Impacto dos polimorfismos C677t e A1298c do gene MTHFR nos

PRISCILA QUEIROZ DÉLIA

IMPACTO DOS POLIMORFISMOS C677T E A1298C DO GENE MTHFR NOS RESULTADOS DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO EM

MULHERES BRASILEIRAS

Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde.

SÃO PAULO 2012

PRISCILA QUEIROZ DÉLIA

IMPACTO DOS POLIMORFISMOS C677T E A1298C DO GENE MTHFR NOS RESULTADOS DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO EM

MULHERES BRASILEIRAS

Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Tsutomu Aoki Co-orientadora: Profª. Dra. Denise Maria Christofolini

SÃO PAULO

2012

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

D’Elia, Priscila Queiroz Impacto dos Polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR nos resultados de Fertilização In Vitro em Mulheres Brasileiras / Priscila Queiroz D’ Elia. São Paulo, 2012.

Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Tsutomu Aoki Co-Orientador: Denise Maria Christofolini 1. Fertilidade 2. Reprodução 3. Injeções de esperma

intraplasmáticas 4. Poliformismo genético 5. Genes BC-FCMSCSP/56-12

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a Jesus Cristo, por sempre me sustentar e dar condições

de realizar meus sonhos.

Ao meu marido Eduardo, meu verdadeiro amor, companheiro, amigo e

confidente, que com todo carinho, dedicação e apoio me acompanhou em todos

os momentos. Foi sempre paciente e compreensivo e me deu todo suporte que

somente um verdadeiro homem pode dar.

A minha mãe e amiga Angela em quem me espelho como mulher por sua

garra e determinação, meu pai Dimas que sempre muito companheiro e amigo me

incentivou e torceu por minhas conquistas, meus irmãos Vanessa e Junior, super

especiais em minha vida que sempre me compreenderam e amaram dando cada

vez mais forças, aos meus cunhados Vânia e Thiago que sempre estiveram ao

meu lado me incentivando e torcendo por mais essa conquista.

A minha sogra Cecília que esteve por muitas vezes orando e intercedendo por

mim, me acolhendo sempre como uma filha, meu sogro Clóvis, meus cunhados

Alessandra e José Augusto e minha sobrinha Bianca que sempre torceram por

mim.

Aos meus amigos Cybele e Jimmy que compreenderam sempre minhas

ausências e estiveram sempre presentes quando precisei.

"...Sede fecundos, disse-lhes Ele, multiplicai-vos e enchei a terra.” Gênesis 9:1

AGRADECIMENTOS

Seria difícil expressar com palavras o quanto sou grata às pessoas que

me ajudaram na realização deste trabalho. Com certeza muitas pessoas

fazem parte desta conquista e a elas devo meu sincero agradecimento.

Agradeço primeiramente ao Rei dos Reis, Jesus, por ter me abençoado

sempre, me dando sabedoria e todas as condições de realizar mais esse

sonho em minha vida.

A Capes que financiou meus estudos na Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo durante esse tempo e acreditou em

minha vontade de ser pesquisadora. A FAPESP e CNPQ pelo incentivo a

pesquisa e estudo realizados.

A Faculdade de Ciências Médicas Santa Casa de São Paulo e a

Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo que me acolheram

como aluna em sua instituição de ensino.

Ao Prof. Dr. José Mendes Aldrighi, Professor Titular de Ginecologia do

Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo e diretor do Departamento de

Ginecologia e Obstetrícia (D.O.G.I.) da Irmandade da Santa Casa de

Misericórdia de São Paulo, pela oportunidade de realizar a pesquisa junto a

esse departamento.

Ao meu orientador Prof. Dr. Tsutomu Aoki, Chefe de Clínica de

Reprodução Humana no departamento de Ginecologia e Obstetrícia da

Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e Professor Adjunto

da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela

paciência, generosidade e profissionalismo sempre presentes e a quem tenho

profunda admiração pela força, humanismo e equilíbrio.

A Faculdade de Medicina do ABC e ao Instituto Ideia Fértil que fazem

um trabalho maravilhoso junto à população infértil, onde realizei esse estudo.

Ao Prof. Dr. Caio Parente Barbosa, Presidente do Instituto Ideia Fértil

na Faculdade de Medicina do ABC, que me acolheu em seu serviço, em um

momento que muito precisei, sendo sempre muito prestativo abrindo as portas

de seu serviço para que eu pudesse realizar essa pesquisa.

A Prof.ª Dra. Ângela Mara Bentes de Souza van Nimwegen,

Coordenadora de Ensino e Pesquisa do Instituto Ideia Fértil e Responsável

pelo Laboratório de Embriologia do Instituto Ideia Fértil pelo apoio sempre

prestados.

A minha co-orientadora Prof.ª Dra. Denise Maria Christofolini,

responsável pelo Laboratório de Citogenética da Faculdade de Medicina do

ABC - Instituto Ideia Fértil, que me ajudou imensamente com todo carinho e

compreensão sendo sempre disposta a me ajudar e a quem me espelho

como pesquisadora.

Ao Prof. Dr. Roberto Adelino de Almeida Prado, Chefe de Clínica pela

Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e

Professor Assistente da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de

São Paulo pela contribuição realizada durante a qualificação e banca de

defesa desta Tese de Doutorado.

Ao Prof. Dr. Thomaz Gabriel Miklos, médico especialista em

Reprodução Humana Assistida e Médico Segundo Assistente do

Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Irmandade da Santa Casa de

Misericórdia de São Paulo, pela participação e contribuição em banca de

qualificação e defesa desta Tese de Doutorado.

A Prof.ª Dra. Fabia Lima Vilarino, Pesquisadora da Faculdade de

Medicina do ABC, Médica preceptora do Hospital Estadual de Santo André e

do Centro de Reprodução Humana da Faculdade de Medicina do ABC, pela

gentileza de participar e contribuir durante a qualificação e defesa desta Tese

de Doutorado.

Ao Prof. Dr. Carlos Roberto Izzo, Médico Assistente do Centro de

Reprodução Humana Governador Mário Covas do Hospital das Clínicas da

FMUSP, Diretor da Originare - Centro de Reprodução Humana, pela

disponibilidade e contribuição na participação da banca de defesa desta Tese

de Doutorado.

Ao Prof. Dr. Newton Eduardo Busso, Professor Assistente da

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e Professor

Segundo Assistente da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São

Paulo, pela gentileza em contribuir com sua participação como suplente na

defesa desta Tese de Doutorado.

Ao Prof. Dr. Artur Dzik, Presidente da Sociedade Brasileira de

Reprodução Humana (SBRH) pelo apoio prestado através da participação

como suplente na defesa desta Tese de Doutorado.

Ao Prof. Dr. Vilmar Marques de Oliveira, Médico Segundo Assistente

na Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e Professor

Instrutor da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, por

aceitar participar como suplente na defesa desta Tese de Doutorado.

Ao Prof. Dr. Gilberto da Costa Freitas, Médico assistente da divisão de

reprodução humana do Centro de Referência da Saúde da Mulher Nutrição

Alimentação e Desenvolvimento e médico da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo, pela participação como suplente na defesa desta

Tese de Doutorado.

As minhas colegas de trabalho e a equipe que estiveram sempre

comigo e que participaram ativamente na coleta das amostras e realização

dos exames necessários para o trabalho: Ana Paula, Luciana, Juliana,

Caroline Lopes, Caroline Zulim e Aline.

A Equipe de Enfermagem e Equipe do Departamento de Genética que

sempre contribuíram direta ou indiretamente para essa pesquisa.

As pacientes que contribuíram muito para esse trabalho autorizando a

avaliação dos dados de seu tratamento.

A Equipe da Secretaria de Pós Graduação da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo, em especial a Mirtes que sempre

muito solicita me ajudou nos tramites burocráticos da pós-graduação.

A minha amiga Débora Rodrigues Lopes que me ajudou em um

momento em que precisei me dando oportunidade de conhecer o Instituto

Ideia Fértil.

De todo meu coração, agradeço todas as pessoas que contribuíram

direta ou indiretamente para realização deste trabalho, e que Deus abençoe

sempre suas vidas.

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ATP – Trifosfato de Adenosina

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

FF – Fluído Folicular

FSHr – FSH recombinante

ICSI – Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides

ISCA – Infertilidade Sem Causa Aparente

Mg - Miligramas

MI – Metáfase I

MII – Metáfase II

min – Minuto

mL – Mililitro

mM – milimolar

MTHFR – Metilenotetrahidrofolato redutase

NF - Não Fertilizado

ng – nanograma

PCR – Reação em Cadeia de Polimerase

PI - Prófase

PN – Pró-núcleo

RHA – Reprodução Humana Assistida

RNA – Ácido ribonucleico

rpm – rotação por minuto

SAH – S-adenosilhomocisteína

SAM – S-adenosilmetionina

SOP – Síndrome dos Ovários Policísticos

μL – microlitro

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO..................................................................................pg 01

1.1 Infertilidade ................................................................................ pg 01

1.2 Reprodução Humana Assistida...................................................pg 03

1.3 Importância do Folato................................................................. pg 05

1.4 O Gene MTHFR e os polimorfismos 677 e 1298 .......................pg 08

1.5 O Folato e a Fertilidade.............................................................. pg 13

2.OBJETIVO.........................................................................................pg 17

3.CASUÍSTICA E MÉTODOS..............................................................pg 18

3.1 Pacientes.................................................................................... pg 18

3.2 Métodos.......................................................................................pg 19

3.2.1 Coleta de história e exame físico....................................... pg 19

3.2.2 Método de indução folicular................................................pg 19

3.2.3 Oócitos, seleção embrionária e transferência embrionária.pg 20

3.2.4 Diagnóstico e evolução das gestações...............................pg 21

3.2.5 Coleta de sangue................................................................pg 21

3.2.6 Extração de DNA.................................................................pg 21

3.2.7 Genotipagem.......................................................................pg 22

3.2.8 Análise estatítica.................................................................pg 23

4.RESULTADOS..................................................................................pg 24

5.DISCUSSÃO.....................................................................................pg 55

6.CONCLUSÕES.................................................................................pg 65

7.ANEXOS...........................................................................................pg 66

8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................pg 78

FONTES CONSULTADAS...................................................................pg 90

RESUMO..............................................................................................pg 91

ABSTRACT..........................................................................................pg 92

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Infertilidade

A infertilidade é definida como a ausência de gestação espontânea, após

doze meses ou mais de atividade sexual regular e ausência de métodos

contraceptivos (ASRM, 2008). A inabilidade de procriar é frequentemente

considerada uma tragédia tanto pessoal como para o casal, impactando em

grande parte das vezes sobre a família e até mesmo em pessoas que convivem

com o casal (Bergstrom, 1992). Estimativas globais sugerem que cerca de 72,4

milhões de casais em idade fértil apresentam problemas de infertilidade e que em

aproximadamente 30% dos casos a causa de infertilidade está relacionada a

fatores femininos, em 30% a fatores masculinos, em 30% ambos os fatores estão

presentes e em 10% não apresentam causa aparente (Vigano et al., 2004;

Renner et al., 2006; Boivin et al., 2007). A infertilidade pode apresentar-se de

maneira primária ou secundária, sendo que casais com infertilidade primária são

aqueles que nunca conseguiram engravidar, enquanto que casais com

infertilidade secundária possuem dificuldades em conceber após gestação

anterior, seja esta por gestação a termo ou aborto (WHO, 1991).

Dentre as causas de infertilidade conhecidas, a idade da mulher é uma

das questões mais importantes a ser abordada. Sabe-se que a fertilidade

feminina parece decrescer com o passar dos anos, tendo um declínio aos 30

anos, acentuando-se aos 35 anos e quase desaparecendo aos 45 anos (West,

1987). Além disso, torna-se necessário a abordagem de alguns fatores

importantes como a frequência e tempo entre as relações sexuais, uso de

lubrificantes ou outros produtos que podem prejudicar a fertilidade (Wilcox et al.,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1644025

2

1995; Kutteh et al., 1996; Stanford et al., 2002). O tempo de infertilidade e o

histórico de fertilidade do casal e para cada parceiro individualmente também

precisam ser abordados, pois podem afetar o prognóstico e ajudam a determinar

a etiologia da infertilidade (Hull et al., 1985; WHO, 1993).

Além da idade, outras causas podem estar relacionadas à infertilidade

feminina como a obstrução ou ausência das tubas uterinas devido a processos

infecciosos e inflamatórios e a presença de fatores uterinos, destacando-se as

malformações mullerianas, miomas, pólipos, sinéquias e endometrites. Outros

fatores como o fator ovariano devido à síndrome dos ovários policísticos (SOP),

falência ovariana precoce e presença de cistos; alterações decorrentes do

comprometimento anatômico ou funcional do eixo hipotalâmico-hipofisário-

ovariano associado a distúrbios das glândulas anexas (tireoide ou adrenais),

podem ser encontrados (Hull et al., 1985; ASRM, 2004; WHO, 1993; Adamson,

Baker, 2003; Jensen et al., 1998). Do mesmo modo, uma doença que tem um

importante impacto sobre a fertilidade feminina é a endometriose. A

endometriose é uma doença estrogênio-dependente que se caracteriza pela

presença de estroma e/ou epitélio glandular fora da cavidade uterina, e pode

causar algia pélvica e infertilidade (Jubanyik et al., 1997; Vilarino et al., 2011).

No que diz respeito às causas masculinas de infertilidade, qualquer

condição que possa prejudicar a quantidade ou qualidade espermática pode

relacionar-se a fatores de infertilidade masculina. As causas de infertilidade

masculina mais comumente identificadas são: a insuficiência ou disfunção

testicular, também referida como hipogonadismo primário e a disfunção

hipotalâmica-pituitária, também referida como hipogonadismo secundário, uma

condição que afeta o transporte de espermatozoide, porém identificadas com

3

menos frequência (De Kretser, 1997). Alguns outros fatores também podem

levar a alterações seminais como, por exemplo, a varicocele, definida como a

dilatação das veias do plexo pampiniforme, sendo mais frequente do lado

esquerdo devido à disposição anatômica da veia espermática; infecções

geniturinárias por Chlamydia trachomatis e Ureaplasma urealyticum, assim como

a idade, uso de medicamentos, doenças sistêmicas ou genéticas (WHO, 1993;

De Kretser, 1997; WHO, 1999; Jarow, 1994; ASRM, 2004). Importantes detalhes

da anamnese, exames físicos e laboratoriais na avaliação do parceiro masculino

são importantes a fim de avaliar os parâmetros seminais (WHO, 1999).

No entanto, quando após a avaliação detalhada do casal observa-se

condições clínicas e laboratoriais normais em ambos os parceiros classifica-se o

casal como portador de Infertilidade Sem Causa Aparente (ISCA) (ASRM, 2006).

1.2 Reprodução Humana Assistida

Nos últimos anos as técnicas de Reprodução Humana Assistida (RHA) têm

ajudado inúmeros casais inférteis a terem filhos. Desde o nascimento do

primeiro bebê de proveta, Louise Brown em 1978 na Inglaterra, grandes avanços

foram realizados nas técnicas de RHA melhorando significativamente as taxas

de sucesso dos procedimentos (Allen, Reardon, 2005). A fertilização assistida é

definida como um conjunto de técnicas de manipulação de gametas que tem

como objetivo facilitar o encontro do espermatozoide com o óvulo a fim de que

ocorra a fertilização (Myers et al., 2008). As duas principais técnicas utilizadas

atualmente são a fertilização in vitro clássica (FIV clássica) em que após o

preparo seminal ocorre a incubação de espermatozoides pós preparo com o

óvulo ou a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI), em que ocorre

4

a injeção direta de um espermatozoide no óvulo, sob visualização em

microscópio óptico invertido (Myers et al., 2008) (Figura 1).

Previamente à utilização das técnicas laboratoriais de RHA é necessária a

realização de alguns procedimentos como a estimulação ovariana controlada, o

preparo seminal para a separação de espermatozoides e a aspiração folicular.

Para a escolha das diferentes técnicas de reprodução humana assistida, devem

ser consideradas algumas variáveis como: a idade da paciente, o histórico de

infertilidade do casal, o número de gametas disponíveis, o número de embriões

passiveis de transferência, e as condições laboratoriais do serviço (Franco Jr.,

Marinho, 1994).

