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10/10/2009
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Imunodiagnóstico: Infecções Virais
Valdirene Leão Carneiro
Diagnóstico Laboratorial das Infecções ViraisInfecções Virais
Isolamento Viral por cultura;
Detecção de Antígenos virais;Microscopia eletrônica e IFD;
Amplificação do Ácido Nucléico;
Técnicas de Imunoensaios:Detecção de Antígenos;Detecção de Anticorpos.
Aspectos Gerais e Diagnósticos das Infecções Virais
Importantes em nosso meioImportantes em nosso meio
VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA
HUMANA - HIV
Origem do HIV
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HIV
Família: Retroviridae
Gênero: Lentivirus
Tipos: HIV-1 e HIV-2Subtipos: A a J (Grupo M)
(Grupo N e O)
HIV
Cronologia:1983: Foi descoberto1984: Testes de ELISA1986: Entrada através do CD41986: Outro tipo de HIV1986: Outro tipo de HIV1987: Zidovudina (transcriptase reversa)1994: AZT diminui transmissão vertical1995: Inibidores de proteases1996: Entrada também com quimiocinas1997: Macrófagos e Linfócitos em latência1998: Diminui mortalidade => doenças metabólicas1999: Cepas resistentes as novas drogas2005: Começa a aparecer em países pobres
AIDS ????
• Conceito:
“ Corresponde ao estágio final da infecção pelo HIV-1 e/ou HIV-2, quando as manifestações clínicas de uma severa imunodeficiência são observadas pela incapacidade do paciente em controlar infecções oportunistas e processos neoplásicos.”
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Figure 11-20 Figure 11-21
Ligação a Receptores Figure 11-30
HIV - Infecção
Fase Aguda:Manifestações clínicas de um resfriado comum.
Fase de Latência:Fase de Latência:Teste anti-HIV positivo.
AIDSDestruição das células imunes leva a falência imunológica.
HIV
Vias de transmissão:
Contato sexual;
Sangue e derivados;
Da mãe infectada para a criança (intraparto, congênita, amamentação etc)
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Risco médio de transmissão do HIV
Tipo de Exposição Risco Médio
Relação sexual (1 vez) 0,01-1,0%
Uso droga injetável (1vez) 0 5-1 0%Uso droga injetável (1vez) 0,5 1,0%
Aleitamento materno 12%
Sangue contaminado 90%
Transmissão ocupacional < 0,03%
Diagnóstico Laboratorial - HIV
Determinação sorológica de Acs circulantes (Anti-ç g (env, gag e pol);
Detecção e quantificação de Ags virais (p24).
• Pesquisa de Anticorpos (HIV I e II):
– ELISA (indireto, competição)– Detecção de Acs anti-HIV e Agp24
Diagnóstico Laboratorial - HIV
Detecção de Acs anti-HIV e Agp24– Quimioluminescência, Eletroquimiolumin.– Micropartículas de Gelatina– Testes rápidos – IFI– Western-Blotting (Immunoblotting).
Antígenos dos ensaios:
P24 41 / 120 (A bi t
Diagnóstico Laboratorial - HIV
P24, gp41 e/ou gp120 (Ags recombinantes ou peptídeos sintéticos);Apenas HIV-1 ?????HIV-1 (grupo O e M) e HIV-2.
Western-Blotting ou Immunoblot- HIV
Western-Blotting - HIV
PROTEÍNAS DO VÍRUS HIV 1:
ENV: GP160, GP110/120 e GP41
POL: P68, P52 e P34
GAG: P55, P40, P24/25 e P18
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PADRÃO DE INTERPRETAÇÃO
NEGATIVO:Ausência de bandas específicas do vírus ou presença de P 18 apenas
Western-Blotting - HIV
apenasPOSITIVO:
2 ENV +/- GAG +/- POLINDETERMINADO:
1 ENV +/- GAG +/- POL ouGAG + POL ouGAG (exceto P18) ou POL
Western-Blotting - HIV
WesternWestern--Blotting Blotting -- HIVHIV
Ferreira et al, 2001 Imunoensaios, Vaz et al, 2007
Imunoensaios, Vaz et al, 2007
Acompanhamento do paciente com AIDScom AIDS
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Detecção qualitativa e quantitativa do vírus no sangue:
Carga viral: Técnicas de amplificação do RNA viral
Exames de Seguimento
Níveis de células CD4+ e CD8+:Concentração de células CD4+ inversamente proporcional a carga viral.
