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Evaluación in vitro de cepas nativas de hongos filamentosos como agentes controladores de Phytophthora infestans
Gustavo Adolfo Araque Echeverry
Trabajo de Grado
Presentado como requisito parcial para optar al título de
Microbiólogo Agrícola y Veterinario
Director
Jorge Robles Camargo, Ph.D.
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Microbiología Agrícola y Veterinaria
Bogotá, D.C. Junio de 2014
2
Evaluación in vitro de cepas nativas de hongos filamentosos como agentes controladores de Phytophthora infestans
Gustavo Adolfo Araque Echeverry
Aprobado
Concepción Judith Puerta, Ph.D. DECANA ACADÉMICA
FACULTAD DE CIENCIAS
Janeth del Carmen Arias, M.Sc.
DIRECTORA CARRERAS MICROBIOLOGÍA
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Evaluación in vitro de cepas nativas de hongos filamentosos como agentes controladores de Phytophthora infestans
Gustavo Adolfo Araque Echeverry
Aprobado
Jorge Robles Camargo, Ph.D.
Director
Lucía Ana Díaz Ariza, M.Sc.
Jurado Ecología
Amanda Varela Ramírez, Ph.D.
Jurado Microbiología
4
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos
por sus alumnos en sus trabajos de grado Sólo velará por qué no se
publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946.
5
Tabla de contenido
No.
Página
Lista de Figuras 10
Lista de Tablas 11
Lista de Anexos 12
Resumen 13
1. Introducción 14
1.1 Descripción del problema 14
1.2 Justificación 14
1.3 Propósito de la investigación 15
2. Objetivos 15
2.1 Objetivo general 15
2.2 Objetivos específicos 16
3. Marco Teórico 16
3.1 Agricultura y seguridad alimentaria 16
3.2 Hongos fitopatógenos en la agricultura mundial 16
3.3 Phytophtora sp. 17
3.4 Phytophtora infestans 18
3.5 Hongos empleados para el control biológico de hongos
fitopatógenos
19
4. Materiales y métodos 20
4.1 Diseño del estudio 20
6
4.1.1 Reactivación de las cepas de Trichoderma sp. CV29NS y
Penicillium sp. A14CVSF13.
21
4.1.1.1 Elaboración de cultivos monospóricos 22
4.1.2 Extracción de compuestos totales de Penicillium sp.
A14CVSF13.
22
4.1.2.1 Cinética de crecimiento 23
4.1.2.2 Obtención extracto crudo de Penicillium sp.
A14CVSF13
23
4.1.2.2.1 Fermentación 23
4.1.2.2.2 Obtención del extracto crudo 23
4.1.2.2.3 Extracción, fraccionamiento y
caracterización de los metabolitos secundarios
23
4.1.3 Determinación de las mejores condiciones in vitro para
comprobar el antagonismo y efecto de los extractos obtenidos
a partir de Penicillium sp. A14CVSF13 sobre el crecimiento del
micelio de P. infestans.
23
4.1.4 Determinación de las mejores condiciones in vitro para
comprobar el antagonismo y confrontación de Trichoderma sp.
CV29NS frente a Phytophthora infestans.
24
4.2 Análisis de datos 24
5. Resultados y discusión 24
5.1 Reactivación de las cepas de Trichoderma sp. CV29NS y
Penicillium sp. A14CVSF13 y obtención de cultivos
monospóricos
24
5.2 Extracción de compuestos totales de Penicillium sp.
A14CVSF13
24
5.2.1 Cinética de crecimiento 25
5.2.2 Obtención extracto crudo de Penicillium sp. A14CVSF13
y extracción, fraccionamiento y caracterización de los
27
7
metabolitos secundarios
5.2.3 Determinación de las mejores condiciones in vitro para
comprobar el antagonismo de los extractos de Penicillium sp.
A14CVSF13 y efecto de los mismos sobre el crecimiento del
micelio de P. infestans
28
5.2.4 Determinación de las mejores condiciones in vitro para
comprobar el antagonismo y confrontación de Trichoderma
sp. CV29NS frente a Phytophthora infestans
33
6. Conclusiones 36
7. Perspectivas 37
8. Referencias Bibliográficas 37
8
Dedicado a aquellos que siempre han estado en el momento
y lugar preciso.
9
AGRADECIMIENTOS
A mis padres por ser el motivante a diario, por ser quienes son, por su aliento, por su
apoyo incondicional, por su comprensión, por su paciencia, por no sólo ser únicos sino
por ser los mejores…. Esto es por ustedes.
A Valeria por su inmenso cariño, por sus buenas palabras, por sus sinceros
sentimientos, por esas largas horas de compañía, por los felices momentos, por su
apoyo a toda costa, por su ayuda y por regalarme esa sonrisa a diario.
A Laura por ser una amiga incondicional y querer siempre aportar algo a mi vida,
estando en los buenos y en los peores momentos.
A mis hermanos, por ser mi soporte y consejeros de cabecera, por querer prepararme
desde muy pequeño al mundo real. Por siempre estar dispuestos cuando los necesito.
A Samuel por ser un pequeño hombrecito lleno de vida y alegría, por ser uno de las
razones de querer un futuro mejor.
Al profesor Jorge Robles, gracias por compartir algo de su conocimiento conmigo y
darme la oportunidad de trabajar con usted.
A mis amigos, compañeros y futuros colegas, a los que aportaron algo en el presente
trabajo y a los que no pudieron, gracias por esos gratos recuerdos y gratas enseñanzas
de vida.
Al laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de Los Andes (LAMFU).
Al personal de Química y Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana.
10
LISTA DE FIGURAS
No. Figura Página
1 Cinética de crecimiento de Penicillium sp. A14CVSF13 27
2 Cromatografía en capa delgada de la cinética de crecimiento
de Penicillium sp. A14CVSF13
27
3 Prueba de antagonismo a 18°C de los extractos de Penicillium sp.
A14CVSF13 frente a P. infestans en medio V8
32
4 Prueba de antagonismo a 25°C de los extractos de Penicillium sp.
A14CVSF13 frente a P. infestans en medio V8.
33
5 Pruebas de antagonismo de Trichoderma sp. CV29NS frente a P. infestans 34
6 Gráfico de medias de las tres temperaturas evaluadas 35
7 Comparación entre las medias de inhibición de
las diluciones de los extractos de Penicillium sp. A14CVSF13 y
Trichoderma sp. CV29NS en las tres temperaturas evaluadas.
36
11
LISTA DE TABLAS
No. Tabla Página
1 Resultados ANOVA de dos vías para las variables: temperatura, dilución y la
interacción entre ambas
30
2 Prueba de Tukey: Comparaciones múltiples de las temperaturas
evaluadas 18°C (1,00), 22°C (2,00) y 25°C (3,00)
31
3 Prueba de Tukey: Comparaciones múltiples de las diluciones de los
extractos de Penicillium sp. A14CVSF13 evaluadas para el antagonismo de
P. infestans.
32
4 Resultados prueba no paramétrica Kruskal Wallis, en donde
se evidencia que hay diferencias significativas en las pruebas realizadas
a diferentes temperaturas
34
12
LISTA DE ANEXOS
No. Anexo Página
1 Características macroscópicas y microscópicas de Trichoderma sp. CV29NS
43
2 Características macroscópicas y microscópicas de de Penicillium sp. A14CVSF13
43
3 a. Cromatograma de la cromatografía de gases acoplada a masas
44
b. Nombres, estructura y abundancia de los compuestos hallados en la cromatografía de gases acoplada a masas
45
4 Ausencia de crecimiento de P. infestans en PDA y en Czapek, después de ocho días de incubación.
46
13
RESUMEN
El uso desmesurado de insumos químicos en los sistemas de producción agrícola ha
desencadenado la necesidad de investigar nuevas opciones de manejo sostenible que
reduzcan el impacto ambiental de estas, una de las cuales es el control biológico. Phytophthora
infestans es uno de los agentes causales de los agentes causales de enfermedades más
estudiados en el cultivo de papa, dado su rápido efecto devastador dentro del cultivo, las
grandes pérdidas económicas ocasionadas y el uso de grandes cantidades de fungicidas
químicos altamente tóxicos por parte de los agricultores que requiere su control. El presente
estudio pretende evaluar la capacidad controladora in vitro de dos especies fúngicas nativas
(Trichoderma CV29NS sp. y Penicillium sp. A14CVSF13) como antagonistas de P. infestans y
las condiciones in vitro más efectivas en las que este control se lleva a cabo. Con este fin, se
midieron los porcentajes de inhibición de las cepas nativas frente al patógeno en diferentes
medios de cultivo (V8, Czapeck y PDA), tres temperaturas (18ºC, 22°C y 25°C) y para el caso
de Penicillium sp. A14CVSF13 se usaron 3 diluciones diferentes de los extractos polares
obtenidos (2, 0,2 y 0,05 mL/mL). Los resultados muestran que tanto la cepa de Trichoderma sp.
CV29NS como los extractos polares obtenidos a partir de Penicillium A14CVSF13 sp.
presentaron actividad controladora frente al patógeno, bajo condiciones de laboratorio. Los
resultados del antagonismo de ambas cepas fueron evidenciados en medio V8, siendo
significativamente mejores en temperaturas superiores a los 22°C y en el caso de los extractos
polares obtenidos a partir de Penicillium sp. A14CVSF13, no se evidenciaron diferencias
significativas en las diluciones evaluadas. Además la cepa de Trichoderma sp. CV29NS mostró
mayor porcentaje de inhibición que los extractos polares de Penicillium sp. A14CVSF13 en las
temperaturas de 18°C, 22°C y 25°C. Se concluye que ambas cepas nativas presentaron
actividad antagonista frente a P. infestans in vitro, en temperaturas superiores a 22°C, en medio
de cultivo V8.
14
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Descripción del problema Los hongos fitopatógenos son unos de los principales causantes de afectaciones en los cultivos
dentro de los sistemas de producción agrícola (Trigos et al., 2008). A pesar de ser una
problemática a nivel global, la incidencia en la región del trópico es mayor dadas las
condiciones ambientales que allí se dan, las cuales contribuyen a la presencia, ataque y
propagación de los patógenos (Claudio et al., 2010). El problema radica en que agricultores
han optado durante décadas por aplicar fungicidas e insecticidas de síntesis química en
grandes cantidades, lo cual contribuye en la disminución de la calidad de los alimentos, el
aumento de los costos de producción y venta de los mismos, la contaminación de los suelos,
recursos hídricos, problemáticas de salud en animales y seres humanos, al igual que la
resistencia de plagas y patógenos a estos productos (Izquierdo et al., 2007).
