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INFECÇÕES BACTERIANAS

IMUNODIAGNÓSTICO da SÍFILIS

Profa. Alessandra PardiniImunologia Clínica

IMUNODIAGNÓSTICO DAS INFECÇÕES BACTERIANAS

Infecção Bacteriana: tempo para resposta imune X tempo para ação

patogênica

Diagnóstico Microbiológico é confirmatório e permite antibiogramas

(demorado)

1 - TOXINAS

2 - CÁPSULAS

3 - INTRACELULAR

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BACTÉRIAS INTRACELULARES

Mycobacterium tuberculosis, M. leprae: tuberculose e hanseníase. Testes Intradérmicos de Hipersensibilidade tardia (formação de nódulo/pápula com ou sem eritema em 48-72 horas). Pouca ou nenhuma resposta humoral

Lysteria monocytogenes, Brucella abortus: conjuntivites e infecção intra-uterina. Fonte de infecção animais (suínos e bovinos). Difícil isolamento microbiológico. Testes Imunológicos para detecção de anticorpos.

Salmonella typhi, S. paratyphi A, B.

Antígeno flagelar (H) - proteínas. Anticorpos protetores IgG

Antígeno somático (O) - polissacarídeos. Anticorpos IgM

Antígeno Vi(multiplicação) - polissacarídeos. Anticorpos IgM persistentes

Infecção Recente: Ac anti-O e anti-Vi

Infecção Pregressa ou vacina: anti-H com ou sem anti-Vi

Portador crônico: anti-O e anti-Vi

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BACTÉRIAS TOXIGÊNICAS

Único Fator de Virulência:

Clostrideos (C. tetani, C. botulinum, C. perfingens, C. diphtheriae)

Testes Imunológicos para estudo e produção de soros e vacinas)

Anticorpos neutralizantes de toxinas (Soroterapia e após imunização

com toxóides)

C. diphtheriae: Teste de SCHICK. Inóculo da toxina, se houver Ac

neutraliza a ação necrosante da toxina

Vibrio cholerae: imunizar grupos de risco

Também há testes imunológicos que detectam e quantificam as toxinas

(usam anticorpos poli- e monoclonais)

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Principal Fator de Virulência:

Bordetella pertussis: vacinas e soros

Staphylococcus aureus: não produz imunidade protetora

Streptococcus beta hemolítico: grupos A (mais importante), B, C, D, F, G

Enzimas degradadoras: hialuronidase, estreptoquinase, DNAse, NADse, Polissacaride A . Grupo A:

toxinas O, S (citopáticas e inibem macrófagos)

Anti-SLO = ASLO (streptolisina O): anticorpos produzidos na vigência de infecções crônicas . ASLO

(por semelhança antigênica?) pode ligar-se a fibras do sarcolema cardíaco, induzindo auto-

imunidade (febre reumática)

Imunocomplexos SLO-ASLO podem depositar-se no endotélio dos glomérulos e por

hipersensibilidade tipo III (citotoxicidade mediada por imunocomplexos) causar

glomerulonefrites

Controle do nível de ASLO para evitar essas consequências

Dosagem de ASLO: nefelometria ou inibição de imuno-hemólise

SLO lisa hemácias de carneiro. ASLO inibe essa ação. AX, PARDINI

DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DA SÍFILIS

Treponema pallidum

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Característica

Doença infecto-contagiosa

DST (doença sexualmente transmissível)

Sistêmica de evolução crônica

Manifestações cutâneas temporárias

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SÍFILIS – Treponema pallidum

- causada pelo Treponema pallidum (Ordem Spirochaetales, Família Treponemataceae)- Espiroquetas delicadas (5-15m x 0,09-0,20m), 6-24 espirais (média 14)- Corpo envolvido por duas membranas entre as quais se enrola umfilamento helicoidal fibrilar, inserido nas extremidades (filamento axial)- Motilidade: contração das espirais para frente e para trás com rotação contínua- Não cultiváveis. Mantido por inoculação em testículo de coelho- Constituintes externos, envelope (específicos): proteínas, lipídeos e poliosídeos- Parede celular: ácido murâmico, glicosamina e ornitina- Membrana citoplasmática: proteínas e fosfolípides (inespecíficos)

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Transmissão

Sífilis:

Contato direto com tecido íntegro ou com lesões .