CITOMETRIA DE FLUXO
PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO
CITO METRIA FLUXO
Célula Medida Movimento
HEPATITES VIRAIS
Hepatites virais
• Diagnóstico Laboratorial:• Testes sorológicos = “Marcadores Imunológicos”;
• Técnicas de Biologia Molecular = Confirmação da infecção viral em casos duvidosos;
• Métodos Bioquímicos = Avaliar o tipo e o grau do comprometimento hepático, cura, cronicidade e eficácia terapêutica
Características e Diagnóstico Laboratorial
das Hepatites (A-E)
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Principais características das hepatites virais
Hepatite A Hepatite B Hepatite C Hepatite D Hepatite E
Agente etilógico
HAV HBV HCV HDV HEV
Período de incubação ( )
2 - 7 6 - 16 6 - 12 2 - 16 2 - 8(semanas)
EnvelopeNão Sim Sim Do HBV Não
Genoma (no. Nucleotídeos)
RNA (7900)
DNA (3200) RNA (9400) RNA (1700)
RNA (7600)
FamíliaPicornavi-
ridaeHepadna-
viridaeFlaviviridae ? Calciviridae
Ferreira et al, 2001
Principais características das hepatites virais
Vias de transmissão
Hepatite A Hepatite B Hepatite C Hepatite D Hepatite E
Fecal-oralSim Não Não Não Sim
Não Sim Sim Sim NãoParenteral
Sexual e Vertical
Não Sim Pouco freqüente
? Não
Formas crônica
Não Sim (5%) Sim (70%) - Não
Triagem sorológica doadores
Não AgHBs Anti-HCV Não Não
Vírus da Hepatite A
• Marcadores Sorológicos: Anti-HAV G e M;
• Anti-HAV IgM patognomônico;
Vírus da Hepatite A
• Anti-HAV IgG Estudos soroepidemiológicos;
• Recuperação da doença, sem reinfecção;
• Metodologias utilizadas ELISA, QL, EQL…
• Biologia Molecular Fezes.
Vírus da Hepatite A
Ferreira et al, 2001
Vírus da Hepatite A
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Vírus da Hepatite B
Resposta dos LTCs elimina o vírus
• Período de incubação: 6 a 8 semanas;
• Presente no sangue Fase aguda, convalescença e forma crônica;
Vírus da Hepatite B
• Transmissão pelo sangue e agulhas muito eficaz;
• Recuperação sorológica, bioquímica e clínica: 93%;
• Formas crônicas 5%;
• Hepatite fulminante 1%.
• Marcadores Imunológicos:
• a) AgHBs;• b) Anti-HBS;
Vírus da Hepatite B
• c) Anti-HBc G e M;• d) AgHBe;• e) Anti-HBe.
Outros marcadores a nível de investigação
Vírus da Hepatite B
Ferreira et al, 2001
• Cronologia dos marcadores imunológicos:• Primeiro....
S d
Vírus da Hepatite B
• Segundo ....• Terceiro .....• Quarto ..........• Quinto ............• Sexto ...............
• AgHBs > 6 meses forma crônica;
• AgHBs e AgHBe > 6 meses prognóstico
Vírus da Hepatite B
AgHBs e AgHBe 6 meses prognóstico de maior gravidade com alta replicação viral.
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Vírus da Hepatite B
Ferreira et al, 2001
• Biologia Molecular:
C fi d id
Vírus da Hepatite B
• Confirmar casos duvidosos;• Várias metodologias.
