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ANÁLISE CRÍTICA DO MÉTODO DE DETECÇÃO DO mRNA DE TIREOGLOBULINA NO SANGUE DE PACIENTES COM
CARCINOMA DIFERENCIADO DA TIREÓIDE
I. SABRINA MENDES COELHO
II. DISSERTAÇÃO DE DOUTORADO SUBMETIDA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA (ENDOCRINOLOGIA), FACULDADE DE MEDICINA, DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO – UFRJ, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM MEDICINA (ENDOCRINOLOGIA).
Orientadores: Prof. Dr. Mário Vaisman Profa. Dra. Denise Pires de Carvalho
Rio de Janeiro
Novembro/2005
ANÁLISE CRÍTICA DO MÉTODO DE DETECÇÃO DO mRNA DE TIREOGLOBULINA NO SANGUE DE PACIENTES COM
CARCINOMA DIFERENCIADO DA TIREÓIDE
Sabrina Mendes Coelho
Orientadores: Prof. Dr. Mário Vaisman e Profa. Dra. Denise Pires de Carvalho
2
Dissertação de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Endocrinologia),
Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Medicina (Endocrinologia).
Aprovada por:
______________________________________________________
______________________________________________________
_______________________________________________________
______________________________________________________
______________________________________________________
Rio de Janeiro
Novembro/2005
FICHA CATALOGRÁFICA
I.
3
DEDICATÓRIA
II.
Coelho, Sabrina Mendes.
Análise crítica do método de detecção do mRNA de tireoglobulina
em amostra de sangue de pacientes com carcinoma diferenciado da
tireóide / Sabrina Mendes Coelho. Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade
de Medicina, 2005.
xv, 108 f., il., 31cm.
Orientadores: Mário Vaisman e Denise Pires Carvalho
Dissertação (Doutorado) Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Faculdade de Medicina / Endocrinologia, 2005.
Referências Bibliográficas: f. 66-80
1. Neoplasias da tireóide. 2. Recidiva. 3. Tireoglobulina 4. mRNA.
Tese. I. Dissertação (Doutorado) Faculdade de Medicina. II. Título.
4
Ao meu melhor projeto,
meu filho Bernardo.
AGRADECIMENTOS
III.
Aos meus amados pais, Sérgio e Regina. Além de todo amor e suporte sempre oferecidos,
ensinaram-me a importância da responsabilidade, honestidade e dedicação para alcançar objetivos na
vida e a não temer os obstáculos.
As minhas queridas irmãs Soraya e Raquele, pela eterna torcida e estímulo. Aos meus sobrinhos,
Marcelo e Rodrigo, pela grande fonte de alegria.
Ao meu amado marido Flávio, pelo seu companheirismo. Sua força, incentivo e carinho me
auxiliam a enfrentar os momentos difíceis.
5
Às amigas Renata Grozovsky, Flávia Nóbrega, Elaine Cristina e a todos do Laboratório de
Fisiologia Endócrina pelo companheirismo, incentivo e ajuda nos experimentos laboratoriais. À Vanessa
Varandas pela amizade e auxílio no acompanhamento dos pacientes.
Ao Dr. Ronald Freire e Dra. Maria Inês pela confiança neste projeto de pesquisa e
encaminhamento de pacientes.
A Mabel Barbosa Esteves, doutoranda do Laboratório de Imunologia Tumoral, que auxiliou nos
experimentos de cultura primária de linfócitos.
À Profa. Dra. Doris Rosenthal, minha primeira orientadora, cuja dedicação exemplar à pesquisa,
estimulou-me a seguir este caminho.
Ao Prof. Dr. Alexandru Buescu, Chefe do Ambulatório de Câncer de Tiróide, pela confiança e
carinho em mim depositados.
Aos meus eternos e queridos orientadores. Em 1992, quando ingressei no
Programa de Iniciação Científica, fui premiada por ter a Profª. Drª. Denise Pires de
Carvalho como minha orientadora. Sua inteligência, sensatez e dinamismo tornam-na
esta admirável pesquisadora. O meu primeiro contato com o Prof. Dr. Mário Vaisman foi
em 1994, no Curso da Graduação em Medicina. Entretanto, foi ao longo do Curso de
Residência Médica que pude conhecer esta rara pessoa. Sua objetividade, seriedade e
sua incansável disposição em estimular os alunos tornam-no um exemplo a ser
seguido. Desta forma, se hoje cheguei até esta etapa profissional, certamente foi devido
à enorme contribuição desta maravilhosa dupla de orientadores. Obrigada também pelo
carinho e amizade tão importantes nesta caminhada.
