IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTIPICA DE Helicobacter pylori, MODELO ANIMAL DE CEPAS DE GASTRITIS CRÓNICA. ESTUDIOS EN

Enterococcus, Mycoplasma y Haemophilus DE INFECCIONES DIVERSAS.

INFORME TÉCNICO FINAL

Clave: 2006251

Director: Dra. Silvia Giono

NOTA:

De acuerdo a los objetivos se individualizaron los resultados.

Diversidad genética de cepas de Helicobacter pylori por rapd-PCR y patrones de susceptibilidad a antimicrobianos.

Introducción

Helicobacter pylori es el agente etiológico de la gastritis crónica activa, la enfermedad de úlcera péptica y es un factor de riesgo importante para el desarrollo de cáncer gástrico. En países en desarrollo, la infección alcanza el 80% de la población adulta y es adquirida en la infancia antes de los 10 años. El tratamiento utilizado incluye un inhibidor de la bomba de protones más dos agentes antimicrobianos: amoxicilina (Am), claritromicina (CH), metronidazol (Mtz) y tetraciclina (Tt). Sin embargo, la resistencia a antibióticos de H. pylori está disminuyendo la eficacia del tratamiento de erradicación. H. pylori muestra considerable diversidad genética, condición que puede ser atribuida a la deriva genética y a la transferencia horizontal de genes. Durante el largo tiempo de colonización por H. pylori, puede haber infección por poblaciones bacterianas genética y fenotípicamente heterogéneas. Pocos estudios que estimen la diversidad genética de la bacteria han sido realizados en niños. El objetivo de éste trabajo fue estimar la diversidad genética de cepas de H. pylori aisladas de niños mexicanos con alteraciones gastroduodenales empleando técnicas moleculares.

Métodos y Materiales

Se estudiaron 152 cepas de H. pylori aisladas de biopsia gástrica: 142 cepas recuperadas de 19 niños mexicanos y 9 cepas aisladas de un paciente adulto. En el estudio de diversidad genética se usó como referencia la cepas de H. pylori ATCC 43504 y para los ensayos de susceptibilidad a antimicrobianos se utilizó además la cepa de S. aureus ATCC 29213 para validar el estudio. La susceptibilidad a CH se hizo por el método de tira E, mientras que con los antibióticos Am, Tt y Mtz se utilizó el método de dilución seriada en placa de agar con replicador de “Steers”. Los valores de referencia para definir la resistencia a Am, CH, Mtz y Tt fueron ≥ 4, 1, 8 y 2 μg/mL respectivamente. En el estudio de diversidad genética se utilizó la técnica de RAPD-PCR con cuatro iniciadores con secuencias seleccionadas al azar (1254, 1283, 1281 y 1247), utilizados individualmente para generar la “huella

genética” correspondientes a cada cepa. Se construyó una matriz de datos binarios de ausencia y presencia que se analizó utilizando el programa NTSYS PC versión 2.0.

Resultados

La prevalencia de la infección en niños mexicanos fue de 13.3%. La edad de inicio de la colonización en la población estudiada fue alrededor de los 2 años. El dolor abdominal severo o recurrente fue la historia prediagnóstica más relacionada con la infección por H. pylori en niños. La gastritis nodular crónica (46.1%) fue el diagnóstico endoscópico más importante en niños con H. pylori. La tasa de resistencia a Am, CH, Mtz y Tt se observó en 27.4%, 21.8%, 58.4% y 31.5% respectivamente. El 44.3% de las cepas de H. pylori fueron resistentes a dos antimicrobianos. La combinación Am-Mtz presentó mayor resistencia en un 16.9% de las cepas. El antimicrobiano que produjo mayor resistencia fue Mtz (58.9%). El 21% de las cepas fueron sensibles a los cuatro antimicrobianos. No hubo cepas de H. pylori resistentes a los cuatro antimicrobianos. La técnica de RAPD-PCR pudo distinguir entre cepas de diferentes individuos y entre cepas del mismo paciente. Los 4 iniciadores produjeron 134 marcadores y 44 perfiles RAPD reproducibles entre las 153 cepas de H. pylori estudiadas. El análisis RAPD agrupó a las cepas por su cuadro clínico. La mayoría de los niños estuvieron colonizados por una sola cepa cada uno; los perfiles RAPD de las cepas de éstos niños, fueron diferentes con sutiles diferencias en sus patrones genéticos y de susceptibilidad. Los datos sugieren que, aunque la población consistió de bacterias íntimamente relacionadas, éstas no fueron completamente homogéneas; variantes genéticas de la misma cepa de H. pylori pueden existir entre los aislados. Dos poblaciones de H. pylori con diferentes perfiles RAPD colonizaron a 7 niños. Las cepas estuvieron más relacionadas entre ellas mismas en un paciente que con cepas de otros niños. Sin embargo, tres niños estuvieron colonizados por aislados más relacionados con cepas de otros individuos independientes que entre sí. Los resultados del estudio indicaron que existe colonización con múltiples cepas en niños mexicanos.

Impacto Pocos estudios son realizados utilizando cepas de Helicobacter pylori provenientes de niños, principalmente porque los comités de bioética no aceptan protocolos invasivos en éstas poblaciones si no están bien justificados. La importancia de encontrar colonización múltiple en poblaciones infantiles nos habla de la gran variabilidad de la bacteria y aporta información para estudios en poblaciones adultas donde la diversidad se encuentra más relacionada con la colonización con múltiples cepas virulentas que favorecen el desarrollo de adenocarcinoma gástrico. El trabajo aporta información para estudios de filogeografía en poblaciones migratorias y en estudios de recombinación e intercambio genético.

PCR múltiple para marcadores de virulencia de Helicobacter pylori aisladas de pacientes pediátricos.

Introducción H. pylori es un bacilo Gram negativo, curvo y microaerofílico tiene morfología espiral en forma de sacacorchos. Mide de 0.5 a 1.0 µm de ancho y 3 µm de largo, tiene membrana externa. Produce ureasa, considerablemente más potente que en otras bacterias. Otras dos enzimas útiles para su identificación cuando crece en medios de cultivo son la oxidasa y la

catalasa (Hernández y cols., 2003). H. pylori coloniza la mucosa gástrica del 50 % de la población mundial (Seok-Yong y cols., 2001) produce una infección crónica persistente (Gerhard y cols., 2002). La infección por H. pylori se adquiere en la infancia desde el primer año, (Rowland y cols., 2006). Las cepas se clasifican en dos grupos esta clasificación es útil al relacionar el genotipo de la cepa y la patogenicidad para establecer la relación con el curso clínico. Las cepas se han clasificado en:

• Cepas tipo I: Cepas de H. pylori que poseen el gen cagA y expresan una citotoxina funcional (vacA).

