Aus dem I . Zoologischen lnstitut der Universitat Wien und dem lnstitut fur Biochernie der Universitat Wien

Immunchemische Untersuchungen an Laubfrosch-Laich : Vergleichende Untersuchungen an Rana temporaria, Rana

arvalis, Rana dalmatina und Rana latastei

Von H. KOTHBAUER und H. SCHENKEL-BRUNNER

Eingegangen am 25. November 1977

Einleitung

Hamagglutinine, das sind Stoffe, die imstande sind, rote Blutzellen zu verklumpen, sind bei Pflanzen und Tieren weit verbreitet (GOLD und BALDING 1975; KOTHBAUER 1975; SCHNITZLER 1977). Das Auf- treten dieser Agglutinine laRt sich in einigen Fallen auch als zusatzliches Argument bei der Beantwor- tung gewisser systematischer Fragen heranziehen. So lieR sich bei rnehreren Tieren ein Zusarnmenhang zwischen dem Auftreten von Hamagglutininen und der systernatischen Verwandtschaft der untersuch- ten Tiere finden, wie bei Schnecken der Gattung Cepaea (KOTHBAUER und SCHNITZLER 1972) oder bei Fischen der Gattungen Salmo, Salvelinus, Hucho, Coregonus und Thymallus (KOTHBAUER und SCHFN- KEL-BRUNNER 1975). Bei anderen Tieren fand sich bis jetzt kein solcher Zusarnmenhang, wie bei Molchen der Gattung Tritwrus (SCHENKEL-BRUNNER et al. 1975; vgl. KOTHBAUER und SCHENKEL- BRUNNER 1978) - es lief3 sich aber u. a. aus den unterschiedlichen Reaktionen Nahverwandter schliegen, daR sehr wahrscheinlich nur kleine Anderungen in der Struktur der agglutininaktiven Proteine fur die unterschiedlichen Reaktionen verantwortlich sind (SCHENKEL-BRUNNER et al. 1975).

Kiirzlich wurde gezeigt, daR auch die weitverbreitet auftretenden blutgruppenaktiven Substanzen durchaus brauchbare Hinweise bei der Beantwortung systematischer Fragen geben konnen. Die zum Beispiel beim A B O Blutgruppensystem des Menschen die Blutgruppenzugehorigkeit bestirnrnenden Kohlenhydratstrukturen (vgl. RACE und SANGER 1975) sind namlich nicht nur auf menschliche Erythrocyten beschrankt, sie sind vielmehr ubiquitar vorkommende Strukturen, die, mit mehr oder weniger groRen Variationen, als ,,Bauprinzip" von Mikroben bis zu den Saugetieren zu finden sind (z. B. CUSHING et al. 1963; SPRINGER 1966; PROKOP und UHLENBRUCK 1970; YAMAMOTO 1975; SCHNITZLER 1977). Die diesbeziiglichen Untersuchungen an Amphibienlaich zeigten vielver- sprechende Ergebnisse. Bei Kroten, BwJo buJo, E. viridis und B. calamita, IieRen sich Blutgruppen- aktivitaten feststellen, die auffallend mit der systematischen Klassifikation dieser drei Arten iiberein- stimmen (SCHENKEL-BRUNNER und KOTHBAUER 1976; vgl. INCER 1972). Weiters sprechen die beim Laubfrosch Hyla arborea und die beim urspriinglich als Unterart von Hyla arborea beschriebenen Mit- telrneerlaubfrosch Hyla rneridionalis (vgl. SCHNEIDER 1968; TRUTNAU 1975) deutlich unterschiedlichen Reaktionen, ganz in Obereinstimmung rnit den verschiedenen Paarungsrufen dieser Tiere (SCHNEIDER 1968), dafiir, daR es sich bei diesen Tieren um zwei gute Arten handelt (SCHENKEL-BRUNNER und KOTH- BAUER im Druck). SchlieRlich zeigten die an den Wasserfroschen Rana esculenta, R. ridibunda und R. lessonae erhobenen Refunde deutlich den hybriden Ursprung von R . esculenta auf (KOTHBAUER und SCHENKEL-BRUNNER im Druck, vgl. dazu z. B. TUNNER 1974; UZZELL und BERGEH 1975; UZZELL et al. 1977). Es lag daher nahe, auch den Laich einiger europiischer Braunfrosche auf blutgruppenaktive Substanzen hin zu untersuchen.

