Ilgdzīvotības molekulāri Ilgdzīvotības molekulāri ģenētisko pamatu padziļināta ģenētisko pamatu padziļināta

izpēte Latvijas populācijāizpēte Latvijas populācijā

2008. gads

Pētījums veikts Latvijas Universitātes Pētījums veikts Latvijas Universitātes Bioloģijas fakultātē sadarbībā ar Bioloģijas fakultātē sadarbībā ar Latvijas Biomedicīnas pētījumu un Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centru studiju centru

LU pētniecības projekta nr.: 2008/ZP-5LU pētniecības projekta nr.: 2008/ZP-5

Projekta izpildītāji: V. Baumanis, L. Pliss, I. Projekta izpildītāji: V. Baumanis, L. Pliss, I. Pelnēna, A. Grunskis, A. Brakmanis, K. Pelnēna, A. Grunskis, A. Brakmanis, K. Brangulis, B. Steinbrekera, A.KrūmiņaBrangulis, B. Steinbrekera, A.Krūmiņa

Pētījuma aktualitātePētījuma aktualitāte

Mitohondriālās DNS (mtDNS) pētījumi:

• Organismiem novecojot, pakāpeniski palielinās mtDNS mutāciju skaits, radot heteroplazmiju – atšķirīgus mtDNS variantus vienā indivīdā.

• Turklāt, noteikti nosacīti neitrālie iedzimtie mtDNS polimorfismi ar atšķirīgu biežumu ir sastopami dažādās vecuma grupās.

• Iespējams, ka mtDNS variantu ietekme uz bioloģiskās novecošanās procesiem ir populāciju specifiska, un, ka šo ietekmi iespaido kā pētāmās populācijas genofonda īpatnības, tā arī vides apstākļi.

Pētījuma Pētījuma aktualitāteaktualitāte

HLA - DRB1 pētījumi palīdzētu: • konstatēt ilgdzīvotāju imunoloģiskās ģenētiskās īpatnības, nosākot HLA ( (human leukocyte antigens) II klases DRB1 gēna otrā eksona variabilitāti.

• izprast CD4+ limfocītu nozīmi HIV replikācijas nomākšanā;

• farmakoģenētikā (palīdzēt izstrādāt pareizu farmaceitisko preparātu lietošanu atkarībā no atrastajiem DRB1 gēna polimorfismiem).

Mitohondriālās DNS (mtDNS) pētījumi

““Mitohondriālais Mitohondriālais novecošanās pulkstenis”novecošanās pulkstenis”

Mitohondriju bojājums

mtDNS punktveida mutācijas

Mutantās mtDNS

amplifikācija

mtPTP aktivācija

Šūnas nāve

Šūn

u da

udzu

ms

Bērnība Jaunība VecumsPusmūžs

funkcionālais

slieksnis

Mitohondriālā DNS Mitohondriālā DNS (mtDNS)(mtDNS)

• Katrā šūnā ir apmēram Katrā šūnā ir apmēram • 1 000 – 10 000 mitohondriju, 1 000 – 10 000 mitohondriju,

bet mitohondrijā 1-15 mtDNS bet mitohondrijā 1-15 mtDNS kopijaskopijas

• Cirkulāra, divpavedienu DNSCirkulāra, divpavedienu DNS• Garums – 16 569 bpGarums – 16 569 bp• Nav pierādīta rekombinācijaNav pierādīta rekombinācija• Ir nedaudz atšķirīgs Ir nedaudz atšķirīgs

ģenētiskais kods nekā kodola ģenētiskais kods nekā kodola DNSDNS

• Ir 37 gēni, kas kodē 13 Ir 37 gēni, kas kodē 13 proteīnus, 22 tRNS un 2 rRNSproteīnus, 22 tRNS un 2 rRNS

• Nav intronuNav intronu

mtDNS genotipimtDNS genotipi• Haplotips – – konkrēts konkrēts mtDNSmtDNS sekvences sekvences

tips, kas var būt unikāls vai arī atrasts tips, kas var būt unikāls vai arī atrasts vairākos indivīdosvairākos indivīdos

• Haplogrupa – līdzīgu haplotipu kopums, – līdzīgu haplotipu kopums, kuriem ir viena vai vairākas kopīgas alēleskuriem ir viena vai vairākas kopīgas alēles

mtDNS mutācijasmtDNS mutācijas

Mērķis un uzdevumiMērķis un uzdevumi

Mērķis: Izpētīt mtDNS genotipu Izpētīt mtDNS genotipu daudzveidību trīs dažādās vecuma daudzveidību trīs dažādās vecuma grupāsgrupās

Uzdevumi:

1. Iegūt ģenētisko informāciju par Latvijas 1. Iegūt ģenētisko informāciju par Latvijas ilgdzīvotājiemilgdzīvotājiem

2. Noskaidrot mtDNS polimorfismu un 2. Noskaidrot mtDNS polimorfismu un heteroplazmijas iespējamo saistību ar heteroplazmijas iespējamo saistību ar novecošanos Latvijas populācijānovecošanos Latvijas populācijā

