Universidad Autónoma de Sinaloa Dirección General de Servicio Social
[Identificación de dípteros de interés en la trasmisión de la Leishmaniasis en el Estado de Sinaloa]
[Dr. Edith Hilario Torres Montoya]
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NOMBRE DEL PROYECTO:
Identificación de dípteros de interés en la trasmisión de la Leishmaniasis en el Estado de Sinaloa
CICLO: 2021-2022-1
MODALIDAD UNIDISCIPLINARIA
ASESOR DE PROYECTO: Dr. Edith Hilario Torres Montoy
Fecha de autorización 22/09/2021
Universidad Autónoma de Sinaloa Dirección General de Servicio Social
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I. Título del proyecto de servicio social Identificación de dípteros de interés en la trasmisión de la Leishmaniasis en el Estado de Sinaloa.
II. Antecedentes
Leishmaniasis
La leishmaniasis es una enfermedad zoonótica la cual se puede presentar en
animales como canidos, marsupiales, roedores, edentados e incluso al ser humano,
siendo las más comunes la leishmaniasis canina y la leishmaniasis humana
(Dirección General de Programas Preventivos., 2015). Esta patología se caracteriza
por la presencia de ulceras, en piel, mucosas y vísceras, transmitida por vectores
infectados con el parasito de Leishmania (The Center for Food Security & Public
Health., 2017).
Agente Etiológico
El parásito Leishmania es considerado un protozoario que pertenece al reino
Protista, subreino Protozoa, orden kinetoplastida y a la familia Trypanosomatidae,
en la que se encuentran 30 especies, de las cuales, 20 son considerados
organismos patógenos (The Center for Food Security & Public Health., 2017,
Sánchez-Saldaña et al., 2004). El género Leishmania se divide en dos subgéneros
según el sitio donde el parásito se desarrolle dentro del tubo digestivo del vector,
estos son, Leishmania, el cual se desarrolla en la parte anterior del píloro, en la
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unión del intestino medio y posterior; Viannia se encuentra en el intestino medio
como posterior. En México se encuentran 3 especies de Leishmania, L. infantum, L.
mexicana y L. braziliensis. Esta enfermedad es considerada de declaración
obligatoria, por la Organización Mundial de la Salud (OMS), ya que, en su forma
visceral, puede llegar a ser mortal, por lo que cualquier caso debe ser reportado
(The Center for Food Security & Public Health., 2017, Dirección General de
Programas Preventivos., 2015).
Vectores
La Leishmaniasis se transmite a través de la picadura de pequeñas moscas,
llamadas flebótomos, las cuales son abundantes en las zonas tropicales, zonas
templadas y durante el verano. Hoy en día existen cinco géneros de flebótomos:
Phlebotomus, Sergentomya, Lutzomyia, Warileya y Brumptomya. Sin embargo, de
esas cinco especies, solo dos son reconocidas como vectores de Leishmania, el
género Phlebotomus en Europa, Asia y África (viejo mundo) y el género Lutzomyia
en América (nuevo mundo) (Sánchez-Saldaña et al., 2004). En México existen once
especies responsables de la transmisión del parásito, su importancia varía según la
especie de Leishmania que se le atribuye, la zona geográfica donde se encuentra y
la forma clínica que se asocia a su presencia; estos insectos suelen encontrarse
comúnmente en zonas selváticas, bosques tropicales, pero también hay especies
que pueden localizarse en zonas áridas y semi-desérticas (Dirección General de
Programas Preventivos., 2015).
Los flebótomos pertenecen al phylum Artropoda, clase Insecta, orden Díptera,
suborden Nematocera, familia Psychodidae, subfamilia Phlebotominae la cual se
divide en dos géneros, Phlebotomus en el viejo mundo y Lutzomyia en el nuevo
mundo. Se han reportado alrededor de 900 especies para los cinco géneros de
flebótomos, de las cuales 379 han sido reportadas para el género Lutzomyia y 30
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especies han sido catalogadas como vectores de Leishmania (Orellana., 2009,
Kwakye-Nuako., 2016). Los insectos del género Lutzomyia han sido descritos como
vectores para el parasito de Leishmania en América (Cuba Cuba., 2012). En México
se encuentran once especies responsables de la trasmisión del parasito, las cuales
se encuentran repartidas en diferentes zonas geográficas del país, por lo que su
importancia en salud publica depende de la especie que se encuentre en las
distintas regiones del mismo, debido a que existen algunas especies que son
vectores comprobados de Leishmania, como, Lutzomyia olmeca olmeca, Lutzomyia
diabólica, Lutzomyia cruciata, Lutzomyia shannoni, Lutzomyia longipalpis y
Lutzomyia evansi (Dirección General de Programas Preventivos., 2015).