El hongo fitopatógeno Phytophthora infestans es el agente causal de la enfermedad conocida
como “gota” o “tizón tardío” en algunas especies de la familia Solanaceae, siendo la mayor
causa del uso de productos de síntesis química en el cultivo de papa, que pueden envenenar la
fauna asociada al sistema productivo y a las poblaciones humanas aledañas (Vargas et al.,
2009). Además no se disuelven fácilmente en el ambiente, por ello se puede acumular en
plantas, animales, recursos hídricos y suelo, en donde reduce el número de plantas que puedan
crecer allí, influyendo sobre la microbiota edáfica y la descomposición de materia orgánica
presente (Wrigth, 2003). A pesar de que existen investigaciones referentes al control de P.
infestans por medio de especies de hongos capaces de afectar el crecimiento y desarrollo de
dicho fitopatógeno (Infante et al., 2009), en Colombia no hay evidencia de la implementación
de cepas nativas de hongos filamentosos para el manejo y el control del agente causal del tizón
tardío bajo condiciones de laboratorio ni en campo.
1.2 Justificación
La papa es el cuarto cultivo alimenticio en orden de importancia a nivel mundial, después del
trigo, el arroz y el maíz, alimentando a más de mil millones de consumidores en todo el mundo;
dentro del cual, existen 500 millones de consumidores e los países en vía de desarrollo, cuya
dieta básica incluye la papa (Moreno, 1996). En Colombia, el cultivo de papa representa el
principal sistema de producción del piso térmico frío, ubicado en la Región Andina, entre los
2000 y 4000 m.s.n.m, lo cual corresponde a los altiplanos fríos y a los páramos, ubicados
15
principalmente en los departamentos de Cundinamarca, Boyacá, Nariño y Antioquia, en ellos el,
el cultivo ocupa el 70% de la producción nacional, la cual se encuentra alrededor de 2,7
millones de toneladas de tubérculo fresco al año (Moreno, 1996). Cerca de 90.000 familias
están vinculadas directamente con su producción y medio millón más participan en su
comercialización y procesamiento. La “gota” o “tizón tardío”, sigue siendo el principal problema
fitosanitario dentro del cultivo, debido a su potencial de daño, la dispersión y variedad de razas
del agente causa (Phytophthora infestans), que se suma a la suceptibilidad de las variedades
sembradas por los agricultores (Moreno, 1996). Phytophthora infestans es la mayor causa del
uso (cantidad y repetición) de agroquímicos en el cultivo de papa (Agrocardenas, 2006 in
Martínez & Osorio, 2007), dentro de los cuales los compuestos cúpricos son los que
demuestran mayor eficiencia, dentro de los cuales en el mercado se consiguen productos como
metalaxyl, ofurace, oxadyxil y benalaxil; sin embargo, se ha descubierto que la población del
patógeno desarrolla rápidamente resistencia a estos fungicidas (Pérez & Forbes, 2008). La
aplicación sostenida de fungicidas de síntesis química para el control de enfermedades en los
cultivos agrícolas, ha obligado a la búsqueda de alternativas que sean más amigables con el
planeta y contribuyan en la prevención o reducción de los efectos de estos compuestos sobre el
medio ambiente. El manejo basado en la mitigación de los impactos ambientales, debe proteger
la estructura, función y diversidad biológica de los sistemas agrícolas, buscando así un
equilibrio entre el medio ambiente y los recursos naturales. Es por ello que el manejo con
organismos biológicos dentro de los cultivos, se presenta como una alternativa ecológica frente
a los ya nombrados problemas causados por microorganismos fitopatógenos. Dentro de éstos
organismos se encuentran los hongos controladores, los cuales ofrecen buenas posibilidades
de manejo dentro del cultivo para plagas y enfermedades, promoviendo así una continua y
progresiva investigación en estudios de control biológico con el fin de contrarrestar algunas de
las patologías que se presentan en plantas.
1.3 Propósito de la investigación
El propósito de la siguiente investigación es realizar una evaluación de la actividad
biocontroladora de dos cepas nativas (Penicillium sp. A14CVSF1313 y Trichoderma sp.
CV29NS) frente al patógeno Phytophthora infestans in vitro, con el fin de contribuir a la
investigación en los programas de manejo integrado de plagas y enfermedades, mediante la
implementación de nuevas tecnologías limpias y amigables con el medio ambiente.
16
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Determinar y evaluar la actividad controladora por parte de las cepas nativas de Trichoderma
sp. CV29NS y Penicillium sp. A14CVSF13 frente a P. infestans in vitro.
2.2 Objetivos específicos
Comprobar si existe algún efecto de control por parte de los metabolitos
secundarios de Penicillium sp. A14CVSF13 y el micoparasitismo de Trichoderma
sp. CV29NS frente a P. infestans.
Determinar las condiciones de cultivo in vitro, en las cuales se presenta mayor
inhibición por parte de Penicillium sp. A14CVSF13 y Trichoderma sp. CV29NS
frente a P. infestans.
3. MARCO TEÓRICO
3.1 El cultivo de papa en la agricultura y seguridad alimentaria
La producción de papa por unidad de superficie y unidad de tiempo es una de las más
interesantes entre los alimentos básicos. La papa puede producir entre dos y cuatro veces más
alimento que el arroz o el trigo y presenta numerosas propiedades nutritivas. Hasta 85 % de la
planta es comestible, mientras que en los cereales, esta proporción es de más o menos 50%
(Vries, 1967). El elevado rendimiento por hectárea de la papa permite obtener además una
producción de energía digestible diaria comparable a los cereales. Esto se puede lograr en
regiones donde existen escasas alternativas productivas, como los Andes. Una papa de tamaño
promedio proporciona aproximadamente la mitad de las necesidades diarias de un adulto en
vitamina C, así como importantes cantidades de hierro, de potasio y de zinc. La papa contiene
también cantidades importantes de vitamina B y proporciona oligoelementos esenciales tales
como manganeso, cromo, selenio y molibdeno (Vries, 1967).
En el transcurso de los últimos años, la producción mundial de papa ha crecido
sustancialmente, sobre todo en los países en desarrollo. Gracias al mejoramiento de las
semillas, de las variedades y de los métodos de manejo de los cultivos, la productividad de la
papa ha aumentado significativamente. Además, en muchos países, el cambio de las
costumbres alimenticias, con un consumo creciente de productos transformados
17
industrialmente, ha generado una demanda mayor (Devaux et al, 2012). En 2005, la
producción de papa en los países en vías de desarrollo ha superado por primera vez aquella de
los países industrializados. Igualmente, sigue aumentando en el Sur y disminuyendo en el
Norte. Los productores más importantes son hoy China, Rusia e India. En el África Sub-
Sahariana, la superficie de papa prácticamente se ha duplicado en el transcurso de los 10
últimos años y sigue expandiéndose con fuerza (Devaux et al, 2012).
El cultivo de la papa contribuye con 7.4%, 11.0% y 10.0%, respectivamente, del Producto
Interno Bruto de Ecuador, Perú y Bolivia, equivalente en 2006 a un valor total agregado de
US$1,055.6 millones. Se estima que hay más de 820,000 productores de papa en los tres
países, representando el 5% de la población agrícola económicamente activa, y más de 52
millones de jornales o días de trabajo generados cada año. Más del 90% de esos productores
son pobres y sus hogares representan más de 3 millones de personas. La papa es una de las
principales fuentes de ingresos y mano de obra en los Andes rurales. Sin embargo, los
rendimientos aún siguen siendo bajos: 17.2, 12.3, 7.8 y 5.7 t/ha en Colombia, Perú, Ecuador y
Bolivia, respectivamente. Dichos rendimientos están por debajo del promedio mundial de 17.6
t/ha (Devaux et al., 2010).
3.2 Hongos fitopatógenos en la agricultura
Las enfermedades producidas por hongos fitgopatógenos presentan una gran incidencia en los
cultivos de producción agrícola a lo largo del mundo. En países tropicales, las condiciones de
temperatura y humedad, principalmente son propicias para el desarrollo de un sinnúmero de
organismos, entre ellos estos hongos que afectan los cultivos (Claudio et al., 2010; Rodriguez,
2001). La presencia de estos en especies frutales ha causado un impacto importante en la
economía y producción de los agricultores y en el manejo de los cultivos y el agroecosistema en
sí (Ochoa et al., 2007). A nivel mundial los hongos fitopatógenos constituyen el grupo más
importante dentro de los patógenos que atacan en los cultivos, a nivel económico en cuanto a
su frecuencia de aparición y el daño que puedan causar, refiriéndose a daño, no sólo a las
pérdidas económicas de producción, sino a las pérdidas a nivel biológico (Agrios, 2002). Son
aproximadamente 8000 especies de hongos que se han reportado como patógenos de plantas,
pudiendo afectar un mismo hongo a varias plantas hospederas o una planta puede estar
afectada por varios hongos patógenos (Becerra et al., 2010). La mayoría de los hongos
fitopatógenos cumplen su ciclo dentro de la planta hospedera y otra en el suelo o residuos
vegetales dentro del cultivo, cumpliendo un papel de saprófitos. Dentro de los principales
18
síntomas ocasionados por éstos organismos fitopatógenos en la planta, se pueden encontrar,
necrosis de tejidos, atrofia, hiperplasia, clorosis, marchitez, manchas foliares y tizones (Becerra
et al., 2010). Para el manejo y control de estos hongos fitopatógenos se han estudiado varias
posibilidades, algunas sostenibles para el ecosistema y otras que buscan la erradicación del
hongo sin escatimar en las consecuencias que estas prácticas puedan conllevar (Contreras et
al., 2010; Venturoso et al., 2011). Dentro de estas alternativas de control se ha implementado
el control biológico, técnica que ha puesto en discusión su beneficio en términos de
productividad, pero que sin ninguna duda, es una opción de manejo sostenible dentro del
agroecosistema (Fernández, 2001; Jacas et al., 2005).
3.3 Phytophthora spp.
El género Phytophthora es uno de los géneros de hongos fitopatógenos que ocasionan más
impactos negativos dentro de los sistemas de producción agrícola (Gouveia et al., 2009).
Dentro de este género se encuentra Phytophthora infestans, el cual es el causante de la
enfermedad de la pudrición de la raíz en el aguacate y en algunas otras especies frutales.