6
RESUMO
Após quase uma década de estudo sobre amplificação do mRNA de
tireoglobulina (Tg) em sangue de pacientes com carcinoma diferenciado da tireóide,
ainda não foi estabelecida sua real contribuição. Neste trabalho objetiva-se avaliar: 1) a
possibilidade de relação entre a detecção do mRNA de Tg no sangue de pacientes com
carcinoma tireoideano e a avaliação tradicional através da Tg sérica, pesquisa de corpo
inteiro e ultra-sonografia cervical; 2) se a presença do mRNA de Tg representa um fator
de risco para recidiva; 3) a possibilidade de transcrição ilegítima de mRNA de Tg em
modelo de linfócitos em cultura. Após padronização das técnicas de extração de RNA e
RT-PCR em 10 indivíduos normais, foram estudados 32 pacientes com carcinoma da
tireóide. O mRNA foi encontrado em 100% dos pacientes com doença residual. Dos 25
pacientes sem evidência prévia de doença, o mRNA foi detectado em 9, porém a nova
investigação confirmou recidiva somente em 2 casos. A Tg sérica em supressão e o
mRNA de Tg apresentaram sensibilidade de 75% e especificidade de 100% e 61,1%,
respectivamente. Nos pacientes com mRNA de Tg não foi observado um maior risco de
recidiva num período de 24 meses de acompanhamento. O estudo com linfócitos em
cultura demonstrou expressão do mRNA de Tg por estas células, podendo representar
transcrição ilegítima e justificar a baixa especificidade do método. A aplicabilidade
clínica do teste de mRNA de Tg só será possível após padronização de técnica capaz
de distinguir a amplificação específica da não específica.
Palavras-chaves: câncer de tireóide, recidiva, tireoglobulina, mRNA de tireglobulina.
7
ABSTRACT
IV.
The amplification of thyroglobulin (Tg) mRNA in peripheral blood of patients with
thyroid cancer has been studied for almost one decade, but its real contribution has not
yet been established. The objectives of this study were to analyze: 1) the possible
correlation between Tg mRNA expression in peripheral blood and the traditional
evaluation of patients by thyroid carcinoma with serum Tg, whole body scan and cervical
ultrasound; 2) whether Tg mRNA expression represents a risk factor for relapse; 3) the
possibility of illegitimate transcription of Tg mRNA by lymphocytes in culture. After
standardization of total RNA extraction and RT-PCR amplification in 10 normal
volunteers, 32 patients with thyroid cancer were studied. Amplification of Tg mRNA was
observed in 100% of patients with known residual disease. Of the 25 patients without
previous evidence of disease, Tg mRNA was detected in 9. However the new
investigation confirmed relapse in only 2 cases. Serum Tg during suppressive therapy
and Tg mRNA had sensitivity of 75% and specificity of 100% and 61.1%, respectively.
Patients with Tg mRNA detected in blood did not have an increased risk of cancer
relapse after 24 months of follow-up. The study with cultured lymphocytes
demonstrated Tg mRNA expression by theses cells. This finding may represent
illegitimate transcription and justify the low specificity of this test. The clinical applicability
of Tg mRNA amplification will only be possible after a methodological standardization
that could distinguish specific from non-specific amplification.
Key words: thyroid cancer, relapse, thyroglobulin mRNA, thyroglobulin.
8
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
V.