• Cepas tipo II: Cepas de H. pylori que perdieron el gen cagA y expresan una citotoxina (vacA) no funcional.

Actualmente, se ha demostrado que la presencia genotípica de los marcadores: babA2, vacAs1 y cagA dan lugar a cepas triples-positivas, que muestran una elevada significancia estadística relacionada con la prevalencia de úlcera y adenocarcinoma.

Marcadores de virulencia: Gen babA2: H. pylori que se adhiere a receptores al epitelio gástrico por medio de la adhesina BabA2 que es una adhesina de unión al antígeno de grupo sanguíneo Lewisb (�-1,3/4-difucosilado) que se expresa en glóbulos rojos y en células del epitelio gástrico. El gen babA codifica para la adhesina, tiene dos alelos: babA1 y babA2. El gen que codifica para la adhesina completa y funcional es babA2; mientras que, el gen babA1 carece del codón de inicio (Pride y cols., 2001). Gen cagA: Gen asociado a la citotoxina; se encuentra en el 50 al 60% de las cepas de H.pylori. El gen cagA, se emplea como marcador de la isla de patogenicidad (cagA-PAI) que codifica para un sistema de secreción tipo IV y el incremento en la secreción de IL-8. La infección de H.pylori con cepas cagA,+ aumenta el riesgo de úlcera duodenal y adenocarcinoma (Audibert y cols., 2001). Gen vacA: El gen vacA codifica para una citotoxina vacuolizante; sin embargo solo el 50% de las cepas expresan la citotoxina activa. Su diversidad involucra dos regiones: la región s con dos tipos alélicos: s1 y s2; a su vez, s1 posee los subtipos: s1a, s1b y s1c mientras que la región m tiene dos tipos alélicos: m1 y m2. Los alelos s1/m1 producen altos niveles de toxina; s1/m2 producen niveles bajos o moderados de toxina mientras que, las cepas s2/m2, no producen una toxina activa. La citotoxina, se ha aislado del 66.6% de pacientes con padecimientos como: úlcera péptica, frente al 30.1% presente solamente en el grupo con gastritis crónica (Zhou y cols., 2004).

Métodos y materiales

La población de estudio fueron 127 clonas aisladas de 18 biopsias de pacientes pediátricos pertenecientes a la colección del Laboratorio de Bacteriología Médica, proporcionadas por el Departamento de Endoscopia Pediátrica HGCM. “La Raza” del Instituto Mexicano de Seguro Social (IMSS) con la colaboración de la Dra. Rosalía Austria Míreles.

Cultivo e Identificación de H. pylori. Recuperación y cultivo de la cepa de referencia H. pylori ATCC 43504: La recuperación de la cepa de referencia H. pylori ATCC 43504 se realizó, empleando la base de Casman con 10 % de sangre de carnero desfibrinada estéril y el suplemento antimicrobiano de Skirrow (vancomicina, trimetoprim, polimixina B). Las placas se incubaron en atmósfera microaerofílica (10 % CO2, 85 % NO2 y 5 % de O2) utilizando tres pastillas de Alka-Seltzaer®; el tiempo de incubación fue de 2-5 días. Extracción de DNA. Método de tiocianato de guanidina:

La extracción del DNA se realizó por el método de tiocianato de guanidina. La integridad del DNA se visualizó en geles de agarosa al 1.0 % y se observó con luz ultravioleta. Los marcadores de talla molecular empleados fueron de 1 Kb, 123 pb y de 100 pb.

Selección de iniciadores: Los iniciadores empleados fueron reportados previamente. Los iniciadores para glmM fueron: glmMF; GGATAAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGG; glmMR; CTTACTTTCTAACACTAACGCGC; babA2; babA2F; AATCCAAAAAGGAGAAAAAGTATGAAA; babA2R: TGTTAGTGATTTCGGTGTAGGAC; vacA m1/m2: VAGF; CAATCTGTCCAATCAAGCGAG, VAGR; GCGTCAAATAATTCCAAGG; vacA s1/s2: VAIF; ATGGAAAATACAACAAACACAC, VAIR; CTGCTTGAATGCGCCAAAC; cagA; F1, GATAACAGGCAAGCTTTTTGAGG, B1; CTGCAAAAGAATGTTTGGCAG; cagE; F1; GCGATTGTTATTGTGCTTGTAG, R1; GAAGTGGTTAAAAATCAATGCCCC; ureA; F1; GCCAATGGTAAATTAGTT, R1; CTCCTTAATTGTTTTTAC Estandarización de la técnica PCR múltiple y PCR dúplex: El programa que se empleó consistió en: desnaturalización inicial de 94°C/10 min, 20 ciclos de 94°C/1 min, 57°C/1 min, 72°C 1 min; 15 ciclos de 94°C/1 min, 60°C/1 min, 72°C/1 min y una extensión final de 72°C/10 min. La mezcla de reacción se llevó a un volumen de 25 μl, 1 μl de DNA bacteriano (80 ng) y 24 μl de la mezcla de reacción con las siguientes concentraciones: regulador 1x con Tris-HCl pH 8.5, KCl 50 mM (Invitrogen®), 250 mM de cada nucleótido dATP, dCTP, dTTP, dGTP (Invitrogen®), 1.5 U de Taq DNA pol recombinante (Invitrogen®). La concentración final de los iniciadores fue de: 10 pM para babA2, 5 pM para vacAm1, vacAs1 y cagA. Para la PCR duplex, se empleó el mismo programa mencionado anteriormente, únicamente se vario la temperatura a 52 OC para el alineamiento y 35 ciclos. La mezcla de reacción se llevó a un volumen de 25 μl, 1 μl de DNA bacteriano (80 ng) y 24 μl de la mezcla de reacción con las siguientes concentraciones: regulador 1x con Tris-HCl pH 8.5, KCl 50 mM (Invitrogen®), 250 mM de cada nucleótido dATP, dCTP, dTTP, dGTP (Invitrogen®), 1.5 U de Taq DNA pol recombinante (Invitrogen®). La concentración final de los iniciadores fue de: 10 pM para babA2, 5 pM para vacAm1, vacAs1 y cagA y de 5 pM para ureA y 7.5 pM para glmM. Validación del ensayo de PCR múltiple:

Técnica de hibridación “Southern blot”: Las sondas se marcaron enzimáticamente, por PCR utilizando dNTP’sDIG* (Roche®). Las sondas marcadas se visualizaron al revelar la membrana empleando un kit de detección (“digoxigenina detection Kit” Roche®). Secuenciación: Los productos babA2, cagA, vacAm1, vacAs1, glmM se secuenciaron de manera automatizada en la Unidad de Síntesis y Secuenciación IBT, UNAM en Cuernavaca, Morelos. El alineamiento de las secuencias se llevó a cabo, en la base de datos NCBI (National Center of Biotechnology Information) con el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Aplicación de la técnica de PCR múltiple y PCR duplex en cepas clínicas:

La PCR múltiple se utilizó en la genotipificación de 127 clonas aisladas de 19 biopsias de pacientes pediátricos pertenecientes a la colección del Laboratorio de Bacteriología Médica, proporcionadas por el Departamento de Endoscopia Pediátrica HGCM. “La Raza” del IMSS con la colaboración de la Dr. Rosalía Austria Mireles, para la aplicación de la PCR simple y PCR duplex, estas se llevaron a cabo en 110 cepas de la misma colección.

Técnicas de hibridación “Dot blot”:

Los resultados obtenidos por PCR múltiple de las cepas clínicas, se compararon con los obtenidos por “Dot blot”. La cantidad de sonda que se utilizó para el ensayo se determinó empleando la siguiente relación: 3 μl de Sonda por 10 μl de Solución de hibridación. Sensibilidad y especificidad del ensayo múltiple La eficiencia del método se evaluó con la determinación de la sensibilidad y especificidad del ensayo múltiple empleando como estándar de oro la técnica de PCR simple de 127 cepas clínicas (Daniel, 2004). Resultados Diseño del iniciador GLM MR1: El diseño del iniciador reverso para la detección del gen glmM se realizó con base en las secuencias reportadas en el “GeneBank” con número de acceso AE001446. Se realizaron análisis en el programa DNAMAN para analizar las interacciones entre los iniciadores. Los iniciadores empleados para detectar el gen ureA al igual que para el gen glmM, no mostraron complementariedad. El iniciador se denominó GLM MR1 (5´- GCA TTC ACA AAC TTA TCC CCA ATC-3´) y amplifica un producto de 140 pb. Técnica de hibridación “Southern blot”: La capacidad de detección de las sondas fue: cagA (100 pg/μl), vacAm1 (100 pg/μl), vacAs1 (100 pg/μl) y babA2 (1 pg/μl). Los resultados demostraron que los amplicones correspondieron a los obtenidos por PCR. Secuenciación: El reporte escrito demostró que, el valor máximo de puntuación que fue de 1047, el valor E fue de 0 en la mayoría de las secuencias de los genes validados por lo que se puede considerar un alineamiento significativo. Los resultados mostraron que las secuencias

amplificadas corresponden perfectamente a los productos babA2, cagA, vacAm1/s1, glmM de H. pylori; por lo que, la técnica de PCR múltiple se aplicó para caracterizar las cepas clínicas. Aplicación en las cepas clínicas: Los genes: cagA, vacAm1, vacAs1, se detectaron con mayor frecuencia, los datos se analizaron con el programa estadístico epiInfo™ 2000. El resultado fue: vacAs1

+ (71.63 %),

vacAm1+

(68.5 %), cagA+ (66.14 %) semejante a lo observado en población adulta (Torres, 2000); el gen babA2

+ se encontró en menor proporción (37.79 %). Los marcadores de virulencia: vacAm2/s2 se encontraron en menor porcentaje; sin embargo, se relacionaron con casos de UP. Las cepas tipificadas por PCR se clasificaron para establecer el porcentaje y frecuencia de cada genotipo en la población estudiada según la clasificación de Atherton y Gerhard: cepas tipo I: babA2-, cagA+, vacAm1s1

+ (40.15%); cepas tipo II babA2-, cagA-, vacAm2s2

+(22%); triple positivas babA2+, cagA+, vacAm1s1

+ (28.34%). En este estudio también se obtuvieron los genotipos: babA2

+, cagA+, vacAs1+ (n= 4); babA2

+, cagA-, vacAm2s2

+ (n= 8), estas cepas no se clasificaron por la ausencia o presencia de un marcador en particular. Las cepas del paciente B046: B046C1, B046C5, B046C9, B046C11, B046C12, B046C13, B046C14, B046C15 fueron cepas triple positivas con el genotipo: babA2

+, cagA+, vacAm1s1

+ (fig. 1).

Figura 1. Electroferograma de la amplificación de la cepa BO46: babA2

+, cagA+, vacAm1s1+ por PCR simple y múltiple. A. babA2 (812

pb). B. vacAs1 (259 pb). C. cagA (340 pb). D. vacAm1 (570 pb). E. PCR múltiple. Carril: 1. Marcador de talla molecular 100 pb, 123 pb 2. H. pylori ATCC 43504, 3. BO46C1, 4. B046C5, 5. BO46C9, 6. B046C11, 7. BO46C12, 8. B046C13, 9. B046C14, 10. B046C15. La distribución del gen babA2 en las cepas genotipificadas se observa en la figura 2; babA2 se detectó en 48 cepas y se distribuyó principalmente en triple positivas (n= 36) también, se detectó en las cepas: babA2

+, cagA+, vacAs1+ (n= 4); cagA-, babA2

+ vacAm2s2+

(n= 8).