Básicamente condiciones de alta humedad y temperatura bajas son propicias para el desarrollo
de este hongo (Martins et al., 2006). Algunas especies infectan principalmente las raíces
primarias de la planta, reduciendo así la absorción de agua y nutrientes por parte del árbol y
ocasionando una alteración en el correcto funcionamiento del organismo (Alfonso, 2008; Ho &
Lu, 1997). Debido a que este es uno de los géneros de fitopatógenos cuyo manejo y control a
nivel de cultivo es complejo, se han desarrollado diversos estudios para este fin; sin embargo,
Phytophthora sigue siendo un grave problema en los sistemas productivos a nivel mundial, cuyo
manejo y control requiere de la aplicación de una gran variedad de productos químicos, en
repetidas ocasiones durante el ciclo productivo del cultivo, lo cual ocasiona la resistencia de
plagas y patógenos, contaminación de los suelos y recursos hídricos y problemas de salud en
animales y seres humanos (Chávez et al., 2011; Dunstan et al., 2010; Gallo et al., 1999; Ma
et al., 2008).
3.4 Phytophthora infestans
Este fitopatógeno es el agente causal de la enfermedad conocida como “tizón tardío” en
algunos cultivos de la familia Solanaceae (Solanum lycopersicum, S. tuberosum, betaceum, S.
phujera, S. quitoense y Physalis peruviana) y uno de los patógenos de plantas más importantes
19
en Colombia (Vargas et al., 2009). Constituye la mayor causa del uso de agroquímicos en el
cultivo de papa (Agrocardenas, 2006 in Martínez, 2007), cultivo en el que las pérdidas
asociadas a éste patógeno pueden ascender a 6,7 billones de dólares anuales a nivel mundial
(Monsalve et al., 2012). El ciclo de la enfermedad se da cuando el microorganismo produce
zoosporas, las cuales en primera medida infectan las hojas, ocasionando un tizón sobre ellas,
algunas de estas zoosporas caen al suelo infectando al tubérculo, en el caso del cultivo de
papa, el micelio del hongo que crece sobre este, infecta a la plántula, en donde se desarrolla un
zooesporangióforo que da origen a las zoosporas y así se repite el ciclo de la enfermedad, este
zoosporangióforo también se puede desarrollar sobre las hojas (Agrios, 2002). Su incidencia se
acentúa en aquellas épocas de alta humedad relativa y temperaturas bajas, ocasionando la
muerte de hojas, tallos y en el caso de la papa, de los tubérculos. Bajo éstas condiciones el
ciclo de la enfermedad es muy corto, lo cual implica que en menos de 5 días, el patógeno
infecta al hospedero y se reproduce en él, afectando el cultivo de manera sistémica en muy
corto tiempo (Agrios, 2002). La principal cualidad del patógeno es presentar una gran
variabilidad patogénica, lo cual ha significado una dificultad a la hora de la implementación de
variedades resistentes, como una alternativa de manejo y control hacia el patógeno. Según
Shaw (1991) y Goodwin y colaboradores (1995), los mecanismos relevantes que evidencian la
variabilidad de este patógeno son la posibilidad de reproducción sexual, hibridación somática de
hifas y la variación poblacional del mismo. Esto sumado a la migración de patotipos entre
países y continentes, contribuyen a que exista una amplia dinámica que favorece a los cambios
en la composición genética de la población de P. infestans (Goodwin et al., 1995). Los
agricultores colombianos para controlar la enfermedad en papa, emplean aplicaciones con
fungicidas protectantes (Mancozeb) junto con algunos sistémicos (Metalaxyl), de manera
intensiva, de dos a tres veces por semana dentro del ciclo del cultivo; sin embargo, los
resultados obtenidos hacia el manejo y el control de la enfermedad son poco alentadores, y sí
se han aumentado las contaminaciones de fuentes hídricas y del suelo, amenazando así la
salud de la población humana y de los demás organismos vivos que se encuentran aledaños a
éste tipo de cultivos (Martínez, 2007).
3.5 Hongos empleados para el control biológico de hongos fitopatógenos
El control biológico incluye estrategias y métodos para manejar plagas enfermedades a través
de la actividad de organismos distintos al hombre. Es sabido que en el mundo se conoce un
grupo relevante de hongos y bacterias que pueden presentar un efecto antagónico sobre otros
20
microorganismos; esto ha sido investigado y empleado por el hombre para la regulación de
patógenos de plantas y la atenuación de las enfermedades causadas por estos (Fernández,
2001; Infante et al., 2009). Estos organismos afectan negativamente el desarrollo de
fitopatógenos, limitando así el inicio y propagación de la enfermedad dentro de los cultivos
(Izzedin & Medina, 2011). Para cumplir con este objetivo los microorganismos antagonistas
presentan variados mecanismos de acción que les permite ejercer su papel de biocontrolador
(Infante et al., 2009). Dentro de los mecanismos de acción descritos para controlar el desarrollo
de patógenos, se encuentran: antibiosis, competencia por nutrientes o espacio,
micoparasitismo, lisis enzimática e inducción de resistencia (Fernández, 2001). La competencia
es la disputa de dos o más organismos por un recurso limitante, la cual puede ser por
nutrientes, factores de crecimiento o espacio (Baker & Cook, 1974). La antibiosis es la
inhibición del crecimiento o de las funciones metabólicas de un organismo por la acción de una
sustancia o de otro organismo (Gottlieb & Shaw, 1970), siendo posible incluso al no tener
contacto el organismo antagónico con el patógeno. El micoparasitismo se expresa como una
relación de nutrientes, en donde el parásito obtiene una parte o todo de lo que necesita para
vivir de partes vivas de otro organismo que es el hospedero, en el control biológico este
parasitismo se reporta como hiperparastitismo (Dubos, 1987). Al igual la secreción de
antibióticos, es uno de los mecanismos antagonistas más reportados, la interacción de péptidos
antibióticos con la membrana del patógeno puede inducir a la formación de canales iónicos en
la membrana plasmática de estos, lo cual permite el vaciamiento celular. Por otro lado, la
secreción de enzimas como endoquitinasas, β, 1-3 glucanasas y proteasas, permite la
degradación de los componentes de la pared celular del fitopatógeno y se considera como uno
de los mecanismos más importantes del control biológico (Pérez, 2005). Dentro de los hongos
empleados para el control biológico se encuentran algunas especies del género Trichoderma
spp. para el cual se reportan diferentes mecanismos de acción reguladores del desarrollo de
hongos fitopatógenos, entre ellos siendo el de mayor eficacia y de mayor interés, la
combinación de micoparasitismo, producción de metabolitos y enzimas y la antibiosis (Infante
et al., 2009; Stefanova et al., 1999). Otro género que se ha empleado para tal fin es el caso de
Penicillium spp. del cual son variadas las especies que mediante la producción de metabolitos
secundarios a partir de fermentación han demostrado ser capaces de controlar especies
fitopatógenas, ya que dichos metabolitos presentan compuestos capaces de presentar
respuestas biocidas, inhibiendo así el crecimiento de dichos hongos en cualquier fase de su
desarrollo. En algunos otros casos son capaces de producir enzimas líticas que degradan la
21
pared celular del patógeno e incluso se reporta que puede activar mecanismos de defensa
reduciendo la enfermedad entre un 20% y un 50% (Ma et al., 2008).
4. MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se realizó en tres fases, las cuales comprendieron una fase de reactivación de
las cepas de Trichoderma sp. CV29NS y Penicillium sp. A14CVSF13 pertenecientes al Grupo
de Investigación en Fitoquímica de la Universidad Javeriana (GIFUJ) y obtención de la cepa de
P. infestans obtenida del Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los
Andes (LAMFU); una segunda fase en donde se extrajeron los extractos de metabolitos
secundarios de Penicillium sp. A14CVSF13 y una tercera fase en la cual se realizaron las
pruebas de antagonismo por parte de Trichoderma sp. CV29NS y Penicillium sp. A14CVSF13
frente a P. infestans, teniendo en cuenta condiciones in vitro controladas para observar en
cuáles el biocontrol de los hongos antagonistas frente al patógeno presenta mayor eficacia.
4.1 Diseño del estudio
El estudio se dividió en dos experimentos, uno para la evaluación de las mejores condiciones in
vitro para comprobar el antagonismo y el efecto de los extractos obtenidos a partir de
Penicillium A14CVSF13 sp. sobre el crecimiento del micelio de P. infestans, el cual fue un
diseño trifactorial (3x3x3), en donde se tuvieron tres niveles. El primer nivel fueron los medios
de cultivos a evaluar, en el cual se usaron Czapek, V8 y PDA; el segundo nivel fue la
temperatura, en el cual se evaluaron tres tratamientos (18°C, 22°C y 25°C) y el tercer nivel
fueron las tres diluciones empleadas de los extractos obtenidos a partir de Penicillium
A14CVSF13 sp. (2, 0,5 y 0,02 v:v). La unidad experimental utilizada fue una caja de Petri y se
realizaron 6 repeticiones para cada una de las pruebas realizadas. El segundo diseño se realizó
para determinar las mejores condiciones in vitro para comprobar el antagonismo y
confrontación de Trichoderma sp. CV29NS frente a Phytophthora infestans, el cual fue un
diseño bifactorial (3x3), en donde los niveles evaluados fueron, medios de cultivo, con tres
tratamientos (Czapek, V8 y PDA) y tres temperaturas distintas (18°C, 22°C y 25°C). Al igual que
en el caso anterior la unidad experimental fue una caja de Petri y se realizaron 11 repeticiones
por cada tratamiento.
22
4.1.1 Reactivación de las cepas de Trichoderma sp. CV29NS y Penicillium sp.
A14CVSF13
Se reactivaron las cepas de Penicillium sp. A14CVSF13 y Trichoderma sp. CV29NS, teniendo
en cuenta que estas fueron suministradas por el banco de cepas de la línea de Química
microbiológica del GIFUJ, obtenidas previamente a partir de muestras de suelo del Páramo de
Cruz Verde (Arias, 2008). Para la reactivación de las cepas se sembró una pequeña muestra
del suelo, en la cual estaban conservadas, en PDA y posteriormente esto se llevó a incubar
durante 7 días a una temperatura de 25°C. Una vez finalizado el periodo de incubación, se
verificó la pureza del cultivo realizando una tinción de azul de lactofenol del micelio del hongo,
observando que las características microscópicas y macroscópicas correspondieran a las cepas
antes señaladas (García, 2010).