Sífilis congênita:

Via hematogênica a partir do 4º mês de gravidez.

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Transmissão- contato direto com pele, mucosa ou tecidos íntegro ou lesados- sexual- parenteral- vertical- inoculação

cancro mole (Haemophilus ducreyi)Cancro duro: ulceração indolor, de bordas endurecidas acompanhada de linfadenopatia regional.

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Patogenia- T. pallidum é invasivo- A resposta celular local forma o cancro ou proto-sifiloma- Os treponemas, via linfática, alcançam a correntesangüínea- Resposta imune-inflamatória lenta e progressiva: lesões teciduais

Imunidade na sífilis pode variar de acordo com as fases da infecção

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Resposta Humoral: Ac (IgG, IgM, IgA, IgE) específicos (inclusive imobilizadores) e inespecíficos, imunidade passiva em experimentos animais, resistência parcial à reinfecção.

Resposta Celular: lesões do tipo hipersensibilidade tardiaFatores Supressores: material mucopolissacarídico da cápsula do T. pallidum,

observação experimental.Cicatrização Espontânea: Ac, ly e mucopolissacaridase bloqueando adesão do treponema aos tecidos + processo inflamatório.

FASES CLÍNICAS EVOLUTIVAS- crônica em quatro estágios distintos- flutuação entre sintomática (curtos) e assintomática (longos)

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Tipos de sífilis:

Primária

Secundária

Terciária

Latente

Decaptada

Congênita

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SÍFILIS PRIMÁRIAT. pallidum penetra no hospedeiro através da mucosa íntegra multiplica-se - vasos linfáticos - corrente sangüínea – disseminação- após incubação de 10 a 90 dias (média 21 dias): proto-sifiloma, lesão primária (local da inoculação), geralmente única e indolor e reação ganglionar satélite- cancro: base lisa, bordas salientes, firmes e endurecidas (material mucóide com sulfatação do ácido hialurônico) a cicatrização da lesão é espontânea (resposta imune-inflamatória) em 3 a 6 semanas- Anticorpos são detectados concomitante ou até 2 semanas após o início da lesão- Isolamento e identificação: microscopia de campo escuro (S=95%) (visualização direta do espiroqueta) a resolução e cura do cancro está associada a um influxo maciço de macrófagos, ao que segue fagocitose e digestão dos organismos

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Sífilis Primária

Incubação: ± 21 dia

Lesão primária: geralmente única e indolor, reação ganglionar satélite.

Anticorpos: são detectados duas semanas após início da lesão.

T. pallidum penetra na mucosa íntegra multiplica-se vasos linfáticos corrente sangüínea disseminação

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Sífilis Primária

P.E.-CRT-DST/AIDS

SÍFILIS SECUNDÁRIA- mesmo havendo um aparente controle inicial da infecção pela imunidade humoral e celular, a doença torna-se generalizada- surge após 6-8 semanas da cura da lesão primária- lesões disseminadas (pele, mucosas, fígado, baço, rim, coração, ossos,

articulações)- lesões cutâneas: papulares, maculosas, pápulo-escamosas, pustulares e nodulares (não há prurido)- manifestações clínicas: mal-estar, anorexia, cefaléia, artralgia, febre e

linfadenopatia- Síndrome nefrótica moderada ou nefrite hemorrágica: deposição de

imunocomplexos- pode ser isolado o Treponema: lesões, sangue, LCR, leite materno

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Sífilis Secundária

Erupções cutâneas

Surge após 6-8 semanas da cura da lesão primária

lesões disseminadas (pele, mucosas, fígado, baço, rim, coração, ossos, articulações)

manifestações clínicas: mal-estar, anorexia, cefaléia, artralgia, febre e linfadenopatia

Síndrome nefrótica moderada ou nefrite hemorrágica: deposição de imunocomplexos.