Fatores ambientais e estilos de vida podem trazer implicações na

subfertilidade, e a nutrição é dentre eles um fator significativo. A nutrição é

importante para a síntese de DNA, importante no desenvolvimento de oócitos e

espermatozoides, e diversas enzimas envolvidas nessa síntese são

dependentes de vitaminas como, por exemplo, a vitamina B (Berker et al., 2009).

A B

Figura 1. A – Injeção Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI),

B - Fertilização in vitro clássica (FIV), (Acervo Pessoal).

5

1.3 A Importância do Folato

O folato é uma importante vitamina do complexo B e está envolvido em

inúmeros processos fisiológicos e patológicos, incluindo a reprodução (Tamura,

Picciano, 2006). Os folatos constituem um grupo de compostos heterocíclicos ao

qual o ácido pteróico está conjugado com um ou diversos resíduos de ácido L-

glutâmico. Em geral, os termos folato e ácido fólico são considerados sinônimos.

(Lucock et al., 2002).

O ácido fólico (2-amino-4-hidroxi-6-metilenoaminobenzol-L-glutâmico)

(Figura 2), também conhecido como ácido pteroilglutâmico, é a forma mais

estável de folato e é considerada uma vitamina apresentando ação de coenzima,

responsável pelo transporte de unidades químicas de carbono simples (Franco,

Mahan, apud Upia, 2009).

Ácido Fólico

Figura 2– Estrutura química do ácido fólico (Fonte: Sackheim and Lehman, 2001)

2-amino-4-hidroxi-6-

metil-pteridina Ac. P-aminobenzoico Ac. L-glutâmico

6

Sabe-se que o folato é um cofator fundamental envolvido em dois processos

fisiológicos principais: a) metilação de ácidos nucléicos, proteínas e lipídios, que

atuam no controle e estão associados à expressão gênica e manutenção da

estabilidade genômica; b) síntese de purinas e pirimidinas, necessárias a

síntese e reparo do DNA (Jacques et al., 2001).

Nesses processos fisiológicos, a enzima metilenotetrahidrofolato

desidrogenase 1 (MTHFD1) catalisa a conversão de tetrahidrofolato (THF)

para os derivados correspondentes 10-formil, 5,10-metinil e 5,10-

metilenotetrahidrofolato (Hum et al., 1988). A enzima Metilenotetrahidrofolato

redutase (MTHFR), catalisa a conversão do 5,10-metilenotetrahidrofolato para 5-

metilenotetrahidrofolato (5-MTHFR), a principal forma de folato circulante, que

apresenta função de doador de grupos metil para a remetilação da homocisteína

em metionina. Essa reação de metilação é realizada através da catalisação da

enzima metionina sintase (MTR), que requer a cobalamina (vitamina B12) como

cofator e resulta na formação de S-adenosilmetionina (SAM) (Finkelstein et al.,

2000; Pavarino et al., 2005), a qual é retirada o radical metil transformando-se

em S-adenosilhomocisteína (SAH) e posteriormente hidrolisada para adenosina

e homocisteína (Lucock et al., 2002) As elevações de homocisteína

intracelulares podem levar a uma diminuição de SAM e conseqüente aumento

de S-adenosilhomocisteína (SAH) que está associada com inibição de DNA-

metiltransferases e hipometilação do DNA (Balaghi,Wagner, 1993; De Cabo et

al., 1994; Melnyk et al., 2000) (Figura 3).

7

Figura 3. Ciclo dos folatos (Crott et al., 2001).

A deficiência de folatos pode ser determinada geneticamente ou pela dieta,

podendo comprometer a função dessas vias metabólicas, conduzindo a um

acúmulo de homocisteína (Jacques et al., 2001).

A deficiência de ácido fólico além de estar relacionada ao desenvolvimento ou

aumento de certos tipos de câncer, vem sendo também referida a patologias

associadas a tecidos de alta renovação, que dependem do suprimento de folato

para a correta composição e duplicação do DNA (Baluz et al., 2002). Nos últimos

anos, inúmeras evidências indicam que mesmo concentrações moderadamente

elevadas de homocisteína sérica podem estar associadas a um risco aumentado

diversas doenças como a aterosclerose, tromboembolismo, doenças

neurodegenerativas e também com as primeiras ocorrências de doenças em

neonatais (Herrmann, 2001; Gueant et al., 2003). Essa última categoria inclui uma

série de anomalias no desenvolvimento fetal, particularmente defeitos do tubo

neural, bem como complicações na gravidez tardia, como a pré-eclâmpsia,

descolamento prematuro de placenta, retardo no crescimento intrauterino, parto

prematuro e até mesmo morte fetal intrauterina (Eskes, 2000; Nelen, 2001;

Hague, 2003; Steegers-Theunissen et al., 2004; Tamura, Picciano, 2006).

DNA+Proteína

Metilação

Metionina

Homocisteína

Cisteína

Síntese

Metionina

Vitamina B12

5-metil THF

5,10-Metileno THF

DNA Síntese &

Reparo

8

Assim, o folato é indispensável durante períodos de crescimento e

proliferação celular rápida, que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário e

folicular. A ingestão insuficiente de folato demonstrou prejudicar também a

fertilidade em modelos animais causando também abortos espontâneos, defeitos

congênitos e outros efeitos adversos na gravidez em humanos (Mohanty, Das,

1982; Mooij et al., 1992; Willmott et al., 1968; George et al., 2002). Além disso, a

deficiência de folato pode ainda aumentar a incorporação inadequada de

monofosfato de desoxiuridina pelo DNA, perturbando sua integridade e

diminuindo a replicação e provocando a apoptose e necrose das células lesadas

(Blount et al., 1997; Duthie, Hawdon, 1998; Huang et al., 1999; Koury et al., 2000;

Courtemanche et al., 2004; Kimura et al., 2004).

1.4 O Gene MTHFR e os polimorfismos 677 e 1298

A enzima MTHFR é codificada pelo gene Metilenotetrahidrofolato redutase

(MTHFR). O gene MTHFR é constituído por 11 éxons e está localizado no braço

curto do cromossomo 1 especificamente na região de posição 1p36.3 (Goyette et

al., 1998) (Figura 4).

Figura 4. Localização do Gene MTHFR (Genetics Home Reference, 2012).

9

Inúmeras variações têm sido identificadas em genes envolvidos na

absorção do folato e nos mediadores de seu metabolismo, entre eles alguns

polimorfismos do gene MTHFR. Estes polimorfismos podem alterar o efeito

benéfico dos folatos e outras vitaminas B que apresentam um papel importante no

metabolismo dos grupos metil, e mudar o fluxo entre os co-fatores do folato, a

síntese de DNA e as reações de metilação (Narayanan et al., 2004, Pavarino-

Bertelli et al., 2004; Shy et al., 2005) (Figura 5).

Figura 5. Reações metabólicas relacionadas à degradação de homocisteína e

influência do gene MTHFR (Fonte: O Autor).

DIETA

Ac.Fólico

Tetrahidrofolato N5,N10

metilenotetrahidrofolato MTHFR (enzima)

N5,N10 metilenotetrahidrofolato

redutase

N5 metil-tetrahidrofolato

Doação Radical

Metil

Vitamina B6 + Cistationa β

Sintase

Ação Vitamina B12

METIONINA

HOMOCISTEÍNA CISTATIONA

CISTEÍNA

Metionina Sintase

GENE MTHFR

Gene Codificador/ Regulador da enzima

MTHFR

10

Polimorfismo é definido como a presença da variabilidade genética de um

determinado loco gênico que ocorre em uma população, em que os alelos

apresentem frequências maiores do que 1 %. Os polimorfismos podem acarretar

em aumento, diminuição ou perda de função das enzimas relacionadas ao gene,

e consequentemente, podem ser a causa direta de uma anormalidade fenotípica,

resultando em um aumento na susceptibilidade a uma doença, com ocorrência

também de maneira silenciosa (Strachan, Read, apud Upia, 2009).

O envolvimento do gene MTHFR com doenças foi publicado pela primeira

vez em 1972, através da identificação de um paciente com homocisteinúria devido

a uma deficiência grave da enzima (Mudd et al., 1972). Este tipo de deficiência da

enzima MTHFR, é um erro inato do metabolismo do folato e é relativamente raro.

Em 1988, uma variante termolábil do gene MTHFR foi identificada através

de ensaios enzimáticos de extratos de linfócitos de pacientes com doença

cardiovascular (Kang et al., 1988). Esta deficiência mais suave pareceu ser mais

comum, e resultou em uma ligeira a moderada elevação da homocisteína total

plasmática, um fator de risco para a doença cardiovascular. As relações, entre as

deficiências graves e leves eram pouco claras, particularmente desde que a

variante termolábil do gene MTHFR também tinha sido observada em algumas

famílias com a homocisteínuria. Naquela época, as investigações da deficiência

da MTHFR foram limitadas aos laboratórios com experiência em bioquímica e

metodologias em genética. (Kang et al., 1991).

Outro estudo, realizado em 1993 através da utilização de oligonucleotídeos

degenerados conseguiu isolar uma sequência de 90 pares de bases do fígado de

suínos. Esta sequência foi comparada com uma biblioteca genômica de fígado

humano, utilizando-se a técnica de fluorescência de hibridização in situ, que

11

demonstrou forte homologia com o gene MTHFR (Goyette, apud Angelita, 2004).

O isolamento do DNA em 1994 abriu caminhos para as abordagens genéticas

moleculares a fim de estudar o gene da MTHFR e suas deficiências (Goyette et

al., 1994). O isolamento de DNA foi rapidamente seguido da identificação de uma

de suas variantes.

Atualmente, sabe-se que a deficiência grave da enzima MTHFR e prejuízos

no metabolismo de folato é rara com aproximadamente 50 casos relatados no

mundo todo, resultando em hiperhomocisteínemia, homocisteinuria e

hipometilação do DNA. Os pacientes que possuem essa deficiência apresentam

retardo em seu desenvolvimento, doença de oclusão vascular, tromboembolismo

e sitomas neurológicos (Rosenblatt, 1995; Green, Miller, 1999; Rosenblatt,

Whitehead, 1999). Entretanto, muito mais comum é a deficiência suave da enzima

MTHFR devida à síntese de uma variante termolábil causando sua redução

catalítica (Schneider et al, 1998).

A primeira mutação identificada no gene MTHFR foi descrita na posição

nucleotídica 677 (éxon 4), onde ocorre uma mutação do tipo substituição de ponto

de Citosina por Timina (Frosst et al., 1995) ocasionando a mudança do

aminoácido alanina para valina dentro do domínio catalítico N-terminal da enzima

(Frosst et al., 1995; Rozen et al., 1996; van der Put et al., 1998). A atividade

específica da enzima MTHFR é reduzida em 35% na presença de heterozigose,

genótipo 677CT, e em 70% em homozigose, genótipo 677TT em relação ao

genótipo normal 677CC (Wainfan, Poirier, 1992; Balaghi, Wagner, 1993; De Cabo

et al.,1994).

Outra mutação identificada nesse gene é substituição de ponto de Adenina

por Citosina, na posição nucleotídica 1298 (éxon 7). Esta mudança leva a

12

substituição do aminoácido glutamato por alanina na proteína (van der Put et al.,

1998). Diferentemente da mutação MTHFR C677T, a mutação MTHFR A1298C

localiza-se no domínio que regula a enzima MTHFR (van der Put et al.,1998;

Weisberg et al., 1998). Esta mutação, tanto no seu estado homozigoto mutante

(CC) ou heterozigótico (AC), parece não ocasionar elevações do nível da

homocisteína plasmática. Entretanto, a combinação em heterozigose de ambas

as mutações (duplo heterozigoto), C677T e A1298C, produzem um genótipo

677CT/1298AC que resulta na elevação significativa do nível da homocisteína

plasmática (van der Put et al., 1998; Weisberg et al., 1998; Weisberg et al., 2001).

O polimorfismo C677T do gene MTHFR pode representar um importante fator

de risco genético para doenças vasculares. Homozigotos com genótipo TT podem

apresentar risco três vezes maior de evoluir para uma doença cardiovascular

(Kluijtman et al.,1996). Além disso, existem vários estudos demonstrando a

ligação entre os polimorfismos do gene MTHFR com o fechamento do tubo

neural, o qual se apresenta como uma malformação congênita grave, ocorrendo

devido às falhas de união da linha média do tubo neural (Sttegers, Mills, apud

Angelita, 2004). Alguns estudos observaram uma redução de três vezes em

relação ao risco de ALL (Leucemia Linfocítica Aguda) em indivíduos heterozigotos

(AC) para mutação MTHFR A1298C e um risco quatorze vezes menor naqueles

que apresentavam o genótipo CC (MTHFR A1298C) (Skibola et al.,1999). Outras

publicações associaram o polimorfismo do gene MTHFR, em mães de crianças

com a síndrome de Down (Hassold et al., 2001).

A frequência desses polimorfismos em diversas populações tem sido

amplamente estudada. Alguns estudos avaliaram a frequência do alelo T em

diferentes etnias e diferentes regiões geográficas e observaram que, em negros,

13

da região da África Subsaariana, o genótipo (677TT) não foi identificado,

sugerindo que a frequência do alelo T é menos comum nessa população que em

outros grupos étnicos. Resultados semelhantes também foram descritos entre

negros que vivem em países fora da África, como por exemplo, Brasil e Estados

Unidos, apresentando frequência do alelo de 1 a 2% nesses povos (Botto et al.,

2005). Outro estudo demonstrou frequência de 10% do alelo T entre os

descendentes europeus, 1,45% entre negros e de 1,2% entre pessoas de

populações indígenas (Arruda et al., 1998).

Quanto à distribuição do polimorfismo 1298, mais especificamente do alelo

C, alguns trabalhos relataram que 4% das populações caucasiana e hispânica e

10% da população canadense eram compostos por indivíduos homozigotos,

enquanto, 42% dos caucasianos e 38% dos hispânicos corresponderam a

indivíduos heterozigotos (Peng et al., 2001; Weisberg et al., 1998). Do mesmo

modo, um estudo realizado em diferentes populações do mundo, demonstrou

frequências gênicas que variavam desde 4% no Senegal a 50% na Namíbia,

sendo encontrado, ainda taxa de 23% em brasileiros (Shi et al., 2003).

1.5 O Folato e a Fertilidade

No que diz respeito às funções reprodutivas, a falta do folato e consequente

acúmulo de homocisteína provocam a deficiência de divisão celular e produção de

citocinas inflamatórias, além de alterações no metabolismo do óxido nítrico,

aumento do estresse oxidativo, elevadas taxas de apoptose e alterações nas

reações de metilação (Gmyrek et al., 2005; Thaler et al., 2003; Agarwal et al.,

2005; Hussein et al., 2005; Forges et al., 2007).

14

Sabe-se que a hiperhomocisteinemia pode afetar diversos processos

reprodutivos em diferentes níveis tanto na fertilidade masculina quanto na

feminina. Nos homens são comuns casos de anormalidades na morfologia

espermática, baixa concentração e perda da motilidade dos espermatozoides

(Steegers-Theunissen et al., 1993; Ebisch et al, 2006).

Em relação à fertilidade feminina, a ligação entre o ácido fólico e as funções

ovarianas já havia sido observada desde 1982 em estudos com macacos Rhesus

demonstrando que uma dieta restritiva de folato traz como consequência ciclos

menstruais irregulares, além de decréscimos progressivos nas concentrações

séricas de estradiol e progesterona quando comparados a animais submetidos a

dietas normais. Biópsias nos ovários desses animais demonstraram degeneração

dos folículos de Graaf, aumento de folículos atrésicos e císticos, além da

diminuição das células da granulosa e redução ou até ausência de corpo-lúteo

(Mohanty et al., 1982).

