Identifisering/Klassifisering · 09.04.2018 4 Massespektrometri Massespektronomi er en analyseteknikk der man kan, v.h.a. et massespektrometer, kan bestemme molekylmassen av frie

09.04.2018

1

MALDI TOF MS i klinisk

mikrobiologi – Status 2018

André Ingebretsen

Avdeling for mikrobiologi og Avdeling for smittevern

Oslo universitetssykehus

Identifisering/Klassifisering

Bioingeniørdagen 2018

09.04.2018

2

Tidsforløp ”klassisk” klinisk

bakteriologi

Avle

sn

ing

Uts

æd

Hu

rtigte

ste

r, mik

ro

Prø

ve

sva

r

Re

gis

trerin

g

Prø

ve

tak

ing

InkuberingTransport

Identifikasjon

Resistens-

bestemmelse

4 timer 18 timer18 timer1 time 1 time

Kultur: Tid til ID og AST resultater: ~ 40 timer


Klassifisering av Bacteria


Hug et al. Nat. Microbiol (2016)

09.04.2018

3

Genomics & Proteomics i klinisk mikrobiologi


Massespektrometri i klinisk mikrobiologi

Emonet et al. CMI 2010.16;1604-13


09.04.2018

4

Massespektrometri

Massespektronomi er en analyseteknikk der man kan, v.h.a.

et massespektrometer, kan bestemme molekylmassen av

frie ioner i et vakum.

Ione-

kilde

DetektorMasse-analysator

Electron impact (EI)

Chemical ionization (CI)

Fast atom bombardment (FAB)

Electronspray ionization (ESI)

Matrix assisted laser

desorption/ionization (MALDI)

Quadrupol

Magnetic sector

Electric sector

Ion trap

Ion cyclotron

Time-of-flight

Faraday cup

Secondary electron

multiplier (SEM)

Scintillator

Micro channel plate (MCP)


Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time

Of Flight (MALDI TOF) Mass Spectrometry

• Matrix Assisted

– Krystalliserte molekyler med lav mol.vekt

– Høy absorption av UV eller IR hindrer ødeleggelse av protein

– Fremmer fordampning og ionisering

• Laser Desorption Ionization

– Matrix ionisering via laserpulser

– Delvis overføring av positiv ladning til proteiner

• Time Of Flight

– Ioneaksellering

– TOF korrelerer med masse og ladning

• Mass spectrometry


09.04.2018

5


Protein fingerprinting


Del Chierico et al. 2014 Journal of Proteomics, Volume 97, 2014, 69–87

09.04.2018

6


Kvalitet på spektra

• Høykvalitetsspektra gir– Stor reproduserbarhet av data

– Høyere oppløslighet innenfor artskomplekser (subtyping)

– Muligheter for typing

• Avhengig av – Alder på koloni

– Dyrkningsforhold

– Anvendt prosedyre for proteinekstraksjon

– Kolonitetthet


09.04.2018

7

Andre proteiner ?

• For Salmonella sp: – Cold-shock-like protein (Csph)

– Translation initiation factor IF-1

– Ribosome modulation factor

– Integration host factors A & B

– Nucleoid-associated proteins H-NS

– RNA chaperone CspeE

– Glutaredoxin-1

– Phosphocarrier protein HPr

– Andre?


Dieckmann et al. Appl Env Microbiol 2008

Prøvepreparering fra kultur

• Direkte preparering (”smear prep”)

– En tynn film smøres direkte på MALDI målplata

– Direkte innokulering vha loop, pipettespiss etc.

– Fungerer godt med de fleste G- og mange G+

• Rask ekstraksjon

– Tilsetter maursyre direkte på MALDI målplata.

• Etanol-Maursyre ekstraksjon

– Inaktivering av mikrober

– Anvendes i hovedsak på G+ og gjærsopp

– Gir generelt bedre scoreverdi –Bibliotekoppbygging


09.04.2018

8

Identifikasjon direkte

fra prøvematerialet


Clark et al. 2013 Clin Microb Rev

MALDI TOF MS direkte på

blodkulturer

Drancourt, M. CMI 2010.16;1620-25


09.04.2018

9

ID direkte fra urinprøver

Laura Ferreira et al. J. Clin. Microbiol. 2010;48:2110-2115


Hvordan bedre datakvaliteten?