Sífilis Secundária

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Diagnóstico

Pesquisa em Campo Escuro 1) coleta do material: deve ser realizado cuidadosamente, removendo-se

a camada de material que recobre a lesão;2) encostar a lâmina meio mais definitivo de diagnóstico é feito pelo

achado de espiroquetas móveis e de morfologia típica em lesões da sífilis adiquirida recente ou congênita positivo para sífilis primária, nas lesões úmidas da sífilis secundária e congênita

- um único resultado negativo é insuficiente para excluir o diagnóstico porque sabões e outras coisas que os pacientes passam no cancro falseiam o resultado

Pesquisa em Campo Escuro - coleta – após remoção do material que recobre a lesão

- diagnóstico - espiroquetas típicas em lesões – outras

- Positivo: lesões de sífilis primária, secundária (úmidas) e congênita

- Negativo: falso- negativo – sabão

- Sensibilidade: 80%

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Microscopia de campo escuro Imunofluorescência direta (IFD).

Sífilis - diagnóstico

reação específica de antígeno – anticorpo, com uso

de soro hiperimune anti-treponema marcado com

isotiocianato de fluoresceína.

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Testes sorológicos

Não Treponêmicos

Cardiolipídicos

Ac anti-lipídicos

Treponêmicos

Ac anti-treponema

VDRLFTA-ABS

ELISAMicroaglutinação

Sífilis Secundária - diagnóstico

VDRL: Teste de floculação, composto de cardiolipina, colesterol e lecitina.

Sífilis - diagnóstico

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VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)- RPR (Rapid Plasm Reagin) - suporte: cristais de colesterol - Ag: cardiolipina - placas escavadas- Uso: pesquisa de reaginas

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Reação negativa

Reação positiva

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Testes Não Treponêmicos – Testes de Cardiolipina Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) Rapid Plasma Reagin (RPR)- Utilizam como antígeno fosfolípide (extrato do coração de boi) são

testes cujos antígenos são cardiolipina, colesterol e lecitina geralmente empregados para TRIAGEM da sífilis revelam a presença de REAGINAS (anticorpos naturais) – embora encontrem-se em quantidades diminutas, na sífilis atingem altos níveis evidenciam anticorpos chamados reaginas, presentes no soro de pessoas com sífilis e, ocasionalmente, em soros de outras pessoas com doenças agudas ou crônicas e, também, em condições fisiológicas (gravidez) fácil realização, econômicas, reprodutíveis, simples, baratos

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RPR (Rapid Plasma Reagin - Reagina Plasmática Rápida)- antígeno é reparado com uma suspensão de antígeno de VDRL modificada que contém cloreto de colina (elimina a necessidade aquecer soro); EDTA (para aumentar a estabilidade da suspensão); partículas muito finas de carvão (agente de visualização/melhora a visualização)

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Resultados:Reagente (floculação): as partículas de carvão se coaglutinam com os anticorpos e aparecem grumos negros / deve ser quantificadaNão-Reagente: não há anticorpos presentes, a mistura fica com cor cinzenta

uniforme reações falso-positivas e falso-negativas: Falso-positivo: erros, gravidez, no curso de doenças agudas tais como viroses

diversas, tuberculose malária, etc., ou crônicas como artrite reumatóide, lúpus Falso-negativo: erros, fenômeno de pró-zona (excesso de reaginas)

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FTA-ABS Sífilis - diagnóstico

Técnica de imunofluorescência indireta -

pesquisa de anticorpo

Interação Ac específicos do soro - Ag treponêmicos pré-fixados em

lâmina de microscopia.