Sabe-se que os oócitos de mamíferos antes e após a ovulação são

envolvidos por uma massa de células encaixadas em uma matriz extracelular

conhecida como cumullus oophorus. No ovário previamente à ovulação, a

secreção das células do cumullus e das células da granulosa que estão

intimamente relacionadas é acumulada internamente ao antro folicular (Ball et al.,

1982; Salustri et al., 1999). Essa secreção denominada fluido folicular (FF) provê

o microambiente necessário para desenvolvimento do oócito e contêm muitas

substâncias envolvidas na maturação oocitária, fertilização e possivelmente

desenvolvimento do embrião (Schweigert et al., 2006). Assim, a composição do

FF reflete as fases de desenvolvimento do oócito e o grau de maturação folicular

(Eppig et al., 2005; Sugiura et al., 2005).

15

As alterações nesse microambiente folicular podem acarretar em disfunção

ovulatória, má qualidade do oócitária, baixa qualidade embrionária, redução nas

taxas de fertilização e implantação (Pellicer et al., 2000; Garrido et al., 2003). A

presença de folato e homocisteína no FF já foram previamente demonstradas e

inicialmente observou-se que baixas concentrações de homocisteína no fluído

folicular teriam sido relacionadas com um alto grau de maturação oocitária

(Steegers-Theunissen et al., 1993; Szymanski et al. , 2003).

Entretanto, mais recentemente, uma associação inversamente significativa

foi realizada entre as concentrações de homocisteína no fluído folicular e na

qualidade embrionária em mulheres submetidas a ciclos de reprodução assistida

através da utilização de técnicas como FIV clássica ou ICSI (Ebisch et al., 2006).

Dessa maneira, a deficiência primária de folato resultando em um aumento da

concentração total de homocisteína pode ser decisiva na qualidade de oócitos,

subsequentemente da fertilização, implantação, desenvolvimento embrionário e

fetal (Hague et al., 2003; Steegers-Theunissen et al., 2003; Ebisch et al., 2007).

Nos últimos anos, alguns estudos têm sido realizados a fim de avaliar a

presença de polimorfismos do gene MTHFR e a fertilidade. Recentemente

avaliou-se o líquido folicular e as células da granulosa de pacientes submetidas à

estimulação ovariana e verificaram a relação entre a presença do alelo T do

polimorfismo 677 do gene MTHFR e a síntese de estradiol, observando um

decréscimo dos níveis de estradiol do fluido folicular e das células da granulosa

em indivíduos portadores do genótipo TT, sugerindo que a mutação afeta a

produção de estrógeno por folículos terciários. Esse mesmo estudo demonstrou

também que pacientes apresentando genótipo 677T obtiveram menor

recuperação oocitária (Hecht et al., 2009). Outro estudo ainda avaliou as

16

implicações dos polimorfismos C677T e A1298C na fertilidade humana e

concluíram que esses polimorfismos podem trazer reais implicações nas taxas de

fetos não viáveis com taxas de 4-7%, apresentando um papel significativo na

fertilidade (Reyes-Engel et al., 2002).

Assim, faremos um estudo com o objetivo de verificar o impacto entre os

polimorfismos do gene MTHFR (C677T, A1298C) sobre os diversos resultados

obtidos no laboratório de fertilização in vitro em mulheres brasileiras que buscam

auxílio das técnicas de fertilização assistida.

17

2. OBJETIVO

Verificar o impacto entre a presença do alelo mutado dos polimorfismos

C677T e A1298C do gene MTHFR nos resultados observados de fertilização in

vitro de mulheres brasileiras submetidas às técnicas de reprodução humana

assistida.

18

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1 Pacientes

Nesse estudo prospectivo foram triadas 146 mulheres submetidas à

procedimentos de reprodução assistida no Serviço de Reprodução Humana da

Faculdade de Medicina do ABC – Instituto Ideia Fértil, entre Outubro de 2010 a

Fevereiro de 2012.

Os critérios utilizados para a inclusão das pacientes no estudo foram:

- Indicações de fertilização assistida que não apresentasse influência sobre a

resposta ovariana como: soro discordância, falha de implantação, endometriose

graus I e II, fator tubáreo, infertilidade sem causa aparente (ISCA) e Fator

Masculino;

- Apresentar níveis hormonais séricos dentro dos parâmetros de normalidade,

considerando os níveis de FSH até 10mUI/mL e de Prolactina até 25 pg/mL;

- Idade até 37 anos.

Durante a triagem dos casais, foi realizada investigação padrão para casais

inférteis: testes sorológicos, perfil hormonal e bioquímico, teste para doenças

sexualmente transmissíveis, exames de imagem, análise seminal,

histerossalpingografia, histeroscopia e laparoscopia. Todas as pacientes

receberam orientação para suplementação com ácido fólico no início da

estimulação ovariana controlada.

Os dados clínicos e as amostras de sangue periférico foram colhidos somente

após exposição dos objetivos do estudo e assinatura do Termo de Consentimento

Informado aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina

do ABC, número do processo 097/2010.

19

Foram excluídas desse estudo pacientes que não se enquadravam nos

critérios de inclusão ou aquelas que não aceitaram assinar o termo de

consentimento informado.

3.2 Métodos

3.2.1 Coleta de história e exame físico

Na admissão das pacientes foram colhidos dados de sua história clínica e

realizado exame físico completo. Para homogeneização da amostra foram

observados nessas pacientes: Idade, peso, altura, história de tabagismo,

concentrações de FSH, prolactina e TSH. Além disso, após a fertilização foram

avaliados parâmetros como número e grau de maturidade dos oócitos (prófase I,

metáfase I, metáfase II), taxas de fertilização normal, número e qualidade dos

embriões e taxa de gravidez.

3.2.2 Método de Indução folicular

A indução folicular foi realizada através de estimulação com FSHr

(Folitrofina, Puregon®, 100 UI) a partir do segundo dia da menstruação,

administrados entre 8 e 14 dias. Quando os folículos da paciente atingiram o

tamanho adequado (14 mm), determinado por ultrassonografia transvaginal,

administrou-se o antagonista (Acetato de Ganirelix, Orgalutran®).

Aproximadamente entre o 10º e 11º dia, momento em que os folículos

apresentavam diâmetro de aproximadamente 18mm, administrava-se à paciente

uma dose de gonadotrofina coriônica (HCG-Ovidrel®, 250 µg) e após 36 horas

20

realizava-se a aspiração folicular (sob sedação com propofol) para obtenção dos

oócitos.

3.2.3 Oócitos, seleção dos embriões e transferência embrionária

De acordo com o grau de maturação nuclear, os oócitos foram classificados

em maduros = Metáfase II (MII) e imaturos = Metáfase I (MI) ou Prófase (PI). Para

a realização do procedimento de ICSI, foram utilizados somente oócitos em

estágio de MII. Após a ICSI, foi observada a fertilização através da identificação

da presença de formação de dois pró-núcleos (PN) cerca de 16 a 18 horas após o

procedimento, através de microscópio invertido com objetiva de 40 vezes. A

fertilização foi classificada como normal (2PN) ou anormal (3PN, 4PN, vários PN).

Quando não houve fertilização os oócitos injetados foram classificados como não

fertilizados (NF). Embriões com menos de 20% de fragmentação e número de

células adequado para o dia da transferência foram considerados de boa

qualidade (Veek,1999).

Conforme normatização do Conselho Federal de Medicina (CFM) de 15 de

dezembro de 2010 foram transferidos no máximo dois embriões para pacientes

com idade abaixo de 35 anos e no máximo três embriões para pacientes com

idade acima de 35 anos. A transferência foi realizada no terceiro ou quinto dia

após a fertilização, e o suporte da fase lútea foi feita com progesterona via vaginal

na dose de 200 mg três vezes ao dia iniciando-se no dia seguinte a punção

ovariana.

21

3.2.4 Diagnóstico e evolução das gestações

As gestações foram confirmadas através da dosagem sérica da fração beta do

hCG (βhCG) no 12º dia após a transferência embrionária. A gestação clínica foi

considerada, quando identificado saco gestacional intrauterino ao exame de

ultrassonografia transvaginal a partir da quinta ou sexta semana de gestação.

3.2.5 Coleta de sangue

Foram colhidos 15 mL de sangue periférico a partir de venopunções

periféricas para análise do DNA genômico. Após a coleta o tubo destinado à

análise foi armazenado a -80ºC até o momento da extração do DNA.

3.2.6 Extração de DNA

A extração e análise do DNA foram realizadas no Laboratório de Genética e

Biologia Molecular do Centro de Reprodução Humana da Faculdade de Medicina

do ABC.

O DNA foi extraído de acordo com o protocolo de Lahiri e Nurnberger (1991).

De acordo com este protocolo cerca de 4 mL de sangue periférico coletados

foram transferidos para um tubo cônico de vidro (Corex) de 15 mL e centrifugados

por 8 minutos a 8000 rpm. O plasma foi então desprezado com pipeta Pasteur e,

ao pellet celular foram adicionados 9 mL de solução TM1 (TM1 solução mãe:

10mM Tris-HCl pH 7,6; 10mM MgCl2; 2 mM EDTA diluídos em solução de Triton

2,75% 1:9 (V:V) para solução de uso). A solução foi homogeneizada várias vezes

com pipeta Pasteur e então centrifugada por 8 minutos a 8000 rpm.

O sobrenadante foi então descartado e ao pellet adicionado 8,5 mL de TM1,

homogeneizado com pipeta Pasteur e em seguida, centrifugado novamente por 8

22

minutos a 8000 rpm. O procedimento foi repetido até que o pellet estivesse

límpido e isento de hemoglobina.

Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o pellet e ressuspendido em

1,6mL de TM2 (10mM Tris-HCl; 10mM KCl; 10mM MgCl2; 2mM EDTA; 0,4M NaCl;

completando-se para 100mL com água). À suspensão foi adicionado 160μL de

SDS 10%, misturada vigorosamente e incubada em banho-maria por 15 minutos a

56ºC.

Adicionou-se 480 μL de NaCl gelado e homogeneizou-se cuidadosamente.

O conteúdo do tubo foi então transferido para 2 tubos tipo eppendorf e

centrifugado por 5 minutos a 12000 rpm. Ao final deste procedimento, o

sobrenadante foi cuidadosamente retirado e colocado em tubo Corex de 15 mL

limpo. Adicionou-se 10 mL de etanol absoluto gelado e o tubo foi invertido para

precipitação do DNA.

Após visualização do DNA precipitado, este foi retirado com o auxílio de

uma pipeta e transferido para um tubo tipo eppendorf contendo 250 μL de água

autoclavada. O DNA foi então mantido a 37ºC em banho-maria overnight e

conservado a 4ºC até a utilização.

3.2.7 Genotipagem

A detecção dos polimorfismos do gene MTHFR foi realizada usando o

sistema TaqMan para PCR em tempo real, utilizando o equipamento Rotor-Gene

Q 6 plex (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Os primers e sondas Taqman para os

polimorfismos estudados estão disponíveis comercialmente pela Applied

Biosystems® (Foster City, CA, USA), conforme descrito na Tab.1, abaixo. Os

ensaios foram realizados com Taqman Universal Master Mix (Applied

23

Biosystems) com 50 ng de DNA por reação. As condições de PCR foram

realizadas de acordo com o fabricante: 50 ciclos de desnaturação a 95°C (15

sec), anelamento/extensão a 60°C (1 min).

Tabela 1. Polimorfismos do gene MTHFR e respectivos ensaios TaqMan.

3.2.8 Análise estatística

Tendo em vista a não normalidade dos dados (teste de Shapiro-Wilk, p<0,05)

optou-se por apresentá-los com base em valores de mediana, percentil 25 e 75.

Para comparar as variáveis quantitativas em relação a presença ou não do alelo

mutado para o polimosfismo 677 e 1298 (0 = não tem alelo mutado; 1 = tem alelo

mutado) utilizou-se teste de Mann-Whitney. Para a avaliação segundo presença

do alelo mutado nos dois polimorfismos (0 = sem alelo mutado; 1 = pelo menos

um alelo mutado em um dos polimorfismos; 2 = os dois alelos mutado), utilizou-

se teste de Kruskal-Wallis. A associação dos genótipos com variáveis qualitativas

foi realizada através da utilização do teste do qui-quadrado. O software

estatístico utilizado foi o Stata 11.0.

Gene Polimorfismo Rs Ensaio TaqMan

MTHFR C677T rs1801133 C___1202883_20

A1298C rs1801131 C____850486_20

24

4. RESULTADOS

No presente estudo, as análises dos polimorfismos 677 e 1298 do gene

MTHFR foram realizadas em 146 pacientes submetidas a ciclos de reprodução

humana assistida. Para a análise estatística dos dados separamos as pacientes

em dois grupos: normal (sem presença de mutação em nenhum dos alelos) e

mutado (presença de mutação em pelo menos um dos alelos).

Ao avaliarmos os dados referentes ao polimorfismo 677, obtivemos um grupo

normal apresentando 60 pacientes e um grupo mutado apresentando 86

pacientes. Ao comparar os grupos, não encontramos diferenças no que diz

respeito à idade (32,0 x 33,0, respectivamente p=0,172). Quanto as variáveis

laboratoriais em relação ao número de oócitos recuperados (8,0 x 8,0,

respectivamente, p = 0,417); porcentagem de oócitos maduros recuperados

(85,7% x 81,1%, respectivamente, p =0,346); taxa de fertilização normal (61,3% x

66,7%,respectivamente, p = 0,275), porcentagem de Não Fertilizados (21,5% x

17,4%,respectivamente, p = 0,407) e porcentagem de bons embriões (66,7% x

60,0%, respectivamente, p = 0,954) e taxas de gestação (28,6% x 29,3%,

respectivamente, p =0,908) não observamos diferença entre os grupos avaliados.

Ao avaliarmos a porcentagem de oócitos imaturos, observamos uma tendência a

maiores porcentagens no grupo mutado (2,9% x 12,9%, respectivamente, p =

0,056) (Tab.2).

Ao avaliarmos os dados para o polimorfismo 1298, obtivemos um grupo com

genótipo normal apresentando 80 pacientes e um grupo mutado apresentando 66

pacientes. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre

os grupos normal e mutado em relação à idade (33,0 x 32,0, respectivamente

p=0,642) e variáveis laboratoriais, tais como, número de oócitos recuperados (8,0

25

x 7,5, respectivamente, p = 0,476); porcentagem de oócitos maduros

recuperados (84,4% x 81,1%, respectivamente, p = 0,724); porcentagem de

oócitos imaturos (11,1% x 12,5%, respectivamente, p = 0,743); porcentagem de

fertilização normal (62,5% x 66,7%, respectivamente, p = 0,975); porcentagem de

Não Fertilizados (16,7% x 20,9%,respectivamente, p = 0,361) e taxas de

gestação (29,6% x 28,6%, respectivamente, p = 0,898). Em relação à

porcentagem de desenvolvimento de bons embriões pudemos observar que o

grupo mutado apresentava valores maiores quando comparados ao normal

(50,0% x 68,3%, respectivamente, p = 0,022) (Tab.2).

26

TABELA 2: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo mutado

dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR.

p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Mann-Whitney ** Teste do qui-quadrado

Variáveis Normal

(n=60)

Hetero e

Mutado (n=86) p

Normal

(n=80)

Hetero e

Mutado

(n=66)

p

Polimorfismo C677T do gene

MTHFR Polimorfismo A1298C do gene

MTHFR

Mediana (p25 – p75) Mediana (p25 – p75)

Idade* 32,0 (30,0 – 34,0)

33,0 (30,0 – 35,0)

0,172 33,0

(30,0 – 35,0) 32,0

(30,0 – 35,0) 0,642

Nº Oócitos

Recuperados *

8,0 (5,0 – 12)

8,0 (6,0 – 12)

0,417 8,0

(6,0 – 12,0) 7,5

(5,0 – 12,0) 0,476

% Oócitos

Maduros*

85,7 (66,7 – 100)

81,1 (66,7 – 100)

0,346 84,4

(66,7 – 100) 81,1

(66,7 – 100) 0,724

% Oócitos

Imaturos *

2,9 (0 – 16,7)

12,9 (0 – 25,0)

0,056 11,1

(0 – 20,0) 12,5

(0 – 19,0) 0,743

% Fertilização

Normal *

61,3 (33,3 – 86,7)

66,7 (50,0 – 80,0)

0,275 62,5

(50,0 – 80,0) 66,7

(40,0 – 80,0) 0,975

% NF*

21,5 (0 – 40,0)

17,4 (0 – 33,3)

0,407 16,7

(0 – 33,3) 20,9

(0 – 37,5) 0,361

% Bons

Embriões *

66,7 (18,1 – 88,2)

60,0 (28,6 – 83,3)

0,954 50,0

(11,8 – 75,0) 68,3

(40,0 – 100) 0,022

(%) Taxa de gestação **

28,6

29,3

0,908

29,6

28,6

0,898

27

Durante a avaliação estatística percebemos que o fator idade poderia exercer

interferência em nossos resultados podendo mascarar a real importância da

presença do polimorfismo em nosso grupo de estudo. Embora a literatura ainda

não apresente consenso em relação ao valor de corte para a influência da idade

nos resultados laboratoriais e clínicos em reprodução humana assistida,

decidimos ser rigorosos e estabelecer um grupo de pacientes com idade até 30

anos.