U. S. Copyright Clearance Center Code Statement: 0044-3808 / 78 / 1602-0144 $2.50/0 Z. zool. Syst. Evol.-forsch. 16 (1978) 144-148 0 1978 Verlag Paul Parey, Hamburg und Berlin ISSN 0044-3808 / ASTM-Coden : ZZSEAA

Immunchemische Untersuchungen an Braunfrosch-Laich 145

Material und Methoden

L a i c h m a t e r i a l - Herkunft und Praparation

Die Herkunft des Laichmaterials ist in Tabelle 1 angegeben. Der Laich von R . temporaria (Spillern) und K. dalmatina (Spillern) wurde von Herrn Dr. FRANZ LUTERBERGER (Tiergarten Schonbtunn, Wien), der Laich von R. arvalis (Tulln) von Herrn Dr. WALTER HODL ( 1 . Zoologisches Institut der Universitat Wien) und der Laich von R. latastei von Herrn Dr. ALBERTO Pozzi (Como) freundlicherweise zur Verfugung gestellt.

Die Laichproben wurden mit 10 Volumina einer Losung von 0,02% Pepsin (krist., Merck, 100 mE/mg) in 0,5 M Zitrat-Puffer ( H 2,3) unter Zusatz von 0,01% Na-Azid 2 Wochen bei 37°C in- kubiert. Der Ansatz wurde dann diaLsiert (gegen destilliertes Wasser), zentrifugiert und lyophilisiert. Das so erhaltene Material wurde in einer Konzentration von 5 mg/ml in gepufferter physiologischer Kochsalzlosung (KOTHBAUER und SCHENKEL-BRUNNER 1971) gelost und mit Hilfe des Hamagglutina- tionshemmtests auf Blutgruppenaktivitat untersucht.

A g g l u t i n i n e und E r y t h r o c y t e n

Menschliches Anti-A- und Anti-B-Serum wurden bei Imrnuno A.G. (Wien) gekauft. Das menschliche Anti-H-Serum, von einem ,,Bombay”-Phinotyp (G. J.), war ein Geschenk von Dr. M. HRUBISKO (Bra- tislava, Tschechoslowakei). Das Anti-A aus der Eiweiddriise von Helixpomatia (PROKOP et al. 1965) wurde nach SCHNITZLER et al. (1971) gereinigt. Das Anti-B von Evonymus europaeus und das Anti-H von Ulex europaeus (GOLD und BALDING 1975) wurde aus zerriebenen Samen gewonnen (SCHENKEL- BRUNNER und KOTHBAUER 1976). Das WGA = Wheat Germ Agglutinin (LIS und SHARON 1973) war ein Geschenk von Dr. M. WRANN, Institut fur Biochemie der Universitat Wien.

Alle Agglutinine wurden mit physiologischer Kochsalzlosung so verdiinnt, dad diese verdunnten Agglutininlosungen in einer geometrischen Verdunnungsreihe (1 : 2“) in der zweiten bis dritten Ver- dunnungsstufe die entsprechenden Erythrocyten noch agglutinierten (entsprechend 4 bis 8 Hamagglu- tinationseinheiten [KABAT 19561).

Menschliche A,-, B- und 0-Erythrocyten wurden 3mal mit physiologischer Kochsalzlosung gewa- schen und auf eine Endkonzenrration von 2 % gebracht.

Hamagglutinationshemrntests

Von den auf Blutgruppenaktivitat zu untersuchenden Laich raparationen (vgl. Tab. 1) wurden in den Napfchen von Salkplatten mit physiologischer Kochsalzisung geometrische Verdiinnungsreihen ( 1 :2”) hergestellt. Jeder Verdiinnungsstufe einer Reihe (25 p1 pro Napfchen) wurden dann 25 p1 einer verdunnten Agglutininlosung zugesetzt; nach 30 Minuten Inkubation bei Zirnmertemperatur wurden dann je Napfchen 25pl der entsprechenden Erythrocytensuspension beigefiigt (vgl. Tab. 1). Nach einer weiteren Stunde Inkubation bei Zirnmertemperatur wurde die Zahl der Verdiinnungsstufen bestirnrnt, bei denen keine Agglutination der Erythrocyten feststellbar war. Wenn sich in dem Laichmaterial Keaktionspartner fur ein bestimmtes Agglutinin finden, werden durch diese die reaktiven Bezirke des Agglutinins besetzt und es kann daher die spater zugesetzten Erythrocyten nicht mehr agglutinieren - die Agglutination der Erythrocyten wird gehemmt.

