1

Izabela Jasicka-Misiak Piotr Młynarz Paweł Kafarski

Identyfikacja grzybów halucynogennych ze wskazaniem najpowszechniej stosowanych metod oznaczania substancji

halucynogennych z grzybów we krwi

Opole i Wrocław, 2006

2

1. WSTĘP

Nie wiadomo, kiedy człowiek po raz pierwszy sięgnął po środki odurzające. Zapewne

wtedy, gdy uświadomił sobie ograniczenia i kruchość swej egzystencji, poczuł ból i odkrył, że

niektóre rośliny potrafią go łagodzić.

Archeolodzy odnaleźli ślady makówek i nasiona konopi w grobach z epoki neolitu. W

trzecim tysiącleciu p.n.e., na Dalekim Wschodzie ludzie żuli już betel przygotowywany z

orzechów palmy arekowej (Areca catechu), a w Mezopotamii wytwarzali alkohol. W V wieku

p.n.e. Herodot pisał o Scytach odurzających się haszyszem. Ryty naskalne w grobowcu na

bretońskiej wysepce Gawinis sprzed 8.000 lat wywołują takie wrażenie, że wielu badaczy

podejrzewa ich twórców o działanie pod wpływem substancji halucynogennych.

Skomplikowane, powtarzające się wielokrotnie wzory geometryczne nie mają bowiem

żadnego odpowiednika w naturze [RUDGLEY, 2000].

Naukowcom nie udało znaleźć się żadnej cywilizacji pierwotnej, która obywałaby się

bez środków odurzających. Ludzie wszędzie znajdowali substancje zmieniające świadomość,

niezależnie od tego, gdzie przyszło im żyć, w amazońskiej dżungli, syberyjskiej tajdze, na

stepie czy pustyni. Botanicy opisali ponad 200 roślin o właściwościach halucynogennych, do

dziś odkryto w nich kilka tysięcy związków chemicznych. Największą grupę stanowią

alkaloidy, czyli zasady zawierające atom azotu. Łączy je zdolność wpływania na

funkcjonowanie układu nerwowego człowieka. Efekty mogą być różne - od uspokajania i

znieczulenia, przez pobudzanie, po wywoływanie halucynacji.

Alkaloidy w czystej postaci są toksyczne, przyjęte w dużych dawkach powodują

zatrucia, także śmiertelne. Dlatego od czasów prehistorycznych zażywanie zawierających je

preparatów starano się kontrolować. Po środki odurzające dawniej nie sięgano dla

przyjemności, lecz w ściśle określonych celach i czasie - dla nawiązania kontaktu z bogami i

duchami, wprowadzenia się w trans podczas rytualnych obrzędów, wzmocnienia sił i odwagi

przed wyruszeniem na łowy lub wojnę. Młodzież uzyskiwała prawo korzystania z używek

dopiero po inicjacji

Dawniej o tym, co dozwolone, decydowała religia i tradycja, dziś - przepisy prawa.

Środki dopuszczone do obrotu określa się zazwyczaj jako używki, zakazane - jako narkotyki.

Podstawą podziału jest ich szkodliwość, moc i właściwości uzależniające. W wypadku roślin

nieprzetworzonych nie jest to kryterium precyzyjne, o czym świadczy odmienne traktowanie

tytoniu i marihuany. Wątpliwości nie wzbudzają wyizolowane i zsyntetyzowane środki

psychotropowe. Przepisy regulujące dostęp do używek i narkotyków wydają się stałe, ale w

rzeczywistości ulegają zmianom. W XIX wieku w europejskich miastach działały palarnie

opium i kluby miłośników haszyszu. W XX wieku do dobrego tonu należało palenie tytoniu,

dziś napiętnowane. Freud uważał kokainę za cudowny lek, a zawierające ją napoje

reklamowano tak, jak dziś kawę czy herbatę. W Holandii można palić papierosy z marihuaną,

3

co w sąsiedniej Francji grozi już konsekwencjami prawnymi. Dla Indian z Andów zakaz żucia

liści koki jest równie absurdalny, jak dla Europejczyków alkoholowa prohibicja. Muzułmanie

zdelegalizowali obie te używki, ale nie mają nic przeciwko raczeniu się wywołującym

podobne efekty ghatem [RUDGLEY, 2000].

Od kilku lat obserwuje się stały wzrost liczby ujawnianych przestępstw ściganych na

podstawie ustawy o przeciwdziałaniu narkomanii, w tym przemytu i nielegalnego

wytwarzania narkotyków. Nagłaśniane przez media przykłady skutecznych działań

odpowiedzialnych służb i stosunkowo wysokie kary nakładane na producentów środków

odurzania czy kurierów narkotykowych, nie powstrzymują kolejnych sprawców. Na terenie

spokojnych dotąd województw (w tym województw dolnośląskie i opolskie) dynamicznie

wzrasta przestępczość narkotykowa, a proceder ten, z uwagi na ogromne zyski, podejmuje

niemal każda grupa przestępcza, dążąc następnie do stworzenia własnych źródeł zaopatrzenia

(kanału przemytu lub produkcji). Z danych statystycznych wynika, że na terenie całego kraju

w dalszym ciągu utrzymuje się wzrost podaży narkotyków i popytu na te środki, szczególnie

wśród młodych ludzi. Narkotyki dostępne są już praktycznie nie tylko w dużych miastach, ale

także w mniejszych miejscowościach, a co najgorsze również na terenie szkół. W ciągu

jedenastu lat prawie pięciokrotnie powiększyła się grupa uczniów, którzy próbowali

nielegalnych substancji odurzających. Po okresie stabilizacji, odnotowanej w latach 1994-

1996, dwa kolejne badania ujawniły skokowy wzrost liczby uczniów eksperymentujących z

narkotykami. Pochodne konopi indyjskich i ruteckich (marihuana i haszysz) to zdecydowanie

najbardziej powszechnie stosowany nielegalny narkotyk (w Polsce używa go stale 6,3%

młodzieży w ogóle, a w Czechach aż 22,1%). Następnym narkotykiem najczęściej

konsumowanym jest amfetamina i jej pochodne, w tym głównie Ecstasy (MDA, MDMA,

MDEA, PMA, PMMA). Zaznacza się spadek zainteresowania LSD, który rekompensowany

jest popytem na grzyby halucynogenne (np. łysiczka lancetowata) oraz inne halucynogeny

pochodzenia roślinnego. Choć rozpowszechnienie stosowania „magicznych grzybków” jest

stosunkowo niewielkie, są one najczęściej stosowanym środkiem halucynogennym w 12

Państwach Członkowskich UE (w Polsce ok. 20% oburzeń - według badań sieci „Znaczenie i

użytkowanie grzybów trujących w tym halucynogennych na terenie Polski i krajów

ościennych”).

Z ponad 5.000 odmian grzybów znanych przez człowieka około 80 posiada

właściwości psychoaktywne. Dolny Śląsk, a szczególnie rejon Karkonoszy, to jeden z

głównych regionów gdzie grzyby te są zbierane. Można dokonać też ich zakupu (wraz ze

szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi hodowli) przez internet. Zjawisko narkotyzowania

się grzybami halucynogennymi ma w Polsce coraz szerszy zasięg. Istnieje zatem potrzeba

zdefiniowania tego typu grzybów ze wskazaniem najczęściej używanych, opracowanie

przewodnika dla potrzeb policji, identyfikacja głównych składników odpowiedzialnych za

efekty narkotyczne, opracowanie metod standardowego oznaczania poziomu tych substancji

4

w materiale biologicznym, w osoczu i moczu (w tym i metod immunologicznych - tzw.

testów paskowych). Pod względem prawnym aktualnie obowiązująca ustawa z dnia 29 lipca 2005 r. „O

przeciwdziałaniu narkomanii” nie precyzuje dokładnie, które gatunki grzybów zaliczone są

do kategorii grzybów halucynogennych. Mówi ona jedynie, iż „grzyby halucynogenne, są to

grzyby zawierające substancje psychotropowe”. Taki stan prawny pozostawia wiele miejsca

do subiektywnej interpretacji zapisów tej ustawy. Przykładem takiej interpretacji może być

przypadek muchomora czerwonego, który posiada dobrze poznane właściwości

halucynogenne. Substancje czynne tego grzyba – kwas ibotenowy i muscymol, nie zostały

umieszczone w wykazie środków psychotropowych we wspomnianej ustawie.

Brak jest jednoznacznych informacji, które precyzują sposoby określania zawartości

substancji halucynogennych w grzybach oraz informacji, które gatunki należy bezsprzecznie

zaliczyć do kategorii halucynogennych.