Para a avaliação do polimorfismo 677, obtivemos um total de 45 pacientes

com idade até 30 anos, 19 pacientes no grupo normal e 26 pacientes no grupo

mutado. Após a análise de nossos resultados em relação às variáveis

laboratoriais, não foi observado diferença estatisticamente significante entre os

grupos normal e mutado no que diz respeito à idade (28,0 x 29,0,

respectivamente, p = 0,294) número de oócitos recuperados (12,0 x 7,0,

respectivamente, p = 0,399); porcentagem de oócitos maduros recuperados

(84,6% x 82,3%, respectivamente, p = 0,834); porcentagem de oócitos imaturos

(0% x 14,3%, respectivamente, p = 0,062); porcentagem de fertilização normal

(66,7% x 65,7%, respectivamente, p = 0,518); porcentagem de Não Fertilizados

(12,5% x 20,0%,respectivamente, p = 0,267); porcentagem de desenvolvimento

de bons embriões (70,0% x 50,0%, respectivamente, p = 0,071) e taxas de

gestação (26,3% x 40,9%, respectivamente, p = 0,326) (Tab. 3).

28


do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres com idade até 30 anos.

Variáveis Normal

(n=19)

Hetero e Mutado

(n=26) p

Idade ≤ 30 anos

Mediana (p25 – p75)

Idade* 28,0 (26,0 – 30,0)

29,0 (27,0 – 30,0)

0,294

Nº Oócitos Recuperados *

12,0

(5,0 – 16) 7,0

(5,0 – 12,0) 0,399

% Oócitos Maduros * 84,6 (66,7 – 100)

82,3 (71,4 – 100)

0,834

% Oócitos Imaturos * 0 (0 – 15,4)

14,3 (0 – 25)

0,062

% Fertilização Normal * 66,7 (50,0 – 83,3)

65,7 (45,5 – 80,0)

0,518

% NF * 12,5 (0 – 33,3)

20,0 (5,9 – 33,3)

0,267

% Bons Embriões * 70,0 (50,0 – 100)

50,0 (20,0 – 75,0)

0,071

(%) Taxa de gestação**

26,3 40,9 0,326


29

Ao avaliarmos os dados quanto ao polimorfismo 1298, obtivemos um total de

45 pacientes, 22 no grupo normal e 23 no grupo mutado. Não foram encontradas

diferenças estatisticamente significantes entre os grupos normal e mutado em

relação à idade (28,0 x 29,0, respectivamente, p = 0,382) número de oócitos

recuperados (8,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,991); porcentagem de oócitos

maduros recuperados (85,2% x 80,0%, respectivamente, p = 0,223); porcentagem

de oócitos imaturos (8,0% x 12,5%, respectivamente, p = 0,677); porcentagem de


Não Fertilizados (19,1% x 20,0%,respectivamente, p = 0,926); porcentagem de

desenvolvimento de bons embriões (63,3% x 70,0%, respectivamente, p = 0,583)

e taxas de gestação (40,0% x 28,6%, respectivamente, p = 0,440) (Tab. 4)

30


do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 30 anos.

Variáveis Normal

(n=22)

Hetero e Mutado

(n=23) p

Idade ≤ 30 anos


Idade* 28,0 (27,0 – 29,0)

29,0 (26,0 – 30,0)

0,382


8,0

(5,0 – 13,0) 8,0

(5,0 – 16,0) 0,991

% Oócitos Maduros * 85,2 (80,0 – 100)

80,0 (66,7 – 100)

0,223

% Oócitos Imaturos * 8,0 (0 – 16,7)

12,5 (0 – 25,0)

0,677


66,7 (33,3 – 83,3)

0,531

% NF * 19,1 (5,9 – 33,3)

20,0 (0 – 36,5)

0,926

% Bons Embriões * 63,3 (45,5 – 75,0)

70,0 (25,0 – 93,8)

0,583


40,0 28,6 0,440


31

Também realizamos a avaliação estatística das pacientes apresentando idade

até 35 anos. Para a avaliação do polimorfismo 677 obtivemos um total de 117

pacientes, 52 pacientes do grupo normal e 65 pacientes do grupo mutado. Na

avaliação do polimorfismo 1298 obtivemos um grupo total também com 117

pacientes sendo, 80 do grupo normal e 37 do grupo mutado. Entretanto, assim

como a avaliação realizada com pacientes apresentando idade até 30 anos não

obtivemos diferença estatística em nenhuma das variáveis avaliadas embora o

número de pacientes avaliado tenha sido maior (Tab 5 e 6).

32


do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres com idade até 35 anos.

Variáveis Normal

(n=52)

Hetero e Mutado

(n=65) p

Idade ≤ 35 anos


Idade* 31,5 (29,0 – 34,0)

32,0 (30,0 – 34,0)

0,851


8,0

(5,0 – 12,0) 8,0

(6,0 – 12,0) 0,459

% Oócitos Maduros * 85,2 (66,7 – 100)

81,8 (66,7 – 100)

0,599


13,3 (0 – 25,0)

0,120


66,7 (50,0 – 80,0)

0,287

% NF * 21,5 (0 – 40,0)

20,0 (5,9 – 33,3)

0,623

% Bons Embriões * 66,7 (26,8 – 94,4)

54,5 (20,0 – 81,8)

0,453


33,3 31,0 0,801


33


do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 35 anos.

Variáveis Normal

(n=80)

Hetero e Mutado

(n=37) p

Idade ≤ 35 anos


Idade* 32,0 (29,0 – 34,0)

31,0 (30,0 – 34,0)

0,657


8,0

(6,0 – 12,0) 6,0

(5,0 – 12,0) 0,183

% Oócitos Maduros * 84,4 (66,7 – 100)

81,3 (66,7 – 100)

0,848


11,1 (0 – 18,8)

0,298


66,7 (40,0 – 80,0)

0,577

% NF * 19,1 (0 – 33,3)

20,0 (0 – 36,4)

0,810

% Bons Embriões * 52,3 (14,6 – 75,0)

66,7 (28,6 – 93,8)

0,172


33,9 30,0 0,665


34

Com o objetivo de avaliar se a ocorrência concomitante dos polimorfismos em

ambos os loci gênicos (677 e 1298) poderia exercer alguma influência em nossos

resultados, dividimos nossas pacientes em três grupos: pacientes que não

apresentaram polimorfismos em nenhum dos loci, pacientes que apresentaram

polimorfismo em pelo menos um dos loci e pacientes que apresentaram

polimorfismos em ambos os loci concomitantemente. Após a análise dos dados

entre os grupos avaliados: Ausência de Polimorfismos (n=31) x Presença de Pelo

Menos um Polimorfismo (n=78) x Presença de Dois Polimorfismos (n=37), não

encontramos diferença estatisticamente significante no que diz respeito à idade

das pacientes avaliadas (32,0 x 32,5 x 32,0, respectivamente, p = 0,810);número

de oócitos recuperados (8,0 x 7,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,793);

porcentagem de oócitos maduros recuperados (84,6% x 85,7% x 80,0%,

respectivamente, p = 0,461); porcentagem de oócitos imaturos (10,0% x 0 % x

16,7%, respectivamente, p = 0,159); porcentagem de fertilização normal (60,0% x

66,7% x 66,7%, respectivamente, p = 0,738); porcentagem de Não Fertilizados

(12,5% x 20,0% x 20,0%, respectivamente, p = 0,952); porcentagem de bons

embriões (50,0% x 57,3% x 75,0%, respectivamente, p = 0,269) e porcentagem

de gestação (28,6% x 29,6% x 28,6%, respectivamente, p = 0,992) (Tab.7).

35

TABELA 7: Variáveis laboratoriais e gestação a ausência de polimorfismos,

presença de pelo menos um polimorfismo e presença de dois polimorfismos

C677T e A1298C do gene MTHFR.

p25 e p75: Percentis 25 e 75 * Teste de Kruskal-Wallis ** Teste do qui-quadrado

Variáveis Ausência de

Polimorfismos

(n=31)

Presença de pelo menos

um polimorfismo

(n=78)

Presença de dois

polimorfismos

(n=37)

p


Idade* 32,0

(30,0 – 34,0)

32,5

(30,0 – 35,0)

32,0

(30,0 – 35,0)

0,810

Nº Oócitos*

Recuperados

8,0

(6,0 – 12,0)

7,0

(5,0 – 12,0)

8,0

(6,0 – 12,0)

0,793

% Oócitos

Maduros*

84,6

(66,7 – 100)

85,7

(66,7 – 100)

80,0

(66,7 – 85,7)

0,461

% Oócitos

Imaturos *

10,0

(0 – 20,0)

0

(0 – 19,0)

16,7

(0 – 23,8)

0,159

% Fertilização

Normal*

60,0

(33,3 – 80,0)

66,7

(50,0 – 80,0)

66,7

(40,0 – 83,3)

0,738

% NF* 12,5

(0 – 40,0)

20,0

(0 – 33,3)

20,0

(0 – 36,4)

0,952

% Bons

Embriões*

50,0

(0 – 70,0)

57,3

(28,6 – 83,3)

75,0

(40,0 – 93,8)

0,269


28,6 29,6 28,6 0,992

36

Da mesma maneira foram avaliadas pacientes com idade até trinta anos em

relação aos mesmos grupos Ausência de Polimorfismos (n=9) x Presença de Pelo

Menos um Polimorfismo (n=23) x Presença de Dois Polimorfismos (n=13). Não foi

observada diferença estatisticamente significante em relação à idade das

pacientes avaliadas (28,0 x 28,0 x 30,0, respectivamente, p = 0,142); número de

oócitos recuperados (12,0 x 8,0 x 6,0, respectivamente, p = 0,828); porcentagem

de oócitos maduros recuperados (84,6% x 84,6% x 80,0%, respectivamente, p =

0,596); porcentagem de oócitos imaturos (7,7% x 0 % x 18,7%, respectivamente,

p = 0,220); porcentagem de fertilização normal (58,3% x 66,7% x 66,7%,

respectivamente, p = 0,981); porcentagem de Não Fertilizados(16,7% x 18,2% x

21,7%, respectivamente, p = 0,755); porcentagem de bons embriões (70,0% x

50,0% x 66,7%, respectivamente, p = 0,310) e porcentagem de gestação (33,3% x

33,3% x 36,4%, respectivamente, p = 0,984) (Tab.8).

Do mesmo modo, foram avaliadas pacientes com idade até 35 anos, mas

assim como na avaliação do grupo de pacientes com idade até 30 anos não foram

observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (Tab.9).

37



C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 30 anos.



Polimorfismos

(n=9)


um polimorfismo

(n=23)

Idade ≤ 30 anos

Presença de dois

polimorfismos

(n=13)

p


Idade* 28,0

(28,0 – 29,0)

28,0

(25,0 – 30,0)

30,0

(29,0 – 30,0)

0,142

Nº Oócitos*

Recuperados

12,0

(6,0 – 13,0)

8,0

(5,0 – 16,0)

6,0

(5,0 – 12,0)

0,828

% Oócitos

Maduros*

84,6

(80,0 – 100)

84,6

(71,4 – 100)

80,0

(66,7 – 100)

0,596

% Oócitos

Imaturos *

7,7

(0 – 15,4)

0

(0 – 19,0)

18,7

(0 – 25,0)

0,220

% Fertilização

Normal*

58,3

(50,0 – 75,0)

66,7

(50,0 – 80,0)

66,7

(33,3 – 83,3)

0,981

% NF* 16,7

(0 – 25,0)

18,2

(0 – 33,3)

21,7

(0 – 36,4)

0,755

% Bons

Embriões*

70,0

(66,7 – 100,0)

50,0

(20,0 – 75,0)

66,7

(25,0 – 93,8)

0,310


33,3 33,3 36,4 0,984

38



C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres com idade até 35 anos.



Polimorfismos

(n=27)


um polimorfismo

(n=62)

Idade ≤ 35 anos

Presença de dois

polimorfismos

(n=28)

p


Idade* 31,0

(29,0 – 34,0)

32,0

(29,0 – 34,0)

31,0

(30,0 – 34,0)

0,957

Nº Oócitos*

Recuperados

8,0

(6,0 – 12,0)

7,0

(5,0 – 12,0)

7,0

(5,0 – 13,0)

0,890

% Oócitos

Maduros*

84,6

(66,7 – 100)

85,2

(66,7 – 100)

80,0

(66,7 – 97,2)

0,863

% Oócitos

Imaturos *

11,1

(0 – 20,0)

8,8

(0 – 25,0)

15,5

(0 – 22,5)

0,563

% Fertilização

Normal*

60,0

(36,4 – 83,3)

66,7

(50,0 – 80,0)

66,7

(40,0 – 84,5)

0,934

% NF* 12,5

(0 – 40,0)

20,0

(10,0 – 33,3)

17,1

(0 – 34,8)

0,716

% Bons

Embriões*

66,7

(0 – 87,5)

63,3

(28,6 – 83,3)

66,7

(22,5 – 89,2)

0,868


33,3 33,9 26,9 0,810

39

Com o objetivo de identificar com maior clareza a interferência dos

polimorfismos 677 e 1298 do gene MTHFR nas variáveis laboratoriais realizamos

uma avaliação com pacientes apresentando apenas fator masculino como causa

de infertilidade, conseguindo dessa maneira avaliar apenas pacientes que não

apresentassem nenhuma alteração em sua fertilidade. Assim, nosso grupo de

pacientes que inicialmente apresentava-se com 146 pacientes foi reduzido ao

número de 82 pacientes.

Nessa segunda análise, foram realizadas as mesmas avaliações que haviam

sido feitas com o grupo inicial. Assim, na avaliação do polimorfismo 677 obteve-se

um grupo normal apresentando 35 pacientes e um grupo mutado apresentando

47 pacientes. Considerando os dados de idade (31,0 x 32,0, respectivamente

p=0,235) e variáveis laboratoriais em relação ao número de oócitos recuperados

(8,0 x 9,0, respectivamente, p = 0,382); taxa de fertilização normal (60,0% x

57,1%, respectivamente, p = 0,847), porcentagem de Não Fertilizados (25,0 % x

25,0%,respectivamente, p = 0,785); porcentagem de bons embriões (66,7% x

60,0%, respectivamente, p = 0,754) e taxas de gestação (33,3% x 36,6%,

respectivamente, p =0,771) não observamos diferença entre os grupos avaliados.

Ao avaliarmos a porcentagem de porcentagem de oócitos maduros recuperados

(86,7% x 75,0 %, respectivamente, p =0,006) e oócitos imaturos recuperados

(7,7% x 16,7 %, respectivamente, p =0,003) observamos diferenças

estatisticamente significantes entre os grupos avaliados (Tab.10).