Culicoides spp
Los miembros del orden Díptera, son insectos que se caracterizan por poseer solo
un par de alas membranosas funcionales para el vuelo, además de estar distribuidos
de manera mundial, por lo que se encuentran en cualquier zona terrestre
alcanzable. Estos insectos también reciben el nombre de “moscas”, “mosquitos”,
“jejenes” y “chaquistes”, dependiendo de la región en la que se encuentran. Dentro
del desarrollo de estos invertebrados se diferencian 4 estadios: huevo, larva, pupa
y adulto (Ibáñez-Bernal y Hernández-Ortiz., 2006). Dentro de la morfología de los
dípteros, se puede observar el cuerpo dividido en tres partes: cabeza, tórax y
abdomen (Carles y Hjorth., 2015). Este orden posee una variedad de familias de
entre las cuales se puede destacar la Cerotopogonidae, la cual comprende
alrededor de 6,089 especies distribuidas por todo el mundo. Los miembros de esta
familia se caracterizan por ser insectos que usualmente son depredadores de
insectos de menor tamaño o que se alimentan de néctar, sin embargo, existen
algunas especies que son consideradas hematófagas, siendo las hembras
portadoras de esta cualidad, estas se alimentan de sangre de algunos vertebrados,
incluyendo al hombre. Las especies consideradas hematófagas son de importancia
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médica y veterinaria, debido a que estos insectos son vectores y reservorios de
algunos agentes patógenos, por lo que esto contribuye a la transmisión de
enfermedades que afectan controversialmente al hombre y animales, entre los
cuales se encuentra el género Culicoides, entre otros. (Ibañez-Bernal y Hernández-
Ortiz., 2006, Gonzáles et al., 2012). Los insectos pertenecientes al género
Culicoides, se caracterizan por ser pequeños en tamaño, midiendo de 1 a 3 mm de
largo, siendo las hembras hematófagas, debido a que necesitan de la proteína
animal encontrada en la sangre para la maduración adecuada de sus huevos,
además de ser considerados de importancia médica y veterinaria, ya que, varias
especies son consideradas vectores de ciertos patógenos, como virus o parásitos
(Carles y Hjorth., 2015). Este género es el más diversificado de la familia
Ceratopogonidae, teniendo más de 1,400 especies registradas alrededor del
mundo, de las cuales el mayor porcentaje (96%), atacan comúnmente a los
vertebrados (Lopes y De Sousa., 2010). En México se han reportado alrededor de
49 especies de Culicoides de las cuales 3 han sido reconocidas para Sinaloa, las
cuales son C.blantoni, C. furens y C. phlebotomus (Huerta et al., 2012, Spinelli et
al., 2009).
III. Justificación La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria desatendida por parte del sector salud en México y el mundo. Siendo Sinaloa un estado endémico para la leishmaniasis cutánea en personas, aunado a la reciente identificación del primer caso de Leishmaniasis canina en el sur del Estado, la ubicación de los dípteros hematófagos con potencial carácter vectorial es sumamente pertinente para realizar las recomendaciones epidemiológicas que tengan lugar, en los municipios del centro de la entidad.
IV. Objetivos
Determinar la prevalencia de Leishmania spp en dípteros del género
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- Específicos
1. Caracterizar las especies del género Culicoides presentes en el área de
estudio.
2. Detectar a través de pruebas moleculares a Leishmania spp en Culicoides
spp.
3. Recomendar medidas preventivas a la población rural en las comunidades de estudio
V. Metas
Para este proyecto se proponen las siguientes metas:
Contar con el registro de organismos dípteros de interés en la trasmisión de
la Leishmaniasis en el estado de Sinaloa para
Estandarizar las pruebas de biología molecular necesarias tanto para la
detección de vectores como el reconocimiento de parásitos en la entidad.
Registrar los cambios espacio temporales en relación con la abundancia de
dípteros nematóceros de interés en la trasmisión de Leishmania sp
VI. Localización geográfica del proyecto
El siguiente proyecto se desarrollará en el Laboratorio de Conservación de Fauna
Silvestre y el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Biología, ubicado
en la Ciudad Universitaria de la Universidad Autónoma de Sinaloa en Culiacán,
Sinaloa, (Fase de Laboratorio) y en 4 localidades: Imala y área suburbana de
Culiacán y Rosamorada y área suburbana de Navolato (Fase de Campo).