2. GRZYBY HALUCYNOGENNE

Grzyby halucynogenne („magiczne grzyby”, „grzybki-halucynki”), to grupa grzybów,

które zawierają substancje psychoaktywne powodujące doznania narkotyczne. Grzyby te

należą do grupy trzeciego typu toksyczności określanego neurologicznym oraz ze względu na

działanie na człowieka sklasyfikowane są do szóstej grupy toksyczności (halucynogenne).

Zazwyczaj spożywane są one w celach narkotycznych bądź w wyniku pomyłki grzybiarza.

Obecnie znanych jest ok. 80 gatunków grzybów posiadających właściwości halucynogenne.

Grzyby halucynogenne należą głównie do rodzaju Psilocybe, natomiast sporadycznie do

rodzajów Gymnopilus i Panaeolus [NUGENT I SAVILLE, 2004]. Na świecie występuje około 140

gatunków łysiczek, z których około 80 zalicza się do halucynogennych. Grzyby te rosną

niemalże na wszystkich kontynentach, najwięcej jednak gatunków halucynogennych

zidentyfikowanych zostało w Meksyku [GUZMAN, 1983]. W Europie rośnie kilkanaście

gatunków Psilocybe, jednakże działanie halucynogenne wykazuje tylko kilka gatunków tych

grzybów. Najczęściej wymienia się: Psilocybe semilanceata (Fr.) Quel., Psilocybe bohemica,

Psilocybe montana, Psilocybe cyanescens Wakef. Łysiczki rosną na ziemi, nawozie,

odchodach roślinożerców, resztkach obumarłych roślin. Spotyka się je w trawie, najczęściej w

otwartym terenie, rzadziej rosną w lesie [JANOSZKA, 2005; KAFARSKI, 2006].

5

Łysiczka lancetowata (Psilocybe semilanceata) – gatunek grzyba należący do

pierścieniakowatych. Ze względu na wygląd i właściwości halucynogenne nazywany również

czapeczką wolności (Liberty Cap). Dość rzadko występujący w Polsce.

Królestwo: grzyby

Typ: grzyby podstawkowe

Klasa: podstawczaki

Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne

Rząd: pieczarkowce

Rodzina: pierścieniakowate

Rodzaj: łysiczka

Gatunek: Łysiczka lancetowata

Kapelusz higrofaniczny, 0,5-1,5 cm średnicy, zmienny w kształcie, stożkowaty lub

dzwonkowaty, ze szpiczastym guzkiem w środku, ale również bez guzka tylko z nieznacznym

uwypukleniem, gładki. W czasie wilgotnej pogody nieco lepki i brązowy, suchy jest

brudnoochrowy, żółtawy lub żółtawo-brązowy, czasami z odcieniem oliwkowozielonym.

U starszych owocników brzeg trochę pomarszczony. Blaszki dość rzadkie, szerokie,

przerośnięte, początkowo ochrowe, szybko stają się purpurowo-brązowe do prawie czarnych.

Trzon wysmukły, elastyczny, cylindryczny, do 10 cm długi i do 2 mm gruby (przeważnie

1 mm), zabarwiony kremowo, bladożółtawo lub żółtobrązowo, w podstawie może mieć

odcień niebieskawy, a czasami jest u dołu biało oprószony. Miąższ cienki, białawy, bez

wyraźnego smaku. Zapach nieznaczny, grzybowy, nieco stęchły. Wysyp zarodników

ciemnobrązowy z purpurowym odcieniem. Zarodniki elipsoidalne, grubościenne, gładkie,

z wyraźną porą rostkową; 13-15 x 6.5-7.5 µm, nieco spłaszczone. Występuje głównie na

terenach o dużej ilości opadów, w górach. Owocniki wyrastają od lata do jesieni, pojedynczo

lub w grupach po kilka, w trawie i mchach, w miejscach podmokłych, na ścieżkach.

Większość źródeł podaje, że występuje w miejscach bogatych w składniki odżywcze. Zawiera

psylocybinę [HTTP://WWW.GRZYBY.PL].

6

Łysiczka czeska (Psilocybe bohemica) – podobnie jak łysiczka lancetowata

grzyb ten należy do pierścieniakowatych. Bardzo rzadko występujący w Polsce.

Królestwo: grzyby

Typ: grzyby podstawkowe

Klasa: podstawczaki

Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne

Rząd: pieczarkowce

Rodzina: pierścieniakowate

Rodzaj: łysiczka

Gatunek: Łysiczka czeska

Kapelusz higrofaniczny, wilgotny płowo do rdzawobrązowego, suchy jasnoochrowy,

z wiekiem i w miejscach uszkodzonych przebarwia się ciemno sino-zielonkawo; 20-50 mm

średnicy, początkowo tępostożkowaty, potem wypukły do rozpostartego; brzeg podgięty,

z wiekiem prosty lub odgięty, wilgotny słabo prążkowany; powierzchnia gładka, nie lepka;

skórka nieściągalna. Blaszki początkowo jasnobrązowe, z czasem przyjmują barwę kremową.

Wysyp zarodników brązowy z purpurowym odcieniem. Zarodniki elipsoidalne, nieco

spłaszczone, grubościenne, z wyraźną porą rostkową; 10-12.5 × 6-7.5 µm. Trzon wysmukły,

elastyczny, cylindryczny, do 12 cm długi i do 4 mm gruby. Zapach nieznaczny, grzybowy.

Owocniki wyrastają pojedynczo lub w grupach. Na silnie rozłożonym drewnie drzew

liściastych i iglastych, gałązkach, kompoście, resztkach roślinnych, w ogrodach, parkach, na

poboczach dróg, w miejscach żyznych, ruderalnych [HTTP://WWW.GRZYBY.PL].

Łysiczka górska (Psilocybe montana) – jak większość łasiczek występuje dość

rzadko. Owocniki wyrastają przez cały rok, poza zimą, w grupach, rzadziej pojedynczo, na

ubogich terenach porośniętych mchem i trawą z mchami.

Królestwo: grzyby

Typ: grzyby podstawkowe

Klasa: podstawczaki

Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne

Rząd: pieczarkowce

Rodzina: pierścieniakowate

Rodzaj: łysiczka

Gatunek: Łysiczka czarnobrązowa

7

Kapelusz higrofaniczny, wilgotny ciemnobrązowy do ciemnoczerwonobrązowego, suchy

jasny beżowoochrowy do beżowego; 5-15(20) mm średnicy; półkulisty z wiekiem wypukły,

bez garbka lub nieznacznym garbkiem. Brzeg kapelusza ostry, gdy wilgotny to prążkowany,

mogą być widoczne białe włókienka osłonki. Blaszki początkowo szare, szybko brązowe z

purpurowym odcieniem. Trzon barwy kapelusza, u szczytu nieco jaśniejszy; 15-25(50) x 0.5-

1(2) mm, równogruby, powierzchnia oprószona na szczycie, poza tym włókienkowata.

Cechy wyróżniające, to nie lepki kapelusz, dojrzałe blaszki posiadają purpurowy odcień

[HTTP://WWW.GRZYBY.PL].

Muchomor czerwony (Amanita muscaria), to rozpowszechniony w Polsce grzyb

kapeluszowy z rodziny drobnołuszczakowatych. Jest to grzyb o słabych właściwościach

trujących. Ze względu na swój charakterystyczny wygląd, do zatruć nim dochodzi dość

rzadko. Najczęściej, są to zatrucia w przypadku nieodpowiedniego spreparowania grzyba w

celach odurzających. Wedle statystyk śmiertelność przy zatruciu tym grzybem waha się w

granicach 2-5%. Najbardziej trujące są świeże osobniki ze względu na zwiększoną zawartość

w swoim składzie kwasu ibotenowego.

Królestwo: grzyby

Typ: grzyby podstawkowe

Klasa: podstawczaki

Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne

Rząd: pieczarkowce

Rodzina: drobnołuszczakowate

Rodzaj: muchomor

Gatunek: Muchomor czerwony

Kapelusz grzyba jest żywo czerwony do żółtopomarańczowego, jego średnica wynosi

od 50 do 150 (200) mm; początkowo półkulisty, potem wypukły, w końcu rozpostarty.