Revelação anti-IgG/IgM humana marcada com isotiocianato de

fluoresceína (fluorocromo)

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Testes Treponêmicos – confirmação dos resultados dos testes de cardiolipina(a) FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibody Absorption) – para a pesquisa de anticorpos IgM e IgG- são testes mais específicos pois utilizam antígenos do T. pallidum,

obtidos de testículos de coelho empregam como antígeno o T. pallidum vivo ou morto

- diagnóstico da sífilis congênita - (FTA-IgM) e a avaliação do período de doença (FTA-IgG em infecções

passadas)- diagnóstico confirmatório- alta especificidade e sensibilidade

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FLUORESCÊNCIA

Micro - hemaglutinação para Treponema pallidum - hemaglutinação indireta baseada na aglutinação de eritrócitos de

carneiro, sensibilizados com antígeno Treponema pallidum - cepa Nichols

- simples, não exige quipamento- reação-cruzada: soro diluído com diluente absorvente para eliminar

possíveis anticorpos heterófilos de reação cruzada (anticorpos dirigidos contra as hemácias do carneiro)

- reação positiva: “tapete” - reação negativa: botão compacto - sensibilidade e especificidade são comparáveis às do FTA-ABS

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Micro-hemaglutinação

Sífilis - diagnóstico

Reação de aglutinação de eritrócitos sensibilizados com Ag do

T. pallidum - soro Ac anti-T. pallidum.

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HEMAGLUTINAÇÃO

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ELISA IgM e IgG- antígenos treponêmicos são fixados em pocinhos e realiza-se a detecção de anticorpos específicos - IgM: de preferência ELISA captura para IgM, ou remover a IgGdetecção da IgM é muito importante na sífilis congênita

Raio-X de Ossos Longos- demonstra alterações ósseas compatíveis com periostite, osteíte e osteocondrite

SÍFILIS CONGÊNITA- Gestantes com sífilis não tratada, em especial na 16a - 18a semana.- Pode manifestar-se de forma precoce, ao nascimento, semelhante à fase

secundária: com lesões mucocutâneas, linfadenopatia difusa, hepatoesplenomegalia, lesões oculares, comprometimento renal e do SNC.

Ou tardiamente, após 2 anos de idade: neurosífilis, surdez, comprometimento vascular, fronte olímpica, nariz em sela, tíbia em sabre, dentes de Hutchinson.

- Dificuldades diagnósticas: anticorpos maternos (IgG), cerca de 40% dos casos de sífilis congênita evoluem para morte (fetal, nati ou neonatal) até 75% dos casos são diagnosticados após 10 anos de idade

(PNCDST/AIDS - MS, 1993): soropositividade em gestantes de 2,7 a 11,5% (lesões sifilíticas em 3,2% de placentas)

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Ocorre em qualquer fase da gestação Em qualquer estágio da sífilis materna.

Fatores: Tempo exposição Carga treponêmica e Virulência Tratamento Imunodeficiências

”Quanto mais tarde na gestação e mais precoce for a sífilis, maior o risco de infecção fetal”.

Sífilis congênita

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TRANSMISSÃO Vertical Canal do parto Aleitamento (?)

QUADRO CLÍNICOPrecoce - 2 anosTardia - 2 anos

Sífilis congênita

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1. Neonatal sintomática: corioretinite o sintoma mais comum no

recém-nascido;

2. Precoce: 1º. mês de vida (leve a grave)

3. Seqüela tardia: na infância ou adolescência (doença não

diagnosticada anteriormente)

4. Infecção sub-clínica.

Formas Clínicas da Sífilis congênita

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Sífilis congênita

Sífilis congênita

Sífilis congênita

Lesões ósseas de sífilis congênita: necrose de epífises.

SÍFILIS LATENTE- À medida que as lesões da sífilis secundária secundária involuem, inicia-se o estágio de latência- Anticorpos presentes e Sintomatologia ausente- Precoce (< 1-2 anos) e tardia- A fase latente precoce é considerada altamente infectante: alguns pacientes

apresentam reincidência de lesões mucocutâneas- Na fase latente tardia é possível a transmissão materno-fetal e por via

sangüínea- Na ausência de tratamento, os terponemas invadem o sistema nervoso central

e tecidos vasculares

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SÍFILIS TARDIA ou TERCIÁRIA- Não é infectante. Compromete todos os órgãos (fase destrutiva). Pode manifestar-se: - sífilis latente benigna ou gomosa: 1-10 anos após o início da infecção (15%

dos pacientes não tratados) com lesões granulomatosas em olhos, ossos, viscerais (cardiovascular, fígado e SNC) e pele. Número pequeno de treponemas, sugerindo hipersensibilidade celular.