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VII. Actividades a realizar Para este proyecto se proponen un total de 10 actividades a realizar durante el
transcurso del año, dichas actividades se enlistan a continuación:
1. Búsqueda bibliográfica
7. Secuenciación de ADN
8. Comparación del comportamiento de los insectos y el parasito durante el año
9. Comparación entre las localidades estudiadas
10. Interpretación de resultado
- Humano:
- Material y Económico:
Frascos para almacenar insectos (16 piezas $250 pesos)
Tubos Falcon (100 piezas $1200 pesos)
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Tubos 2 ml (Bolsa con 500 tubos $277 pesos)
Sacos de malla para captura de Insectos (16 piezas $70 pesos)
IX. Financiamiento
Este proyecto está financiado por la Unidad Receptora, el Laboratorio de
Conservación de la Fauna Silvestre, cuyo responsable es el Dr. Edith Hilario Torres
Montoya.
Distribución espacio temporal de Culicoides spp
Se realizará una comparación entre las localidades a lo largo de toda la colecta de
insectos para establecer como se comportaron durante los meses de captura,
además de observar las cantidades de insectos atrapados, así como, verificar si las
variantes climáticas influyen en su comportamiento y en qué sitio se presentó
positividad ante Leishmania.
Análisis estadístico de los resultados
Todos los datos obtenidos en el área de estudio, serán anotados en la bitácora de
campo para después almacenarlos en una base de datos del programa Microsoft
Excel®. Para obtener las diferencias entre los datos de las localidades incluidas en
el estudio, así como de las diferencias entre las temporadas climáticas, el área de
captura de los vectores será analizadas mediante la prueba de análisis de varianza
de 3 vías (localidad de estudio, estación climática y el área de captura) con el
programa IBM SPSS Statistics v20.
Con la prueba de Chi-cuadrada se compararán las diferencias entre el espectro
trófico de los vectores según la temporada climática, el área de captura y el tipo de
hospedero. La positividad de Leishmania en los insectos capturados, así como los
hospederos analizados se obtendrá por conteo directo y cálculo de porcentajes.
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Todos los resultados se mostrarán con gráficos y tablas de frecuencia para su mejor
interpretación.
Colecta de insectos.
Para la captura de los flebótomos se utilizarán trampas de luz tipo CDC las cuales
se colocan entre las 19:00 y las 20:00 horas, estas se ubican en sitios
peridomiciliarios/domiciliarios y en zona selvática. Los muestreos entomológicos se
realizarán bimensualmente durante un año a partir del mes de Agosto de 2021 y
terminarán en el mes de Julio de 2022 siguiendo la metodología descrita por
Sandoval et al en el 2006, asimismo durante los días de captura se tomarán datos
tales como: coordenadas del sitio de captura, fase lunar, vegetación autóctona,
condiciones orográficas, precipitación, temperatura, humedad, dirección y velocidad
del viento, entre otros. Los insectos capturados serán almacenados en frascos de
plástico con alcohol al 70% para la preservación de los mismos.
Identificación y caracterización morfológica
La identificación y caracterización de los dípteros capturados se realizará en el
laboratorio de Conservación de Fauna Silvestre de la Facultad de Biología siguiendo
la guía propuesta por Harrup et al en 2015
Identificación y caracterización molecular de los organismos
Extracción de ADN de los organismos
La extracción del ADN de los organismos colectados se realizará con el estuche
comercial Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega Corporation,
USA) ® para ellos se seguirán las instrucciones del fabricante.
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Identificación molecular de los organismos
Para la identificación molecular de Culicoides sp. Se amplificará por PCR una
región de 710 pb del gen COI, para ello se utilizarán los iniciadores LCO1490: 5'
GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3' HC02198: 5'-TAA ACT TCA GGG
TGA CCA AAA AAT CA-3'). La reacción de PCR se llevará a cabo con el kit
comercial GoTaq Green Master Mix de la marca Promega y se seguirá las
indicaciones del fabricante.
La amplificación se realizará en un termociclador T100 de la marca BioRad con las
siguientes condiciones: 40 ciclos que comprenden desnaturalización a 95°C por
15’’, hibridación a 60°C por 30’’ y polimerización a 72°C por 30’’. Finalmente se
aplicará un paso de extensión a 72°C por 7´ (Moura-Rodrigues., 2016). Los
productos amplificados serán analizados por electroforesis en gel de agarosa al X%
previamente teñidos con colorante GelRed. Se empleará como marcador de peso
molecular DNA ladder de 100 pb de la marca Promega. El producto amplificado será
purificado mediante el estuche comercial Wizard DNA Purification System de la
marca comercial Promega. Una vez purificados serán enviados a secuenciación a
Macrogen Corp. Para después comparar las secuencias en la base de Gen Bank.
