique obtenusdirectement ou, encore, par reconversionrapide du dicalcique formé initialement. Ilfaut par ailleurs considérer que la zone depH se situant entre 6,5 et 8,0 est favorableà la formation de ces phosphates alcalins.

La technique de précipitation présentéeici offre un potentiel technologique en ce

sens qu'une simple combinaison pH-température-ensemencement permet deprécipiter jusqu'à 61% du calcium et 32%du phosphate présents dans le perméat delactosérum. L'utilisation de la microfiltrationen aval de ce procédé de précipitation per-mettrait de clarifier le perméat et d'en faireun substrat adéquat pour la bioconversiondu lactose.

REMERCIEMENTS

Les auteurs désirent remercier 0 Desbiens et AGoulet pour leur aide technique concernant lamicroscopie de nos échantillons.

320 y Pouliot et al

RÉFÉRENCESAdamson AW (1982) The formation of a new

phase - nucleation and crystal growth. In:Physical Chemistry of Surfaces, 49 ed, JohnWiley & Sons, New York, 319-331

Allen RJ (1940) Determination of phosphorus.Biochem J 34, 858-865

Boulet M (1966) Formation du phosphate decalcium dans le lait et son ultrafiltrat. 179Congr Int Lait Munich B, 111-118

Boulet M, Marier JR (1961) Precipitation of cal-cium phosphates from solutions at near phy-siological concentrations. Arch Biochem Bio-phys93,157-165

Brooks lB, Luster GA, Easterly DG (1970) Aprocedure for the rapid determination of themajor cations by atomic absorption spectro-photometry. At Absorpt Newsl9, 93-94

Brulé G, Real del-Sol E, Fauquant J, Fiaud C(1978) Mineral salts stability in aqueousphase of milk: influence of heat treatments. JDairy Sci 61, 1225-1232

Holt C (1985) The milk salts: their secretion,concentrations and physical chemistry. In:Developments in Dairy Chemistry. 3 (Fox

PF, ed), Applied Science Publishers, London,3,143-181

Modler HW (1987) The use of whey as animalfeed and fertilizer. Int Dairy Fed Bull 212,111-124

Neuman WF, Neuman MW (1953) The nature ofthe minerai phase of bene. Chem Rev 53, 1-29

Pouliot Y, Boulet M, Paquin P (1989) Experi-ments on the heat-induced salt balancechanges in cow's milk. J Dairy Res 56, 513-519

Schmidt DG, Both P (1987) Studies on the preci-pitation of calcium phosphate. 1. Experimentsin the pH range 5.3 to 6.8 at 25 oC and 50 oCin the absence of additives. Neth Milk Dairy J41,105-120

Schmidt DG, Both P, Visser S, Slangen KJ, VanRooijen PJ (1987) Studies on the precipita-tion of calcium phosphate. II. Experiments inthe pH range 7.3 to 5.8 in the presence of ad-ditives. Neth Milk Dairy J 41, 121-136

Van Kemenade MJJM (1988) Influence of ca-sein on precipitation of calcium phosphates.Thèse de doctorat, Université d'Utrecht, TheNetherlands (no 12762054)