- sífilis cardiovascular: após mais de dez anos de infecção (10% dos pacientes não tratados). Vasculites e aneurismas graves.

neurossífilis: 3-35 anos após a infecção inicial pode haver comprometimento do SNC (8% dos pacientes não tratados).

- O diagnóstico precoce pode ser feito com exames do LCR.

Rx de ossos longos

Exame de líquido cefalorraquiano: RN

Leucócitos> 25 céls/mm proteinorraquia> 100 mg/dl

Pós-natalLeucócitos > 5 céls./mm Proteinorraquia > 40 mg/dl

VDRL positivo.

exames hematológicos e de função hepática.

Diagnóstico da Sífilis congênita

Triagem do RN

VDRL Seguimento do RN tratado/suspeita de infecção

Comparar títulos c/ mãe

Treponêmicos Confirmatórios e específicos

Diagnóstico da Sífilis congênita

Após os seis meses de vida, a criança com VDRL reagente deve ser investigada.

Testes treponêmicosSorologia reagente (IgG) após os 18 meses de idade define o diagnóstico

de sífilis congênita.

Negatividade sorológica no RN não exclui a infecção, especialmente quando a infecção materna se dá no período próximo ao parto.

Diagnóstico da Sífilis congênita

DEFINIÇÃO DE CASO

Exame do líquido céfalo-raquidiano (LCR) - Neurossífilis

- É necessário para detectar ou afastar a neurossífilis- - Alterações na contagem de linfócitos (>25 leucócitos/mm3); e na

dosagem de proteínas (>100 mg/dl) do recém-nascido (após o período neonatal, os valores são >5 leucócitos e >40mg/D1, respectivamente) associados ou não com VDRL reagente, definem o quadro, e pode

ocasionar lesões do sistema nervoso central – principalmente na sífilis tardia

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Prevenção - uso regular de preservativos- redução do número de parceiros sexuais- diagnóstico precoce- tratamento imediato dos casos diagnosticados

Tratamento - medicamentoso- cura, se tratado adequadamente- penicilina G/benzatina

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Observações: - orientar os pacientes para que evitem relações sexuais até que o seu

tratamento (e o do parceiro) se complete; uso de preservativo; realizar controle de cura trimestral através do teste não treponêmico quantitativo; tratar novamente em caso de quadruplicação dos títulos (ex.: de 1/2 para 1/8)

- se não for tratada pode causar danos permanentes no cérebro, no coração e outros problemas de saúde a longo prazo no caso de gestantes pode causar sérios problemas ao recém-nascido incluindo a morte a presença de úlceras pode facilitar a transmissão de outros vírus como o VIH e hepatites B e C

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Testes de acordo com a fase

95-100%88-

100%

96-100%88-

100%

100%88-100%

65-78%86-

100%

SE

MicroAglutinação

97-100%100%

97-100%100%

100%100%

92-100%100%

SE

FTA-abs

60-75%95-

100%

74-90%95-

100%

100%95-100%

70-80%95-

100%

SE

VDRLRPR

Terciária

Latente Secundária

PrimáriaÍNDICETESTES

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Agradecimento:Profa. Dra. Adriana De Brito, pelo material gentilmente cedidoProfa Ms. Cecília Toralles, pelo material gentilmente cedidoProfa. Ms. Paula Knox, pelo material gentilmente cedidoProfa. Dra. Adelaide José Vaz, pelo material gentilmente cedido FCF/USPProfa. Dra. Kioko Takei, pelo material gentilmente cedido FCF/USP

Bibliografia:FERREIRA & ÁVILA, Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças

Infecciosas e Auto-Imunes, Guanabara Koogan, 2003.VAZ et al., Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações, Guanabara

Koogan, 2007.Internet:Pesquisa na internet agosto de 2011