Powierzchnia kapelusza pokryta jest dość regularnie rozmieszczonymi, białymi, luźno

przylegającymi łatkami będącymi resztkami osłony, łatki te mogą być spłukiwane przez

deszcze. Skórka błyszcząca, ściągalna, w czasie wilgotnej pogody lepka. Brzeg kapelusza

długo gładki, u starych okazów prążkowany. Blaszki białe do kremowych; dość gęste,

brzuchate, wolne. Trzon biały lub żółtawy; 60-150 (200) x 15-30 mm; cylindryczny;

podstawa bulwiasta, kulista od jajowatej, z pochwą zredukowaną do kilku pierścieni

kłaczkowato-wałeczkowatych brodawek, powyżej pokryta nielicznymi kosmkami. Pierścień

8

wyraźny, biały lub białożółtawy, zwieszony, nieprążkowany; brzeg pierścienia biały lub

żółtawo ząbkowany. Miąższ biały, pod skórką kapelusza żółty (żółtopomarańczowy);

niezmienny, kruchy. Smak grzyba jest łagodny oraz bez zapachu [HTTP://WWW.GRZYBY.PL]. W

celach halucynogennych często wykorzystywany jest także dość pospolity w Polsce

muchomor plamisty (Amanita pantherina).

Królestwo: grzyby

Typ: grzyby podstawkowe

Klasa: podstawczaki

Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne

Rząd: pieczarkowce

Rodzina: drobnołuszczakowate

Rodzaj: muchomor

Gatunek: Muchomor plamisty

Oprócz wymienionych wyżej gatunków występujących w Polsce zawierających

substancje psychoaktywne, istnieje także wiele gatunków grzybów podejrzewanych o

zawartość w swym składzie substancji halucynogennych. Grzyby te są mniej poznane pod

względem zawartości substancji toksycznych i halucynogennych, a niektóre z nich rzadziej

występują w naszej strefie klimatycznej. Gatunki podejrzewane o zawartość substancji

halucynogennych to między innymi:

- Pierścieniaki: pierścieniak wieńczony (Stropharia coronilla),

- Czernidłaki: czernidłak narkotyczny (Corpinus narcoticus), czernidłak pospolity

(Corpinus atramentarius),

- Kołpaczki: kołpaczek motylkowaty (Panaeolus sphinctrinus), kołpaczek motylkowaty

(Panaeolus papilonaceus)

- Niektóre gatunki z rodzaju Inocybe (strzępiaki), Conocybe (stożkogłówka), Pluteus

(drobnołuszczak), Gymnopilus (łysak).

Do chwili obecnej przeprowadzono badania składu chemicznego niewielu spośród wyżej

wymienionych gatunków grzybów. Z dotychczas przeprowadzonych analiz wynika, że

w grzybie Inocybe aeruginascens obecna jest psylocybina w ilości 0,3% suchej masy oraz

baeocestyna w ilości 0,2% suchej masy. Dodatkowo odnotowano kilkanaście zatruć

spowodowanych tym grzybem. Kolejnym gatunkiem zbadanym pod kątem obecności

9

substancji halucynogennych był grzyb z rodziny łysaków - Gymnopilus purpuratus. Zarówno

psylocyna jak i baeocystyna znajdowały się w tym gatunku w ilości ok. 0,3% [GARTZ, 1992].

Jak wynika z literatury, zawartość procentowa substancji halucynogennych w grzybach jest

zmienna i zależy od gatunku, stadium rozwojowego, warunków klimatycznych oraz

dostępności rozpuszczalnego azotu i fosforu w glebie (Tabela 1).

Tabela 1. Przykładowe gatunki grzybów halucynogennych oraz zawartość psylocyny,

psylocybiny oraz baeocystyny w przeliczeniu na suchą masę grzyba.

Gatunek

%

Psylocybiny

%

Psylocyny

%

Baeocystyny

Źródło

P. azurenscens 1,78 0,38 0,35 [STAMETS I GARTZ, 1995]

P. bohemica 1,34 0,11 0,02 [GARTZ I MUELLER, 1990];

[GARTZ, 1994]

P. semilanceata 0,98 0,02 0,36 [GARTZ, 1994]

P. baeocystis 0,85 0,59 0,1 [REPKE, 1977; BEUG I BIGWOOD,

1982]

P. cyanescens 0,85 0,36 0,03 [STIJVE I KUYPER, 1985; REPKE I

IN., 1977]

P. tampanensis 0,68 0,32 --- [GARTZ, 1994]

P. cubensis 0,63 0,60 0,25 [GARTZ, 1994]

P. weilii 0,61 0,27 0,05 ---

P. hoogshagenii 0,60 0,10 --- [HEIM I HOFMANN,1958;

HTTP://WWW.EROWID.ORG]

P. stuntzii 0,36 0,12 0,02 [BEUG I BIGWOOD, 1982; REPKE,

1977]

P. cyanofibrillosa 0,21 0,04 --- [STAMETS I GARTZ, 1995]

P. liniformans 0,16 --- 0,005 [STIJVE I KUYPER, 1985]

Wydawać by się mogło, iż z racji sezonowego występowania grzybów, dostęp do

świeżego materiału ogranicza się wyłącznie do późnego lata i jesieni. Istnieje jednak

możliwość prowadzenia hodowli grzybów posiadających właściwości halucynogenne w

warunkach domowych. Nielegalne sklepy internetowe oferują sprzedaż zarodników takich

grzybów, zarówno gatunków występujących w naszej strefie klimatycznej, jak i gatunków

10

spoza naszej strefy (na przykład Psilocybe cubensis). Zarodniki, a także fragmenty

owocników stanowią materiał wyjściowy do prowadzenia hodowli w warunkach domowych.

Wraz z materiałem do hodowli grzybiarze żądni mocnych wrażeń otrzymują dokładne

wskazówki dotyczące warunków hodowli, których dotrzymanie gwarantuje wyhodowanie

owocników w ciągu czterech do ośmiu miesięcy [JANOSZKA I IN., 2005]. Poniżej pokazano

zdjęcia z instrukcji dla hodowców takich grzybów – łysiczki kubańskiej, których zarodniki

oferuje w internecie firma PF (1202 E. Pike #783, Seattle Wa. 98122, USA), oraz ofertę z

witryny „Buy magic mushrooms”. Warto zaznaczyć, że znalezienie tych ofert zajęło autorom

raportu 5 minut.

Psilocybe Colombian #1

This one has a nice history in Colombia. Picked from the cowfields of the little village Villa de Leiva. Found to be very potent, giving a beautiful journey. From the same grower as the Normal Mexican. Fresh Colombian Magic Mushrooms available in 750g packs.

Not recommended for use under 18. If pregnant, nursing or taking a prescription drug, consult your health care professional. Do not exceed recommended dose. Consumption may impair ability to drive or operate heavy equipment. Not recommended for consumption with alcoholic beverages.

Opisano również metodę, w której wykorzystanie zarodników prowadzi do otrzymania

dikariotycznej grzybni. Grzybnię tę można wykorzystać do dalszego jej namnażania lub do

porcjowania i sprzedawania jako gotowego do spożycia materiału [JANOSZKA I IN., 2005].

Takie produkty, ze względu na swą bezpostaciową formę, są niemożliwe do identyfikacji za

pomocą tradycyjnych metod makro- i mikroskopowych [ADAMCZYK, 2006].

Dostęp do grzybków halucynogennych jest zatrważająco łatwy, nie dziwi zatem ich

rosnąca wciąż popularność. Należy jednak wziąć pod uwagę fakt, iż w naszej strefie

klimatycznej oprócz osławionej przez zbieraczy łasiczki lancetowatej, na łąkach rośnie

kilkadziesiąt podobnych gatunków grzybów, praktycznie nierozróżnialnych dla laików.

11

Gatunki te stanowią poważne zagrożenie życia dla amatorów odurzania, którzy przez

niewiedzę konsumują silnie trujące grzyby, jak na przykład stożogłówki (Conocybe), czy

hełmówki (Galerina).

3. MORFOLOGICZNA IDENTYFIKACJI GRZYBÓW

Oznaczanie grzybów do celów konsumpcyjnych jest zadaniem stosunkowo łatwym.

Dla oznaczenia gatunku grzyba konieczne jest sprawdzenie cech, które odróżniają ten gatunek

od innych podobnych. Są to tak zwane cechy diagnostyczne. Jedną z takich cech jest barwa

zarodników, dzięki której można nieuzbrojonym okiem określić gatunek grzyba. Wysyp

zarodników otrzymuje się układając dojrzały kapelusz hymenoforem do dołu na kartce

białego papieru. Po kilku godzinach należy usunąć kapelusz, na kartce pozostają wówczas

zarodniki o kolorze właściwym dla danego gatunku. Barwa wysypu zarodników jest cechą

bardzo pomocną przy oznaczaniu grzybów, pozwala ona na szybkie przyporządkowanie

znaleziska do rodziny w danej grupie grzybów. Warto podkreślić, że w przypadku grzybów

blaszkowych zrobienie wysypu zarodników jest łatwe i szybkie i jest bardzo pomocne.

W praktyce grzybiarza, umiejętność robienia wysypu zarodników jest także bardzo przydatna.