Ergebnisse und Diskussion

D i e vier untersuchten Braunfrosch-Arten IieRen s ich anhand d e r vorgefundenen Reakt ions- muster unterscheiden (Tabelle 1). , ,A-Aktivitat” (d. h. die betreffende Laichpraparat ion hernrnt d ie Agglut inat ion v o n A , - E r y t h r o c y t e n durch Anti-A-Agglut inine) fand s ich schwach, bei Reakt ion mit menschlichern Ant i -A, beirn Grasf rosch R . temporaria, und stark, bei Reakt ion rnit Helix Anti-A, be im Springfrosch R . dalmatina u n d be im itdieni- schen Springfrosch R. katastei. , ,H-Aktivi ta t” (d. h . die betreffende Laichpraparat ion hernmt

146 H . Kothbauer und H . Schenkel-Brunner

Lnichpriparationen

Art

(Herkunfr)

die Agglutination von 0-Erythrocyten durch Anti-H-Agglutinine; Blutgruppen-H-Akti- vitat ist fur 0-Erythrocyten charakteristisch [RACE und SANGER 19751) war stark bei Reaktion rnit menschlichem Anti-H und schwach bei Reaktion mit Ulex Anti-H bei R. la- tastei nachweisbar. Das Wheat Germ Agglutinin (WGA) zeigte deutliche Reaktionen mit den Laichpraparationen von R. dafmat ina und R. fatastei (Hemmung der Agglutination von A ,-Erythrocyten durch WGA). ,,B-Aktivitat” war bei keiner der untersuchten Arten nach- weisbar. Beim Moorfrosch R. arualis zeigte sich keine Hemmung. Die unrerschiedlichen Reaktionen der Anti-A-Agglutinine lassen sich wie folgt erklaren: Agglutinine aus Pflan- zensamen und aus tierischen Genitaltrakten reagieren in vielen Fallen blutgruppenspezi- fisch, d. h. sie agglutinieren nur Erythrocyten ganz bestimrnter Blutgruppen. Wenn sie aber mit Reaktionspartnern zusammengebracht werden, die nicht an Zellen gebunden sind, wie z. B. im vorliegenden Fall rnit Losungen, zeigen sie manchmal ein anderes Reaktionsspek- trum (vgl. SCHENKEL-BRUNNER und KOTHBAUER 1976).

R. temporaria von zwei Fundorten reagiertegleich (Tab. l ) , entsprechend den an Bufo bufo (SCHENKEL-BRUNNER und KOTHBAUER 1976) und Hyla arborea (SCHENKEL-BRUNNER und KOTHBAUER, im Druck) erhobenen Befunden. Eine Abhangigkeit der Blutgruppenaktivitat vom Fundort liegt also nach allen bis jetzt vorliegenden Daten nicht vor. Bei den blutgrup- penaktiven Substanzen des Menschen handelt es sich urn genetisch festgelegte Strukturen (RACE und SANGER 1975). Wenn nun, wie z. B. bei drei Bufo Arten festgestellt, die Reaktions- spektra und die vermutliche Biosynthese der nachgewiesenen Substanzen rnit der systema- tischen Klassifikation dieser Tiere ubereinstimrnen (SCHENKEL-BRUNNER und KOTHBAUER 1976) oder die an Wasserfroschen erhobenen Befunde in jeder Einzelheit den hybriden Ur- sprung von Rana esculenta wiedergeben (KOTHBAUER und SCHENKEL-BRUNNER, im Druck), kann an der genetischen Determination der blutgruppenaktiven Substanzen in Amphibien- laich kaum gezweifelt werden. Blutgruppenaktive Substanten in Amphibienlaich konnen daher durchaus als zusatzliche Hilfe zur Klarung gewisser systematischer Fragen innerhalb relativ nahverwandter Arten herangezogen werden.

Bemerkenswert ist, dai3 R. dalmatina und R. latastei (vgl. Tab. I ) , zwei sehr ahnliche Arten (MERTENS 1975), sich zwar deutlich unterscheiden lieaen (Reaktion mit menschli- chem und Ufex Anti-H), verglichen rnit den anderen Arten aber ahnlich reagierten (Reaktion mic Helix Anti-A und WGA). Moglicherweise lassen sich daher bestimmte Blutgruppen-

Agglutinin (Herkunft) Anti-A Anti-B Anti-H Anti-A Anti-B Anti-H WGA

(Mensch) (Mensch) (Mensch) (He l ix ) (Evonymur) (Utex) (Tnticurn)

Erythrocyten

Tabelle 1

Hamagglutinationshemmversuche mit Laich von vier Braunfroscharten unter Verwendung ver- schiedener Agglutinine und menschlicher Erythrocyten

~~

I Znhl der Verdinnungsstufen der Laichpraparationen, die Hernrnung der Agglutination zeigten

- - - - - Rana temporaria 1 -

Rana temporaria 1 -

(Lunz, Niederosterreich)