Figura 2. Distribución del gen babA2 en cepas de H. pylori. El círculo morado corresponde a las cepas que presentaron el gen babA2, los círculos simples representan los genotipos detectados. Sensibilidad y especificidad del ensayo múltiple Se genotificarón 127 cepas H. pylori por PCR simple y múltiple el objetivo fue determinar la sensibilidad y especificidad del ensayo múltiple. La sensibilidad fue del 100% para todos los casos excepto para babA2 que fue de 31.25%; la especificidad fue del 100%. La aplicación de la PCR individual y PCR duplex para detectar los genes ureA y glmM, en las 104 muestras de DNA y en el DNA extraído de las 6 cepas recuperadas del cepario mostraron una alta sensibilidad y especificidad, no así cuando se aplico la PCR duplex en las mismas. La tabla 2 muestra una grafica en donde se aprecia de forma detallada los resultados obtenidos al aplicar la técnica de PCR. TABLA 2. Aplicación de la técnica de PCR y PCR duplex para la detección del gen ureA y glmM. FOLIO CEPAS PRU* CULTIVO PCR glmM PCR ureA PCR

duplex 94 m,12,24,25,26,27 6 de 6 NC 6 de 6 6 de 6 5 de 8 36 1,2,3,4,5,6,m 7 de 7 NC 7 de 7 7 de 7 5 de 7 73 1,2,3,4,5,8,31,7 8 de 8 NC 8 de 8 8 de 8 4 de 8 B119 4,6,7,9,12,10,2 7 de 7 NC 7 de 7 5 de 7 3 de 7 62 1,2,11,19,12 5 de 5 NC 5 de 5 5 de 5 5 de 5 29 5,12,17,20,23,8,5,24 8 de 8 NC 8 de 8 8 de 8 3 de 8 144 1,6,8,23,24,27,20,22 9 de 9 144C27 9 de 9

9 de 9

3 de 9

63 1,2,4,5,6,7,22 7 de 7 63C6 7 de 7 7 de 7 3 de 7 78 2,6c,14,10,11,

15,7b,13 8 de 8 NC 8 de 8 6 de 8 4 de 8

39 8,11,5,4,3,2,7,1,19,m 10 de 10 39C2 10 de 10 10de 10 7de 10 110M m,167ptxa,3ptxa,17b,7ptx

a,8ptxa 6 de 6 NC 6 de 6 4 de 6 6 de 6

58 1,2,4,8,9,13 6 de 6 58C8 6 de 6 6 de 6 6 de 6 54 1,2,3,5,6,7,8,11,m 9 de 9 54C5,54C9 9 de 9 9 de 9 9 de 9 175 2,4,11,20,24,7ª 6 de 6 NC 6 de 6 6 de 6 2 de 6 Se observa una disminución de la especificidad cuando la técnica de PCR se aplica con los dos iniciadores. En las cepas recuperadas: 58C8, 63C6, 144C27, 54C5, 54M, 39C2 y en las cuales el DNA era de reciente extracción se observan resultados satisfactorios puesto que tanto como en la PCR simples como en las PCR duplex hubo amplificación del producto esperado a 140 pb para el gen glmM y 411 pb para el gen ureA. La aplicación de

la PCR duplex en estas cepas fue satisfactorio. La aplicación de la técnica en las 104 muestras de DNA que previamente se encontraban congeladas fue variable ya que mientras amplificaban todas en PCR individual al aplicar la PCR duplex, únicamente se visualizaba la banda del producto del gen glmM , esto se puede observar en la tabla 5, en la cepa 29 en donde se empleo muestra de DNA, para las PCR individuales amplifico en todas, tanto para el gen glmM y el gen ureA, al momento de aplicar la PCR duplex en algunos casos no se observo ningún producto o se observo únicamente el producto del gen glmM. Estos resultados pueden deberse debido a la calidad del DNA, debido al proceso de descongelación, quizá la calidad del mismo vario, y a pesar de que se llevo a cabo una cuantificación del DNA, no en todos los casos se contaba con un DNA de buena calidad. El iniciador reverso diseñado para detectar el gen glmM puede ser empleado para detectar H. pylori a partir de diversas muestras, ya que mostro alta especificidad al no amplificar con el control negativo empleado, P. mirabilis, aunque este microorganismo cuenta con una enzima similar. Impacto:

• Las cepas aisladas de la población infantil mexicana estudiada presentaron dos genotipos no clasificables: babA2

+, cagA+, vacAs1+; babA2

+, cagA-, vacAm2s2+.

• La población infantil estudiada se encontró colonizada con mayor frecuencia con cepas tipo I; sin embargo, también se detectaron cepas triples positivas.

• Las cepas tipo II amplificaron el gen cagE por lo que, probablemente podría emplearse como mejor marcador de la isla cag-PAI que cagA.

• El gen babA2 se encontró distribuido en cepas triple positivas y a diferencia de la bibliografía no se observó relación entre úlcera péptica y estas cepas; sin embargo, fueron aisladas de pacientes con padecimientos crónicos.

• El iniciador diseñado GLM MR1 muestra alta especificidad para detectar el gen glmM , por lo que se puede utilizar para identificar a H. pylori.

La técnica de PCR duplex puede ser empleada para la detección de H. pylori en muestras clínicas o en otro tipo de muestra.

β-lactamasas Tipo TEM1 en cepas de Haemophilus influenzae

Objetivo

- Comparar la eficacia del medio HTM contra el medio de GC durante las pruebas de susceptibilidad por CMI en placa.

- Identificar las especies y serotipos - Identificar el modelo de resistencia de Hi a antibióticos β-lactámicos con Difusión

de Disco y CMI - Identificar el gen blaTEM1 que codifica a la enzima β-lactamasa TEM1 y la presencia

del plásmido p1056

Materiales y Métodos Se elaboraron 4 lotes de placas de HTM y de GC para CMI de ampicilina de acuerdo a las recomendaciones del CLSI 2005. Un par de lotes (GC y HTM) fue probado al siguiente día de ser preparado, el otro par de lotes se uso 7 días después. Se utilizaron 23 cepas

previamente caracterizadas por difusión de disco y Cefinasa®; 14 cepas fueron resistentes y hubo 9 sensibles Cefinasa® negativas; 13 cepas fueron Cefinasa® positivas y 1 negativa,. Todas fueron inoculadas con cultivos de 18h. Se analizaron 115 cepas de distintas fuentes de aislamiento la tabla 1 muestra los orígenes y los serotipos. 75 cepas fueron aisladas en 2003-2004. 40 fueron aisladas en 1998. Se aglutinaron con antisueros: polivalente y contra serotipo b. La resistencia se hizo se hizo con difusión de disco y la CMI en dilución de placa. La producción de β-lactamasa con discos de nitrocefina Cefinasa®. Se realizó una PCR duplex para detectar al gen blaTEM1 y plásmido p1056. Los iniciadores usados fueron de Hasegawa et al 2003 y Leaves et al 2000. Los amplificados fueron visualizados por electroforesis de gel de agarosa por métodos convencionales. Resultados La tabla 1 muestra resultados de serotipificación.