Określenie barwy wysypu zarodników umożliwia na przykład pewne odróżnienie pieczarek

(czekoladowobrązowy wysyp) od muchomorów (biały wysyp), opieniek (biały wysyp) od

"fałszywych opieniek" (brązowy wysyp), itd. Wysyp zarodników bywa także potocznie

nazywany "odciskiem kapelusza". W przypadku grzybów Psilocybe wysyp zarodników jest

purpurowo-brązowy. Często można zauważyć, iż kapelusze sąsiadujących ze sobą łysiczek są

oprószone smugami ciemnego pyłu.

Inną cechą, która ułatwia identyfikację gatunków grzybów Psilocybe jest niebieskie

zabarwienie trzonka u nasady kapelusza. Po ścięciu lub uszkodzeniu trzonka barwa ta zmienia

się na czerwoną w ciągu 30-60 min. Zjawisko to, nie jest cechą charakterystyczną gatunków

grzybów zawierających psylocybinę, ale może świadczyć o tym, iż grzyb nie należy do

gatunku trującego [SCHWARZ I SMITH, 1988]

Wysypu zarodników można dokonać dysponując świeżymi owocnikami, jednakże

najczęściej do identyfikacji i analizy otrzymywane są grzyby w postaci zasuszonej. Ze

względu na trudności z makroskopowym określeniem gatunku grzyba w celu jego

identyfikacji stosuje się często metody mikroskopowe.

12

Psilocybe semilanceata Psilocybe cubensis

(Łysiczka lancetowta) (Łysiczka kubańska)

Amanita muscaria (Muchomor czerwony)

Aby przywrócić turgor tkanek często stosuje się roztwór 2,5% wodorotlenku potasu.

Po potraktowaniu wodorotlenkiem tkanki grzyba powracają w pewnym stopniu do swojego

pierwotnego stanu i możliwa staje się identyfikacja gatunku przy pomocy mikroskopu

tradycyjnego bądź elektronowego.

W przypadku analizy z użyciem mikroskopu tradycyjnego bierze się pod uwagę

kształt oraz cechy charakterystyczne zarodników, cystyd oraz basyd umiejscowionych na

grzybni. Dodatkowo, analiza za pomocą mikroskopu elektronowego może ułatwić

identyfikację grubszych i bezbarwnych tkanek. W przypadku zastosowania skaningowego

mikroskopu elektronowego (SEM) otrzymuje się także zdjęcia trójwymiarowe [TSUJIKAWA, I

IN., 2003].

13

4. EFEKTY SPOŻYWANIA GRZYBÓW

„Magiczne grzybki”, jak wynika z wielu doniesień [MUSSHOFF I IN. 2000; PASSIE I IN.,

2002], konsumowane są zazwyczaj w postaci surowej, taka forma wywołuje, bowiem,

najsilniejsze doznania już po 20-40 minut od spożycia. Opisywane są również przykłady

spożywania grzybków zmieszanych w napojach lub potrawach. Zbiory grzybków

przechowywane są najczęściej w postaci suszonej bądź mrożonej, często są trzymane w

miodzie, co w znacznym stopniu pozwala zachować ich wysoką aktywność [BOGUSZ I IN.,

1998; MUSSHOFF I IN., 2000].

Doniesienia dotyczące formy oraz ilości spożywanych grzybków są bardzo

zróżnicowane. Jednakże za ilość pozwalającą odczuć działanie przyjmuje się 20-30 sztuk

świeżych lub 30-40 suszonych grzybków. Badania kliniczne pozwoliły na oszacowanie, iż

konsumpcja 15-20 mg grzybków wpływała na różnorodne zachowanie psychiczne niektórych

pacjentów. Notowano między innymi zaburzenia toku myślenia, zaburzenia emocjonalne oraz

zaburzenia spostrzegania rzeczywistości [VOLLENWEIDER I IN., 1997]. W literaturze naukowej

oraz w doniesieniach internatów spotyka się opisy różnorodnych doznań po spożyciu

grzybków. Spośród wielu efektów najczęściej jednak opisywane są:

- halucynacje, zmiany percepcyjne i zmiany sposobu postrzegania świata definiowane

jako fałszywe spostrzeżenia zmysłowe, patologiczne postrzeganie przedmiotów, które

nie znajdują się w polu widzenia jednostki lub w ogóle nie istnieją; halucynacjom

towarzyszy silne przekonanie o realności odbieranych bodźców,

- uczucie błogostanu czyli przyjemne odprężenie, wrażenie „odpływania”, przyjemne

barwne wizje, ogólne pozytywne spostrzeganie stanu rzeczy, uczucie opuszczenia

ciała, brak koordynacji ruchowej [KELLER I IN., 1999];

- stany psychotyczne w tym paranoidalne urojenia oraz obsesje, nagłe i gwałtowne

zmiany osobowości oraz toku postępowania, może wystąpić tzw. „bad trip”

[JANOSZKA I IN., 2005]

- nadmierne pobudzenie psychosomatyczne, huśtawka nastrojów,

- różnorakiego rodzaju zaburzenia ze strony układu pokarmowego w tym wymioty,

biegunki oraz bóle brzucha.

Badania dotyczące konsumpcji Psilocybe dowodzą, że nie istnieje możliwość fizycznego

uzależnienia od tych grzybów, pomimo zwiększającej się tolerancji przy ich długotrwałym

zażywaniu. Ich częste spożywanie stwarza możliwość uzależnienia psychicznego. Element

oszołomienia, związany z ich spożywaniem, nie jest obojętny dla młodego organizmu.

14

Grzyby te powodują pobudzenie psychoruchowe, halucynacje, uczucie niepokoju. Przy

niewłaściwym stosowaniu może dojść nawet do ostrej psychozy. Człowiek w takim stanie

traci świadomość i może być bardzo niebezpieczny dla siebie i innych. Osoby często

zażywające substancje halucynogenne wykazują podwyższony poziom agresji

[https://hyperreal.info/].

5. SUBSTANCJE AKTYWNE WYSTĘPUJĄCE W GRZYBACH

Głównymi substancjami o właściwościach halucynogennych występującymi

w grzybach są psylocybina (4-fosfonyloksy-N,N-dimetylotryptamina) i towarzyszący jej

drugi alkaloid psylocyna (4-hydroksy-N,N-dimetylotryptamina). Oprócz tych związków, w

grzybach stwierdzono również obecność baeocystyny (4-fosforyloksy-N-metylotryptaminy)

będącej pochodną psylocybiny, a różniąca się od niej jedynie brakiem podstawnika

metylowego przy azocie w łańcuchu bocznym, oraz norbaeocestyny (4-

fosforyloksytryptaminy) występującej zazwyczaj w ilościach śladowych.

Psylocyna Psylocybina

Baeocystyna Norbaeocystyna

O

NH

N

H

CH3

POH

OH

O

O

NH

N

H

H

POH

OH

O

OH

NH

N

CH3

CH3

O

NH

N

CH3

CH3

POH

OH

O

15

Psylocybina jest jednym z nielicznych związków naturalnych, które zawierają w swej

strukturze atom fosforu. Substancja ta dobrze wchłania się poprzez tkanki jamy ustnej i ulega

w organizmie defosforylacji. W wyniku tego procesu degradacji powstaje

najprawdopodobniej jej metabolit – psylocyna, która jest odpowiedzialna za ogół właściwości

halucynogennych grzybów. Przyjęcie inhibitorów monoaminooksygenazy przed zażyciem

psylocybiny groźnie wzmacnia jej działanie. Farmakologicznie działanie psylocybiny jest

charakterystyczne dla substancji halucynogennych i przypomina efekty wywoływane przez

LSD, jednakże około 100 razy słabsze. Przyjęta doustnie, działa około 5-6 godzin. Pierwsze

efekty jej działania zauważalne są po około 15-40 minutach od jej zażycia. Psylocybina

pojawia się we krwi w oznaczalnych stężeniach w 20 - 40 minut po podaniu doustnym 0,2

mg/kg masy ciała [KAFARSKI, 2006].

Z przeprowadzonych badań wynika, że ilość psylocybiny niezbędna do wywołania

silnych halucynacji to około 10-18 mg [HASLER I IN., 2002]. Jest to jednak ilość szacunkowa,

gdyż na efekty działania psylocybiny składa się wiele czynników, jak na przykład

indywidualne cechy związane z metabolizmem osoby zażywającej oraz pokarm przyjęty

przed spożyciem grzybów.

Zarówno psylocybina, jak i psylocyna zostały sklasyfikowane jako substancje o

dużym potencjale nadużywania. Substancje te znajdują się w wykazie środków odurzających

w grupie I-P stanowiącym załącznik do ustawy „O przeciwdziałaniu narkomanii”.