(Spillern, Niederosterreich) Rana arvalis (Tulln, Niederosterreich) Rana dalmatina (Spillern, Niederosterreich) Rana latastei (Corno, Italien)

- - - - -

- - - - - - -

5

8 8 2 3

- - - - - 8

- - -

Immunchemische Untersuchungen an Braunfrosch-Laich 147

aktivitaten n ich t n u r z u r Unterscheidung v o n Ar ten , sondern auch z u r Abgrenzung v o n Ar tengruppen heranziehen. Hinweise in dieser Richtung f inden sich auch bei d e n e r w a h n - ten Kroten: Bcrfo viridis u n d B. cukzmita, nach INGER (1972) in die ,,viridi5 g r o u p ” gestellt, reagierten z w a r unterschiedlich, aber beide zeigten ,,H-Aktivitat”, wahrend B. bcrfo, nach I N C E R (1972) z u r ,,bcrfo g r o u p ” gerechnet, deut l ich verschieden reagierte u n d ,,A-Aktivitat” zeigte (SCHENKEL-BRUNNER u n d KOTHBAUER 1976). Weiters ist auffallend, d a 8 bei ke inem d e r untersuchten Braunfrosche ,,B-Aktivitat” nachgewiesen werden k o n n t e (vgl. Tab. I) , dafl diese aber bei Wasserfroschen zu f inden w a r (KOTHBAUER und SCHENKEL-BRUNNER, im Druck) .

Mit d e r Beantwor tung d e r naheliegenden Frage, ob es bes t immte blutgruppenakt ive Substanzen gibt, d ie auch fur groflere systematische G r u p p e n ,,charakteristisch” s ind, m u 8 gewartet werden , bis m e h r Befunde vorliegen.

Zusammenfassung

Laich von vier Braunfroscharten (Rana temporaria, R.arvalis, R.dalmatina, R.lataster] wurde auf blut- gruppenaktive Substanzen untersucht. Anhand der vorgefundenen Reaktionsmuster IieRen sich die vier untersuchten Arten unterscheiden. R. dalmatina und R. latastei, zwei sehr ahnliche Arten, rea- gierten zwar unterschiedlich, zeigten aber doch im Reaktionsmuster Gemeinsamkeiten. Im Zusammen- hang mit anderen bereits vorliegenden Daten wird die Moglichkeit diskutiert, gewisse blutgruppen- aktive Substanzen im Laich zur Abgrenzung von Artengruppen heranzuziehen.

Summary

Immunochemical investigations on brown frog eggs: comparative studies on Rana temporaria, Rana arvalis, Rana dalmatina and Rana latastei

The spawn of four European brown frog species (Rana temporaria, R. arvalis, R.dalmatina, R. latastei) was examined for blood group activity. All four species exhibited different reaction patterns. The two closely resembling species R. dalmatina and R. latastei though being distinguishable from each other, showed conformity in their reaction spectra. In connection with other results already known the possi- bility is discussed to use blood group activities in the spawn as an additional aid in the definition of species groups.

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Anscbriften der Verfusser: Univ.-Doz. Dr. HANS KOTHBAUER, 1. Zoologisches Institut der Universitat Wien, Dr. Karl Lueger-Ring I , A-1010 Wien 1; Univ.-Doz. Dr . HELMUT SCHENKEL-BRUNNER, Institut fur Biochemie der Universitat Wien, Wah- ringerstrage 17, A- 1090 Wien 9

Aus dem Institut fur Haustierkunde der Christian-Albrecht-Universitat zu Kiel

Studien an europaischen Igeln

V o n H. HOLZ

Eingegungen am 30. August 1977

D e r biologische Artbegriff h a t sich in d e r Zoologie grundsatzl ich A n e r k e n n u n g verschafft (MAYER 1963; TIMOFEEFF-RESSOVSKY, VORONTSOV, JABLOKOV 1975). D e r Fest legung d e r Artkennzeichen stellen sich jedoch of t Schwierigkeiten entgegen ( H E R R E 1964). N i c h t sel ten ist in systematischen Arbei ten, welche n u r v o n Ges ta l tmerkmalen ausgehen, d ie U m g r e n - z u n g v o n Arten umstr i t ten. Verschiedentlich werden unsichere Falle als , ,Grenzfalle” zwischen A r t u n d U n t e r a r t gewertet u n d z u r Er lau terung v o n Vorgangen u n d bes t immen-

U. S. Copyright Clearance Center Code Statement: 0044-3808 / 78 / 1602-0148 $2.50/0 Z. zool. Syst. Evolut.-forsch. 16 (1978) 148-165 0 1978 Verlag Paul Parey, Hamburg und Berlin ISSN 0044-3808 / ASTM-Coden : ZZSEAA