Tabla 1. Serotipos y fuentes de aislamiento de Hi. SEROTIPOS % (n/115)

b Capsuladas no del tipo b NTHi MUESTRA

% n % n % N LCRa 13.91 16 5.22 6 1.74 2 Hemocultivo 6.09 7 1.74 2 0.00 0 E. Faringeo 0.87 1 2.61 3 8.70 10 Oído 0.87 1 0.87 1 2.61 3 Celulitis 0.87 1 0.00 0 0.00 0 Músculo 1.74 2 0.00 0 0.00 0 E. Nasofaringeo 0.00 0 1.74 2 0.00 0 Broncoaspirado 0.87 1 1.74 2 0.00 0 EPOCb 8.70 10 3.48 4 5.22 6 Portadores 0.00 0 12.17 14 18.26 21 Total 33.91 39 29.57 34 36.52 42 a LCR = Líquido Cefalorraquídeo b EPOC= Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica

Los medios HTM Y GC, con las 23 cepas se desarrollaron bien en las categorías a

las que corresponden. Las 14 cepas resistentes dieron en el rango de 8-128µg/ml y las 9 sensibles de 0.015-0.25µg/ml., las mismas cepas probadas con el medio de HTM, solo creció el 65.2% del total de las cepas y el rango obtenido fue de 0.015-0.064µg/ml. Mientras que, en GC las 23 cepas se desarrollaron bien, 14 cepas resistentes dieron en el rango de 4-32µg/ml manteniéndose en la categoría de resistentes. Se obtuvo un 28.7% (33/115) de cepas resistentes en la población analizada. La población aislada en 2003-2004 mostró un 20.1% de cepas resistentes (24/75), 21.2% (9/40).

Se obtuvieron 24 cepas con el gen blaTEM1 y 19 con el plásmidos, solo 48.9% (16/33) mostraron tanto el plásmido como el gen blaTEM1. La tabla 2 muestra los resultados de la susceptibilidad en difusión de disco.

Tabla 2. Susceptibilidad por el método de Difusión de Disco Antibiótico R I S

n % n % n % Ampicilina 33 28.70 4 3.48 78 67.83 Amoxicilina Acido clavúlanico 1 0.87 0 0.00 114 99.13

Cloranfenicol 11 9.57 5 4.35 99 86.09 Cefotaxima 3 2.61 0 0.00 112 97.39 Ceftriaxona 2 1.74 0 0.00 113 98.26 efuroxima 2 1.74 1 0.87 112 97.39

La CMI al 50% fue de 0.125µg/ml y CMI al 90% de 32.0µg/ml. La susceptibilidad

no se vio desplazada hacia la derecha, lo cual indica que las cepas no han disminuido su susceptibilidad.

Hubo 2 cepas que mostraron un patrón de resistencia cefuroxime, cefotaxime y ceftriaxona; además de ampicilina, una de ellas no mostró blaTEM1 pero fue Cefinasa® positivo. Una cepa aislada de nasofaríngeo fue resistente a amoxicilina/ácido clavulánico y ampicilina pero fue Cefinasa® negativa. Se observó además que hubo una prevalencia del gen blaTEM1 en cepas capsuladas (18.2% Hib y 18.2% de capsuladas no b). En cepas NTHi hubo 6 cepas blaTEM1 negativas pero Cefinasa® positivas. 5 cepas que amplificaron el p1056 dieron amplificados de peso molecular (~500bp) más alto que el reportado (370bp).

La tabla 3 resume los resultados obtenidos para las 33 cepas resistentes obtenidas en este estudio.

Tabla 3. Correlación entre Cefinasa®, PCR (blaTEM1 y p1056). (n/33)

Prueba Serotipo

Cefinasa® blaTEM1 p1056 blaTEM1 /p1056 B 33.33 (11) 27.27 (9) 18.18 (6) 18.18 (6) NTHi 39.39 (13) 21.21 (7) 21.21 (7) 12.12 (4) Cap no b 24.24 (8) 24.24 (8) 18.18 (6) 18.18 (6) Total 96.96 (32) 72.72 (24) 57.57 (19) 48.48 (16)

Impacto

El medio de HTM es un medio que utiliza ingredientes puros como el β-NAD, este componente es muy inestable en soluciones acuosas, tal inestabilidad aumenta cuando se adiciona a medios con una temperatura mayor a 40º C. Si es almacenado en refrigeración es estable solo durante 2 semanas en soluciones no en medios. El medio de GC es una mezcla compleja de distintos componentes, sin embargo es mucho más estable que el NAD utilizado del medio HTM de modo que permite que los microorganismos se desarrollen bien aunque disminuya un poco la eficacia para promover el crecimiento, pero tal disminución no fue representativa, porque las cepas resistentes continuaron creciendo en la misma categoría.

La presencia del gen blaTEM1 se asocia con la producción de β-lactamasas TEM1,

fue la prevalencia mayor en los aislados de Hi, se observo que fue mayor en las capsuladas

que en las NTHi. Solo hubo una cepa Cefinasa® negativa relacionada con un fenotipo low BLNAR porque demostró resistencia amoxicilina/ácido clavulánico resistente, pero no dio resistencia a las cefalosporinas.. El modelo de resistencia que prevaleció en este grupo fue el de resistencia por β-lactamasas de tipo TEM1 sobre las cepas Cefinasa® positivas blaTEM1 negativas.

Las cepas NTHi verdaderas, es decir carecen de cápsula fueron genéticamente más

variables, este fenómeno se observó en 6 cepas blaTEM1 negativas, 3 presentaron también el plásmido p1056. El plásmido presente en cepas del serotipo b; estuvo en 4 de enfermedad sistémica (2 de hemocultivo y 2 LCR). Los iniciadores que se utilizaron para la detección del p1056 abarcan desde un fago similar a CTX de V. cholerae hasta una región de repetidos invertidos, es posible que los amplificados de mayor peso molecular sean resultado de una duplicación de los repetidos invertidos o que el fago similar a CTX, tenga información complementaria que haga que el amplificado sea de un peso molecular más alto.

Conclusiones

- El medio de HTM es un medio útil si se utiliza hasta 24 después haberse preparado, de otra forma, el medio da resultados falsos que pueden aparecer como sensibles

- El medio de GC demostró mantener el desarrollo de las 23 cepas probadas y dentro

de sus respectivas categorías (14 cepas resistentes y 9 sensibles)

- Es necesario realizar pruebas de control de calidad en los laboratorios en los que se utilice este medio.

• La resistencia por β-lactamasas ha reducido hasta 21.3% en las cepas estudiadas de

2003-2004 comparado con el 48.5% de Giono et al. 2001. • El modelo de resistencia que prevalece es de cepas BLPAR de tipo TEM1. Es

posible que las cepas con el fenotipo de resistente a CTX, CXM, CRO y AMP presenten una β-lactamasa distinta a TEM1 las descritas anteriormente.