ONOH

NH2

O OH

ONOH

NH2

Kwas ibotenowy Muscymol

Oprócz wyżej wymienionych psylocyny i psylocybiny w wielu grzybach

o właściwościach halucynogennych występują także kwas ibotenowy oraz muscymol (5-

(aminometylo)-3-izoksazolol), pochodne izoksazoli [HALLEN I IN., 2002]. Związki te występują

w znacznych ilościach w muchomorach (Amanita muscaria, Amanita phalloides, Amanita

pantherina), i to właśnie one odpowiedzialne są za ich właściwości odurzające. W 100 g

suchej masy grzyba Amanita muscaria zawartych jest 180 mg wymienionych substancji, z

których jedynie 25 mg, to kwas ibotenowy. W organizmie kwas ten metabolizowany jest

właśnie do muscymolu, który wykazuje mniejszą toksyczność i wydalany jest z moczem w

16

postaci niezmienionej. Dawka niezbędna do wywołania doznań narkotycznych to 30-60 mg

dla kwasu ibotenowego oraz 10-15 mg dla muscymolu [HALPERN, 2004]. Aktualny pogląd

głosi, że kwas ibotenowy nie przekracza bariery krew-mózg w formie zmienionej i jest

częściowo metabolizowany do muscymolu i muskazonu, a częściowo wydalany w

niezmienionej formie. Z badań prowadzonych nad zwierzętami przy użyciu kwasu

ibotenowego wynika, że jest potężną neurotoksyną (po wstrzyknięciu domózgowym). Jest

strukturalnie podobny do glutaminy i aktywuje receptory NMDA, ale to prawdopodobnie nie

włącza się to w ogół działania psychoaktywnego Amanita muscaria. Ma on działanie 5-8 razy

słabsze niż muscymol (efektywna dawka to 50-100 mg). Muscymol odpowiada za większą

część działania psychoaktywnego muchomorów. Główne działanie tego związku polega na

blokowaniu receptora GABA-A. Związek ten używany jest w badaniach nad GABA jako jego

najskuteczniejszy broker [LI I OBERLIES, 2005]. Dowiedziono, że muscymol działa na kilka

obszarów mózgu - korę mózgową, hipokamp i móżdżek. Związek ten wpływa także na

poziom neuroprzekaźników: zwiększa ilość serotoniny i acetylocholiny w mózgu, a obniża

ilość noradrenaliny. Działanie muscymolu znacznie różni się od działania pochodnych

fenyloetyloaminy i indolu, co jest widoczne na wykresach badań EEG. Nie są to jednak

naukowo potwierdzone badania, gdyż muscymol nie jest metabolizowany przez organizm

ludzki. Oznacza to, z czysto teoretycznego punktu widzenia, że nie ma on prawa oddziaływać

w jakikolwiek sposób na ciało i umysł. Muscymol wydalany jest z organizmu w

niezmienionej formie. Dawkowanie doustne substancji waha się w granicach 10-15 mg. W

ustawie o przeciwdziałaniu narkomanii kwas ibotenowy oraz muscymol nie znajdują się w

wykazie środków psychotropowych.

Kolejnym związkiem, który występuje w muchomorach w niewielkich ilościach jest

muskazon. Wykazuje on psychoaktywość i bardzo możliwe, że odpowiada za część ogólnego

działania muchomorów czerwonych. W niewielkich ilościach (0,002% - 0,003% suchej masy

grzyba), w Amanita muscaria występuję muskaryna. Alkaloid ten, charakterystyczny dla

innych gatunków grzybów (min.: strzępiaka ceglastego Inocybe patouillardii) oddziaływuje

na poziom acetylocholiny w mózgu i działa na receptory muskarynowe. Zawartość

muskaryny w muchomorach jest dosyć niska, jednak może być ona odpowiedzialna za

cholinergiczne działanie muchomorów. Choć dowiedziono naukowo aktywność muskaryny,

to jej wchłanianie przez ścianę jelita jest bardzo powolne i prawie nie przedostaje się ona

przez barierę krew-mózg (możliwe jest to w zasadzie tylko przy równoczesnym podaniu

lecytyny). Ponadto efekt działania muskaryny znacznie różni się od działania Amanita

17

muscaria. Zatem muskaryna nie ma większego wpływu na charakter odurzenia muchomorem

czerwonym.

6. BADANIA FARMAKOKINETYCZNE

Rosnąca liczba publikacji naukowych wskazuje na coraz to większe zainteresowanie

zarówno środowisk medycznych jak i chemicznych tematem oddziaływania psylocybiny na

organizm ludzki.

Badania przeprowadzane na wolontariuszach oraz zwierzętach laboratoryjnych, przy

użyciu 14C-znakowanej psylocybiny wykazały, iż metabolitami tej substancji są 4-hydroksy-

N,N-dimetylotryptamina, aldehyd 4-hydroksy-indolo-3-octowy, kwas 4-hydroksy-indolo-3-

octowy oraz 4-hydroksytryptofanol. Produkty te powstają w procesie deaminacji oraz

oksydacji psylocybiny [HASLER I IN., 1997; HASLER I IN., 2002]. Dodatkowo postulowane jest

tworzenie się w szlaku metabolizmu psylocybiny, psylocyno-O-glukuronidu (typowego

produktu detoksykacji) na zasadzie analogii tworzenia się 5-hydroksytryptamin-O-

glukuronidu w szlaku metabolizmu serotoniny. Jednakże, przeprowadzone do tej pory

badania nie pozwalają na jednoznaczną identyfikację tego metabolitu [PASSIE I IN., 2002].

Psylocyna pojawia się w surowicy po około 30 minutach. W tym czasie, w wątrobie

zachodzi główny szlak przemiany metabolicznej tej substancji. Psylocybina ulega gwałtownej

defosforylacji, przy pomocy fosfatazy alkalicznej, do psylocyny, która jest główną substancją

odpowiedzialną za właściwości halucynogenne grzybków. Ponadto stwierdzono również, że

czas półtrwania psylocybiny oraz długość jej działania jest zmienna i zależy od sposobu jej

podania. I tak, dożylne podanie psylocyny skraca czas do 74,1 ± 19,1 min. w porównaniu do

czasu półtrwania psylocyny podanej doustnie – 163 ± 64 min. Z kolei czas działania tej

substancji po dożylnej aplikacji skraca się nawet do 15-30 minut [HASLER I IN., 1997].

18

Postulowany szlak metabolizmu psylocybiny w organizmie ludzkim [HASLER I IN.,

1997, HASLER I IN., 2002].

Budowa zarówno psylocybiny, jak i psylocyny wykazuje podobieństwo strukturalne

do neuroprzekaźnika – serotoniny. Psylocyna jest substancją mniej hydrofilową niż jej

prekursor, w związku z czym łatwiej przenika barierę krew-mózg. Psylocyna wykazuje

właściwości antagonistyczne względem receptorów serotoniny oraz mimetyczne względem

samej serotoniny. Dowiedziono, iż za działanie halucynogenne, zarówno związków będących

analogami strukturalnymi fenyloetyloaminy (amfetamina, meskalina) jak i indoloaminy

(psylocyna) odpowiedzialne jest ich powinowactwo do receptorów serotoninowych typu 5-

HT2, a w szczególności 5-HT2A i 5HT2C [AGHAJANIAN I MAREK, 1999]. Dzięki tym

właściwościom psylocybina zwiększa poziom serotoniny w mózgu oraz powoduje

pobudzenie czynności sensoromotorycznych i percepcyjnych. Dlatego też charakterystyczne

objawy zażywania grzybków halucynogennych, to niepokój oraz różnego rodzaju

halucynacje.

OPOH

OH

O

NH

N

CH3

CH3

OH

NH

N

CH3

CH3

OH

NH

O

H

OH

NH

O

OH

OH

NH

OH

Psylocybina Psylocyna

4-hydroksyindoloacetaldehyd

4-hydroksyindoloetanolkwas 4-hydroksyindolo-3-octowy

19

OH

NH

N

CH3

CH3

NH

NH2

OH

Psylocyna Serotonina

7. MOŻLIWOŚCI IDENTYFIKACJI I OZNACZANIA SUBSTANCJI

HALUCYNOGENNYCH

Z racji potencjalnego zagrożenia związanego ze zbieractwem, hodowlą, dystrybucją i

zażywaniem grzybków halucynogennych i realizacji założeń Ustawy o zapobieganiu

narkomanii, istnieje zwiększone zapotrzebowanie w zakresie określenia poziomu środków

psychoaktywnych w płynach ustrojowych. Metody analizy jakościowej i ilościowej,

przeznaczone do rutynowych oznaczeń wykorzystywanych przez właściwe instytucje,

powinny być wystarczająco szybkie i wiarygodne. Zatem w tej części opracowania omówione

zostaną aktualnie używane metody izolacji, oraz analizy jakościowej i ilościowej substancji

psychoaktywnych występujących w grzybach polskich.