Materiāls

• mtDNS polimorfismu analīzei izmantoti latviešu DNS paraugi: 351351 indivīds vecumā no 18 līdz 40 gadiem indivīds vecumā no 18 līdz 40 gadiem 100100 indivīdi vecumā no 74 līdz 89 gadiemindivīdi vecumā no 74 līdz 89 gadiem 100100 indivīdi vecumā virs 90 gadiem indivīdi vecumā virs 90 gadiem

• Heteroplazmijas analīzē iekļauti 140 paraugi: 4040 indivīdi vecumā no 18 - 40 gadiem indivīdi vecumā no 18 - 40 gadiem 5050 indivīdi vecumā no 74 - 89 gadiem indivīdi vecumā no 74 - 89 gadiem 5050 indivīdi vecumā virs 90 gadiem indivīdi vecumā virs 90 gadiem

Metodes1)1) mtDNS haplotipu un haplogrupu noteikšana:mtDNS haplotipu un haplogrupu noteikšana:

• HVSI (620bp) un HVSII (450bp) segmentu tiešā HVSI (620bp) un HVSII (450bp) segmentu tiešā nukleotīdu sekvenēšananukleotīdu sekvenēšana

• mtDNS kodējošā rajona PCR-RFLP analīzemtDNS kodējošā rajona PCR-RFLP analīze• Datu statistiskā apstrāde ar Fisher`s testu un Datu statistiskā apstrāde ar Fisher`s testu un

ARLEQUIN ARLEQUIN 44.0.0 programmu programmu (Excoffier, 2005) (Excoffier, 2005)

2)2) Heteroplazmijas noteikšana:Heteroplazmijas noteikšana:• ““mismatch” specifiskā DNS endonukleāze mismatch” specifiskā DNS endonukleāze

(“Surveyor”)(“Surveyor”)• Denaturējošā gradienta gēla elektroforēze (DGGE)Denaturējošā gradienta gēla elektroforēze (DGGE)• Hetero- un homo-dupleksu tiešā nukleotīdu Hetero- un homo-dupleksu tiešā nukleotīdu

sekvenēšanasekvenēšana• Datu statistiskā apstrāde ar Fisher`s testu Datu statistiskā apstrāde ar Fisher`s testu

ARLEQUIN ARLEQUIN 44.0.0 programmu programmu (Excoffier, 2005) (Excoffier, 2005)

KONTROLES RAJONS

Kontroles rajona analīze (HVSI un HVSII)Kontroles rajona analīze (HVSI un HVSII)

MetodesMetodes mtDNS haplotipu noteikšanamtDNS haplotipu noteikšana

MetodesMetodesmtDNS haplogrupu mtDNS haplogrupu

noteikšananoteikšana

Lai apstiprinātu iegūto mtDNS Lai apstiprinātu iegūto mtDNS haplotipu piederību noteiktam mtDNS haplotipu piederību noteiktam mtDNS haplogrupām, tika izmantotas haplogrupām, tika izmantotas 17 dažādas restrikcijas 17 dažādas restrikcijas endonukleāzes:endonukleāzes:

7373AlwAlw44I, 300744I, 3007BshBsh1236I, 1236I, 43324332EcoEco47I, 457747I, 4577NlaNlaIII, 4643III, 4643RsaRsaI, I, 47694769AluAluI, 4793I, 4793BsuBsuRI, 4831RI, 4831HhaHhaI, I, 50035003DdeDdeI, 7025I, 7025AluAluI, 8249I, 8249AvaAvaII, II, 84468446SspSspI, 8994I, 8994HaeHaeIII, 10032III, 10032AluAluI, I, 1039710397AluAluI, 12308I, 12308HinfHinfI, 13704I, 13704BstBstOI, OI, 1446514465AccAccI, 14766I, 14766MseMseI, 15606I, 15606AluAluI, I, 1590415904MseMseI, I, unun 16487 16487DdeDdeII

Kodējošā rajona PCR-RFLP analīzeKodējošā rajona PCR-RFLP analīzeM 1 2 3 4 5

10% PAAG

• Heteroplazmija ir divu vai vairāku ģenētiski atšķirīgu mtDNS sekvenču klātbūtne vienā indivīdā

• Heteroplazmija var būt pārmantota vai radusies somatisku mutāciju rezultātā

MetodesMetodesHeteroplazmijas noteikšana

MetodesMetodes Heteroplazmijas noteikšana““Surveyor” Surveyor” DGGEDGGE

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

6% PAAG

RezultātiRezultātimtDNSmtDNS variantu ģenētiskā variantu ģenētiskā

daudzveidībadaudzveidība

Vecuma grupaVecuma grupa 18-40 gadi18-40 gadi 70-80 gadi70-80 gadi Virs 90 Virs 90 gadiemgadiem