• Standard operating procedures (SOP)– Samme arbeidsflyt

– Samme typer media – ikke chromogene

• Samme alder på kultur– Så ”fersk” som mulig (>24t)

• Samme laserstyrke/flere laserskudd

• Hvis usikker på art – stol på magafølelsen– Bekreft med sekvensering


09.04.2018

10

Antall arter i de kommersielle databasene

• Masserekkevidde: 2000- 20000 Da

• Hovedsakelig ribosomale proteiner og noen husholdsproteiner

• Kommersielle databaser– Bruker Daltonics: 2461 arter (DB6903)

– bioMerieux: 1046 arter (V3 DB)

• Åpne databaser

• Forbedrede databaser


Automatisert spotting på plate

BioVendor MALDI Colonyst


09.04.2018

11

Automatisert spotting på plate

Scirobotics + Tecan: Pickolo


Testing: MBT Galaxy

• Load maursyre og matriks

• Target plate settes i maskinen

• Velg om du vil ha maursyre/matriks eller bare matriks

• Marker posisjoner på target plate (spotting range)

• Start


09.04.2018

12

Konklusjon av testing

• Ingen signifikant forskjell i score verdi

• Ingen kryss-kontaminering

• Minimum prosedyretid var 20 min– Min antall prøver

• Manuell pipettering er raskere– Redusrer hands-on time

• Reduserer kostnader på forbruksvarer

• Reduserer belastningsskader/reagensskader


Karakterisering av sviknott

Kaufmann et al. Parasitology February 2012 139 : pp 248-258


09.04.2018

13

Identifikasjon av virus?


Identifikasjon av Leishmania sp

Cassagne et al. Clinical Microbiology and Infection, Volume 20, Issue 6, 2014, 551 - 557


09.04.2018

14

MBT STAR-BL module

(MBT Selective Testing of Antibiotic Resistance Beta-lactamase)


MBT STAR-BL module

• Ampicillin

• Piperacillin

• Cefotaxime

• Ceftazidime

• Ertapenem

• Meropenem


09.04.2018

15

Påvisning av cfiA hos B.fragilis

Nagy, E. et al. J Med Microbiol. 2011. 60;1584-1590


MBT ASTRA (Antibiotic sucseptibility

testing rapid assay)

O18 (Resistent) ATCC 25285 (Følsom)

Kontroll u/ AB Kontroll u/ ABMeropenem

64 mg/L

Meropenem

64 mg/L

Metronidazol

32 mg/L

Metronidazol

32 mg/L

Sydenhamn et al. Poster P1236 ECCMID 2015


09.04.2018

16

MBT ASTRA (Antibiotic sucseptibility

testing rapid assay)

Meropenem

64 mg/L

Meropenem

64 mg/L

Metronidazol

32 mg/L

Metronidazol

32 mg/L

Resistent

Følsom

O18 (Resistent) ATCC 25285 (Følsom)

Sydenhamn et al. Poster P1236 ECCMID 2015


Resistensbestemmelse på MALDI-TOF MS?

• Rask deteksjon av resistens

• Kan oppdage nye β-laktamaser

• Stemmer godt overens med referansemetoder

• Bør kunne være metode for å detektere alle enzymatiske resistens mekanismer


09.04.2018

17

• Ikke efflux mekanismer eller porinforandringer

• For få studier

• Fingerprint: for artsspesifikk?

• Autohydrolysering?

• Automatiserings-algoritmer

• Nye assay krever ekspertise i MS

Resistensbestemmelse på MALDI-TOF MS?


Subtyping i

utbruddsoppklaring/epidemiologi

Jung et al. 2012 Poster


09.04.2018

18

Subtyping i

utbruddsoppklaring/epidemiologi

Jung et al. 2012 Poster


MALDI TOF biomarkører for typing


Sauget et al. 2017 Trends in Microbiology

09.04.2018

19

Oppsummering MALDI

• Utbredt analyseverktøy i kliniske laboratorier

• Et viktig verktøy i identifisering av en rekke bakterier og eukaryoter

• Kan identifisere resistensmarkører

• Subtyping?

• Automatisere prosessen

• Universalverktøy


Documents

Identifisering/Klassifisering · 09.04.2018 4 Massespektrometri Massespektronomi er en analyseteknikk der man kan, v.h.a. et massespektrometer, kan bestemme molekylmassen av frie