• La susceptibilidad a los β-lactámicos fue reducida, la moda de cepas susceptibles es de 0.031µg/ml y la CMI50% de 0.125 µg/ml.

• La presencia del plásmido es posible que se relacione con la presencia de capsula, ya que en estas cepas no hay presencia del plásmido si este no esta acompañado del gen blaTEM1.

• Las secuencias que amplificaron con un peso molecular de 500bp mayor al reportado es posible que contengan ya sea información complementaria del fago similar a CTX o que solo tengan duplicados de las secuencias repetidas directas.

ADHERENCIA DE Haemophilus influenzae NO TIPIFICABLE (NTHi) DE ORIGEN CLÍNICO Y SU RELACIÓN CON EL GEN hap Introducción

Haemophilus influenzae es una bacteria Gram negativa identificada como patógeno importante en población infantil y de adultos. La patología como agente etiológico, la clasifica como: enfermedades severas, agudas, piógenas, generalmente invasivas y enfermedades crónicas. Haemophilus influenzae posee mecanismos de adherencia,para penetrar y colonizar células del epitelio respiratorio humano. La superficie bacteriana se une a diferentes receptores de las células huésped durante la infección, resultando en una colonización por: ADHESINAS; entre ellas están: pili, IgA proteasa, proteína Hap, proteínas HMWI y HMW2 (proteínas de alto peso molecular), proteínas OPM´S (proteínas de membrana externa), proteína Hia, lipooligosacárido (LOS) y lipopolisacárido (LPS)

La proteína Hap (Homologous IgA protease Protein) es una proteína autotransportadora perteneciente al sistema de secreción tipo V. Es una serin-proteasa identificada por su habilidad para promover una interacción íntima en cultivos de células epiteliales humanas. Se traslada como una proteína precursora de 155 kDa, con tres dominios: una típica secuencia iniciadora N-terminal, una fracción de 110 kDa serin- proteasa (nombrada HapS) y una proteína de membrana externa C-terminal de 45 kDa (denominada Hapβ). El gen hap es ubicuo para cepas de H. influenzae, y Hap es producida por todos los aislamientos no tipificables. OBJETIVO Determinar el patrón de adherencia de cepas NTHi en cepas de origen clínico mexicanas; y relacionarlo con la presencia del gen hap. Métodos y materiales.

a) Cepas de referencia H. influenzae ATCC 49766, Hi ATCC 49247, Hi ATCC 39930, E.coli K12 y E. coli agregativa (proporcionadas en el lab. de Bacteriología Médica)

b) 20 Cepas de Haemophilus influenzae no tipificables (NTHI) de origen clínico mexicanas (proporcionadas por el Hospital Infantil de México y la Benemérita Universidad de Puebla). De las cuales 9 son del serotipo b, 4 son capsulares no b y 7 son no tipificables (NTHi)

c) Línea celular HEp- 2 (carcinoma epidermoide de laringe humana). In Vitro, S.A. ENSAYOS DE ADHERENCIA. A partir de una capa semiconfluente de células HEp-2 sembradas dentro de placas de 24 pozos se estandarizó la técnica de adherencia con cepas ATCC (H. influenzae 33930, 49247 y 49766), se ocupó como testigo positivo la cepa E. coli agregativa y como negativo la cepa E. coli K12. La bacteria se inoculó en un caldo y se incubó hasta obtener una densidad aproximadamente de 2x109 UFC/ml. Se inoculó 1x107 UFC en la monocapa de células epiteliales. Después de una incubación de 90 minutos a 37°C en 5% de CO2, las monocapas se lavaron 5 veces con PBS (pH 7) para remover las bacterias que no se adhirieron, se fijaron con metanol absoluto, se tiñeron con GIEMSA, se observaron al microscopio para contar las células con adherencia bacteriana por campo y se hizo el cálculo de porcentaje de adherencia (St. Geme, J.W. III y cols., 1993). TÉCNICA DE AMPLIFICACIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Se utilizó la técnica de extracción de DNA de Tiocianato de Guanidina. Se estandarizó la técnica utilizando los iniciadores propuestos por Kilian y cols. (2002). Se determinó la presencia del gen hap en cepas de Haemophilus influenzae no tipificables (NTHi) de origen clínico.

Resultados Cepa Serotipo Adherenci

a DESPRENDIMIENTO DE LA MONOCAPA

VACUOLI- ZACION

PCR para el gen hap

Hi ATCC 33930

b ++ + ++ +

Hi ATCC 49247

b + + - -

Hi ATCC 49766

b - + + -

La presencia del gen hap se determinó en el 55% (11 de 20) de las cepas clínicas; 72.7% (8 de 11) fueron del serotipo b, 18.2% (2 de 11) fueron capsulares no b y 9.1% (1 de 11) fueron no tipificables (NTHi). Estudios previos han determinado que el gen hap esta presente en todas las cepas de H. influenzae; sin embargo, nuestros resultados determinaron ausencia del gen hap en sólo 1 de 9 cepas del serotipo b, en 2 de 4 cepas capsulares no b y en 6 de 7 cepas NTHi. Impacto

La relación adherencia- Hap se ve reflejada con la cepa de referencia Hi ATCC 33930; que presentó mayor adherencia y fue positiva para hap.

La relación vacuolización- Hap se observó también con la cepa Hi ATCC 33930; que presentó mayor vacuolización y fue positiva para hap.

El daño celular puede estar relacionado con la autoproteólisis de Haps; lo que pudo afectar a la integridad de las células. Se ha planteado que la liberación de Hap facilita la degradación de células blanco del huésped, así como de componentes del tejido o induce expresión efectores del sistema inmune (Henderson y cols., 2004).

En la PCR para la identificación de hap en cepas clínicas, se determinó que en las cepas del serotipo b SOLO 1/9 resultó hap –

La presencia del gen hap en 8 cepas del tipo b pudo considerarse como serotipos virulentos.

Las cepas capsulares no b 2/4 (50%) y no tipificables 6/7 (85%) fueron negativas para el gen hap.

CONCLUSIONES

La presencia de hap es un factor importante en la adherencia de Haemophilus influenzae en células HEp-2.