Izolacja psylocyny i psylocybiny z materiału biologicznego

Proces izolacji psylocybiny i psylocyny z materiału grzybowego jest prosty i dość

szybki. Najczęściej izolacji tych alkaloidów dokonuje się na drodze ekstrakcji do

rozpuszczalnika. Standardowo stosowane rozpuszczalniki to chloroform, metanol bądź woda

[KYSILKA I WURST 1990, WURST I IN., 1992]. Izolacji substancji halucynogennych, jednym z

wybranych rozpuszczalników, wykonuje się używając ultrasonifikatora celem zniszczenia

komórek grzyba, a tym samym zwiększenia stopnia ekstrakcji substancji halucynogennych z

grzyba. Po oddzieleniu supernatantu od zawiesiny odparowuje się rozpuszczalnik, najlepiej w

środowisku niereaktywnego gazu. Tak otrzymany ekstrakt poddaje się dalszym badaniom

[MUSSHOFF I IN., 2000].

Inną metodą izolacji halucynogennych alkaloidów jest ekstrakcja materiału

grzybowego rozcieńczonym wodnym roztworem kwasu octowego. W kolejnym etapie

wyodrębniania otrzymany ekstrakt zakwasza się do pH=4 lodowatym kwasem octowym.

Rozwór pozostawia się do odstania na okres jednej godziny, a następnie podgrzewa

20

do temperatury 70º C. Po tym czasie ekstrakt chłodzi się, filtruje, otrzymany filtrat

doprowadza się do pH=8 przy użyciu stężonego wodorotlenku amonu. W ten sposób

otrzymany roztwór poddaje się ekstrakcji eterem dietylowym. Otrzymany ekstrakt eterowy

suszy się nad siarczanem sodu, filtruje i odparowuje w środowisku niereaktywnym [CASALE,

1985].

W obu przypadkach otrzymuje się ekstrakty o wystarczającej czystości do

przeprowadzenia dalszych badań. Wynikiem ekstrakcji metanolem jest mieszanina psylocyny

oraz psylocybiny. Z kolei poprzez ekstrakcję, kolejno wodnym roztworem kwasu octowego i

eterem dietylowym otrzymuje się ekstrakt zawierający niemal wyłącznie psylocynę. W

zastosowanych warunkach, obecna w roztworze psylocybina ulega defosforylacji [CASALE,

1985].

Najprostszą i najczęściej wykorzystywaną techniką rozdziału i identyfikacji

pochodnych indolowych zawartych w grzybach jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

[BEUG I BIGWOOD, 1981; GARTZ, 1987; GROSS, 2002; SEMERDZIEVA I IN., 1986; WURST I IN., 1992].

Rozdziału przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej dokonuje się na płytkach pokrytych

krzemionką. Najlepsze efekty rozdziału otrzymano przy użyciu eluentów: n-butanol, kwas

octowy, woda (12:3:5 v/v/v), 1,5% rozwór amoniaku w metanolu, n-butanol, kwas octowy,

woda (2:1:1 v/v/v) oraz amoniak, woda, n-propanol (12:188:500 v/v/v). Stosując pierwszy z

opisanych eluentów otrzymano najlepszy rozdział i nie obserwowano rozmycia plamek na

płytce [BEUG I BIGWOOD, 1981]. W celu wizualizacji rozdzielonych substancji standardowo

używa się odczynnika Ehrliha służącego do wykrywania amin. Ponadto psylocyna jak i

psylocybina są dobrze widoczne na płytce w niskim paśmie promieniowania UV.

Metody immunochemiczne

Najbardziej przydatnymi metodami analizy jakościowej i ilościowej substancji o

właściwościach narkotycznych, są te, które nie wymagają dodatkowych technik izolacji z

materiału biologicznego (krew, mocz). Tego typu metody oparte są przede wszystkim o

badania immunochemiczne. Możliwość wytwarzania przeciwciał dowolnych leków w

organizmie żywym spowodowała istotny postęp w badaniach ilości i jakości środków

psychoaktywnych. Standardowy proces otrzymywania trwałych połączeń chemicznych

badana substancja-białko, opiera się na wykorzystaniu reaktywnych grup, które z tą

substancją tworzą czynny związek immunologiczny - wysokocząsteczkowy hapten

(immunogenic conjugate). Stworzenie tego typu haptenu może stymulować wytworzenie

wysoce specyficznych przeciwciał monoklonalnych, które mogą być wykorzystane w analizie

21

jakościowej oraz ilościowej wybranych substancji psychoaktywnych. W literaturze istnieje

niewiele informacji dotyczących zastosowania tej metody do identyfikacji substancji

halucynogennych. Jedyna informacja dotyczy prób syntezy koniugatów białkowych

psylocyny [ALBERS I IN., 2002].

Metody analizy instrumentalnej

Do najbardziej przydatnych i efektywnych metod zarówno ilościowej, jak i

jakościowej analizy substancji psychoaktywnych należy obecnie wysokosprawna

chromatografia cieczowa (HPLC). Zastosowanie tej metody do celów identyfikacyjnych

wzrosło szczególnie po wprowadzeniu techniki detekcji typu diode-array. Ten typ detekcji

pozwala uzyskać obok sygnału piku danego związku na chromatografie jego widmo UV

(200-350 nm) w układzie trójwymiarowym, potwierdzające jego jednorodność. Ta

właściwość detektora diode-array znacznie podnosi możliwości identyfikacji związków

[BOGUSZ I WU, 1991; FERARA I IN., 1992; LOGAN I IN., 1990].

Wykorzystanie HPLC z możliwością użycia innych detektorów: UV [KYSILKA I IN.,

1985; TSUJIKAWA I IN., 2003], fluorescencyjnym [SAITO I IN. 2004; SAITO I IN., 2005],

chemiluminescencyjnym [ANASTOS I IN., 2005; ANASTOS I IN., 2006], elektrochemicznym

[CHRISTIANSEN I RASMUSSEN, 1983], woltametrycznym [KYSILKA I IN., 1985] i masowym

[BOGUSZ I IN., 1998; SAITO I IN. 2004], pozwala na uzyskanie wysokiego stopnia odzysku

substancji halucynogennych, wysoką selektywność pomiaru oraz niewielki nakład czasu

niezbędny do wykonania pomiarów. Metoda ta została z powodzeniem użyta do badania

obecności i stężenia psylocyny w próbkach krwi [LINDENBLATT I IN., 1998], poziomu

psylocyny i psylocybiny w suszu grzybowym [THOMPSON, 1980], oraz poziomu kwasu

ibotenowego w sporach i kapeluszach muchomora czerwonego [STROEMER I IN., 2004].

Kolejną metodą identyfikacji oraz analizy ilościowej związków o aktywności

halucynogennej jest metoda chromatografii gazowej i spektrofotometrii masowej (GC-MS) z

równoczesną możliwością korzystania z biblioteki widm masowych np. systemu HP 5997 OC

MS/MD Chemistation. Wśród możliwych technik analitycznych w tym układzie,

zastosowanie znalazła techniki SIR (selected ion recording) oraz SIM (selected ion

monitoring) stosowane dla niższych stężeń związków halucynogennych [STICHT I KÄFERSTEIN,

2000]. Techniki te pozwalają na monitorowanie zmian intensywności wybranych

specyficznych fragmentów cząsteczki tworzących widmo masowe. Dane uzyskane dla

materiału badawczego, mogą znaleźć potwierdzenie w komputerowym układzie

porównawczym z odpowiednim wzorcem wybranym z banku widm. Metoda GC-MS

22

znajduje również zastosowanie w analizie ilościowej. Rutynowo, z uwagi na oznaczalność,

stosuje się technikę SIM z równoczesnym użyciem wzorca wewnętrznego, którym jest

pochodna deuterowana oznaczanego związku. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana

do identyfikacji psylocyny, zarówno w materiale grzybowym, jak również w próbkach krwi i

moczu [KELLER I IN., 1999; STICHT I KÄFERSTEIN, 2000, SARWAR I MCDONALD, 2003; KIKURA-

HANAJIRI, 2005].

W rutynowych badaniach toksykologicznych zastosowanie znajdują również

programy systematycznej analizy ksenobiotyków, wśród których wymienić można system

Remedi HS (Bio-Rad). Program Remedi HS oparty jest na zasadach wysokosprawnej

chromatografii cieczowej (HPLC) i detekcji UV. System ten, który umożliwia szybką analizę

około 500 leków i ich metabolitów w układzie wielopunktowego pomiaru UV

(multiwavelenght ultrafiolet detection), znalazł również zastosowanie analizie substancji

psychotropowych zawartych w grzybach halucynogennych. Metodą tą zidentyfikowano

psylocynę w moczu [STICHT I KÄFERSTEIN, 2000].