Ao avaliarmos o genótipo referente ao polimorfismo 1298, obtivemos um

grupo normal apresentando 44 pacientes e um grupo mutado apresentando 38

pacientes. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre

os grupos normal e mutado em relação à idade (32,0 x 31,0, respectivamente

40

p=0,899) e variáveis laboratoriais, tais como, porcentagem de oócitos maduros

recuperados (81,4% x 80,0 %, respectivamente, p = 0,590); porcentagem de

oócitos imaturos (11,8% x 13,8%, respectivamente, p = 0,805); porcentagem de


Não Fertilizados (25,0% x 25,0%,respectivamente, p = 0,896); desenvolvimento

de bons embriões (52,3% x 66,7%, respectivamente, p = 0,261) e taxas de

gestação (39,5% x 30,6%, respectivamente, p = 0,422). Em relação ao número de

oócitos recuperados pudemos observar que o grupo apresentando genótipo

normal apresentou valores superiores quando comparado ao genótipo mutado

(10,5 x 8,0, respectivamente, p = 0,044) (Tab.10).

41

TABELA 10: Variáveis laboratoriais e gestação segundo presença do alelo

mutado dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR em pacientes

férteis.


Variáveis Normal

(n=35)

Hetero e

Mutado (n=47) p

Normal

(n=44)

Hetero e

Mutado

(n=38)

p

Polimorfismo C677T do gene

MTHFR Polimorfismo A1298C do gene

MTHFR

Mediana (p25 – p75) Mediana (p25 – p75)

Idade* 31,0 (29,0 – 34,0)

32,0 (29,0 – 35,0)

0,235 32,0

(29,0 – 34,0) 31,0

(29,0 – 34,0) 0,899

Nº Oócitos

Recuperados *

8,0 (5,0 – 13,0)

9,0 (6,0 – 15,0)

0,382 10,5

(7,5 – 16,0) 8,0

(5,0 – 12,0) 0,044

% Oócitos

Maduros*

86,7 (76,9 – 100)

75,0 (62,5 – 84,6)

0,006 81,4

(66,7 – 81,4) 80,0

(66,7 – 87,5) 0,590

% Oócitos

Imaturos *

7,7 (0 – 15,4)

16,7 (7,7 – 28,6)

0,003 11,8

(0 – 26,6) 13,8

(0 – 23,8) 0,805

% Fertilização

Normal *

60,0 (33,3 – 75,0)

57,1 (40,0 – 75,0)

0,847 57,7

(50,0 – 75,0) 63,3

(33,3 – 75,0) 0,985

% NF*

25,0 (10,0 – 40,0)

25,0 (11,1 – 37,5)

0,785 25,0

(10,0 – 36,9) 25,0

(11,1 – 40,0) 0,896

% Bons

Embriões *

66,7 (0 – 85,7)

60,0 (25,0 – 83,3)

0,754 52,3

(8,3 – 75,0) 66,7

(25,0 – 100) 0,261

(%) Taxa de gestação **

33,3

36,6

0,771

39,5

30,6

0,422

42

Assim como no grupo inicial realizamos nossas avaliações segregando

pacientes em grupos com idade até 30 anos e idade até 35 anos a fim de

conseguirmos excluir o fator idade como interferente em nossa avaliação do papel

dos polimorfismos em variáveis laboratoriais. Assim, para o polimorfismo 677

obtivemos um total de 34 pacientes com idade até 30 anos, sendo que 16

pacientes no grupo normal e 18 pacientes no grupo mutado. Após a análise de

nossos resultados em relação às variáveis laboratoriais, não foi observado

diferença estatisticamente significante entre os grupos normal e mutado no que

diz respeito à idade (28,5 x 29,0, respectivamente, p = 0,523) número de oócitos

recuperados (12,0 x 7,0, respectivamente, p = 0,239); porcentagem de oócitos

maduros recuperados (84,6% x 79,3%, respectivamente, p = 0,138); porcentagem

de fertilização normal (66,7% x 53,6%, respectivamente, p = 0,315); porcentagem

de Não Fertilizados (18,3% x 22,5%,respectivamente, p = 0,637); porcentagem de

desenvolvimento de bons embriões (68,3% x 58,3%, respectivamente, p = 0,217)

e taxas de gestação (31,3% x 40,0%, respectivamente, p = 0,611). Entretanto,

pudemos observar diferença estatisticamente significante entre os grupos normal

e mutado em relação à porcentagem de oócitos imaturos (0% x 19,5%,

respectivamente, p = 0,006) (Tab.11).

43


mutado do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres férteis com idade

até 30 anos.

Variáveis Normal

(n=16)

Hetero e Mutado

(n=18) p

Idade ≤ 30 anos


Idade* 28,5 (25,5 – 29,5)

29,0 (27,0 – 30,0)

0,523


12,0

(5,5 – 14,5) 7,0

(5,0 – 12,0) 0,239

% Oócitos Maduros * 84,6 (80,0 – 100)

79,3 (66,7 – 84,6)

0,138

% Oócitos Imaturos * 0 (0 – 13,9)

19,5 (7,7 – 28,6)

0,006


53,6 (33,3 – 80,0)

0,315

% NF * 18,3 (0 – 33,3)

22,5 (0 – 36,4)

0,637

% Bons Embriões * 68,3 (50,0 – 92,9)

58,3 (16,7 – 75,0)

0,217


31,3 40,0 0,611


44

Ao avaliarmos o genótipo referente ao polimorfismo 1298, obtivemos um total

de 34 pacientes, 17 pacientes no grupo normal e 17 pacientes no grupo mutado.

Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos

normal e mutado em relação à idade (28,0 x 29,0, respectivamente, p = 0,378)

número de oócitos recuperados (12,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,436);

porcentagem de oócitos maduros recuperados (84,6% x 80,0%, respectivamente,

p = 0,076); porcentagem de oócitos imaturos (8,3% x 14,3%, respectivamente, p =

0,709); porcentagem de fertilização normal (58,3% x 66,7%, respectivamente, p =

0,756);porcentagem de Não Fertilizados (20,0% x 20,0%,respectivamente, p =

0,972); porcentagem de desenvolvimento de bons embriões (66,7% x 66,7%,

respectivamente, p = 0,890) e taxas de gestação (40,0% x 31,3%,

respectivamente, p = 0,611) (Tab. 12)

45


mutado do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade

até 30 anos.

Variáveis Normal

(n=17)

Hetero e Mutado

(n=17) p

Idade ≤ 30 anos


Idade* 28,0 (27,0 – 29,0)

29,0 (26,0 – 30,0)

0,378


12,0

(6,0 – 13,0) 8,0

(5,0 – 12,0) 0,436

% Oócitos Maduros * 84,6 (80,0 – 100)

80,0 (66,7 – 83,3)

0,076


14.3 (0 – 25,0)

0,709


66,7 (33,3 – 85,7)

0,756

% NF * 20,0 (5,9 – 33,3)

20 (0 – 36,5)

0,972

% Bons Embriões * 66,7 (50,0 – 75,0)

66,7 (25,0 – 85,7)

0,890


40,0 31,3 0,611


46

Ao avaliarmos o grupo de pacientes com idade até 35 anos para o polimorfismo

677 obtivemos um total de 71 pacientes sendo 32 pacientes no grupo normal e 39

pacientes no grupo mutado. Após a análise de nossos resultados em relação às

variáveis laboratoriais, não foi observado diferença estatisticamente significante

entre os grupos normal e mutado em relação à idade (30,5 x 31,0,

respectivamente, p = 0,534) e número de oócitos recuperados (9,5 x 8,0,

respectivamente, p = 0,812). Entretanto, observamos diferenças estatisticamente

significantes entre os grupos normal e mutado no que diz respeito à porcentagem

de oócitos maduros recuperados (87,1% x 75,0%, respectivamente, p = 0,013); e

porcentagem de oócitos imaturos (6,8% x 16,7%, respectivamente, p = 0,002). Ao

avaliarmos a porcentagem de fertilização normal (64,6% x 54,5%,

respectivamente, p = 0,543); porcentagem de Não Fertilizados (21,5% x

25,0%,respectivamente, p = 0,468); porcentagem de desenvolvimento de bons

embriões (66,7% x 60,0%, respectivamente, p = 0,980) e taxas de gestação

(36,7% x 36,4%, respectivamente, p = 0,797) não foram encontradas diferenças

estatisticamente significantes (Tab.13).

47


mutado do polimorfismo C677T do gene MTHFR em mulheres férteis com idade

até 35 anos.

Variáveis Normal

(n=32)

Hetero e Mutado

(n=39) p

Idade ≤ 35 anos


Idade* 30,5 (28,5 – 33,5)

31,0 (29,0 – 34,0)

0,534


9,5

(5,0 – 13,0) 8,0

(6,0 – 15,0) 0,812

% Oócitos Maduros * 87,1 (78,5 – 100)

75,0 (62,5 – 84,2)

0,013


16,7 (10,5 – 28,6)

0,002


54,5 (40,0 – 75,0)

0,543

% NF * 21,5 (9,1 – 36,7)

25,0 (11,1 – 40,0)

0,468

% Bons Embriões * 66,7 (26,8 – 92,9)

60,0 (20,0 – 83,3)

0,797


36,7 36,4 0,980


48

Em relação ao polimorfismo 1298 obtivemos um grupo também com 71

pacientes, 39 no grupo normal e 32 no grupo mutado. Não foram encontradas

diferenças estatisticamente significantes no que diz respeito à idade das

pacientes avaliadas (31,0% x 30,0%, respectivamente, p = 0,561); porcentagem

de oócitos maduros (81,8% x 80,0%, respectivamente, p = 0,608); porcentagem

de oócitos imaturos (12,5% x 12,9%, respectivamente, p = 0,326); porcentagem

de fertilização normal (58,3% x 63,3%, respectivamente, p = 0,867); porcentagem

de Não Fertilizados (25,0% x 25,0%, respectivamente, p = 0,995); porcentagem

de desenvolvimento de bons embriões (60,0% x 66,7%, respectivamente, p =

0,567) e taxas de gestação (39,4% x 33,3%, respectivamente, p = 0,618). Durante

essa avaliação encontramos diferença estatisticamente significante entre os

grupos normal e mutado no que diz respeito ao número de oócitos recuperados

(11,0% x 8,0%, respectivamente, p = 0,024) (Tab.14).

49


mutado do polimorfismo A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade

até 35 anos.

Variáveis Normal

(n=39)

Hetero e Mutado

(n=32) p

Idade ≤ 35 anos


Idade* 31,0 (29,0 – 34,0)

30,0 (29,0 – 32,0)

0,561


11,0

(7,0 – 17,0) 8,0

(5,0 – 12,0) 0,024

% Oócitos Maduros * 81,8 (66,7 – 100)

80,0 (66,7 – 100)

0,608


12,9 (0 – 22,5)

0,326


63,3 (33,3 – 77,5)

0,867

% NF * 25,0 (10,0 – 37,5)

25,0 (9,7 – 40,0)

0,995

% Bons Embriões * 60,0 (30,0 – 75,0)

66,7 (22,5 – 100)

0,567


39,4 33,3 0,618


50

Com o objetivo de avaliar se a ocorrência concomitante dos polimorfismos em

ambos os loci gênicos (677 e 1298) poderia exercer alguma influência em nossos

resultados, dividimos as pacientes dessa nova avaliação em três grupos:

pacientes que não apresentaram polimorfismos em nenhum dos loci, pacientes

que apresentaram polimorfismo em pelo menos um dos loci e pacientes que

apresentaram polimorfismos em ambos os loci concomitantemente. Após a

análise dos dados entre os grupos avaliados: Ausência de polimorfismos (n=19) x

Presença de um polimorfismo (n=41) x Presença de dois polimorfismos (n=22),

não encontramos diferença estatisticamente significante no que diz respeito à

idade das pacientes avaliadas (31,0 x 32,0 x 31,5, respectivamente, p = 0,539);

número de oócitos recuperados (11,0 x 8,0 x 8,0, respectivamente, p = 0,718);

porcentagem de oócitos imaturos (9,1% x 11,1 % x 17,9%, respectivamente, p =

0,100); porcentagem de fertilização normal (60,0% x 57,1% x 61,9%,

respectivamente, p = 0,894); porcentagem de Não Fertilizados (25,0% x 25,0% x



40,0% x 28,6%, respectivamente, p = 0,675). Pudemos observar uma tendência a

maiores resultados no grupo de pacientes com ausência de polimorfismos no que

diz respeito à porcentagem de oócitos maduros recuperados (88,9% x 81,0% x

76,8%, respectivamente, p = 0,061) (Tab.15).

51



C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis.



Polimorfismos

(n=19)


um polimorfismo

(n=41)

Presença de dois

polimorfismos

(n=22)

p


Idade* 31,0

(29,0 – 34,0)

32,0

(29,0 – 34,0)

31,5

(30,0 – 35,0)

0,539

Nº Oócitos*

Recuperados

11,0

(8,0 – 13,0)

8,0

(6,0 – 16,0)

8,0

(6,0 – 12,0)

0,718

% Oócitos

Maduros*

88,9

(76,9 – 100)

81,0

(62,5 – 90,0)

76,8

(66,7 – 83,3)

0,061

% Oócitos

Imaturos *

9,1

(0 – 20,0)

11,1

(0 – 25,0)

17,9

(13,3 – 25,0)

0,100

% Fertilização

Normal*

60,0

(36,3 – 83,3)

57,1

(50,0 – 75,0)

61,9

(40,0 – 75,0)

0,894

% NF* 25,0

(8,3 – 43,8)

25,0

(12,5 – 36,4)

25,0

(8,3 – 40,0)

0,945

% Bons

Embriões*

66,7

(0 – 70,0)

50,0

(25,0 – 80,0)

70,8

(25,0 – 100)

0,524


33,3 40,0 28,6 0,675

52

Realizamos a avaliação em relação aos mesmos grupos Ausência de

Polimorfismos (n=8) x Presença de um polimorfismo (n=17) x Presença de dois

polimorfismos (n=9) em pacientes com idade até trinta anos. Não observamos

diferença estatisticamente significante em relação à idade das pacientes

avaliadas (28,5 x 28,0 x 30,0, respectivamente, p = 0,118); número de oócitos

recuperados (12,0 x 8,0 x 6,0, respectivamente, p = 0,387); porcentagem de

oócitos maduros recuperados (92,3% x 81,0% x 75,0%, respectivamente, p =

0,074); porcentagem de fertilização normal (62,5% x 64,7% x 50,0%,

respectivamente, p = 0,865); porcentagem de Não Fertilizados (20,8% x 20,0% x



33,3% x 37,5%, respectivamente, p = 0,971). Ao avaliarmos a porcentagem de

oócitos imaturos observamos diferença estatisticamente significante entre os

grupos com porcentagem de oócitos imaturos maior no grupo de pacientes

apresentando presença de dois polimorfismos simultaneamente (8,0% x 0 % x

25,0%, respectivamente, p = 0,036) (Tab.16).

Do mesmo modo, foram avaliadas pacientes com idade até 35 anos, mas

assim como na avaliação do grupo de pacientes com idade até 30 anos não foram

observadas diferenças estatisticamente significantes (Tab.17).

53



C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade até 30 anos.



Polimorfismos

(n=8)


um polimorfismo

(n=17)

Idade ≤ 30 anos

Presença de dois

polimorfismos

(n=9)

p


Idade* 28,5

(27,5 – 29,5)

28,0

(25,0 – 29,0)

30,0

(29,0 – 30,0)

0,118

Nº Oócitos*

Recuperados

12,0

(9,0 – 13,0)

8,0

(5,0 – 16,0)

6,0

(5,0 – 12,0)

0,387

% Oócitos

Maduros*

92,3

(82,3 – 100)

81,0

(71,4 – 87,5)

75,0

(66,7 – 80,0)

0,074

% Oócitos

Imaturos *

8,0

(0 – 16,0)

0

(0 – 19,0)

25,0

(16,7 – 25,0)

0,036

% Fertilização

Normal*

62,5

(52,3 – 79,2)

64,7

(50,0 – 80,0)

50,0

(33,3 – 85,7)

0,865

% NF* 20,8

(4,2 – 29,2)

20,0

(0 – 33,3)

25,0

(0 – 36,4)

0,939

% Bons

Embriões*

68,3

(58,3 – 85,0)

50,0

(25,0 – 80,0)

66,7

(20,0 – 83,3)

0,622


37,5 33,3 37,5 0,971

54



C677T e A1298C do gene MTHFR em mulheres férteis com idade até 35 anos.