Anti -Tg Anticorpo anti-tireoglobulina
cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar
CDT Carcinoma diferenciado da tireóide
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Coquetel de nucleotídeos
DTT Ditiotreitol
ELISA Ensaio de imunoabsorbância ligado a enzima
GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase
ICMA imunoquimioluminescência
IRMA Ensaio radioimunométrico
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
NIS Transportador de sódio-iodeto
PCI Pesquisa de corpo inteiro
PCR Reação em cadeia de polimerase
RIE Radioimunoensaio
RM Ressonância magnética
RNA Ácido ribonucléico
RT Transcrição reversa
RT- Transcrição reversa sem adição da enzima RT-PCR Reação em cadeia de polimerase após transcrição reversa
T4 livre Tiroxina livre
TC Tomografia computadorizada
Tg Tireoglobulina
TPO Tireoperoxidase
TSH Hormônio estimulador da tireóide
TSHR Receptor de TSH
9
UICC União Internacional Contra o Câncer
USG Ultra-sonografia
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Pag Tabela 1 Detecção da Tg sérica de acordo com o tipo de tratamento e o nível de
TSH ................................................................................................................................08
Tabela 2 Diferença da metodologia empregada para amplificação de mRNA de
tireoglobulina ...............…................................................................................................16
Tabela 3 Comparação entre os resultados dos principais artigos publicados .........19
Tabela 4 Casuística - Característica dos pacientes com persistência
tumoral............................................................................................................................33
Tabela 5 Casuística - Característica dos pacientes com Tg sérica prévia < 1ng/ml
em supressão .................................................................................................................34
Tabela 6 Exames dos pacientes com doença residual conhecida.......................................................................................................................38
Tabela 7 Exames dos pacientes com Tg sérica prévia < 1 ng/mL em supressão........................................................................................................................41
Tabela 8 Concordância entre mRNA e investigação clínica ....................................43
Tabela 9 Comparação da sensibilidade e especificidade entre os testes de mRNA de Tg e Tg
sérica em supressão.....................................................................................44
Tabela 10 Acompanhamento dos pacientes com mRNA de Tg indetectável.............50
Tabela 11 Acompanhamento dos pacientes com mRNA de Tg
detectável........................................................................................................................51
Figura 1 Esquema de extração de RNA...................................................................24
Figura 2 Características dos oligunucleotídeos iniciadores.....................................26
Figura 3 Esquema das etapas de RT-PCR..............................................................28
Figura 4 Fluxograma do acompanhamento dos pacientes......................................30
Figura 5 Fragmentos de mRNAs da Tg e GAPDH amplificados através da técnica de RT-
PCR......................................................................................................................36
Figura 6 mRNA de Tg no sangue de pacientes em aparente remissão detectado através da
técnica de RT-PCR........................................................................................40
11
Figura 7 Resumo do resultado da pesquisa de mRNA de Tg e da avaliação
clínica..............................................................................................................................46
Figura 8 Percentual de pacientes com mRNA de Tg detectável de acordo com o
estadiamento tumoral .....................................................................................................47
Figura 9 Resultado da extração de RNA e RT-PCR de linfócitos ...........................52
12
LISTA DE ANEXOS
VI.
Anexo 1 Artigo de revisão submetido aos Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e
Metabologia.................................................................................................................... 81
13
SUMÁRIO
VII.
Pag
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................01
2 REVISÃO DA LITERATURA....................................................................03
I. Dificuldades técnicas da tireoglobulina sérica..................................05
II.RNA mensageiro da Tg como possível marcador tumoral...............09
3 OBJETIVOS..............................................................................................20
4 PACIENTES E MÉTODOS........................................................................21
I. Seleção de pacientes........................................................................21
II. Avaliação clínica e labortorial...........................................................22
III. Extração de RNA.............................................................................22
IV. Síntese de cDNA (transcrição reversa)...........................................25
V. Amplificação através de reação em cadeia de polimerase..............26
VI. Reavaliação clínica.........................................................................29
VII. Estudo da expressão de mRNA de Tg por células não
tireoideanas.........................................................................................31
VIII. Análise estatística.........................................................................32
5 RESULTADOS..........................................................................................33
I. Características dos pacientes...........................................................33
II. Resultados da pesquisa de mRNA no grupo controle.....................35
III. Resultados da pesquisa de mRNA nos pacientes..........................37
IV. Resultado do acompanhamento dos pacientes.............................49
V. Resultado do estudo da expressão de mRNA de Tg em
Linfócitos............................................................................................52
6 DISCUSSÃO.............................................................................................53
7 CONCLUSÕES.........................................................................................65
14
8 REFERÊNCIAS ........................................................................................66
9 ANEXO......................................................................................................81
15
INTRODUÇÃO
Pacientes com carcinoma diferenciado da tireóide (CDT), papilífero ou folicular,
apresentam em geral bom prognóstico após tratamento inicial. Entretanto, recidiva
tumoral, local ou à distância, não é infreqüente, podendo ocorrer até algumas décadas
após o diagnóstico. Como conseqüência, os pacientes devem ser mantidos em
permanente acompanhamento para detecção precoce da recidiva.
A forma clássica de avaliar a presença de recorrência tumoral é o
acompanhamento da tireoglobulina (Tg) sérica e a realização de cintilografia de corpo
inteiro (PCI) com iodo radioativo (131I ou 123I). Entretanto, vários outros métodos
complementares também podem ser utilizados, como por exemplo, ultra-sonografia
(USG), tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (RM), cintilografia
com sestamibi, fluorodeoxiglicose, entre outros.