4.1.1.1 Elaboración cultivos monospóricos
Con el fin de obtener un cultivo con un único genotipo, se realizaron cultivos monospóricos de
las cepas. Para la obtención del cultivo monospórico se realizó una suspensión de conidios en
Tween 80 al 1% (v/v), seguido de un recuento en cámara de Neubauer, determinando la
dilución en base 10, donde se podría obtener una concentración de 108 conidios/mL.
Finalmente se sembró por agotamiento una asada de dicha concentración en medio PDA. Esto
se llevó a incubar a 25°C durante 36 horas, transcurrido éste tiempo, se vieron germinados
algunos conidios, de los cuales se seleccionó uno y se le realizó un re-pase o repique, cortando
un pedazo de agar con una cuchilla estéril y pasándolo a una caja de Petri con medio de cultivo
PDA (García, 2010).
4.1.2 Extracción de compuestos totales de Penicillium sp. A14CVSF13
4.1.2.1 Cinética de crecimiento
Debido a que es una cepa nativa, no hay reportes de la cinética de crecimiento de la misma, la
cual es importante a la hora de determinar los días de producción de metabolitos secundarios.
Para obtener los datos de la cinética de crecimiento de la cepa Penicillium sp. A14CVSF13, se
empleó la metodología desarrollada por García en el 2010, en la cual se evaluó el crecimiento
de la cepa en medio de cultivo líquido Hanson durante 16 días, realizando muestreos periódicos
cada 24 horas, por triplicado, para un total de 48 frascos para el total de días, filtrando la
biomasa con papel Whatman #3 y conservando el sobrenadante en frascos nuevos estériles,
cuantificando la biomasa por la técnica de peso seco (García, 2010), y sustrato consumido
mediante la técnica de DNS según Miller (Miller, 1959).
23
4.1.2.2 Obtención extracto crudo de Penicillium sp. A14CVSF13
4.1.2.2.1 Fermentación
Una vez determinada la cinética de crecimiento de la cepa y los días de producción de
metabolitos, se procedió a obtener los metabolitos secundarios realizando una fermentación en
medio líquido Hanson, para lo cual se necesitó la preparación de un pre-inóculo a partir del
cultivo monospórico, el cual corresponde al 10% del volumen final de la fermentación, con una
concentración de 108 conidios/mL (García, 2010).
4.1.2.2.2 Obtención del extracto crudo
Una vez terminado el tiempo de la fermentación se realizó un proceso de filtración con papel
filtro Whatman número 3. Éste papel filtro fue colocado al interior de unos embudos, de tal
manera que retuviera toda la biomasa acumulada, dejando caer a recipientes estériles
solamente el extracto crudo o la fase acuosa, donde se encontraron los posibles metabolitos
secundarios extracelulares que posteriormente fueron evaluados (García, 2010).
4.1.2.2.3 Extracción, fraccionamiento y caracterización de los
metabolitos secundarios
La extracción de los metabolitos presentes en el extracto crudo se realizó mediante el uso de
solventes con dos polaridades diferentes: éter de petróleo (baja polaridad), y acetato de etilo o
etanol (alta polaridad), en fraccionamiento líquido-líquido en una proporción uno a uno y la
detección de los metabolitos secundarios obtenidos se realizó por medio de la técnica de
cromatografía de capa delgada y cromatografía de gases acoplada a detector de masas,
comparando las sustancias obtenidas con la de la base de datos de la biblioteca NIST
empleada por el equipo (García, 2010). Los extractos fueron solubilizados con dimetilsulfóxido
(DMSO) al 1% (Jekel & Oerte, 1990).
4.1.3 Determinación de las mejores condiciones in vitro para comprobar el
antagonismo y efecto de los extractos obtenidos a partir de Penicillium
A14CVSF13 sp. sobre el crecimiento del micelio de P. infestans
Se sembró mediante punción central un inóculo del micelio de P. infestans en el centro de las
cajas de Petri con medio PDA, V8 y Czapek que contenían 2, 0,2 y 0,05 mL del extracto crudo
concentrado en el paso anterior en 20 mL del medio agregado después de que se autoclavó el
24
mismo, con el fin de evitar que se volatilizó los componentes allí presentes, obteniendo
diluciones de 10, 100 y 400 (Ma et al., 2008), metodología conocida como envenenamiento del
medio (Rivero et al., 2009, Michelena et al., 2005). Se contó con un control del crecimiento de
P. infestans sin ninguna dilución en los tres medios mencionados. Los medios inoculados se
incubaron a 18ºC, 22°C y 25°C y las mediciones de los diámetros de las colonias se realizaron
al octavo día de sembradas. Se realizaron seis réplicas de cada tratamiento para un total de
ciento sesenta y dos siembras, valor obtenido mediante la prueba de aproximación exacta de
Fisher usando la información inversa del seno. El porcentaje de inhibición (x) se calculó como
(Ma et al., 2008):
Donde: Dcc= Diámetro colonia control; Dct= Diámetro colonia tratamiento
4.1.4 Determinación de las mejores condiciones in vitro para comprobar el
antagonismo y confrontación de Trichoderma sp. CV29NS frente a
Phytophthora infestans
Las acciones del antagonista se comprobaron en medios Czapek, PDA y V8. Los inóculos
fueron obtenidos de la colonia micelial de P. infestans y Trichoderma sp. CV29NS, haciendo
siembras por punción, con la ayuda de una aguja de disección, en puntos equidistantes con
respecto al centro de la caja de Petri. Las cajas de Petri se incubaron a 18°C, 22°C y 25°C y las
mediciones de diámetro de las colonias se hicieron igual al octavo día de sembradas,
basándose en la metodología empleada por Ezziyani y colaboradores (2004) y Guigón &
González (2004). Se realizaron once réplicas por cada tratamiento, para un total de noventa y
nueve siembras. El porcentaje de inhibición se calculó con la misma fórmula con que se calculó
el efecto de los extractos de Penicillium sp. A14CVSF13 sobre el micelio de P. infestans.
4.2 Análisis de datos
Para las pruebas de antagonismo realizado con Penicillium sp. A14CVSF13, se realizó un
análisis de varianza (ANOVA) de dos vías al ser un diseño factorial y presentar dos variables
efectoras (temperatura y dilución de los extractos), a un nivel de significancia de 0.05, posterior
a ello se hizo una prueba de Tukey. Para el diseño al azar del experimento realizado con
Trichoderma sp. CV29NS se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, ya que los
25
datos no presentaron una distribución normal ni homogeneidad en las varianzas, a un nivel de
significancia de 0.05. El software empleado para dicho análisis fue IBM SPSS Statistics 22.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Reactivación de las cepas de Trichoderma sp. CV29NS y Penicillium sp.
A14CVSF13 y obtención de cultivos monospóricos
Al reactivar las cepas nativas de Trichoderma sp. y Penicillium sp. codificadas como CV29NS y
A14CVSF13, respectivamente, conservadas en suelo y suministradas por el Grupo de
Investigación en Fitoquímica de la Universidad Javeriana, se procedió a realizar la
caracterización macroscópica y microscópica de ambas cepas, para verificar que efectivamente
correspondieran a los géneros mencionados.
Para la cepa de Trichoderma sp. CV29NS se encontraron colonias de color verde, con una
tonalidad clara hacia el centro y en los bordes oscuro, micelio de textura velutinosa. Con el
tiempo se pudo observar la esporulación en la zona periférica de la siembra, viéndose la colonia
de color blanco (Ver Anexo 1a). El revés no presentó coloración ni pigmento difusible al medio
(Ver Anexo 1b). Microscópicamente se observaron conidios unicelulares, globosos, hialinos y en
gran proporción (Ver Anexo 1c), conidióforos erectos, hialinos, la mayoría ramificados, no
verticilados, fiálides en forma de botella (hinchadas hacia la región central pero delgadas hacia
el ápice), dispuestas de manera alterna, en ocasiones agrupadas y hialinas (Ver Anexo 1d).
Ésta descripción es congruente con lo reportado en la literatura para algunas especies
pertenecientes al género Trichoderma (Barnet & Hunter, 1972; Gams & Bisset, 1998).
Las colonias de la cepa de Penicillium sp. A14CVSF13 fueron de color verde oliva y borde
blanco, aunque con el paso del tiempo, la colonia se iba tornando de un color verde-café, de
textura correosa y pulvurulenta (Ver Anexo 2a). El reverso fue de color crema, con pigmento
difusible al medio de color rojo (Ver Anexo 2b). Microscópicamente presenta conidióforos
tabicados, con ramificaciones al final y fiálides en forma de botella, con métulas ramificadas (Ver
Anexo 2c), los conidios son unicelulares, lisos, elipsoides hialinos, dispuestos en cadenas.
Éstas características coincide con las reportadas para el género Penicillium spp. (Ver Anexo 2d)
(Emmons, 1935; Raper & Thom, 1949).
A partir de estas cepas reactivadas, caracterizadas macroscópica y microscópicamente y
26
verificado que correspondieran a los géneros Penicillium spp. y Trichoderma spp., se elaboraron
los cultivos monospóricos, garantizando así el desarrollo de un único genotipo. A partir del
cultivo monospórico se desarrolló el preinóculo e inóculo para la cinética de crecimiento en el
caso de Penicillium sp. A14CVSF13
5.2 Extracción de compuestos totales de Penicillium sp. A14CVSF13
5.2.1 Cinética de crecimiento
En la figura 1 se puede evidenciar a partir de la cinética de crecimiento, la fase de adaptación
del microorganismo que es de cuatro a cinco días, a partir de éste momento, se inicia la fase
logarítmica, obteniendo un mayor valor hacia el séptimo día, que luego se cambia a una fase de
latencia o muerte, con un descenso inminente de la biomasa. Al igual se puede observar que
existe una relación entre el consumo del sustrato por parte de Penicillium A14CVSF sp. y la
dinámica de la biomasa del mismo, en donde los días con mayor producción de biomasa, el
consumo del sustrato es mayor y la presencia de éste en el medio es evidentemente menor.
Del mismo modo, se pueden observar las dos fases metabólicas relevantes de los hongos en la
producción de metabolitos secundarios la trofofase y la idiofase (Parés & Juárez, 1997), en la
trofofase se puede observar el crecimiento de los hongos hasta el séptimo día y allí no hay
producción de metabolitos, sino que la producción de éstos se da en la idiofase, en donde el
microorganismo no crece pero sigue metabólicamente activo y algún nutriente del medio es
limitante, en éste caso el sustrato empleado en el medio, originando inductores de enzimas que
darán lugar a los metabolitos secundarios en ésta fase (Kavanagh, 2011). Si se retoma la figura
1, se puede ver que hacia el séptimo día finaliza la trofofase y a partir de allí comienza la
idiofase, en donde la mayor producción de metabolitos se da en el décimo día (Ver figura 2).