Polimorfismos

(n=17)


um polimorfismo

(n=37)

Idade ≤ 35 anos

Presença de dois

polimorfismos

(n=17)

p


Idade* 31,0

(29,0 – 34,0)

31,0

(29,0 – 33,0)

30,0

(30,0 – 32,0)

0,928

Nº Oócitos*

Recuperados

12,0

(8,0 – 13,0)

8,0

(5,0 – 16,0)

8,0

(6,0 – 12,0)

0,351

% Oócitos

Maduros*

88,9

(80,0 – 100)

81,0

(62,5 – 90,0)

75,0

(66,7 – 80,0)

0,889

% Oócitos

Imaturos *

9,1

(0 – 20,0)

11,1

(0 – 28,1)

16,7

(13,3 – 25,0)

0,241

% Fertilização

Normal*

62,5

(50,0 – 83,3)

57,1

(37,5 – 75,0)

50,0

(40,0 – 85,7)

0,675

% NF* 16,7

(8,3 – 33,3)

25,0

(12,5 – 37,5)

25,0

(8,3 – 25)

0,737

% Bons

Embriões*

66,7

(44,4 – 70,0)

54,5

(28,6 – 83,3)

66,7

(20,0 – 100)

0,926


37,5 38,7 31,3 0,877

55

5. DISCUSSÃO

O gene da metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) é o gene codificador da

enzima 5-metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) relacionada ao metabolismo

do folato (Goyette et al., 1998). A deficiência de folato e a hiperhomocisteinemia

são fatores de risco para infertilidade e diversos estudos tem demonstrado que

polimorfismos ligados a esse gene exercem um papel importante na fertilidade

feminina (Tamura, Picciano, 2006; Azem et al., 2004; Thaler et al., 2006).

Os polimorfismos C677T e A1298C relacionados a esse gene podem trazer

alterações na atividade específica da enzima MTHFR, como a redução em 35%

na presença do genótipo 677CT, e redução em 70% quando em homozigose na

presença do genótipo 677TT em relação ao genótipo normal 677CC

(Wainfan,Poirier, 1992; De Cabo et al., 1994; Balaghi, Wagner, 1993). Além

disso, esses polimorfismos têm sido também associados às malformações fetais

e perdas gestacionais espontâneas recorrentes (Nelen et al., 1998; Isolato et al.,

2000; Zetterberg et al., 2002).A baixa atividade da enzima MTHFR limita a

viabilidade dos grupos metil provenientes da S-adenosilmetionina, resultando na

hipometilação de diversas moléculas biológicas, incluindo o DNA, devido ao fato

deste estar envolvido na regulação da expressão gênica e manutenção da

integridade genômica (Laird, 2003). Assim, a hipometilação resulta em

instabilidade cromossômica e danos no DNA, levando ao comprometimento das

funções celulares (Eden et al., 2003).

Diversos estudos têm sido realizados para tentar elucidar a influência da

presença dos polimorfismos C677T e A1298C na infertilidade feminina e

masculina, como por exemplo, a incidência do genótipo MTHFR 677 TT e 1298

CC em pacientes com falha de implantação (Azem et al., 2004; Haggarty et al.,

56

2006), assim como o efeito destes na síntese de estradiol folicular (Hech et

al.,2009), ISCA (Altmae et al., 2010), Infertilidade Masculina (Gava et al., 2011),

entre outros.

Nosso estudo foi realizado de duas maneiras, inicialmente com 146 pacientes

as quais apresentavam diversas causas de infertilidade masculinas e femininas.

Posteriormente, com o objetivo de excluir os fatores interferentes na fertilidade

feminina, realizamos as mesmas avaliações somente para pacientes

apresentando fator masculino de infertilidade onde conseguimos agrupar 82

pacientes.

Em nossa análise inicial, onde foram avaliadas pacientes apresentando alelos

normais e mutados para o polimorfismo 677 e 1298, embora não tenhamos

encontrado diferenças estatisticamente significantes em relação às variáveis

laboratoriais como número de oócitos recuperados, porcentagem de oócitos

maduros, porcentagem de fertilização normal, porcentagem de NF, porcentagem

de bons embriões e taxa de gestação, pudemos observar diferenças relevantes

em relação à maturidade oocitária quando avaliamos o polimorfismo 677 do gene

MTHFR. Na avaliação com o grupo total de pacientes (aquelas apresentando

todos os fatores de infertilidade) encontramos uma tendência a maiores

porcentagens de oócitos imaturos no grupo apresentando genótipo mutado,

enquanto que na avaliação realizada com o grupo de pacientes apresentando

apenas fator masculino pudemos observar valores estatisticamente significantes,

revelando também uma porcentagem maior de oócitos imaturos naquelas

pacientes apresentando presença de mutação para o polimorfismo C677T.

Embora, apenas tenhamos obtido resultado estatisticamente significante em

relação à porcentagem de oócitos maduros no grupo de pacientes com fator

57

masculino de fertilidade, em concordância com outros estudos já publicados

anteriormente, acreditamos que esses resultados possam estar relacionados ao

aumento de homocisteína no líquido folicular, o qual pode ter refletido em um

ambiente subótimo para a maturação oocitária como descrito em estudos

anteriores (Szymanski, Kazdepka-Zieminska, 2003; Boxmeer et al., 2008).

Interessantemente ao avaliarmos pacientes com alelos normais e mutados

para o polimorfismo A1298C do gene MTHFR pudemos observar diferença

estatisticamente significante em relação à porcentagem de embriões de boa

qualidade no grupo de pacientes exibindo diversas causas de infertilidade e

alelos mutados (C). Igualmente a esses resultados, observamos nessa mesma

avaliação diferença estatisticamente significante em relação ao número de

oócitos recuperados em pacientes apresentando apenas fator masculino como

causa de infertilidade. Esses resultados são diferentes dos publicados

previamente, pois relata-se que o polimorfismo 1298 exerce influência apenas

quando aparece de maneira concomitante ao polimorfismo 677 (van der Put et

al., 1998; Weisberg et al., 1998; Weisberg et al., 2001). Além disso, recentes

estudos revelaram que a presença do alelo C no polimorfismo 1298 pode estar

relacionada a altas concentrações de FSH basal e diminuição da resposta à

estimulação ovariana (Rosen et al., 2007; Laanpere et al., 2011).

A fim de tentar ser ainda mais rigorosos em relação aos fatores que poderiam

interferir no efeito dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR e sua

relação com as variáveis de infertilidade resolvemos restringir nossos grupos e

realizamos as mesmas avaliações previamente descritas com pacientes

segregadas em grupos com idade até 30 anos e com idade até 35 anos. Sabe-se

que com o aumento da idade feminina inicia-se um declínio na fertilidade, sendo

58

este um processo lento, mas constante em mulheres entre 30 e 35 anos, seguido

de um acelerado declínio com o aumento da idade (Menken J, et al.1986;

ESHRE, 2005). Após essas avaliações, nossos resultados demonstraram que em

pacientes apresentando apenas fator masculino de infertilidade existe diferença

estatisticamente significante entre os grupos normal e mutado do polimorfismo

C677T do gene MTHFR no que diz respeito à porcentagem de oócitos imaturos

recuperados tanto na avaliação das pacientes com idade até 30 anos quanto na

avaliação das pacientes com idade até 35 anos. Entretanto, somente na

avaliação das pacientes com idade até 35 anos encontramos diferença

estatisticamente significante na porcentagem de oócitos maduros, sendo este

maior para o grupo de pacientes apresentando genótipo normal para este

polimorfismo. Além disso, encontramos valores superiores e estatisticamente

significantes para o número de oócitos recuperados no grupo de pacientes com

genótipo normal para o polimorfismo 1298.

Devido ao fato de não terem sido analisados os níveis de homocisteína em

nosso estudo não podemos confirmar se a presença de alelos mutantes nos

polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR realmente reduz a metilação de

homocisteína em metionina, mas esses resultados entram do mesmo modo em

concordância com relatos da literatura, onde a presença do alelo mutante no

polimorfismo 677 pode influenciar as concentrações intrafoliculares de

homocisteína e em consequência disso tornar esse ambiente hostil à maturação

oocitária (Boxmeer et al., 2008).

Considerando as outras variáveis avaliadas as quais não obtivemos diferença

estatística, os dados estão consistentes com outros estudos anteriormente

realizados, exceto pela avaliação da maturidade oocitária. No estudo realizado

59

por Dobson et al., em 2007 foram avaliados 197 casais submetidos a ciclos de

reprodução assistida, sendo estudada a associação entre os polimorfismos

C677T e A1298C do gene MTHFR presentes em homens e mulheres, em relação

ao sucesso de gestação e resultados laboratoriais.

Nesse estudo o autor segregou as pacientes em três grupos de genótipos:

normal, heterozigoto e mutante e avaliou a presença dos genótipos C677T e

A1298C individualmente e simultaneamente. Em ambas as avaliações esse

estudo não encontrou associação entre a presença dos polimorfismos e

resultados laboratoriais como número e qualidade dos embriões transferidos,

além de taxas de gestação nos ciclos de fertilização assistida realizados.

Outro estudo recente avaliou retrospectivamente 273 pacientes submetidas a

ciclos de fertilização in vitro, as quais foram analisadas em dois grupos, um grupo

apresentando mutação em homozigose para o polimorfismo C677T do gene

MTHFR e outro grupo com ausência de mutação. Esse estudo demonstrou que o

grupo de pacientes apresentando mutação necessitava de mais tempo de

estimulação e maiores doses de FSH recombinante em relação ao grupo de

pacientes com genótipo normal. Além disso, o grupo de pacientes com genótipo

normal apresentou maiores taxas de fertilização nos ciclos de FIV realizados

quando comparadas aquelas do grupo mutado (73,4% x 62,6%, p<0,01).

Entretanto, apresentaram taxas de implantação e gestação equivalentes entre os

grupos avaliados. Dessa maneira, esse estudo sugeriu que a mutação C677T do

gene MTHFR não afeta os resultados de FIV (Marci et al., 2012).

Outro estudo ainda correlacionou a presença do polimorfismo C677T com

qualidade embrionária através da avaliação das variantes genéticas do

60

metabolismo do folato e resultados de FIV em 439 mulheres submetidas a ciclos

de fertilização assistida. Esse estudo concluiu que em relação ao polimorfismo

C677T do gene MTHFR, pacientes apresentando genótipo em heterozigose CT

apresentam maiores proporções de embriões de melhor qualidade e aumento

das chances de gestação quando comparadas as pacientes apresentando

genótipos em homozigose TT ou genótipos normal CC (Laanpere et al., 2011).

Embora tenhamos encontrado alguns resultados estatisticamente

significativos em pacientes com alelo mutado para o polimorfismo 1298, já é

postulado que a mutação MTHFR A1298C tanto no seu estado homozigoto

mutante (CC) ou heterozigótico (AC), parece não ocasionar elevações do nível da

homocisteína plasmática quando ocorre de maneira isolada. No entanto, pode

trazer prejuízos quando aparecer concomitantemente em heterozigose com a

mutação no loci 677 (duplo heterozigoto), C677T e A1298C, produzindo um

genótipo 677CT/1298AC (van der Put et al., 1998; Weisberg et al., 1998;

Weisberg et al., 2001). Por essa razão, examinamos também três grupos de

pacientes comparando: a presença do polimorfismo na posição 1298 de forma

concomitante ao polimorfismo na posição 677 versus a presença de pelo menos

um dos polimorfismos versus ausência dos dois polimorfismos. Entretanto, após a

realização dessas análises estatísticas tanto com o grupo apresentando as

diversas causas de infertilidade, como com o grupo com infertilidade por fator

masculino, avaliando pacientes com idade até 35 anos e com idade até 30 anos,

observamos novamente diferença estatisticamente significante apenas na

porcentagem maior de oócitos imaturos recuperados em pacientes apresentando

dois polimorfismos simultaneamente, infertilidade devido a fator masculino e idade

até 30 anos. Não observamos diferença dos resultados entre os grupos em

61

nenhuma das outras variáveis laboratoriais avaliadas.

Alguns estudos demonstraram que os altos níveis de homocisteína no líquido

folicular podem causar diminuição nas divisões celulares e alta fragmentação

embrionária, o que significa decréscimo tanto na qualidade oocitária quanto na

qualidade embrionária (Aitken et al., 1991; Berker et al., 2009). Embora tenhamos

apenas encontrado uma tendência à embriões de melhor qualidade em pacientes

com genótipo normal para o polimorfismo 677 do gene MTHFR, podemos

entender que este estudo está em concordância com outros estudos publicados

até o momento. Existe realmente uma grande preocupação em relação ao efeito

da ausência de ácido fólico, consequente hiperhomocisteínemia e mudanças na

hipometilação do DNA, pois processos epigenéticos complexos podem modificar

o estado genômico de metilação, fundamental na regulação gênica dos

mamíferos (Razin, Shemer, 1995). Além disso, os grupos Metil passam de ácido

fólico através de uma série de enzimas, contribuindo para a produção de S-

adenosilmetionina (SAM), o último doador metil envolvido em centenas de

reações biológicas de transmetilação. Dessa maneira, o ácido fólico torna-se

indispensável ao desenvolvimento embrionário (Lucock, 2000; Khosla et al., 2001;

Shi, Haaf, 2002).

Ainda que as consequências das altas concentrações de homocisteína no

fluído folicular não estejam totalmente claras, sabe-se que a homocisteína é um

thiol conhecido por liberar espécies reativas de oxigênio (ROS), sendo este um

fator importante para a maturação oocitária e fertilização. Altas concentrações de

ROS nos meios de cultura embrionárias têm demonstrado resultados como baixas

taxas de clivagem, altos índices de fragmentação embrionários, além de baixas

taxas de formação de blastocistos (Bedaiwy et al., 2004).

62

Dessa maneira, essa tendência a influenciar a qualidade embrionária talvez

seja consequência de alterações na metilação do DNA, resultando assim em

falência do desenvolvimento embrionário. Os embriões de fertilização in vitro são

comumente cultivados em meio de cultura carente de ácido fólico, vitamina B12,

metionina, S-adenosilmetionina (SAM), metabólitos e cofatores necessários a

metilação do DNA e outras proteínas e lipídios essenciais. Além do mais,

elevados níveis de SAM inibem alostericamente a MTHFR e a inabilidade de

processar a homocisteína e a metionina, ou remover a trans-sulfuração, leva a

elevação dos níveis de S-adenosilhomocisteína (SAH), a qual inibe a metilação de

DNA (De Cabo et al., 1994; Lee, Zhu, 2006 Matthews et al., 1984; Jencks,

Mathews, 1987).

Acreditamos que algumas limitações possam ter influenciado alguns de

nossos resultados. Inicialmente, a maior limitação de nosso estudo foi o baixo

número de pacientes que pode ter reduzido o poder estatístico de nossa

avaliação, trazendo dessa maneira resultados inferiores aos esperados.

Encontramos também outras limitações como a heterogeneidade de

características étnicas da população estudada, o que dificultou estabelecer um

perfil epidemiológico em relação aos polimorfismos C677T e A1298C do gene

MTHFR. Este fato deve-se a mistura étnica presente na população brasileira

estudada, ocorrida durante a sua formação, principalmente entre os grupos

parentais Ameríndio, Africano e Europeu.