• Gênero Hepacivirus ; Família: Flaviviridae
• Fita única de RNA e 9500 nucleotídeos
Vírus da Hepatite C
9500 nucleotídeos (Weine et al, 1991)
• Genótipos e Subtipos: 1a, 1b, 2a, 3a... (Simmonds et al, 1994)
• Quasiespécies : Extensa variabilidade
Recuperação
Estável
HepatiteCrônica
InfecçãoAguda
Estável
Vírus da Hepatite C
Cirrose
Mortalidade (Cirrose, CHC)
20–30 anos
• Hepatite não-A e não-B ( 90%);
• Transmissão pós-transfusional, agulhas contami-nadas, transplante de órgãos etc;
Vírus da Hepatite C
nadas, transplante de órgãos etc;
• Transmissão sexual e vertical rara;
• Ocorre de forma esporádica sem que se possa determinar a forma de infecção.
Vírus da Hepatite CVírus da Hepatite C
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• BIOLOGIA MOLECULAR
• A PCR é o “ gold standard test” no diagnóstico da hep. C;
• Metodologias: Branched DNA e RFLP;
Vírus da Hepatite C
• Metodologias: Branched- DNA e RFLP;
• PCR (Qualitativo, Quantitativo e Genotipagem)
• Confirmação do resultado e acompanhamento do tratamento.
Vírus da Hepatite D
Vírus da Hepatite D
• Prevalência no Brasil? Bahia? Mato Grosso?
• Semelhante a HAV;
Vírus da Hepatite E
• Gestantes pode ser perigoso;
• Marcadores imunológicos: Anti-HEV G eM?
• IFD em hepatócitos infectados: Fase aguda.
• Hepatites não-A-E;
• Hepatites não-A e não-B (90% E e C);
Outras Hepatites
p ( )
• Hepatite F? Hepatite G? (os outros 10%).
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HTLV – Vírus linfotrópico humano para células T.
• Família => Retroviridae;Família Retroviridae;
• Infecta células do sistema imunológico humanodenominadas linfócitos T.
• Existem basicamente dois tipos de HTLV, oHTLV-1 e o HTLV-2.
HTLV
• HTLV-I que está implicado em doençaneurológica e leucemia.
• HTLV-II, o tipo 2, que está poucoevidenciado como causa de doença.
HTLV
HTLV - I HTLV - II
Como se pega o HTLV ?
– Recebendo transfusão de sanguecontaminado pelo vírus;
Compartilhando agulhas seringas ou objetos– Compartilhando agulhas, seringas, ou objetoscortantes;
– Aleitamento materno;
– Relação sexual, não protegida.
Prevalência do HTLV-I
• Endêmico no Japão, Caribe, África, América doSul e ilhas da Melanésia;
• Estima-se que 15 a 20 milhões de pessoastã i f t d l HTLV I destão infectadas pelo HTLV-I no mundo.
• HTLV-I => presente em todas as regiõesbrasileira;
• Prevalência elevada => Bahia, Pernambuco ePará;
• Brasil possui o maior número absoluto deindivíduos infectados no mundo.
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Prevalência do HTLV-I Doenças causadas pelo HTLV?
Maioria dos pacientes assintomáticos;Leucemia/linfoma de células T do adulto;Mielopatia associada ao HTLV-1 => doençacausada por uma inflamação na medula espinhalcausada por uma inflamação na medula espinhalprovocada pelas células infectadas pelo HTLV-1.
Mielopatia associada ao HTLV-I
Os sintomas mais comuns da mielopatiaassociada ao HTLV-1 são:Fraqueza nas pernas;
Rigidez, endurecimento dos músculos das pernas;
Problemas para controlar a urina;
Pele muito seca, boca e olhos secos;
Dormências, formigamentos, dores, sensação dequeimação nos pés ou nas pernas; dores nasarticulações.
Diagnóstico do HTLV-I e II
• Sorológico:Triagem => Aglutinação em látex, EIA (lisados viraise proteínas recombinantes);Confirmatórios => Western-Blotting e IFI.Confirmatórios Western Blotting e IFI.
• Molecular:Confirmar casos indeterminados;Discriminar entre HTLV-I ou II.
Interpretação do WB
• Soropositivos => Anticorpos contra antígenos do core (anti-p24) e anti-glicoproteínas do env (r21, gp46 ou gp61);gp46 ou gp61);
• Indeterminados => Padrão de reação diferente do citado acima;
• Negativo => Ausência de bandas.