Paraugu skaitsParaugu skaits 351351 7070 6868

Salikto haplotipu skaitsSalikto haplotipu skaits 123123 5656 4444

Ģenētiskā Ģenētiskā daudzveidībadaudzveidība

0,97330,9733±±0,000,0044

0,98760,9876±±0,0060,00699

0,97280,9728±±0,0090,00977

A. Haplogrupas un HVSI

B. Haplogrupas, HVSI un HVSII Vecuma grupaVecuma grupa 18-40 gadi18-40 gadi 70-80 gadi70-80 gadi Virs 90 Virs 90

gadiemgadiem

Paraugu skaitsParaugu skaits 351351 7070 4242

Salikto haplotipu Salikto haplotipu skaitsskaits

192192 6464 3636

Ģenētiskā Ģenētiskā daudzveidībadaudzveidība

0,99050,9905±±0,000,001717

0,99500,9950±±0,000,004545

0,98950,9895±±0,000,0099

mtDNS saliktais haplotips – haplogrupu un HVSI vai haplogrupu, HVSI un HVSII ģenētiskā kombinācija

RezultātiRezultātiDažādu vecuma grupu Dažādu vecuma grupu

salīdzinājumssalīdzinājumsGrupa Grupa 11

18-40 gadi18-40 gadi

Grupa Grupa 22

70-80 gadi70-80 gadi

Grupa Grupa 33

Virs 90 Virs 90 gadiemgadiem

Grupa Grupa 11

Grupa Grupa 22

Grupa Grupa 33

Grupa Grupa 11

-- --

Grupa Grupa 22

-- --

Grupa Grupa 33

-- --

Grupa Grupa 11

Grupa Grupa 22

Grupa Grupa 33

Grupa Grupa 11

-- ++

Grupa Grupa 22

-- ++

Grupa Grupa 33

++ ++

Grupa Grupa 11

Grupa Grupa 22

Grupa Grupa 33

Grupa Grupa 11

-- ++

Grupa Grupa 22

-- ++

Grupa Grupa 33

++ ++

A. Haplogrupas

C. Haplogrupas, HVSI un HVSIIB. Haplogrupas un HVSI

RezultātiRezultātimtDNS heteroplazmija HVSI mtDNS heteroplazmija HVSI

segmentāsegmentā

NukleotīdNukleotīdu pozīcijau pozīcija

18-40 18-40 gadigadi

70-80 70-80 gadigadi

virs 90 virs 90 gadiemgadiem

HeteroplazmijHeteroplazmijas veidsas veids%% %% %%

1609216092 -- -- 3,33,3 C/tC/t

1609316093 1010 6,76,7 3,33,3 C/tC/t

1612916129 -- 3,33,3 3,33,3 A/gA/g

1619216192 55 -- 6,76,7 C/tC/t

1630416304 -- 6,76,7 3,33,3 C/tC/t

1631116311 -- -- 6,76,7 C/tC/t

KopāKopā 1515 16,716,7 26,626,6   

SecinājumiSecinājumi• Mūsu rezultāti apstiprina hipotēzi, ka noteikti Mūsu rezultāti apstiprina hipotēzi, ka noteikti

mtDNS lokusu polimorfismi ir saistīti ar mtDNS lokusu polimorfismi ir saistīti ar novecošanos un ilgdzīvošanas fenomenu Latvijas novecošanos un ilgdzīvošanas fenomenu Latvijas populācijāpopulācijā

• Heteroplazmijas līmenis pakāpeniski palielinās līdz Heteroplazmijas līmenis pakāpeniski palielinās līdz ar vecumu, kā arī vecākiem indivīdiem ir novērotas ar vecumu, kā arī vecākiem indivīdiem ir novērotas vairākas heteroplazmiskās pozīcijasvairākas heteroplazmiskās pozīcijas

• Novērotas atšķirības starp dažādu vecuma grupu Novērotas atšķirības starp dažādu vecuma grupu paraugiem Latvijas populācijā norāda, ka paraugiem Latvijas populācijā norāda, ka eksistējošā ģenētiskā asociācija starp mtDNS eksistējošā ģenētiskā asociācija starp mtDNS polimorfismiem un novecošanos vai ilgdzīvotību ir polimorfismiem un novecošanos vai ilgdzīvotību ir populāciju specifiska, un tā ir atkarīga gan no populāciju specifiska, un tā ir atkarīga gan no populācijas genofonda, gan no apkārtējās vides populācijas genofonda, gan no apkārtējās vides faktoriem faktoriem

• Pliss L., Pelnena I., Puzuka A., Baumanis V., Krumina A. Genetic analysis of 12 Y-chromosomal STRs haplotypes in the Latvian population (2008). FEBS Journal, Suppl.1, p. 358.

• Brakmanis A., Krumina A., Pliss L., Baumanis V. Link between ageing and mitochondrial DNA variation in the Latvian population (2008). FEBS Journal, Suppl.1, p. 455.

• Krumina A., Pliss L., Brakmanis A., Novicka A., Baumanis V. Evaluation of different approaches for the comparative analysis of mitochondrial genome variation in human populations (2008). XX International Congress of Genetics, Abstract book, p.322.

• Pliss L., Pelnena I., Puzuka A., Sabule A., Rozane S., Ivanovs A., Baumanis V., Krumina A. Y chromosomal short tandem repeats (Y-STRs) and it’s association with azoospermia factors’ (AZF) microdeletions of infertile males (2008). American Journal of Human Genetics, Suppl.1, p.677.

Publikācijas un konferenču ziņojumiPublikācijas un konferenču ziņojumi