27
Figura 1. Cinética de crecimiento de Penicillium sp. A14CVSF13.
Figura 2. Cromatografía en capa delgada de la cinética de crecimiento de Penicillium sp. A14CVSF13 a. Revelada con luz UV de onda corta b. Revelada con vainillina
5.2.2 Obtención extracto crudo de Penicillium sp. A14CVSF13 y extracción,
fraccionamiento y caracterización de los metabolitos secundarios
Una vez determinados los parámetros cinéticos de la cepa de Penicillium A14CVSF13 sp. se
procedió a obtener los metabolitos secundarios a partir de una fermentación en medio líquido
Hanson (medio empleado también en el modelo cinético). Para tal fin se fermentaron 2.5 L de
medio de cultivo a temperatura ambiente, durante dieciséis días, con el fin de tratar de
recuperar la totalidad de metabolitos producidos por Penicillium sp. A14CVSF13, aunque en
realidad se debió realizar hasta el día décimo en donde hubo una mayor producción de
metabolitos, según lo indicó la cormatografía de capa delgada (Ver Figura 2), con una agitación
constante de 175 rpm, la cual se empleó con el fin de proporcionar una transferencia de
oxígeno al sistema y homogenizar los nutrientes presentes en el medio, garantizando así un
28
adecuado crecimiento del hongo (Doran, 1998). Finalizado el tiempo de fermentación, se inició
la separación del extracto crudo (fase acuosa) y la biomasa, filtrando el volumen total con papel
Whatman # 3. A partir del extracto crudo filtrado se realizó la extracción de los metabolitos
secundarios mediante la técnica de fraccionamiento líquido/líquido, utilizando los solventes éter
de petróleo (baja polaridad) y acetato de etilo (alta polaridad). La cantidad obtenida a partir de la
fracción apolar fue muy escasa, por lo cual no se tomó en cuenta para los fines del presente
estudio, en cambio, de la fracción polar se obtuvo un total de 159. 4 mg, con los cuales fueron
relizadas las pruebas de antagonismo frente a P. infestans. A esta producción de metabolitos
secundarios se le realizó la detección de los compuestos presentes mediante una cromatografía
de gases acoplada a masas, resultando así, en mayor proporción, los compuestos,
bromoclorometano, 1-etoxy-2-propanol, 1-metoxy-2-propanol, 2-cyclopenten-1-one, 1,2-
benzenedicarboxylic acido, mono (2-ethylhexyl) ester y 1-(3,4-dimethoxyphenyl)- Ethanone (Ver
Anexo 3).
5.2.3 Determinación de las mejores condiciones in vitro para comprobar el
antagonismo de los extractos de Penicillium A14CVSF13 sp. y efecto de
los mismos sobre el crecimiento del micelio de P. infestans
El extracto polar obtenido a partir de Penicillium A14CVSF13 sp. se solubilizó con
dimetilsulfóxido (DMSO) al 1%, porque concentraciones más altas son tóxicas para P. infestans
(Jelke & Oerte, 1990), lo cual podría dar falsos positivos en las pruebas, sobrestimando los
resultados obtenidos. Después de solubilizar los extractos polares obtenidos de la cepa de
Penicillium sp. A14CVSF13, se procedió a determinar bajo qué condiciones in vitro había una
mayor inhibición por parte de éstos compuestos frente al patógeno P. infestans. Para ello se
evaluaron tres medios de cultivo: PDA (Papa Dextrosa Agar), V8 y Czapek, en tres
temperaturas diferentes cada uno: 18°C, 22°C y 25°C, a tres diluciones distintas: 2/20, 0,2/20 y
0,05/20 a partir de una concentración del extracto de 512 ppm solubilizado en DMSO al 1%
como se mencionó anteriormente.
De los tres medios de cultivo evaluados, P infestans sólo mostró crecimiento, durante el periodo
de tiempo de incubación (8 días), en V8, mientras que en PDA y Czapek no hubo crecimiento
en los controles ni en las pruebas de antagonismo correspondientes (Ver Anexo 4). Se descarta
que el no crecimiento por parte de P. infestans en PDA y Czapek se relacione con el
antagonismo presentado por los extractos de Penicillium A14CVSF13 sp. ya que como se
mencionó anteriormente, en los controles de las pruebas correspondientes a éstos medios, que
29
no contenían extracto, tampoco hubo crecimiento por parte del hongo, ni en las pruebas
realizadas con Trichoderma sp. CV29NS. Es por ello que la variable de medios de cultivo no fue
tomada en cuenta para el análisis de los datos.
La ausencia de crecimiento en el medio Czapek, se puede deber a que es un medio pobre en
nutrientes, lo cual puede no favorecer el crecimiento de P. infestans (Prada et al., 2009).
Además de esto, el medio Czapek tiene como fuente de carbono sacarosa y de nitrógeno,
nitrato de sodio, sobre lo cual, Clarke (1966) reporta que para un buen crecimiento de P.
infestans in vitro, se deben emplear medios de cultivo que contengan glucosa como fuente de
carbono y extracto de levadura como fuente de nitrógeno. A pesar de ser un medio rico en
nutrientes, en el medio PDA no se evidenció un crecimiento micelial por parte de P. infestans;
sin embargo, se reportan pruebas de antagonismo realizadas con hongos o extractos vegetales
incubadas y leídas en PDA, en el tiempo en que fueron evaluadas las pruebas realizadas en el
presente estudio (Prada et al., 2009; Xiaoyun, 2007; Xiufen et al., 2011 & Yanar et al., 2011),
aunque también se reporta un crecimiento de micelio pobre y lento, sin esporulación (López &
Tomás, 1999). Se cree que el no crecimiento se puede deber también a las condiciones del
medio empleado, debido a que era un medio de cultivo que ya reportaba fecha de caducidad y
llevaba un tiempo considerable destapado sin ser utilizado, lo cual puede afectar la calidad y
concentración de los nutrientes y pH del medio, interfiriendo así en el crecimiento de los
organismos (Microkit, 2003). Mientras que el medio V8 se considera que es un medio propicio
para P. infestans, en donde su desarrollo micelial es rápido y abundante (López & Tomás,
1999); además se considera como un medio selectivo para el género Phytophthora sp. (Drenth
& Sendall, 2001) y en el estudio realizado por Prada y colaboradores (2009), se reporta que el
medio V8 fue en el que más se evidenció el antagonismo del endófito evaluado frente a P.
infestans.
En la tabla 1 se puede observar que las variables de temperatura y dilución de los extractos de
Penicillium sp. A14CVSF13 tuvieron una influencia significativa en el porcentaje de inhibición de
P. infestans, al igual que la interacción entre ambas variables.
Tabla 1. Resultados ANOVA de dos vías para las variables temperatura, dilución y la interacción entre ambas
Origen
Tipo III de suma de
cuadrados gl Cuadrático promedio F Sig.
30
Temperatura ,393 2 ,197 73,170 ,000 Dilución ,591 2 ,295 109,919 ,000 Temp * Dilución ,065 4 ,016 6,090 ,001 Error ,121 45 ,003 Total 15,793 54 Total corregido 1,171 53
a. R al cuadrado = ,897 (R al cuadrado ajustada = ,878)
La temperatura para el desarrollo de P. infestans se encuentran entre los 11°C y los 28°C,
siendo la más óptima entre los 17°C y 25°C (Becerra et al., 2010; Drenth & Sendall, 2001;
Escalante et al., 2004). Es por ello que se seleccionaron las temperaturas evaluadas, en donde
se escoge un valor mínimo, máximo y uno intermedio, del rangomas adecuado de
temperaturas, con el fin de evidenciar el antagonismo y no que la ausencia del crecimiento del
hongo se deba a condiciones ambientales. En la tabla 2 se infiere que las temperaturas 22°C
(2,00) y 25°C (3,00), siendo mayor en la temperatura de 25°C son significativamente diferentes
a la temperatura de 18°C (1,00) y que entre éstas no hubo diferencias significativas, en cuanto
al porcentaje de inhibición frente a P. infestans, aún teniendo en cuenta que las tres
temperaturas fueron significativas para el porcentaje de inhibición de éste. Esto se podría dar ya
que a condiciones cercanas a los 17°C P. infestans presenta un mejor desarrollo micelial y la
germinación de sus esporangios es más eficiente, en cambio a temperaturas más altas, el
hongo va perdiendo su capacidad germinativa (Ezziyanni et al., 2004; Oyarzun et al., 2001), lo
cual ocasiona que no se encuentre en sus mejores condiciones para crecer y sea más propenso
al antagonismo generado por los extractos de Penicillium A14CVSF13 sp..
Se observó que las diluciones evaluadas de los extractos de Penicillium sp. A14CVSF13
presentaron actividad antagónica frente a P. infestans, sin demostrar diferencias significativas
entre las las mismas (Ver tabla 3), a partir de una concentración de los extractos de 512 ppm,
concentración determinada basándose en el estudio de García y colaboradores (2003). Ma y
colaboradores (2008) reportaron que bajo las diluciones empleadas en el presente estudio, otra
especie del género Penicillium sp. presenta actividad antagonista frente a una especie del
género Phytophthora sp.; es por ello que fueron empleadas para la finalidad del presente
estudio, al no tener reportes de la cepa de Penicillium sp. evaluada, por su condición de ser
nativa.
31
Tabla 2. Prueba de Tukey: Comparaciones múltiples de las temperaturas evaluadas 18°C (1,00), 22°C (2,00) y 25°C (3,00)
(I) Temp (J) Temp Diferencia de medias (I-J) Error estándar Sig.