Najnowszym rozwiązaniem analitycznym jest zastosowanie chromatografii cieczowej

sprzężonej ze spektrometrią masową (LC-MS). Osiągane progi detekcji dla oznaczeń wielu

związków w tym układzie są niższe aniżeli uzyskane w systemie GC-MS i najczęściej

występują w zakresie od 10 ng/ml. Z zastosowaniem techniki chromatografii cieczowej

sprzężonej ze spektrometrią mas z jonizacją przez rozpylanie w polu elektrycznym (LC/MS-

ESI), opracowano szybką identyfikację wielu substancji o właściwościach narkotycznych,

takich jak amfetamina, LSD oraz psylocybina. Czas analizy każdego ze związków jest był

dłuższy niż 5 minut, a zastosowanie łagodnej metody jonizacji ESI miało duże znaczenia dla

analizy, substancji termolabilnych [PIHLAINEN I IN., 2003]. Z kolei stosując technikę

chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas z chemiczną jonizacją pod

ciśnieniem atmosferycznym (LC/MS-APCI) wykryto i oznaczono psylocynę w

zredukowanych do niewielkich objętości próbkach krwi [LECHOWICZ, 2004].

Metodą służącą najczęściej do rozdziału związków o niewielkich masach

cząsteczkowych jest strefowa elektroforeza kapilarna (CZE). Znalazła ona również

zastosowanie w identyfikacji i określeniu zawartości substancji o właściwościach

halucynogennych w grzybach. Pomiary psylocybiny zostały przeprowadzone w systemie

P/ACE 5000 i pozwoliły na dokładne określenie zawartości psylocybiny oraz baeocestyny w

próbkach grzybów. [PEDERSEN-BJERGAARD I IN., 1997].

23

Inne metody

W ostatnich kilkudziesięciu latach nastąpił znaczny rozwój technik analitycznych

opartych o zastosowanie metod biologii molekularnej. Metody te są coraz powszechniej

wykorzystywane w wielu dziedzinach nauki, w tym również do identyfikacji grzybów

halucynogennych. Umożliwiają one identyfikację poszczególnych gatunków grzybów

halucynogennych [KIMBERLY I SAVILLE, 2004; NUGENT I SAVILLE, 2004; LI I OBERLIES, 2005]

bez konieczności mikroskopowej analizy zarodników, czy też makroskopowego rozpoznania

materiału w postaci zasuszonej.

Jedną z takich metod jest PCR, która zrewolucjonizowała współczesną biologię

molekularną umożliwiając wyprodukowanie milionów kopii fragmentów DNA w zaledwie

kilka godzin. Metoda ta jest doskonałym narzędziem do wykrywania ekstremalnie niskiego

stężenia szukanego metabolitu z wysoką specyficznością. Niezwykła wybiórczość i

wydajność amplifikacji metody PCR jest uzupełnieniem procedur analitycznych, które

omówiono powyżej. Połączenie tych metod umożliwia badanie pojedynczego genu lub

krótkiego segmentu w jego obrębie, nawet jeśli cały dostępny do analiz DNA pochodzi z

zaledwie jednej komórki. Metodę PCR wykorzystuje się obecnie powszechnie do

wykrywania infekcji wirusowych, również obecności wirusa HIV-1 we krwi pacjentów

chorych na AIDS (lub podejrzewanych o chorobę); do badania samoczynnie powstających

nowotworów ludzkich, aby określić ewentualne zmiany w sekwencji genów kontrolujących

wzrost i podział komórek, oraz przed przeszczepami, do określania typu genów, od których

zależy układ zgodności tkankowej. PCR okazuje się również potężnym narzędziem do

jednoznacznej identyfikacji grzybów z rodzaju Psilocybe [ADAMCZYK, 2006].

Przeprowadzenie testów przy użyciu tej metody może zostać wykorzystane do odróżniania

bezpostaciowych grzybni, ujawniania łysiczki w mieszaninach suszu różnych gatunków

grzybów.

8. MOŻLIWOŚCI IDENTYFIKACJI I OZNACZANIA SUBSTANCJI

HALUCYNOGENNYCH W LABORATORIACH DOLNEGO ŚLĄSKA

Badania strukturalne substancji halucynogennych za pomocą metody NMR: Zakład Chemii Bioorganicznej Kierownik: Prof. Paweł Kafarski Tel.: +713203458

24

Politechnika Wrocławska Wybrzeże Wysińskiego 27 50-370 Wrocław

Rozdział i identyfikacja chemicznych substancji halucynogennych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC: Zakład Chemii Bioorganicznej Kierownik: Prof. Paweł Kafarski Politechnika Wrocławska Wybrzeże Wysińskiego 27 50-370 Wrocław

Rozdział i identyfikacja chemicznych substancji halucynogennych metodą chromatografii gazowej, HPLC i elektroforezy kapilarnej: Zakład Chemii Ekologicznej Kierownik: dr hab. Piotr Wieczorek tel.: +774545841 w. 2545; 2550 Uniwersytet Opolski ul Oleska 48 45-052 Opole

Badania materiału biologicznego za pomocą PCR: Zakład Technik Molekularnych Kierownik: Dr hab. Tadeusz Dobosz Tel.: +717841588 Akademia Medyczna we Wrocławiu ul. M. Curie-Skłodowskiej 52 50-368 Wrocław

Opracowanie metody immunologicznej oznaczania substancji halucynogennych: Zakład Immunologii Chorób Zakaźnych Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Gamian Tel.: +71 370 99 86 Polska Akademia Nauk Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej ul. Rudolfa Weigla 12 53-114 Wrocław

9. LITERATURA

Adamczyk A., Identyfikacja grzybów gatunku Psilocybe semilanceata przy pomocy techniki

PCR, Praca magisterska, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska, Wrocław,

2006.

Aghajanian G. K., Marek G. J., 1999, Serotonin and hallucinogens,

25

Neuropsychopharmacology, 21, 16-23.

Albers Ch., Lehr M., Beike J. Köhler H., Brinkmann B., 2002, Synthesis of a psilocyn hapten

and a protein-hapten conjugate, J. Pharm. Pharmacol. 54, 1265-

1267.

Anastos N., Barnett N. W., Lewis S. W., Gathergood N., Scammells P. J.,. Sims D. N, 2005,

Determination of psilocin and psilocybin using flow injection analysis with acidic

potassium permanganate and tris(2,2/-bipyridyl) ruthenium(II) chemiluminescence

detection respectively, Talanta, 67, 354-359.

Anastos N., Lewis S. W., Barnett N. W., SimsD. N., 2006, The determination of psilocin and

psilocybin in hallucinogenic mushrooms by HPLC utilizing a dual reagent acidic

potassium permanganate and tris(2,20-bipyridyl)ruthenium(II) chemiluminescence

detection system, J. Forensic Sci. 51, 45-51.

Beug M., Bigwood J., 1981, Quantitative analysis of psilocybin and psilocin in Psilocybe

baeocystis by High-Performance Liquid Chromatography and Thin-Layer

Chromatography, J. Chromatogr., 207, 379-385.

Bogusz M., Wu M., 1991, Standarized HPLC-DAD systems based on retention for systematic

toxicological screening, J. Anal. Toxicol. 15, 188-195.

Bogusz M. J., Maier R. D., Schafer A. T., Erkens M., 1998, Honey with Psilocybe

mushrooms: a revival of a very old preparation on the drug market, Int. J. Legal. Med.,

111, 147–50.

Casale J. F., 1985, An aqueous-organic extraction method for the isolation and identification

of Psilocin from hallucinogenic mushrooms, J. Forensic Sci., 30, 247-250.

Christiansen A., Rasmussen K.., 1983, Screening of hallucinogenic mushrooms with high

performance liquid chromatography and multiple detection, J. Chromatogr. 270, 293–

299.

Ferara S. D., Tedeschi L., Frison G., Castanga F., 1992, Solid phase extraction and HPLC-UV

confirmation of drug of abuse in urine, J. Anal. Toxicol. 16, 217-221.

Gartz J., 1987,

Gartz J., 1992, New aspect of the occurrence, chemistry and cultivation of European

hallucinogenic mushrooms, Storia e Scienze Naturali, 8.

Gartz J., 1994, Extraction and analysis of indole derivatives from fungal biomass, J. Basic. Microbiol. 34, 17–22. Gartz J., Mueller G. K., 1990, Analysis and cultivation of fruit bodies and mycelia of

Psilocybe bohemica, Biochem. Physiol. Pflanzen, 184, 337-341.