Outro fator que também deve ser levado em consideração deve-se ao fato de

que foi indicado às pacientes o uso de ácido fólico (5 mg/dia) a fim de prevenir

defeitos no tubo neural. Por essa razão, o efeito negativo dos polimorfismos

C677T e A1298C do gene MTHFR pode ter sido potencialmente aliviado pela

63

administração das doses de ácido fólico pré-concepção, especialmente em

pacientes homozigotos T/T para o polimorfismo 677, pois o regime terapêutico

tem demonstrado ser mais efetivo em indivíduos que carregam a mutação em

ambos os alelos (Malinow et al., 1997). As deficiências severas de folato pré-

concepção e durante a gestação podem trazer problemas no desenvolvimento de

oócitos, foliculogènese, receptividade endometrial, implantação e

desenvolvimento fetal. Além disso, estudos recentes demonstraram correlação

positiva entre as concentrações de homocisteína folicular e o diâmetro dos

folículos (Boxmeer et al., 2008). Em 2007 foi realizado um estudo com 48 casais

onde as mulheres apresentavam elevadas concentrações de homocisteína, ao

dividirem essas pacientes em dois grupos, com e sem tratamento para

hiperomocisteinemia, observaram-se melhores resultados em relação às taxas de

gravidez no grupo com tratamento versus o grupo sem tratamento (47,8% x

17,3%), taxas de implantação (21,4% x 9,2%) e piores resultados em relação às

taxas de aborto (18,2% x 50%) (Pacchiarotti et al., 2007). Assim, a deficiência

severa de folato materno pré-concepção e durante a gestação tem sido

demonstrada como um fator que dificulta a fertilidade feminina e a viabilidade fetal

em diversos modelos animais, sendo o folato enfatizado essencialmente durante

o desenvolvimento folicular de mamíferos e desenvolvimento fetal (Mooij et al.,

1992). Em humanos a suplementação com ácido fólico pré concepção exerce um

efeito significativo nas concentrações de homocisteína intrafolicular o qual

influencia o microambiente de maturação oocitária além de posteriormente

impedir o comprometimento da qualidade dos embriões (Boxmeer et al., 2008).

Além do mais, o uso regular de suplementos multivitamínicos incluindo o folato

tem sido relatado como fator de diminuição dos riscos de infertilidade ovulatória

64

(Chavarro et al., 2008). Alguns outros riscos importantes devem ser levados em

consideração como complicações na gravidez, pois todos esses processos estão

envolvidos no desenvolvimento de oócitos, preparação da receptividade

endometrial, implantação embrionária e gravidez (Tamura, Picciano, 2006).

Dessa maneira, os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR estão

associados ao sucesso de ciclos de FIV e altas concentrações de folato antes da

gestação podem aumentar as chances de gestação gemelar, embora não

garantam o sucesso nos resultados dos ciclos de FIV (Haggatty et al., 2006).

Além disso, sabe-se que o genótipo do gene MTHFR está relacionado à

capacidade da mãe produzir embriões de melhor qualidade e que caso o

potencial genético exista, as concentrações de folato podem aumentar o potencial

de embriões viáveis aumentando então as chances de sucesso de bebês

nascidos (Haggatty et al., 2006).

Apesar das mutações do gene MTHFR já terem sido relacionadas a doenças

como a Síndrome de Down (James et al., 1999), malformações do tubo-neural e

outras malformações (Finnell et al., 1998; van der Put, et al., 1995), complicações

gestacionais (Ray et al., 1999) e perdas gestacionais recorrentes (Nelen et al.,

1998; Isolato et al., 2000; Zetterberg et al. 2002), as pesquisas em relação ao

papel dos polimorfismos C677T e A1298C na fertilidade estão em fase inicial e

ainda existem poucos estudos explorando a real influência desses polimorfismos

nos ciclos de fertilização in vitro. Dessa maneira, acreditamos que nosso estudo

vem enriquecer um pouco mais a literatura a respeito dos dados laboratoriais em

fertilização in vitro relacionados a esses polimorfismos principalmente em uma

população heterogênea como a população brasileira.

65

6. CONCLUSÕES

1. O polimorfismo C677T do gene MTHFR demonstrou associação com a

porcentagem de oócitos maduros e imaturos em ciclos de fertilização in

vitro.

2. O polimorfismo A1298C do gene MTHFR demonstrou associação com o

número de oócitos recuperados e qualidade de embriões provenientes de

fertilização in vitro.

66

7. ANEXOS

ANEXO 1:

Autorização do comitê de ética em pesquisa Faculdade Medicina ABC

67

ANEXO 2:

Registro na comissão nacional de ética em pesquisa (CONEP)

68

ANEXO 3:

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

AVALIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS 677 E 1298DO GENE MTHFR E SUA

CORRELAÇÃO COM OS INDICADORES DE FERTILIDADE EM

MULHERES INFÉRTEIS SUBMETIDAS A CICLOS DE REPRODUÇÃO

HUMANA ASSISTIDA

As seguintes informações estão sendo fornecidas para sua participação voluntária neste estudo. Nesta avaliação serão estudadas mulheres com infertilidade com o objetivo de avaliar fatores genéticos envolvidos nos resultados de reprodução assistida.

Serão obtidas amostras de 15 ml de sangue, por meio de coleta da veia do

antebraço, que serão utilizados para extração de DNA. Será utilizado material

estéril e descartável. Os desconfortos decorrentes da coleta podem ser dor e

vermelhidão no local, porém este procedimento não tem apresentado

complicações na clínica diária.

A qualquer etapa do estudo o paciente ou seu responsável terá acesso aos

profissionais relacionados com a pesquisa para o esclarecimento de dúvidas.

Os principais investigadores são Priscila Queiroz DÉlia e Prof. Dra. Denise

Maria Christofolini, que podem ser encontrados na FMABC, Rua Príncipe de

Gales 821, Departamento de Ginecologia, Disciplina de Genética e

reprodução Humana, telefone 11 – 4438-7299.

É garantida a liberdade de retirada de consentimento a qualquer momento e

deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade do seu

tratamento na instituição.

As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros pacientes,

não sendo divulgada a identificação de nenhum paciente. Os resultados

obtidos estarão à disposição do paciente.

Não há despesas pessoais decorrentes da pesquisa para o participante em

qualquer fase do estudo, incluindo exames e consulta. Também não há

compensação financeira relacionada à participação.

Na eventualidade de ocorrer qualquer dano pessoal causado direta ou

indiretamente pelos procedimentos propostos neste estudo (nexo casual

comprovado), o participante terá direito a tratamento médico na instituição,

bem como às indenizações legalmente estabelecidas.

Acredito ter sido suficientemente esclarecido a respeito das informações que li

ou que foram lidas para mim, descrevendo o estudo. Por esse documento eu declaro minha decisão de participar do estudo. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os

69

procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades, prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido.

---------------------------------------------------------------------------------Data

Assinatura do participante

Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento livre e

Esclarecido deste paciente ou seu representante legal para participação neste

estudo.

-------------------------------------------------------------------------------Data

Assinatura do responsável pelo estudo

70

ANEXO 4:

Planilha de Dados

Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº

Oócitos

% Oóc.Mad

% Oóc.Imat.

% Fert. Total

% Fert.

Normal

% Fert.

Anormal

% NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

1 LFFK Fator Masculino 25 Normal Homozigoto Positiva 16 81,3 12,5 80,0 80,0 0,0 20,0 50 50

3 MMG Fator Masculino 30 Homozigoto Homozigoto Negativa 6 50 33,3 100,0 100,0 0,0 0,0 66,7 33,3

4 ACM Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 21 81,0 19,0 88,2 70,6 20,0 5,9 76,9 23,1

6 KCMC Fator Masculino 34 Homozigoto Normal Negativa 20 100 0 80,0 50,0 37,5 20,0 30 70

7 VEMG Fator Masculino 30 Normal Normal Positiva 5 80 20 75,0 75,0 0,0 25,0 100 0

9 MS Fator Masculino 31 Normal Normal Positiva 8 100 0 87,5 62,5 28,6 12,5 100 0

11 SGC Fator Masculino 29 Homozigoto Normal Negativa 21 81,0 19,0 64,7 64,7 0,0 5,9 45,5 54,5

13 CRS Fator Masculino 35 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 66,7 16,7 40,0 40,0 0,0 60,0 100 0

18 RVR Casal

Sorodiscordante 34 Homozigoto Normal Negativa 6 83,3 16,7 80,0 80,0 0,0 20,0 40 60

19 GLR Fator Masculino 30 Normal Heterozigoto Negativa 8 100 0 62,5 50,0 20,0 12,5 50 50

24 ECSH Fator Masculino 32 Homozigoto Normal Negativa 19 84,2 10,5 68,8 68,8 0,0 31,3 90,9 9,1

26 LPM Endometriose I 28 Normal Normal Negativa 3 66,7 0,0 100,0 50,0 50,0 0,0 100 0

28 MYIH Fator Tubo Peritoneal 37 Heterozigoto Normal Negativa 10 100,0 0,0 80,0 50,0 37,5 0,0 100 0

33 ACPR Fator Tubo Peritoneal 36 Homozigoto Normal Negativa 4 100,0 100,0 100,0 100,0 0,0 0,0 50 50

39 VPS Fator Masculino 29 Normal Normal Negativa 13 84,6 7,7 45,5 36,4 20,0 54,5 50 50

40 FCO Fator Masculino 33 Heterozigoto Normal Positiva 9 100 0 66,7 55,6 16,7 33,3 100 0

46 ACS Fator Masculino 36 Normal Heterozigoto Negativa 7 85,7 14,3 50,0 50,0 0,0 33,3 0 100

50 DOPG Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 17 94,1 5,9 56,3 50,0 11,1 43,8 0 100

52 FRJM Fator Masculino 35 Homozigoto Normal Positiva 15 46,7 53,3 50,0 37,5 25,0 37,5 0 100

53 AAAO Fator Masculino 32 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 15 80 13,3 91,7 91,7 0,0 8,3 81,8 18,2

71

Registro Nome Indicação Idade Polim.677 Polim.1298 Gestação Nº Oócitos %

Oóc.Mad %

Oóc.Imat. %

Fert. Total %

Fert. Normal %

Fert. Anormal % NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

54 LRSLS Fator Masculino 25 Normal Heterozigoto Positiva 5 80 20 75,0 75,0 0,0 0,0 25 75

56 ACN Casal Sorodiscordante 34 Heterozigoto Normal Negativa 3 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100

57 SF Fator Masculino 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 66,7 16,7 75,0 75,0 0,0 25,0 0 100

59 JRL Fator Masculino 30 Heterozigoto Normal Negativa 7 71,4 28,6 80,0 80,0 0,0 20,0 75 25

60 ACL Casal Sorodiscordante 31 Heterozigoto Normal Positiva 12 83,3 0,0 90,0 80,0 11,1 10,0 12,5 87,5

67 CSA ISCA 27 Heterozigoto Heterozigoto Não Transferido 23 100,0 0,0 78,3 69,6 11,1 21,7 93,8 6,25

70 EGILV Fator Masculino 33 Homozigoto Normal Positiva 8 50 25 75,0 75,0 0,0 25,0 33,3 66,7

71 FM ISCA 33 Normal Heterozigoto Positiva 6 66,7 33,3 50,0 16,7 66,7 50,0 100 0

73 DRSB Fator Tubo Peritoneal 36 Normal Heterozigoto Negativa 8 100,0 0,0 87,5 75,0 14,3 12,5 66,7 33,3

81 JRCV Endometriose I 33 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 3 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100

90 ARLT ISCA 37 Heterozigoto Normal Negativa 5 80,0 0,0 100,0 75,0 25,0 0,0 33,3 66,7

91 FM Fator Masculino 35 Normal Normal Não Transferido 9 88,9 11,1 25,0 0,0 100,0 62,5 0 0

95 EMA Fator Masculino 32 Normal Heterozigoto Positiva 15 86,7 13,3 76,9 69,2 10,0 23,1 11,1 88,9

96 AASM Endometriose II 32 Normal Heterozigoto Positiva 8 62,5 0,0 80,0 80,0 0,0 20,0 0 100

99 VGGS Fator Tubo Peritoneal 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 4 75,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 66,7 33,3

102 DBS Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 4 75 25 66,7 66,7 0,0 0,0 100 0

104 CDS Fator Masculino 29 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 12 66,7 25 75,0 50,0 33,3 25,0 100 0

108 VJSL Fator Tubo Peritoneal 32 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 75,0 12,5 75,0 62,5 16,7 0,0 80 20

110 TCS Fator Tubo Peritoneal 35 Heterozigoto Normal Negativa 5 100,0 0,0 80,0 80,0 0,0 0,0 75 25

112 FAZ Fator Masculino 28 Heterozigoto Normal Positiva 8 87,5 12,5 71,4 57,1 20,0 0,0 75 25

72


Oóc.Mad %

Oóc.Imat. %

Fert. Total %

Fert. Normal %

Fert. Anormal % NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

117 JO Casal Sorodiscordante 29 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 16 81,3 18,8 23,1 23,1 0,0 69,2 33,3 66,7

121 GSPP Fator Masculino 22 Homozigoto Normal Negativa 4 100 0 50,0 25,0 50,0 50,0 100 0

124 MBN Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Não Transferido 12 66,7 25 33,3 33,3 0,0 33,3 25 75

126 ABL Fator Masculino 34 Homozigoto Normal Não Transferido 24 45,8 50 54,5 54,5 0,0 36,4 54,5 45,5

128 RMSE Fator Masculino 29 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 83,3 16,7 40,0 20,0 50,0 60,0 0 100

132 GF ISCA 36 Heterozigoto Normal Negativa 15 100,0 0,0 40,0 40,0 0,0 60,0 33,3 66,7

135 JBNS Fator Masculino 34 Normal Heterozigoto Não Transferido 4 100 0 25,0 0,0 100,0 50,0 0 0

138 AMRS Fator Tubo Peritoneal 36 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 7 71,4 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 80 20

139 PF Fator Masculino 26 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 14 78,6 14,3 45,5 45,5 0,0 36,4 20 80

144 SCSA Fator Masculino 28 Normal Normal Positiva 12 100 0 91,7 83,3 9,1 8,3 70 30

145 ROJ Fator Masculino 31 Normal Normal Positiva 8 100 0 75,0 75,0 0,0 25,0 66,7 33,3

146 TCSL Fator Masculino 23 Normal Heterozigoto Negativa 18 27,8 0 100,0 100,0 0,0 0,0 80 20

151 AMF ISCA 34 Normal Heterozigoto Negativa 4 100,0 0,0 50,0 25,0 50,0 50,0 50 50

156 KSLO Fator Tubo Peritoneal 32 Heterozigoto Normal Negativa 7 85,7 14,3 85,7 85,7 0,0 0,0 66,7 33,3

159 AB Fator Tubo Peritoneal 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 83,3 16,7 100,0 100,0 0,0 0,0 80 20

160 FACV Fator Masculino 29 Normal Normal Negativa 6 100 0 66,7 50,0 25,0 0,0 66,7 33,3

161 PMS ISCA 32 Heterozigoto Normal Negativa 7 28,6 57,1 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100

163 DCSV Fator Masculino 36 Normal Normal Negativa 8 75 12,5 33,3 33,3 0,0 50,0 0 100

164 LGR Fator Masculino 31 Heterozigoto Normal Não Transferido 32 62,5 28,1 80,0 80,0 0,0 15,0 47,8 52,2

168 MFS ISCA 36 Homozigoto Heterozigoto Negativa 11 63,6 18,2 57,1 57,1 0,0 42,9 100 0

73


Oóc.Mad %

Oóc.Imat. %

Fert. Total

% Fert.

Normal

% Fert.