Intervalo de confianza al 95%
Límite inferior Límite
superior
1,00 2,00 -,1883* ,01728 ,000 -,2302 -,1464
3,00 -,1728* ,01728 ,000 -,2147 -,1309
2,00 1,00 ,1883* ,01728 ,000 ,1464 ,2302
3,00 ,0156 ,01728 ,643 -,0263 ,0574
3,00 1,00 ,1728* ,01728 ,000 ,1309 ,2147
2,00 -,0156 ,01728 ,643 -,0574 ,0263
Se basa en las medias observadas. El término de error es la media cuadrática(Error) = ,003. *. La diferencia de medias es significativa en el nivel ,05
Como se mencionó anteriormente, los compuestos detectados en mayor proporción en los
extractos polares obtenidos a partir de la cepa de Penicillium sp. A14CVSF13, fueron:
bromoclorometano, 1-etoxy-2-propanol, 1-metoxy-2-propanol, 2-cyclopenten-1-one, 1,2-
benzenedicarboxylic acido, mono (2-ethylhexyl) ester y 1-(3,4-dimethoxyphenyl)- Ethanone.
Para el bromoclorometano se reporta que presenta un efecto inhibitorio frente a las
comunidades de microorganismos presentes en los rumiantes, para así disminuir el metano
producido por estos como resultado de su metabolismo (Goel et al., 2009; Newbold & Yañez,
2012; Sosa et al., 2007). Para 1-etoxy-2-propanol y 1-metoxy-2-propanol, se registra una
patente de los Estados Unidos, cuyo inventor es Jhon Olin Trimble (2012), quien reporta estos
dos compuestos para el tratamiento de hongos cutáneos en humanos; además el 1-etoxy-2-
propanol, presenta actividad contra protozoos y bacterias aeróbias, pero no en aquellas
anaerobias (Prince et al., 1969). Compuestos que contienen un grupo 2-cyclopenten-1-one
dentro de sus estructuras y que se obtienen a partir del metabolismo secundario de hongos, han
reportado tener actividad frente a otros organismos, por ejemplo Trichoderma konigii que
presenta un ciclopenteno derivado y éste presenta actividad frente a hongos filamentosos
(Mukhopadyay et al., 1996), ciclopentenos extraidos de Dasyscyphus sp., con actividad frente
a bacterias y hongos (Mierau et al., 2004), de Streptomyces globisporus con actividad frente a
hongos (Li et al., 2010) y ciclopentanos de Penicillium expansum que presentan antagonismo
frente a hongos y bacterias (Dai & Xia, 2005). Al igual compuestos que son el resultado de
oximas, condensaciones o derivados de etanona, se reportan como agentes con potencial
antimicrobiano (Grazia et al., 2003; Karkurt, et al., 2001; Ruan et al., 2011). El compuesto
que presentó mayor abundancia en lo obtenido en la cromatografía de gases acoplada a
masas, en su fracción polar, fue el 1,2-benzenedicarboxylic acido, mono (2-ethylhexyl) ester, el
32
cual se reporta en la mayoría de estudios de extractos, ya sea de origen vegetal o fúngico, que
muestran actividad antagonista frente a otros organismos patógenos (Bagavathi & Ramasamy,
2012; Balachandran et al., 2012), además reporta ser un anti retoviral, anti tumoral, anti
diabético, anti cancerígeno, antioxidante, anti inflamatorio y un potente agente antimicrobiano
(Akpuaka et al., 2013; Balachandran et al., 2013; Syeda et al., 2011). Con lo anterior se
puede inferir que en efecto los compuestos detectados por la cromatografía de gases acoplada
a masas para los extractos polares obtenidos de la cepa de Penicillium sp. A14CVSF13,
presentan actividad contra una variedad de microorganismos, lo que lleva a pensar que la
inhibición presentada por estos en las diferentes pruebas, es a causa de los compuestos
presentes en los metabolitos producidos por parte de esta cepa (Ver figura 3 y figura 4).
Tabla 3. Prueba de Tukey: Comparaciones múltiples de las diluciones de los extractos de Penicillium A14CVSF13 sp. evaluadas para el antagonismo
de P. infestans.
(I) Dilucion (J) Dilucion Diferencia de medias (I-J)
Error estándar Sig.
Intervalo de confianza al 95%
Límite inferior
Límite superior
,05 ,20 -,0900* ,01728 ,000 -,1319 -,0481
2,00 -,2528* ,01728 ,000 -,2947 -,2109
,20 ,05 ,0900* ,01728 ,000 ,0481 ,1319
2,00 -,1628* ,01728 ,000 -,2047 -,1209
2,00 ,05 ,2528* ,01728 ,000 ,2109 ,2947
,20 ,1628* ,01728 ,000 ,1209 ,2047
Se basa en las medias observadas. El término de error es la media cuadrática(Error) = ,003. *. La diferencia de medias es significativa en el nivel ,05.
Figura 3. Prueba de antagonismo a 18°C de los extractos de Penicillium A14CVSF13 sp. frente a P. infestans en medio V8. a. Dilución 2/20mL; b. Dilución 0,2/20 mL; c. 0,05/20mL; d. control
33
Figura 4. Prueba de antagonismo a 25°C de los extractos de Penicillium A14CVSF13 sp. frente a P. infestans en medio V8. a. Dilución 2/20mL; b. Dilución 0,2/20 mL; c. 0,05/20mL; d. control
A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que las mejores condiciones para que se
evidencie el antagonismo por parte de los extractos de Penicillium A14CVSF13 sp. frente a P.
infestans in vitro, se dan en medio V8, a partir de 22°C y con diluciones de los extractos
obtenidos, a una concentración Stock de 512 ppm, mayores o iguales a 2 mL en 20 mL de
medio de cultivo.
5.2.4 Determinación de las mejores condiciones in vitro para comprobar el
antagonismo y confrontación de Trichoderma CV29NS sp. frente a
Phytophthora infestans
Como se mencionó en el punto anterior, las pruebas de antagonismo no se pudieron medir en
los medios PDA y Czapek, debido a que no hubo crecimiento por parte de P. infestans en éstos
medios por las razones ya nombradas (Ver Anexo 4). Por ende, en este caso la única variable
efectora que se pudo medir para determinar las mejores condiciones in vitro de antagonismo de
Trichoderma sp. CV29NS frente a P. infestans fue la temperatura de incubación de las pruebas.
Hay diferencias significativas entre las tres temperaturas evaluadas (18°C, 22°C y 25°C) (Ver
tabla 4), en donde las temperaturas de 22°C y 25°C muestran un comportamiento igual,
mostrando ambas mayor inhibición que la temperatura de 18°C (Ver figura 6), teniendo en
cuenta que en las tres temperaturas hubo antagonismo por parte de Trichoderma sp. CV29NS
frente a P. infestans, con porcentajes altos de inhibición (Ver figura 5).
34
Figura 5. Pruebas de antagonismo de Trichoderma sp. CV29NS frente a P. infestans
a. 18°C; b. 22°C; c. 25°C y sus respectivos controles (d, e y f). b.
Dentro de los parámetros de temperatura reportados para el género Trichoderma spp. se
registra que algunas especies pueden presentar antagonismo frente a otras especies fúngicas
en temperaturas de hasta 10°C (Kredics et al., 2003) y contra Phytophthora infestans a
temperaturas máximas de hasta 25°C (López et al., 1999; Lozoya et al., 2006), por lo cual las
temperaturas evaluadas en el presente estudio no afectaban su actividad como agente
antagonista. Tabla 4. Resultados prueba no paramétrica Kruskal Wallis, en donde
se evidencia que hay diferencias significativas en las pruebas realizadas a diferentes temperaturas
inhibición
Chi-cuadrado
30,416
Gl 2 Sig. Asintótica
,000
P<0,05
35
Figura 6. Gráfico de medias de inhibición de las tres temperaturas evaluadas. Para la temperatura 18, la media es de 0,9, la desviación estándar de 0,04 y varianza de 0,002, para las temperaturas 22 y 25 la
media es de 1 y la desviación estándar y varianza de 0.
Con lo observado se puede inferir que el antagonismo por parte de Trichoderma sp. CV29NS
frente a P. infestans in vitro, se da mejor a partir de los 22°C. Así mismo, la cepa nativa de
Trichoderma sp. presentó mayor porcentaje de inhibición que los extractos de Penicillium sp.
A14CVSF13 en las tres temperaturas evaluadas (Ver figura 7). Esto dado posiblemente a que el
género Trichoderma spp. presenta diferentes mecanismos de acción reguladores del desarrollo
de hongos fitopatógenos, entre ellos siendo el más eficiente y de mayor atención, en temas de
control biológico, el resultante de la combinación de micoparasitismo y producción de
metabolitos capaces de controlar un gran número de fitopatógenos, además de la producción
de enzimas y la antibiosis, lo cual contribuye a su amplio espectro de control (Infante et al.,
2009; Stefanova et al., 1999). Dándole así una ventaja frente a los metabolitos secundarios, los
cuales, aunque posean un alto potencial patogénico, tienden a ser muy específicos en los
organismos a controlar y la evidencia de su efecto no es inmediata en todos los casos
(Sánchez et al., 2013). Sin embargo, los datos obtenidos en el presente estudio no se pueden
comparar, debido a que son metodologías y mecanismos distintos entre sí, solo es de resaltar
las medias de inhibición obtenidas en cada uno de los tratamientos y las posibles razones por
las cuales se obtuvieron dichos resultados.
36
Figura 7. Medias y desviación estándar de inhibición de las diluciones de los extractos de Penicillium sp. A14CVSF13 y Trichoderma sp. CV29NS en las tres temperaturas evaluadas.
6. CONCLUSIONES
Las cepas nativas Penicillium sp. A14CVSF13 y Trichoderma sp. CV29NS presentaron
actividad antagónica superior al 50% de inhibición en la mayoría de los tratamientos
frente a P. infestans in vitro, siendo mayor en los tratamientos realizados con
Trichoderma sp. CV29NS.
El micoparasitismo evidenciado por la cepa Trichoderma sp. CV29NS presentó un
porcentaje de inhibición, de casi el doble para la mayoría de los tratamientos realizados,
con respecto a los extractos obtenidos Penicillium sp. A14CVSF13 frente a P. infestans
in vitro.
Trichoderma sp. CV29NS presentó un mejor antagonismo en medio cultivo V8, en
temperaturas superiores a los 22°C de incubación.
Se determinaron los parámetros cinéticos para la cepa Penicillium sp. A14CVSF13,
sabiendo así, que la máxima producción metabolitos secundarios se dio en el décimo día
a temperatura ambiente (21°C) y agitación constante a 175 rpm en el caldo de cultivo
Hanson.
Penicillium A14CVSF13 sp.
37
7. PERSPECTIVAS
Se propone realizar el mismo estudio pero a una escala in vivo, bajo condiciones
invernadero y posterior aplicación en campo.
Se recomienda estandarizar la concentración del inóculo Trichoderma CV29NS sp. que
presente actividad antagónica frente a P. infestans.