La citotoxicidad (vacuolización) en células HEp-2 pudiera estar relacionada con la

presencia de hap debido a la autoproteólisis de Haps

El 55% de las cepas clínicas fueron hap positivas, predominando cepas del tipo b, lo que pudiera sugerir una relación entre el gen hap y cepas virulentas.

Se encontraron cepas con la presencia del gen hap, que se adhirieron exitosamente y que también presentaron un porcentaje de vacuolización elevado; lo que se pudiera sugerir una relación con cepas virulentas. Lo que demuestra la relevancia de este factor de virulencia con respecto al daño que provoca en la célula huésped.

RESISTENCIA ELEVADA A AMINOGLUCOSIDOS Y VANCOMICINA EN CEPAS DE Enterococcus spp.

Introducción

Determinar la actividad in Vitro de Glucopéptidos en Enterococos aislados de procesos infecciosos invasivos en pacientes pediátricos del Hospital infantil de México Federico Gómez del periodo 2002-2005. Resultados

Se analizaron 584 cepas, con la finalidad de identificar la resistencia a glucopéptidos (vancomicina y teicoplanina). De esta muestra se obtuvieron 6 diferentes especies de Enterococcus, las cuales varían en su porcentaje, predominando Enterococcus faecalis (85%) con el mayor número de aislamientos, seguido de Enterococcus faecium (8%). Entre las otras especies de enterococos aisladas están: Enterococcus sulfureus (5%), E. raffinosus (2%), E. cecorum (4%) y E. avium (1%). Las cepas que se utilizaron para poder llevar a cabo este experimento fue de 584 cepas de las cuales se le realizaron las pruebas para la identificación de especies y biotipos, y se encontró que Enterococcus faecalis se encuentra en un 77.6% (452), E. faecium en un 10.48% (61), E. cecorum 3.60% (21), E. sulfureus 3.43% (20), E. rafinosus 2.92% (17), E. avium 1.89% (11), E. caseliflavus 0.17% (1). Impacto Los Enterococos del biogrupo II son los de mayor importancia clínica (Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium), siendo estos los principales agentes causales de infecciones nosocomiales, en las diferentes áreas del hospital. La prevalencia de la resistencia en glucopéptidos en éste género, radica principalmente en el biogrupo II (E. faecalis). El origen de la mayoría de los aislamientos se presentan en el siguiente orden: punta de catéter, hemocultivo y urocultivo. NOTA:

El modelo animal está en desarrollo y respecto a Mycoplasma se estará completando dentro

del proyecto 2007 a cual se le han agregado nuevos objetivos.

Ficha de Productividad 2006 Dra Silvia Giono Cerezo III Formación de Recursos Humanos III.4 Tesis sustentadas de nivel maestría

- Nardhy Yadira Gómez López “Identificación del Efecto quimiotáctico ejercido por las membranas coriamnióticas sobre los leucoitos en el trabajo de parto normal” 06-06-06

- Sara Ariadna Ochoa Pérez “ Diversidad genética de cepas de Helicobacter pylori por RAPD-PCR y patrones de susceptibilidad a antimicrobianos” 21-02-06

III.5 Tesis sustentadas de nivel doctoral (a)

- Araceli Torres Morquecho “ Polimorfismo y filogenia de genes asociados a virulencia en cepas mexicanas de Helicobacter pylori” 27-06-06

- Mónica Rosales Pérez “Adherencia de Micoplasma fermentans como atributo de virulencia “ 09-05-06

- José Arellano Galindo “Efecto de la ampicilina sobre la expresión de sustancias de agregación de Enterococcus faecalis” 10-03-06

- Guadalupe del Carmen Estrada Gutiérrez, “Caracterización del microambiente que induce degradación del tejido conectivo del coriamnios humano durante el trabajo de parto” 15-03-06

IV Productos de Investigación IV.2 Artículos en revistas incluidas en ISI (c)

- Arellano-Galindo, J.; Giono-Cerezo, S.; Díaz-Silva, F.; Rodríguez-Angeles, G.; López Saucedo, C. (2006) Virbio cholerae en cultivo de células Vero. 47(2):147-156

- Rivera-Tapia, J.; Cedillo-Ramírez L.; Gúzman-Cortes, M.; Giono-Cerezo, S. (2006). Diagnóstico de Enterobacterias en el Rio Alseseca. Rev Fac Med UNAM 49(1):20-22

- Rivera-Tapia A.; Cedillo-Ramírez, L.; Giono-Cerezo, S. (2006). Comparación genómica en micoplasmas de interés médico. Anales Medicos ABC 51(2):74-79

- Díaz-García, J.; Herrera-Mendoza, A. P.; Giono-Cerezo, S.; Guerra-Infante, F. M. (2006) Mycoplasma hominis attaches to and locates intracellularly in human spermatozoa. Hum. Reprod. 21(6):1591-1598

- Artega-Garibay, R. I.; Aguilera Arreola, M. G.; Navarro-Ocaña, A.; Giono-Cerezo, S.; Sánhez-Manzano, M.; Molina-López, J.; Eslava-Campos, C.; Cravioto, A.; Castro Escarpulli, G. (2006) Serogroups K1antigen and antimicrobial resistance patterns of Aeromonas spp. strains isolated from different sources in Mexico Mem. Inst Oswaldo Cruz 101:1-5

IV.8 Trabajos en extenso en congresos internacionales

- Gómez-de-León, P.; Díaz-García, J. F.; Villaseñor A.; Arredondo J. L.; Segura, J.; Giono S.; Santos J. I.; (2006). 30.040 Avidity Determination for Haemophilus influenzae b Anti-Capsular IgG Mexican children vaccinated with PRP-T. 12th ICID Lisbon Portugal.

- Gómez-de-León, P.; Díaz-García, J. F.; Arredondo J. L.; Segura, S.; Giono S.; Santos J. I.; (2006). Anticapsular Polysaccharide IgG Responses in Mexico children alter H. influenzae PRP-T Immunization. 12th ICID Lisbon Portugal.

- Estrada, G.; Vega, F.; Vadillo-Ortega, F.; Giono, S.(2006). Placental Blood Infected with Distinct Bacteria Induces Differential Secretion of Mediators fetal Membranes Suggesting Variuos Pathways Leading to Labor. 12th ICID Lisbon Portugal.