Identificación y caracterización molecular de organismos reservorios de
Leishmania.
Para la identificación de reservorios se empleará la técnica de PCR-RFLP, para ello
se amplificará un fragmento de 358 pares de bases (pb) del gen mitocondrial CYTB
mediante el uso de los iniciadores BM1 5’- CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC
A -3’ BM2 5’- CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA -3’. Para la reacción de
PCR se utilizará el estuche comercial GoTaq Green master mix de la casa comercial
Promega Corporation y se seguirán las instrucciones del fabricante. La amplificación
se realizará en un termociclador T100 de la marca BioRad, con las siguientes
condiciones: 35 ciclos que consisten en un paso de desnaturalización a 94°C por 1
minuto, Hibridación a 65°C por 30 segundos y polimerización a 72°C por 30
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segundos y un paso final de extensión a 72°C por 7 minutos.
Para los RFLP, el fragmento amplificado será digerido con las enzimas de
restricción: Aci I, AluI, Hae III y Rsa I (Laison et al., 1994). Una alícuota de la
reacción de digestión será sometida a electroforesis en gel de agarosa o al X%
previamente teñida con GelRed y será analizado mediante un fotodocumentador
GelDoc. Se utilizará como marcador de peso molecular DNA ladder de 100 pb.
Identificación y caracterización molecular de especies de Leishmania
La identificación y caracterización molecular de Leishmania se realizará mediante
la técnica de PCR-RFLP para lo cual se amplificará un fragmento de entre 300 a
350 pb (dependiendo de la especie) del espaciador interno transcribible 1 (ITS1)
con los iniciadores LITSR (5´ CTG GAT CAT TTT CCG ATG-3’) y L5.8S (5´-TGA
TAC CAC TTA TCG CAC TT-3’). La reacción de PCR se montará utilizando el
estuche comercial GoTaq Green Master Mix de la marca Promega, Corp., y se
seguirán las instrucciones del fabricante.
La amplificación se realizará en un termociclador T100 de la marca BioRad, con las
siguientes condiciones: 35 ciclos consistentes en desnaturalización a 94°C por 40”,
hibridación a 53°C por 30’’ y polimerización a 72°C por 60’’. Adicionalmente a los 35
ciclos se agregará un paso de extensión a 72°C por 7 minutos. El producto de
amplificación será analizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%
previamente teñido con colorante GelRed y visualizado en un fotodocumentador
GelDoc de la marca BioRad. Una vez corroborado la amplificación, el producto será
analizado mediante la técnica de RFLP para lo cual será digerido con la
endonucleasa de restricción HaeIII siguiendo las especificaciones del fabricante.
Los productos de la digestión serán analizados por electroforesis en gel de agarosa
al 3%. Teñido con colorante GelRed y visualizado en un fotodocumentador GelDoc
de la marca BioRad. Como marcador de peso molecular se usará DNA ladder de la
marca Promega.
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XI. Supervisión y asesoría
Este Proyecto estará bajo la supervisión del asesor asignado por la coordinación de
servicio social de la Facultad de Biología, el Dr. Edith Hilario Torres Montoya y será
de tipo técnica.
XII. Evaluación
El asesor asignado deberá evaluar el desempeño de las actividades realizadas
según su criterio, tomando en cuenta los resultados obtenidos con respecto a los
objetivos planteados en este proyecto.
XIII. Resultados esperados
Al finalizar este proyecto se espera concluir exitosamente con los objetivos y metas
planeadas y obtener resultados que generen un nuevo conocimiento, así como,
impulsar a nuevas investigaciones a que estudien esta interacción, además de
ayudar a la población manteniendo actualizada la información con respecto a la
enfermedad generando nuevos mapas de riesgo e implementar nuevos programas
de control de vectores.
Dirección General de Programas Preventivos. 2015. Manual para el diagnóstico,
tratamiento y control de Leishmaniasis. Dirección electrónica:
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Colecta de material biológico
Procesos morfológicos y moleculares
Recomendaciones y acciones de prevención en la comunidad
** ** ** Brigadistas y asesor
Identificar probables reservorios
** ** ** ** ** Brigadistas y asesor
Redactar informe final
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Proyecto Recursos
1. Caracteri
zar las
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