Em pacientes com CDT, espera-se que a Tg sérica torne-se indetectável após
tratamento ablativo (tireoidectomia total ou subtotal alargada complementada com iodo
radioativo). Nesta situação qualquer nível detectável de Tg pode indicar persistência ou
recorrência da doença maligna.
Vários estudos têm confirmado o importante papel da Tg sérica como marcador
tumoral no acompanhamento de pacientes com CDT (Schlumberger e Baudin, 1998;
Girelli e De Vido, 2000). Entretanto, o ensaio da Tg apresenta alguns dilemas técnicos,
como por exemplo, a sensibilidade do teste dependente do nível de TSH, a interferência
com anticorpo anti-Tg, a existência de métodos comerciais com baixa sensibilidade, a
possibilidade do efeito gancho, a variação interensaio, a ausência de padronização
16
internacional e a produção, por alguns tumores, de formas variantes de Tg não
detectadas pelo método.
O anticorpo anti-Tg permanece como o principal fator de interferência, uma vez
que aproximadamente 15 a 25% dos pacientes com CDT apresentam este anticorpo
(Kumar e cols, 1994; Spencer e cols, 1998; Chung e cols, 2002), dificultando a correta
interpretação do nível de Tg sérica.
Na tentativa de evitar a interferência com anticorpo anti-Tg e aumentar a
sensibilidade em detectar recidiva tumoral, novos métodos vêm sendo desenvolvidos.
Nos últimos anos, foi verificado que células tireoideanas podem ser encontradas na
corrente sangüínea (Ringel e cols, 1998). Este achado possibilita utilizar como
marcador sangüíneo de recidiva tumoral a amplificação de RNAs mensageiros (mRNA)
característicos da tireóide.
Estudos iniciais sugeriram que a amplificação do mRNA da Tg poderia
representar uma alternativa promissora (Ringel e cols, 1998; Wingo e cols, 1999;
Biscolla e cols, 2000). No entanto, atualmente se questiona o verdadeiro valor da
detecção do mRNA de Tg, uma vez que vários estudos recentes demonstram baixa
acurácia do método.
17
REVISÃO DA LITERATURA
A revisão de literatura realizada foi submetida sob a forma de artigo de revisão
aos Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, intitulado “Amplificação de
mRNA de tireoglobulina no sangue de pacientes com carcinoma diferenciado da
tireóide: qual o seu verdadeiro significado?” (Anexo I).
18
Os CDTs, papilífero e folicular, estão entre as neoplasias malignas com melhor
índice de cura. A taxa de sobrevida em 20 anos é de 95% para o carcinoma papilífero e
de 70 a 80% para o folicular (Hamming e cols, 1989). No entanto, alguns pacientes
apresentam alto risco de recorrência tumoral, ou mesmo de morte, e o prognóstico é
afetado por fatores relacionados ao paciente, ao tratamento e à própria doença. A
recidiva tumoral, local ou à distância, não é infreqüente, podendo ocorrer até algumas
décadas após o diagnóstico (Mazzaferri e Massoll, 2002), evidenciando a necessidade de
acompanhamento permanente dos pacientes com CDT.
A forma clássica de avaliar a presença de recorrência tumoral é o acompanhamento
da Tg sérica e a realização de PCI. A USG cervical também vem se afirmando como
método diagnóstico importante para a detecção de recorrência cervical, com
sensibilidade superior à Tg sérica e à PCI (Frasoldati e cols, 2003).
Apesar da Tg sérica ser considerada um excelente marcador de recidiva tumoral, o
ensaio da Tg apresenta ainda alguns dilemas técnicos. Em especial destaca-se a
interferência com anticorpo anti-Tg, e a sensibilidade dependente do nível de TSH. A
administração de TSH recombinante precedendo a dosagem de Tg sérica é
interessante, pois aumenta a síntese de Tg pelos tireócitos, melhorando a sensibilidade
do método, e evita os sintomas indesejáveis do hipotireoidismo. No entanto, o alto custo
desta substância dificulta seu emprego no seguimento dos pacientes com CDT.