- Felipe-López, A.; Giono-Cerezo, S.; Gómez-de-León, P.; Rocha-Gracia R. C.; Díaz-García, J. F. (2006). Beta-lactamases TEM1 by PCR in Haemophilus influenzae Strains from Mexican Patients. 12th ICID Lisbon Portugal

IV.9 Trabajos en extenso en congresos nacionales (max. 2 años)

- Felipe-López, A.; Giono-Cerezo, S.; Gómez-de-León, P.; Rocha-Gracia R. C.; Díaz-García, F. beta-lactamasas tipo TEM1 en cepas de Haemophilus influenzae por PCR. 35° Congreso de Microbiología 3-6 de Abril de 2006. Oaxtepec, Morelos

- Cordova-Espinoza, M G.; Giono-Cerezo, S.; Ochoa-Pérez, S. A.; Majalca-Martínez-. (2006) Detección del gen ureA y el gen constitutivo glmM, (UREC) por PCR de cepas de Helicobacter pylori aisladas de biopsias de pacientes pediátricos. 35° Congreso de Microbiología 3-6 de Abril de 2006. Oaxtepec, Morelos

- Pais-Morales, J.; Camorlinga-Ponce, M.; González-Valencia, G.; Torres-López, J.; Giono-Cerezo, S.(2006) Sensibilidad a antibióticos en cepas de Helicobacter pylori aisladas de población mestiza e indígena mexicana. 35° Congreso de Microbiología 3-6 de Abril de 2006. Oaxtepec, Morelos

- Artega-Garibay, R. I.; Aguilera Arreola, M. G.; Giono-Cerezo, S.; Navarro-Ocaña, A.; Castro Escarpulli, G. (2006) El flagelo lateral en la adherencia y formación de biofilm de Aeromonas ssp. 35° Congreso de Microbiología 3-6 de Abril de 2006. Oaxtepec, Morelos

- González-Vázquez, R.; Giono-Cerezo, S.; Ochoa-Pérez, S. A.; Majalca-Martínez, C. (2006). PCR multiple para la detcción de marcadores de virulencia en cepas de Helicobacter pylori, aisladas de pacientes pediatricos IMSS, La Raza. 35° Congreso de Microbiología 3-6 de Abril de 2006. Oaxtepec, Morelos

- Felipe-López, A.; Giono-Cerezo, S.; Gómez-de-León, P.; Rocha-Gracia R. C.; Díaz-García, J. F. (2006) Resistencia a antibióticos beta-lactámicos en cepas de Haemophilus influenzae XXXI Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Infectología y Microbiología Clínica y XI Congreso de la Asociación Mexicana para el Estudio de las Infecciones Nosocomiales. Monterrey, Nuevo León. 14 de Julio.

- Cordova-Espinoza, M G.; González-Vázquez, R.; Morales-Méndez, Y.; Ochoa-Pérez, S. A.; Giono-Cerezo, S. (2006) Estandarización de la técnica de PCR dúplex para la detección del gen ureA y el gen constitutivo glmM, (UREC) por PCR de cepas de Helicobacter pylori aisladas de biopsias de pacientes pediátricos. XXXI Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Infectología y Microbiología Clínica

y XI Congreso de la Asociación Mexicana para el Estudio de las Infecciones Nosocomiales. Monterrey, Nuevo León. 14 de Julio.

- Morales-Méndez, I.; Estrada-Gutiérrez, G. C.; Aparicio-Ozores, G.; Cordova-Espinoza, M. G.; González-Vázquez, R.; Giono-Cerezo, S. (2006) Metaloproteasas MMP-2 y MMP-9 en cualtivo celular Hep-2 infectado con Helicobacter pylori. XXXI Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Infectología y Microbiología Clínica y XI Congreso de la Asociación Mexicana para el Estudio de las Infecciones Nosocomiales. Monterrey, Nuevo León. 14 de Julio.

- González-Vázquez, R.; Ochoa-Pérez, S. A.; Cordova-Espinoza, M. G.; Morales-Méndez, I.; Majalca-Martínez, C.; Giono-Cerezo, S. (2006) Helicobacter pylori cepas triple virulentas aisladas de pacientes pediátricos por PCR multiple. XXXI Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Infectología y Microbiología Clínica y XI Congreso de la Asociación Mexicana para el Estudio de las Infecciones Nosocomiales. Monterrey, Nuevo León. 14 de Julio.

- Majalca-Martínez, C.; Aguilar-Soto, O.; Avila-Vargas, G.; Giono-Cerezo, S. (2006) busqueda del gen napA en cepas de Helicobacter pylori aisladas de mexicanos adultos con enfermedad ácido péptica. XXXI Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Infectología y Microbiología Clínica y XI Congreso de la Asociación Mexicana para el Estudio de las Infecciones Nosocomiales. Monterrey, Nuevo León. 14 de Julio.

- Gómez-de-León, P.; Díaz-García, J. F.; Villaseñor A.; Arredondo J. L.; Segura, J.; Giono S.; Santos J. I. (2006) Determinación de la avidez de anticuerpos IgG anti-polisacárido capsular de Haemophilus influenzae b en niños mexicanos vacunados con PRP-T. XXXI Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Infectología y Microbiología Clínica y XI Congreso de la Asociación Mexicana para el Estudio de las Infecciones Nosocomiales. Monterrey, Nuevo León. 14 de Julio.

- Gómez-de-León, P.; Díaz-García, J. F.; Villaseñor A.; Arredondo J. L.; Segura, J.; Moreno J. R.; Alfaro, A.; Giono S.; Santos J. I.; (2006) Respuestas de anticuepos IgG antipolisácarido capsular de Haemophilus influenzae b en nisños Mexicanos con vacuna PRP-T. XXXI Congreso Anual de la Asociación Mexicana de Infectología y Microbiología Clínica y XI Congreso de la Asociación Mexicana para el Estudio de las Infecciones Nosocomiales. Monterrey, Nuevo León. 14 de Julio.

IV.10 Libros publicados en Editoriales de Prestigio derivados de proyectos de investigación con dictamen de aprobación de un comité editorial Guía de Bacteriología Médica Autoras Dra. Maria Luisa Taylor de Cunha e Mello Dra. Silvia Giono Cerezo Dra. Irene de Haro Arteaga Dra. Yoalnda López Vidal Edit. McGraw Hill ISSN 970-10-5691-4

IV.12 Reportes técnicos finales de proyectos de investigación (No. De SIP), o de proyectos vinculados, con carta de satisfacción del contratante (m).

- Informe Técnico Final de Proyectos de Investigación “Análisis Moleculares de Helicobacter pylori por PCR multiple, GE-Metaloproteasas, Resitotipos en Patogénesis Bacteriana” 20050123 07-03-06