Anormal

% NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

177 RGA Fator Masculino 36 Normal Normal Negativa 3 100 0 33,3 33,3 0,0 33,3 0 100

188 AKN ISCA 30 Normal Homozigoto Negativa 20 60,0 40,0 100,0 83,3 16,7 0,0 70 30

189 RHC Casal Sorodiscordante 36 Heterozigoto Normal Negativa 5 80,0 20,0 100,0 50,0 50,0 0,0 50 50

192 KMC Fator Tubo Peritoneal 35 Normal Normal Positiva 6 66,7 16,7 75,0 75,0 0,0 0,0 33,3 66,7

195 RCZ Fator Masculino 26 Normal Normal Negativa 12 100 8,3 66,7 66,7 0,0 33,3 100 0

198 CC Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 7 85,7 14,3 66,7 66,7 0,0 33,3 50 50

202 JJNA Fator Masculino 27 Heterozigoto Normal Não Transferido 7 71,4 28,6 0,0 0,0 * 83,3 0 0

205 SLR Fator Masculino 33 Heterozigoto Normal Negativa 6 50 50 33,3 33,3 0,0 66,7 100 0

209 RSP Fator Masculino 20 Heterozigoto Normal Positiva 5 80 0 75,0 50,0 33,3 0,0 50 50

210 FALS Fator Masculino 31 Normal Heterozigoto Positiva 3 66,7 33,3 33,3 33,3 0,0 33,3 100 0

211 ASV Fator Masculino 32 Normal Heterozigoto Positiva 8 62,5 0 80,0 60,0 25,0 20,0 66,7 33,3

214 SEM ISCA 31 Normal Normal Não Transferido 4 50,0 0,0 0,0 0,0 * 100,0 0 0

219 CAC Endometriose I 34 Normal Heterozigoto Negativa 7 57,1 42,9 75,0 75,0 0,0 25,0 100 0

224 RAP Fator Masculino 31 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 5 80 0 25,0 25,0 0,0 25,0 100 0

228 EVC Fator Masculino 24 Normal Homozigoto Negativa 22 27,3 0 33,3 33,3 0,0 50,0 0 100

229 TASC Fator Masculino 27 Heterozigoto Normal Não Transferido 21 57,1 28,6 58,3 50,0 14,3 25,0 16,7 83,3

233 MPBT Fator Tubo Peritoneal 30 Heterozigoto Normal Negativa 7 85,7 14,3 66,7 66,7 0,0 33,3 50 50

238 NJC Fator Masculino 32 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 62,5 37,5 60,0 40,0 33,3 40,0 50 50

243 CNKK Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 10 40 50 25,0 25,0 0,0 75,0 100 0

245 RFS Fator Masculino 27 Normal Normal Negativa 13 84,6 15,4 90,9 54,5 40,0 0,0 66,7 33,3

74


Oóc.Mad %

Oóc.Imat. %

Fert. Total %

Fert. Normal %

Fert. Anormal % NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

250 ASP Endometriose 37 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 11 72,7 27,3 62,5 50,0 20,0 37,5 100 0

252 FCDR Aborto de Repetição 27 Heterozigoto Normal Positiva 11 90,9 0,0 90,0 80,0 11,1 10,0 11,1 88,9

254 CBL Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 21 66,7 23,8 57,1 57,1 0,0 42,9 75 25

262 CGFL Fator Masculino 27 Homozigoto Heterozigoto Negativa 5 80 20 100,0 100,0 0,0 0,0 75 25

263 MAS Fator Tubo Peritoneal 36 Normal Homozigoto Negativa 13 46,2 0,0 83,3 83,3 0,0 16,7 40 60

271 AMPM Fator Masculino 30 Normal Normal Positiva 18 66,7 16,7 83,3 83,3 0,0 16,7 70 30

275 SMSA Fator Masculino 30 Normal Heterozigoto Negativa 3 100 0 66,7 66,7 0,0 33,3 100 0

278 SRS Fator Masculino 29 Normal Heterozigoto Negativa 5 80 0 25,0 25,0 0,0 75,0 100 0

280 EARS Endometriose I 31 Normal Normal Não Transferido 8 25,0 75,0 0,0 0,0 * 100,0 0 0

286 MAP Fator Masculino 37 Heterozigoto Normal Negativa 9 66,7 11,1 66,7 50,0 25,0 16,7 0 100

288 MGOF Fator Masculino 34 Heterozigoto Normal Não Transferido 22 81,8 13,6 77,8 72,2 7,1 22,2 75 25

289 CMO Fator Masculino 29 Normal Homozigoto Negativa 8 87,5 0 100,0 100,0 0,0 0,0 85,7 14,3

291 APMM Endometriose I 35 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 18 94,4 11,1 94,1 76,5 18,8 0,0 84,6 15,4

293 RMS Fator Masculino 31 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 24 83,3 12,5 75,0 66,7 11,1 4,2 100 0

295 BMSMS Fator Masculino 36 Heterozigoto Normal Positiva 38 10,5 0 75,0 75,0 0,0 25,0 66,7 33,3

304 SCGB ISCA 32 Heterozigoto Normal Positiva 7 85,7 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 83,3 16,7

307 SOSP Fator Masculino 29 Homozigoto Normal Negativa 3 100 0 66,7 66,7 0,0 33,3 0 100

312 JRL Fator Masculino 31 Heterozigoto Normal Negativa 8 62,5 12,5 100,0 100,0 0,0 0,0 60 40

314 RIM Fator Masculino 35 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 8 75 25 50,0 50,0 0,0 50,0 66,7 33,3

317 AAGB Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 3 100 0 33,3 33,3 0,0 66,7 0 100

75


Oóc.Mad %

Oóc.Imat. %

Fert. Total %

Fert. Normal %

Fert. Anormal % NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

318 KB ISCA 35 Normal Heterozigoto Negativa 4 100,0 0,0 100,0 75,0 25,0 0,0 75 25

319 GLS Fator Tubo Peritoneal 37 Heterozigoto Normal Negativa 8 87,5 12,5 85,7 85,7 0,0 14,3 83,3 16,7

320 CHS Endometriose I 31 Normal Heterozigoto Positiva 15 86,7 13,3 76,9 69,2 10,0 23,1 88,9 11,1

324 VMDGG Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 18 66,7 33,3 91,7 83,3 9,1 8,3 70 30

326 GCV Fator Masculino 32 Heterozigoto Normal Negativa 9 88,9 11,1 75,0 50,0 33,3 12,5 50 50

328 EMGDP Fator Tubo Peritoneal 36 Heterozigoto Normal Negativa 7 57,1 14,3 75,0 75,0 0,0 0,0 100 0

332 LGS ISCA 36 Normal Normal Negativa 10 100,0 0,0 90,0 50,0 44,4 0,0 57,1 42,9

340 RPS ISCA 32 Normal Normal Negativa 10 100,0 0,0 90,0 80,0 11,1 0,0 87,5 12,5

345 MRML Fator Masculino 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 9 100 0 88,9 88,9 0,0 11,1 0 100

346 APS Fator Masculino 35 Heterozigoto Normal Negativa 6 50 50 33,3 33,3 0,0 66,7 0 100

349 AMCP Fator Masculino 29 Heterozigoto Normal Positiva 13 84,6 7,7 81,8 81,8 0,0 18,2 66,7 33,3

354 FVL Fator Tubo Peritoneal 30 Heterozigoto Normal Positiva 8 87,5 12,5 75,0 62,5 16,7 12,5 60 40

357 MAZPS Fator Tubo Peritoneal 28 Heterozigoto Normal Negativa 5 100,0 0,0 80,0 80,0 0,0 20,0 20 80

360 EMT ISCA 33 Normal Heterozigoto Negativa 6 100,0 0,0 50,0 50,0 0,0 50,0 66,7 33,3

362 EB Endometriose II 31 Normal Normal Positiva 7 71,4 28,6 60,0 60,0 0,0 40,0 66,7 33,3

364 DPS Fator Masculino 36 Homozigoto Normal Positiva 12 100 0 100,0 58,3 41,7 0,0 28,6 71,4

365 FLNJ Fator Masculino 33 Normal Normal Positiva 11 90,9 9,1 90,0 90,0 0,0 10,0 44,4 55,6

369 FBZ Endometriose 30 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 6 100,0 0,0 100,0 83,3 16,7 0,0 40 60

371 ACI Fator Tubo Peritoneal 32 Homozigoto Normal Negativa 6 100,0 0,0 83,3 50,0 40,0 16,7 100 0

373 KCOB Fator Tubo Peritoneal 34 Normal Normal Negativa 5 60,0 20,0 33,3 33,3 0,0 0,0 100 0

76


Oóc.Mad %

Oóc.Imat. %

Fert. Total %

Fert. Normal %

Fert. Anormal % NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

376 POP Fator Masculino 36 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 87,5 0 85,7 71,4 16,7 14,3 60 40

378 KMA ISCA 37 Heterozigoto Normal Não Transferido 3 100,0 0,0 33,3 0,0 100,0 66,7 0 0

390 RAL Endometriose 33 Normal Normal Negativa 3 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100

393 MN Endometriose II 32 Heterozigoto Homozigoto Negativa 6 66,7 16,7 80,0 40,0 50,0 0,0 50 50

395 RAS Endometriose 35 Homozigoto Normal Negativa 7 100,0 0,0 71,4 71,4 0,0 14,3 80 20

396 CCR Fator Tubo Peritoneal 34 Normal Normal Negativa 7 85,7 14,3 100,0 100,0 0,0 0,0 50 50

397 AALD Endometriose I 31 Heterozigoto Normal Negativa 10 70,0 30,0 71,4 57,1 20,0 28,6 50 50

398 MSP Fator Masculino 34 Normal Normal Negativa 13 76,9 23,1 80,0 60,0 25,0 10,0 0 100

403 MMCB Fator Masculino 34 Heterozigoto Normal Positiva 12 66,7 33,3 50,0 50,0 0,0 50,0 83,3 16,7

408 PACX ISCA 26 Normal Homozigoto Negativa 6 100,0 0,0 83,3 66,7 20,0 0,0 75 25

411 HML ISCA 34 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 5 100,0 0,0 60,0 40,0 33,3 20,0 0 100

412 SCOS Endometriose I 37 Heterozigoto Normal Negativa 4 75,0 0,0 100,0 33,3 66,7 0,0 0 100

413 MGF Fator Masculino 34 Normal Heterozigoto Negativa 4 100 0 75,0 75,0 0,0 25,0 66,7 33,3

421 VBB Fator Masculino 32 Normal Heterozigoto Negativa 10 90 10 77,8 66,7 14,3 11,1 28,6 71,4

423 JFMS Fator Masculino 32 Normal Normal Negativa 5 80 20 100,0 100,0 0,0 0,0 0 100

424 PVLB Fator Tubo Peritoneal 35 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 17 82,4 17,6 85,7 78,6 8,3 7,1 45,5 54,5

428 LCT Fator Masculino 34 Normal Heterozigoto Negativa 5 100 0 40,0 20,0 50,0 40,0 100 0

431 DPDO Fator Tubo Peritoneal 37 Normal Normal Negativa 10 80,0 10,0 100,0 75,0 25,0 0,0 33,3 66,7

436 CVRC Fator Masculino 37 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 8 37,5 37,5 66,7 33,3 50,0 33,3 100 0

439 SCS Endometriose I 34 Normal Normal Negativa 6 50,0 16,7 66,7 33,3 50,0 33,3 0 100

77


Oóc.Mad %

Oóc.Imat. %

Fert. Total %

Fert. Normal %

Fert. Anormal % NF

% Bons

Embriões

% Embriões

Ruins

445 VGRP ISCA 34 Homozigoto Normal Negativa 5 100 0 80,0 80,0 0,0 20,0 75 25

457 LFS Fator Masculino 28 Normal Normal Negativa 12 100 0 75,0 58,3 22,2 25,0 50 50

470 LMS Fator Masculino 30 Heterozigoto Heterozigoto Positiva 11 63,6 36,4 85,7 85,7 0,0 14,3 83,3 16,7

489 MRNA ISCA 34 Normal Heterozigoto Negativa 3 100 0 66,7 33,3 50,0 33,3 100 0

490 APC ISCA 36 Normal Heterozigoto Negativa 5 100 0 60,0 60,0 0,0 40,0 100 0

492 APPMC Endometriose I 30 Heterozigoto Heterozigoto Negativa 5 100 0 80,0 80,0 0,0 20,0 100 0

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8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Introdução: Acredita-se que o folato apresente crucial importância nos processos de reprodução humana e, que sua deficiência possa comprometer a função das vias metabólicas relacionadas, conduzindo a um acúmulo de homocisteína (hcy). O gene MTHFR codificador da enzima 5-MTHFR que metaboliza essas reações e os polimorfismos C677T e A1298C desse gene estão relacionados à diminuição da atividade enzimática e consequente alterações nos níveis de hcy. Essas alterações relacionam-se a diversas doenças e comprometem etapas do mecanismo reprodutivo.

Objetivo: Verificar o impacto entre os polimorfismos do gene MTHFR e variáveis laboratoriais em mulheres brasileiras submetidas às técnicas de reprodução assistida (TRA).

Casuística e Métodos: Estudo prospectivo, realizado no Serviço de Reprodução Humana da Faculdade de Medicina do ABC – Instituto Ideia Fértil, de Dezembro 2010 a Abril 2012, onde em 146 mulheres foi realizada genotipagem para os polimorfismos 677 e 1298 do gene MTHFR e avaliação dos resultados laboratoriais e gestação. Para a análise estatística utilizou-se teste de Shapiro-Wilk (p<0,05), Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e qui-quadrado. As pacientes foram separadas em dois grupos (diversas causas de infertilidade e apenas fator masculino) e avaliadas de três maneiras: pacientes com até 37 anos, pacientes com até 35 anos e pacientes com até 30 anos. Para os três grupos foram comparados polimorfismo ausente (normais) x polimorfismo presente (mutado) nos pontos 677 e 1298 e presença do genótipo mutado 677 e 1298 concomitantemente. Os dados foram analisados em relação a idade, número de oócitos recuperados, (%) oócitos maduros, (%) oócitos imaturos, (%) fertilização normal, (%) NF, (%) bons embriões e taxas de gestação.

Resultados: Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes na avaliação das pacientes apresentando apenas fator masculino de infertilidade em relação ao número oócitos recuperados nas avaliações do polimorfismo 1298 idade até 37 anos/idade até 35 anos, (%) oócitos maduros avaliações do polimorfismo 677 idade até 37 anos/ idade até 35 anos, (%) imaturos avaliações do polimorfismo 677 idade até 37 anos/ idade até 35 anos/idade até 30 anos e ausência de polimorfismos idade até 30 anos. Observou-se também (%) de melhores embriões no grupo de pacientes com diversas causas de infertilidade para o grupo mutado do polimorfismo 1298.

Conclusão: Os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR demonstraram associação com ao número de oócitos recuperados e porcentagem de oócitos imaturos em ciclos de fertilização in vitro.

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D'ELIA PQ. Impact of polymorphisms C677T and A1298C of MTHFR gene in Brazilian women and results of in vitro fertilization. Tese. Doutorado. 2012.

Introduction: It is believed that folate has a crucial function in human reproduction process, and it’s deficiency can compromise function of metabolic pathways correlated, leading to an accumulation of homocysteine (Hcy). MTHFR gene encodes 5-MTHFR enzyme, responsible to metabolize these reactions and C677T/A1298C polymorphisms of this gene are related to decrease enzyme activity and consequent changes in Hcy levels. These changes are related to several diseases and can compromise reproductive system.

Objective: The aim of this study is to evaluate the impact between MTHFR gene polymorphisms and laboratory variables in brazilian women undergoing assisted reproduction techniques (ART).

Patients and Methods: Prospective study performed in Human Reproduction Department at Medicine ABC University – Ideia Fértil Institute, between December 2010 and April 2012, with 146 women submitted to MTHFR C677T and A1298C polymorphism genotyping and laboratory results/ pregnancy rates evaluation. For statistical analysis we used the Shapiro-Wilk (p <0.05), Mann-Whitney, Kruskal-Wallis and chi-square tests. Patients were separated into two groups (various causes of infertility and male factor only) and evaluated in three ways: patients up to 37 years, patients up to 35 years and patients up to 30 years. The three groups were compared: patients with no incidence polymorphism (normal) with patients with presence of polymorphism (mutated) of 677 and 1298 loci. The presence of polymorphisms C677T and A1298C simultaneously also were accessed. Data were analyzed in relation to age, number of oocytes retrieved (%) mature oocytes (%) immature oocytes, normal fertilization rate (%), (%) NF, (%) good quality embryos and pregnancy rates.

Results: Our evaluation demonstrated statistically significant differences in patients presenting only male factor infertility in relation to the number of oocytes retrieved in evaluations of polymorphism on age up to 37 years / age up to 35 years, (%) mature oocytes evaluation of polymorphism 677 on age up to 37 years / age up to 35 years, (%) immature oocytes evaluation of polymorphism 677 age up to 37 years / age up to 35 years / age up to 30 years and absence of polymorphisms group on age up to 30 years. It was also observed (%) of good quality embryos in patients with different causes of infertility for mutated group of 1298 polymorphism.

Conclusion: C677T and A1298C MTHFR gene polymorphisms showed association with the number of oocytes retrieved and the percentage of immature oocytes of in vitro fertilization cycles.

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Impacto dos polimorfismos C677t e A1298c do gene MTHFR nos