Se sugiere ampliar la investigación con cepas nativas como agentes controladores
plagas y enfermedades en el país, con el fin de evitar la comercialización de cepas
aisladas en otros países, las cuales pueden disminuir su efecto bajo las condiciones
ambientales del trópico.
Con el fin conocer la especie las cepas Trichoderma sp. y Penicillium sp. empleadas,
se sugiere implementar técnicas moleculares para tener certeza la taxonomía completa
los organismos.
Se recomienda la implementación de cromatografía en columna como técnica
separación los extractos obtenidos en la fracción polar de Penicillium sp. A14CVSF13,
con el fin de determinar cuáles son las sustancias que presentan actividad biológica con
potencial biocida.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRIOS, G. (2002). Fitopatología. México D.F, México: Limusa S.A.
AKPUAKA, A; EKWENCHI, M; DASHAK, D & DILDAR, A. (2013). Biological Activities of
Characterized Isolates of n-Hexane Extract of Azadirachta indica A.Juss (Neem) Leaves. New
York Science Journal. 6(6):19-124.
ÁLVAREZ, D., SALAZAR, C., HURTADO, A., LGADO, D. & ARANGO, O. (2011). Sensiblidad in
vitro Phytophthora infestans al extracto fique (Furcraea gigantea vent.) y fungicidas sistémicos.
Biotecnología en el sector agropecuario y agroinbdustrial, 9(2): 96-104.
ARIAS EL, PIÑEROS PA. (2008). Aislamiento e intificación hongos filamentos muestra suelo
los páramos Guasca y Cruz Ver. Trabajo pregrado. Facultad Ciencias. Pontificia Universidad
Javeriana, Bogotá D.C, 72 p.
BAGAVATHI, P & RAMASAMY, N. (2012). GC-MS analysis of phytocomponents in the etanol
extract of Polygonum chinense L. Pharmacognosy Research 14: 11-14.
BAKER, K & COOK, R. (1974). Biological Control of Plant Pathogens. W.H Freeman and
Company. San Francisco, USA. 433 p.
BALACHANDRAN, C; LAKSHMI, R; DURAIPANDIYAN, V & IGNACIMUTHU, S. (2012).
Antimicrobial activity of Streptomyces sp. (ERI-CPDA-1) isolated from oil contaminated soil from
Chennai, India. 1: 1-4.
38
BARNETT, H. & HUNTER, B. (1972). Illustrated genera of imperfect fungi. St. Paul (EE.UU):
Burgess Publishing Company.
BECERRA, J; SOSA, M & LÓPEZ, A. (2010). Hongos fitopatógenos alta importancia
económica: descripción y métodos control. Temas selectos Ingeniería Alimentos. 4(2): 14-23
CLARKE, D. (1966). Factors affecting the velopment of single zoospore colonies of
Phytophthora infestans. Transactions of the British Mycological Society, 49: 177-184.
DAI, D & XIA, L. (2005). Enhanced production of Penicillium expansum PED-03 lipase through
control of culture conditions and application of the cru enzyme in kinetic resolution of racemic
Allethrolone. Biotechnol Prog. 21 (4): 1165-1168.
VAUX, A; ORDINOLA, A; HIBON & FLORES, M (Eds.). (2010). El sector papa en la región
Andina: Diagnóstico y elementos para una visión estratégica (Bolivia, Ecuador y Perú). CIP.
Lima, Perú, p. 385.
VAUX, A & ANDRA, M. (2012). La papa y la seguridad alimentaria en la Región Andina:
Situación actual y safíos para la innovación. IV Congreso Ecuatoriano la papa. Quito, Ecuador,
p. 131-135.
DORAN, P. (1998). Principios ingeniería los bioprocesos. Zaragoza, España: Acribia S.A.
DUBOS, B. (1987). Fungal antagonism in aerial agrobiocenoses. En: I. Chet ed. P. 107-135
Innovative Approaches to Plant. Disease Control. New York, John Wiley & Sons.
DRENTH, A. & SENDALL, B. (2001). Practical gui to tection and inntification of Phytophthora.
Brisbane: CRC for Tropical Plant Protection. Brisbane, Australia. 217 p.
DUNSTAN, W; RUDMAN, T; SHEARER, B; MOORE, N; PAAP, T; CALVER, M; LL, B &
HARDY, G. (2010). Containment and spot eradication of a highly structive, invasive plant
pathogen (Phytophthora infestans) in natural ecosystems. Biol. Invasions. 12:913-925.
ECHEMENDÍA, Y. (2002). Phytophthora: Características, diagnóstico y daños que provoca en
algunos cultivos tropicales. La Habana, Cuba: Instituto Investigaciones en Fruticultura Tropical.
EMMONS CW. (1935). The ascocarps in species of Penicillium.Mycologia 27: 128–150
ESCALANTE, M. & FARRERA, R. (2004). Epimología l tizón tardía (Phytophthora infestans) la
papa en zonas productoras l estado Táchira Venezuela. Bioagro 16(1): 47-54.
EZZIYANI, M., PÉREZ, C., AHMED, A., & REQUENA, M. (2004). Trichorma harzianum como
biofungicida para el biocontrol Phytophthora capsici en plantas pimiento (Capsicum annuum
L.). Anales Biología 26: 35-45.
FERNÁNZ, O. (2001). Microorganismos antagonistas para el control fitosanitario. Manejo
Integrado Plagas, 62: 96-100.
GALLO, L; PEREZ & S la ROSA, S. (1999). Búsqueda resistencia a Phytophtora infestans
rands. En patrones aguacate raza antillana. Revista Chapingo 5: 275-277.
GAMS W & BISSETT J. (1998). Morphology and indentification of Trichorma. In: HARMANN E &
KUBICEK P, (Eds). Trichorma and Gliocladium. Taylor and Francis. London, England, p. 3–34.
GARCÍA, V; GONZALEZ, M; FUENTES, M. (2003). Antifungal activities of nine traditional
Mexican medicinal plants. Journal Enthopharmacol 87(1): 85-88.
GARCÍA, A. (2010). Obtención metabolitos secundarios a partir una cepa nativa Penicillium
sp. SPG 91 y evaluación su actividad antimicrobiana. Departamento Cundinamarca. Grupo
Investigación en Biotransformación (GIBUJ). Departamento Química, Pontificia Universidad
Javeriana. Trabajo investigación en proceso publicación.
39
GOODWIN, S., SUJKOWSKY, L. & FRY, W. (1995). Rapid evolution of pathogenicity within
clonal lineages of the potato late blight disease fungus. Phytopathology, 85: 669-675.
GOUVEIA, E; COELHO, V; SOUSA, N; COUTINHO, S; NUNES, L & LORETO, M. (2009). An
efficient assay for detection of Phytophthora infestans in the rehizosphere of sweet chestnut
(Castanea sativa). Revista Ciencias Agrarias 32: 130-138.
GOEL G, HARINR P, MAKKAR S & BECKER K. (2009). Inhibition of methanogens by
bromochloromethane: effects on microbial communities and rumen fermentation using batch and
continuous fermentations. British Journal of Nutrition. 101:1484-1492
GÓMEZ, Y., HIDALGO, J., JIMÉNEZ, M. & SALCEDO, J. (2003). Obtención extractos
orgánicos con actividad antimicrobiana a partir Penicillium sp. aislado la esponja Ircinia felix
(Porifera: Mospongiae). Revista Biología Tropical, 51 (4): 141-147.
GRAZIA, M; ZAMPIEN, D; FALAGIANI, V; VIO, L & BANFI, E. (2003). Synthesis and antifungal
activity of (±)-1-(5-aryl-3-pyridin-2-yl-4,5-dihydro-pyrazol-1-yl)-2-imidazol-1-yl-ethanone rivatives.
Farmaco 58(4): 315-322.
GUIGÓN, C. & GONZÁLEZ, P. (2004). Selección Cepas Nativas Trichorma spp. con Actividad
Antagónica sobre Phytophthora capsici. Revista Mexicana Fitopatología, 22 (1): 117-124.
HO, H & LU, L. (1997). A occurren of the occurrence and pathogenicity of Phytophtora species
in mainlan China. Mycopathologia 138: 143-161
INFANTE, D., MARTÍNEZ, B., GONZALEZ, N. & REYES, Y. (2009). Mecanismos accíon
Trichorma frente a hongos fitopatógenos. Revista Protección Vegetal, 24 (1): 14-21.
IZQUIERDO, J; RODRÍGUEZ, M & DURÁN, M. (2007). Manual “Buenas Prácticas Agrícolas
para la Agricultura Familiar”. Antioquia, Colombia. FAO.
IZZEDIN, N & MEDINA, L. (2011). Efecto del control biológico por antagonistas sobre
fitopatógenos en vegetales consumo humano. Salus 15 (3): 8-12.
JACAS, J; CABALLERO, P & AVILLA, J. (2005). El control biológico plagas y enfermedas.
Universitat Jaume. Castelló la Plana, España. P. 15-20.
JELKE, E & OERTEL, B. (1990). DMSO induces thr formation of microfilament bundles in nuclei
of zoospores of Phytophthora infestans (Mont.) Bary (Oomycetes, Pythiaceae). Acta
Histochemica Supplementband. 39: 435-442.
KARAKURT, A; DALKARA, S; ÖZALP, M; ÖZBEY, S; KENDI, E & SATBLES, J. (2001).
Synthesis of some 1-(2-naphthyl)-2-(imidazole-1-yl)ethanone oxime and oxime ether rivatives
and their anticonvulsant and antimicrobial activities. European Journal of Medicinal Chemistry.
36(5): 421-433.
KAVANAGH, K. (2011). Fungi Biology and Applications. Second Edition. USA: Editorial Wiley.
KREDICS, L., ANTAL, Z., MANCZINGER, L., SZEKERES, A., KEVEI, F. & NAGY, E. (2003).
Influence of Environmental Parameters on Trichorma Strains with Biocontrol Potential. Food
Technol. Biotechnology, 41(1): 37-42.
LI, Q; NING, P; ZHENG, L; HUANG, J; LI, G & HSIANG, T. (2010). Fumigant activity of volatiles
of Streptomyces globisporus JK-1 against Penicillium italicum on Citrus microcarpa. Postharvest
Biology and Technology. 58: 157-165.
LÓPEZ, C., PÉREZ, R., MONTE, E., LLOBEL, A. & ZEA, T. (1999). Estudios In vivo Trichorma
como agente biocontrol contra Phytophthora cinnamomi y Rosellinia necatrix en aguacate.