26

Gross S., 2002, Psychotropic drugs in developmental mushrooms: a case study review. J.

Forensic Sci. 47, 1298–1302.

Guzman, G., The genus Psilocybe, 1983 , Beih. Nova Hedwigia 74. J. Cramer, Vaduz.

Hallen H. E., Adams G.C., Eicer A., 2002, Amatoxins and phallotoxins in indigenous and

introduced South African Amanita species, South African J. Botany 68, 322-

326.

Halpern J. H., 2004, Hallucinogens and dissociative agents naturally growing in United

States, Pharmacol. Ther., 102, 131-138.

Hasler F., Bourquin D., Brenneisen R., Bar T., Vollenweider F. X., 1997, Determination of

psilocin and 4-hydroxyindole-3-acetic acid in plasma by HPLC-ECD and

pharmacokinetic profiles of oral and intravenous psilocybin in man, Pharm.

Acta Helv., 72, 175-184.

Hasler F., Bourquin D., Brenneisen R., Vollenweider F. X., 2002, Renal excretion profiles of

psilocin following oral administration of psilocybin: a controlled study in man,

J. Pharm. Biomed. Anal., 30, 331-339.

Heim R., Hofmann A., 1958, Isolement de la Psilocybine à partir du Stropharia cubensis Earle

et d'autres espèces de champignons hallucinogènes mexicains appartenant au genre

Psilocybe, Compt. rend. Acad. sc., 247, 557-561.

http://www.erowid.org/references

http://www.grzyby.pl

https://hyperreal.info/

Janoszka J., Rymkiewicz A., Dobosz T., 2005, Halucynogenne grzyby – Łysiczki

(Psilocybe). Część I. Charakterystyka, skutki zażycia, rozpoznawanie, Arch. Med. Sąd.

Krym. 55, 215-219.

Kafarski P., 2006, Rodzaje i zawartość związków halucynogennych w źródłach biologicznych

z terenu Polski oraz możliwości ich identyfikacji we krwi, Referat na seminarium

naukowym „ Biotechnologia w Strategii Rozwoju Województwa Dolnośląskiego”,

Wrocław.

Keller T., Schneider A., Regenscheit P., Dirnhofer R., Riicker T., Jaspers J., Kisser W., 1999,

Analysis of psilocybin and psilocin in Psilocybe subcubensis GUZMAN by ion

mobility spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry, Forensic Sci.

Int., 99, 93-105.

Kikura-Hanajiri R., Hayashi M., Saisho K., Goda Y., 2005, Simultaneus determination of

nineteen hallucinogenic tryptamines/β-calbolines and phenethylamines using gas

27

chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-electrospray

ionization-mass spectrometry, J. Chromatogr. B 825, 29-37.

Kimberly G. N., Saville B. J., 2004, Forensic analysis of hallucinogenic fungi: a DNA-Based

approach, Forensic Sci. Int., 140, 147-157.

Kysilka R., Wurst M., Pacakova V., Stulik K., Haskovec L., 1985, High-performance liquid

chromatographic determination of hallucinogenic indoleamines with simultaneous UV

photometric and voltametric detection, J. Chromatogr. 320, 414–20.

Kysilka R., Wurst M., 1989, High performance liquid chromatographic determination

of some psychotropic indole derivatives, J Chromatogr. 464, 434–437.

Kysilka R., Wurst M., 1990, A novel extraction procedure for psilocybin and psilocin

determination in mushroom samples, Planta Med., 56, 327-328.

Lechowicz W., Metodyka identyfikacji i oznaczania wybranych substancji halucynogennych

dla potrzeb opiniowania sądowego, Materiały konferencyjne, Sympozjum Ślesin 2004.

Li Ch., Oberlies N. H., 2005, The most widely recognized mushroom: Chemistry of the genus

Amanita, Life Sci., 78, 532-538.

Lindenblatt H., Kramer E., Holzmann-Erens P., Gouzoulis-Mayfrank E., Kovar K.A., 1998,

Quantitation of psilocin in human plasma by high-performance liquid chromatography

and electrochemical detection: comparison of liquid—liquid extraction with automated

on-line solid-phase extraction, J. Chromatogr. B, 709, 255-263.

Logan K. G., Stafford D. T., Tebbett J. R., Moore C. M., 1990, Rapid screening for 100 basic

drugs and metabolites in urine using cation exchango solid phase extraction and high-

performance liquid chromatography with diode array detection, J. Anal. Toxicol., 14,

154-160.

Musshoff F., Madea B., Beike J., Hallucinogenic mushrooms on the German market —

simple instructions for examination and identification, 2000, Forensic Sci. Int., 113,

389-395.

Nugent K. G., Saville B. J., 2004, Forensic analysis of hallucinogenic fungi: A DNA-based

approach, Forensic Sci. Int. 140,147-153.

Passie T., Seifert J., Schneider U., Emrich H. M., 2002, The pharmacology of psilocybin,

Addiction Biology, 7, 357–364

Pedersen-Bjergaard S., Sannes E., Rasmussen K. E, Tonnesen F., 1997, Determination of

psilocybin in Psilocybe semilanceata by capillary zone electrophoresis, J.

Chromatogr. B, 694, 375-381.

Pihlainen K., Sippola E., Kostiainena R., 2003, Rapid identification and quantitation of

28

compounds with forensic interest using fast liquid chromatography-ion trap mass

spectrometry and library searching, J. Chromatogr. A, 994, 93-102.

Repke D. B., Leslie D. T., Mandell D. M., Kish N.G., 1977, GLC-mass spectral analysis of

psilocin and psilocybin, J. Pharm. Sci. 66, 743–744.

Rudgley R., Alchemia kultury. Od opium do kawy, PIW, 2000.

Saito K., Toyo’oka T., Fukushima T., Kato M., Shirota O., Goda Y., 2004, Determination of

psilocin in magic mushrooms and rat plasma by liquid chromatography with

fluorimetry and electrospray ionization mass spectrometry, Anal. Chim. Acta. 527,

149–156.

Saito K., Toyo’oka T., Kato M., Fukushima T., Shirota O., Goda Y., 2005, Determination of

psilocybin in hallucinogenic mushrooms by reversed-phase liquid chromatography

with fluorescence detection, Talanta 66, 562–568.

Sarwar M., McDonald J. L., 2003, A rapid extraction and GC/MS methodology for the

identification of psilocin in mushroom/chocolate concoctions, Microgram J. 1,

177–183.

Schneider S., Donnelly M., Mushroom Toxicity, w: Auerbach PS, edytor:, Wilderness

Medicine 3rd ed, St. Louis, Mosty, 1995.

Schwartz R. H., Smith D. E., 1988, Hallucinogenic mushrooms, Clin. Pediatr. 27, 70-73.

Semerdzieva M., Wurst M., Koza T., Gartz J., 1986, Psilocybin in Fruchtkoerpern von

Inocybe aeruginascens. Planta Med., 47, 83-85.

Shirota O., Hakamata W., Goda Y., 2003, Concise large-scale synthesis of psilocin and

psilocibin, principal hallucinogenic constituents of „Magic Mushroom”, J.

Nat. Prod. , 66, 885-887.

Stamets P., Gartz J., 1995, A new caerulescent Psilocybe from the Pacific Coast of

Northwestern America Integration, Bereich Biotechnologie 6, 21-28.

Sticht G., Kaferstein H., 2000, Detection of psilocin in body fluids, Forensic Sci. Int., 113,

403-407.

Stijve T., Kuyper T., 1985, Occurence of psylocybin in various higher fungi from several

European countries, Planta Med., 385-387.

Stroemer F. C., Janak, K., Koller G. E. B. 2004, Ibotenic acod in Amanita muscaria spores and caps, Mycologist, 18, 114-117.

Thompson B. M., 1980, Analysis of psilocybin and psilocin in mushroom extracts by reversed-phase high performance liquid chromatography, J. Forensic. Sci, 25, 779-785.

29

Tsujikawa K., Kanamori T., Iwata Y., Ohmae Y., Sugita R., Inoue H., Kishi T., 2003,

Morphological and chemical analysis of magic mushrooms in Japan, Forensic Sci.

Int., 138, 85-90.

Vollenweider F. X., Leenders K. L., Scharfetter C., Maguire P., Stadelamnn O., Angst J.,

1997, Positron emission tomography and fluorodeoxyglucose studies of metabolic

hyperfrontality and psychopathology in the psilocybin model of psychosis,

Neuropsychopharmacology, 16, 357-372.

Wurst M., Kysilka R., Koza T., 1992, Analysis and isolation of indole alkaloids of fungi by

high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. 593, 201–208.