Revista Chapingo, 5: 261-265.
40
LÓPEZ, M. & TOMÁS, Y. (1999). Estudio medios cultivo sobre el crecimiento lineal y la
esporulación Phytophthora infestans. Fitosanidad, 3(3): 1562-1569.
LOZOYA, H., COYOTE, M., FERRERA, R. & LARA, M. (2006). Antagonismo microbiano contra
Phytophthora infestans. Agrociencia, 40:491-499.
MA, Y; CHANG, Z; ZHAO, J & ZHOU, M. (2008). Antifungal activity of Penicillium stratisporum
Pst10 and its biocontrol effect on Phytophthora root rot of chilli paper. Biological Control. 44(1):
24-31.
MARTÍNEZ, E. & OSORIO, J. (2007). Estudios preliminares para la producción un
biosurfactante bacteriano activo contra Phytophthora infestans (Mont.) Bary. Revista Corpoica –
Ciencia y Tecnología Agropecuaria, 8 (2): 5-16.
MARTINS, A; LOUSADA, J; BRANCO, I &CAETANO, P. (2006). Factores Edafo-ambientais
asociados ao clínio Quercus sube rem Portugal: Tentativa Intificaçao e dificuldas encontradas.
Silva Lusitana. 14(2): 155-167.
MICHELENA, G., ALMEIDA, G., ALTUNA, B., SILVANO, F., OLIVEIROS, M. & ARMENTEROS,
S. (2005). Efecto inhibidor del ácido jasmónico sobre el crecimiento bacterias y hongos.
ICIDCA, 39 (3): 3-7.
MICROKIT, L. (2003). Estudio sobre la caducidad los medios cultivo preparados herméticos.
Técnicas laboratorio, 284: 686-691.
MIERAU, V; STERNER, O & ANKE, T. (2004). Two new biologically active cyclopentenones
from Dasyscyphus sp. A47-98. 57(5): 311-315
MILLER, G. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent of termination of reducing sugar,
Analytical chemistry.1959, 3: 426-428.
MONSALVE, Z., MONSALVE, M., URREA, A. & ZAPATA, J. (2012). Expresión diferencial
durante la interacción Solanum tuberosum – Phytophthora infestans. Revista Colombiana
Biotecnología, 14 (1): 77-92.
MORENO, J. (1996). Problemática l cultivo papa en Cundinamarca y Boyacá. En: Papas
colombianas con el mejor entorno ambiental. Comunicaciones y Asociados Ltda. Bogotá, p. 93-
102.
MUKHOPADHAYAY, T; ROY, K; SAWANT, S; SHMUKH, S; GANQULI, B & FEHLHABER, H.
(1996). On an unstable antifungal metabolite from Trichorma koningii. Isolation and structure
elucidation of a new cyclopentenone rivative (3-Dimethylamino-5-hydroxy-5-vinyl-2-cyclopenten-
1-one). Journal Antibiot. 49(2): 210-221
NEWBOLD, C.J. & YAŇEZ-RUIZ, D.R. (2012). Effect of bromochloromethane on methane
emission, rumen fermentation pattern, milk yield, and fatty acid profile in lactating dairy goats. J.
Dairy Sci. 95: 2027–2036
OCHOA, J. HERNÁNZ, L. LATISNERE, H. LEÓN, J & LARRAL, C. (2007). Aislamiento e
intificación hongos patógenos naranja (Citrus sinensis) cultivada en baja California Sur,
México. Ciencia y Tecnología Alimentaria. 5 (005): 352-359
OLIN, J. (2012). Antifungal Treatment of Nails. Humco Holding Group, Inc. Patent No: US
8,333,981 B2.
OYARZUN, P., & TAIPE, J. & FORBES, A. (2001). Phytophthora infestans characteristics and
activity in Ecuador: country profile. Proceedings of the International Workshop on
Complementing Resistance to Late Blight (Phytophthora infestans) in the Ans, 15-26.
41
PARÉS, R. & JUÁREZ, A. (1997). En Bioquímica los microorganismos (págs. 324-327). Sevilla,
España: Reverté S.A.
PÉREZ, L. (2005). BASES MOLECULARES L CONTROL BIOLÓGICO FITOPATÓGENOS.
EXPERIENCIA CHILENA. En J. Montealegre, Control biológico e integrado enfermedas y
nematodos en frutales y hortalizas (págs. 10-16). Santiago Chile, Chile: Universidad Chile.
PÉREZ, W & FORBES, G. (2008). Manual Técnico l Tizón tardío la papa. Centro Internacional
la papa. Lima, Perú, p. 21-31.
PITT, J & HOCKING, A. (2009). Fungi and Food Spoilage. Third Edition.
PRADA, H., ÁVILA, L., SIERRA, R., BERNAL, A. & RESTREPO, S. (2009). Caracterización
morfológica y molecular l antagonismo entre el endófito Diaporthe sp. aislado frailejón
(Espeletia sp.) y el fitopatógeno Phytophthora infestans. Revista Iberoamericana Micología,
26(3): 198-201.
PRINCE, H; GRUNBERG, E; TITSWORTH, R & LORENZO, W. (1969). Effects of 1-mwthoxy-
2propanol and 2-methyl-5nitroimidazole-1ethanol against anaerobic and aerobic bacteria and
protozoa.
RAPER KB & THOM C. (1949). Manual of the Penicillia. Williams & amp; Wilkins, Baltimore.
RIVERO, D., CRUZ, A., MARTÍNEZ, A., RAMÍREZ, M. & RODRÍGUEZ, A. (2009). Actividad
antifúngica in vitro la quitosana Sigma frente a hongos fitopatógenos causantes l manchado l
grano en el cultivo arroz (Oryza sativa L.). Fitosanidad, 13(2): 101-108.
RODRÍGUEZ, M. (2001). Biodiversidad los hongos fitopatógenos l suelo México. Acta
zoológica Mexicana. 1: 53-78.
RUAN, Y; JIN, L; HE, J; YANG, S; BHADURY, P; HE, M; WANG, Z & SONG, B. (2011).
Synthesis and antifungal activity of new 1-(2,4-dichlorophenyl)-3-aryl-2-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)
prop-2-en-1-one rivatives. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 5(5): 602-607.
SÁNCHEZ, C & OLIVARES, T. (2013). Una mirada a los organismos fúngicos: Fábricas
versátiles diversos metabolitos secundarios interés biotecnológico. Química Viva. 12 (2): 6-13
SHAW, D. (1991). Genetics. Plant Pathology, 7: 131-168.
SKOET, J. E. (2012). El estado mundial la agricultura y la alimentación. Roma, Italia: FAO.
SOSA, A; GALINDO, J & BOCOURT, R. (2007). Metanogénesis ruminal: Aspectos generales y
manipulación para su control. Revista Cubana Ciencia Agrícola. 41 (2): 105-114
STEFANOVA, M; LLEIVA, A; LARRINAGA, L & CORONADO, M. (1999). Actividad metabólica
cepas Trichorma spp. para el control hongos fitopatógenos l suelo. Rev Fac Agron. 16: 509-
516
SYEDA, F; HABIB, U; CHOUDAHRY, M & ATTA, R. (2011). Gas Chromatography-Mass
Spectrometry (GC-MS) analysis of petroleum ether extract (oil) and bioassays of cru extract of
Iris germanica, International Journal of Genetics and Molecular Biology. 3(7): 95-100.
TRIGOS, A; RAMÍREZ, K & SALINAS, A. (2008). Presencia hongos fitopatógenos en frutas y
hortalizas y su relación en la seguridad alimentaria. Revista Mexicana Micología. 28: 125-129.
VARGAS, A., QUESADA, L., CÉSPES, M., CARREÑO, N., GONZÁLEZ, A., ROJAS, A. &
BERNAL, A. (2009). Characterization of Phytophthora infestans populations in Colombia: First
Report of the A2 Mating Type. Phytopathology, 99 (1): 82-88.
42
VENTUROSO, L; ARRUDA, L; LUIZ, W; APARECIDA, L; ALVARO, B & BERGAMIN, A. (2011).
Activida antifúngica extratos vegetais sobre o senvolvimento fitopatógenos. Summa
Phytopathologica. 37 (1): 18-23.
WRIGHT, J. (2003). Environmental chemistry. Ed. Routledge. New York, USA.
XIAOYUN, L., HU, T., & CAO, K. (2007). Biological characteristics of strain F603 of Epicoccom
sp., an antagonistic fungus for controlling Phytophthora infestans. Frontiers of Agriculture in
China, 1(2): 175-178.
XIUFEN, Y., QIU, D., YANG, H., LIU, Z., ZENG, H. &. (2011). Antifungal activity of
xenocoumacin 1 from Xenorhabdus nematophilus var. pekingensis against Phytophthora
infestans. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 27(3): 523-528.
YANAR, Y., KADIOGLU, I., GOKCE, A., RMITAS, I., GOREN, N., & CAM, H. (2011). In vitro
antifungal activities of 26 plan extracts on mycelial growth of Phytophthora infestans. African
Journal of Biotechnology, 10(14): 2625-2629.
43
ANEXO 1
(a y b) Características macroscópicas y (c y d) microscópicas
Trichorma CV29NS sp.
ANEXO 2
Anverso la colonia Penicillium sp. A14CVSF13 (b). Reverso la colonia Penicillium sp. A14CVSF13 (c y d). características microscópicas Penicillium sp. A14CVSF13
44
ANEXO 3
a. Cromatograma la cromatografía gases acoplada a masas
columna polar HP Innowax 60mx50mmx0,25µm
45
COMPUESTO ESTRUCTURA MOLECULAR ABUNDANCIA
Bromochloromethane
http://webbook.nist.gov
9.237
1-Methoxy-2-propanol
http://webbook.nist.gov
11.090
1-Ethoxy-2-propanol
http://webbook.nist.gov
12.046
2-Cyclopenten-1-one
http://webbook.nist.gov
33.627
1,2-Benzenedicarboxylic acid, mono(2-ethylhexyl) ester
http://webbook.nist.gov
35.464
1(3,4dimethoxyphenyl) ethanone
http://webbook.nist.gov
42.978
b. Nombres, estructura y abundancia los compuestos hallados en la cromatografía gases acoplada a masas
46
ANEXO 4
Ausencia crecimiento P. infestans en PDA (a) y en Czapek (b),
spués ocho días incubación.