Na tentativa de melhorar o acompanhamento de pacientes com câncer,
diagnosticando precocemente a recidiva, esforço tem sido realizado para o
desenvolvimento de métodos alternativos. A amplificação de mRNA tumor específico
extraído a partir de sangue parece ser útil em detectar células neoplásicas na corrente
19
sangüínea (Moreno e cols, 2002; Burchill e cols, 1994; Johnson e cols, 1995). Na
década de 90, iniciou-se a avaliação da pesquisa de mRNA de Tg em amostra de
sangue de pacientes com CDT, com resultados iniciais promissores (Ditkoff e cols,
1996; Tallini e cols, 1998; Ringel e cols, 1998).
III. DIFICULDADES TÉCNICAS DA TIREOGLOBULINA SÉRICA
A Tg é uma proteína sintetizada exclusivamente pelas células foliculares da tireóide.
É codificada por um gene de pelo menos 300kb, contendo 48 exons e localizado no
cromossomo 8 (Baas e cols, 1985; Mendive e cols, 1999; Van de Graaf e cols, 2001). O
produto final é uma glicoproteína de 660 kDa, formada por 2 subunidades idênticas,
unidas por ligação não-covalente. A Tg pode apresentar-se de forma heterogênea em
decorrência de splicing alternativo do seu mRNA.
Por muitos anos acreditava-se que a Tg era encontrada exclusivamente na glândula
tireóide. A partir da década de 40 surgiram relatos de detecção de Tg no sangue
(Lerman, 1940), mas foram Van Herle e cols (1973) que estabeleceram o primeiro
método útil clinicamente para detectar a Tg, o radioimunoensaio (RIE) utilizando
anticorpo policlonal de coelho. Na década de 80, os ensaios radioimunométricos
(IRMAs) com anticorpo monoclonal tornaram-se disponíveis.
Atualmente, existem 4 imunoensaios disponíveis para a dosagem da Tg: RIE (com
duplo ou único anticorpo), IRMA, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e ICMA
(imunoquimioluminescência). Destes, o RIE com duplo anticorpo, IRMA e ICMA são as
técnicas de escolha.
20
Vários fatores podem afetar a acurácia do ensaio de Tg, podendo ser divididos em
fatores ensaio-dependentes e ensaio-independentes (Torréns e Burch, 2001):
- Fatores ensaio-independentes:
. Presença de anticorpo anti-Tg;
. Níveis extremamente elevados de Tg (efeito gancho);
. Anticorpo heterofílico;
. Outros: gamopatia monoclonal, doença renal terminal.
- Fatores ensaio-dependentes:
. Falta de padronização internacional;
. Especificidades diferentes dos anticorpos utilizados;
. Falta de precisão interensaio;
. Sensibilidade funcional sub-ótima;
. Variante de Tg não reconhecida pelo anticorpo utilizado no método.
O anticorpo anti-Tg permanece como o principal fator de erro na dosagem de Tg
sérica, uma vez que aproximadamente 15 a 25% dos indivíduos com CDT apresentam
anticorpo anti-Tg (Kumar e cols, 1994; Spencer e cols, 1998, Chung e cols, 2002),
prevalência esta mais elevada que na população geral. É importante salientar que o
grau de interferência não é proporcional ao título do anticorpo e que nenhum método
está totalmente livre desta interferência. Na presença do auto-anticorpo, o RIE
geralmente determina falsa elevação da Tg, ao passo que IRMA e ELISA podem
subestimar. Desta forma, recomenda-se screening de anticorpo anti-Tg em todo
paciente com CDT. Infelizmente, vários laboratórios ainda utilizam teste de
hemaglutinação para detecção de auto-anticorpo, que sabidamente apresenta baixa
sensibilidade. A discordância entre o nível de Tg medida por RIE e IRMA pode
21
funcionar como um indicador sensível da interferência do anticorpo (Spencer e cols,
1998). Uma alternativa é o teste de recuperação, que consiste em adicionar uma
quantidade conhecida de Tg ao soro e medir posteriormente a recuperação. Caso a
recuperação da Tg seja inferior a 80% sugere haver interferência do anticorpo e se
maior que 80% diminui a possibilidade de interferência. Entretanto, a acurácia deste
teste não é alta e, portanto, o mesmo não deve ser utilizado para validar a medida da
Tg sérica (Spencer e cols, 1996).
A Tg quando em nível bastante elevado (10 a 10.000 vezes a faixa superior de
detecção) pode ser falsamente detectada em nível normal ou mesmo baixo. Este
fenômeno é conhecido como efeito gancho e é exclusivo dos ensaios com duplo
anticorpo, como o IRMA e RIE. Neste caso, a diluição do soro é recomendada.
Ao contrário do anticorpo anti-Tg, a interferência do anticorpo heterofílico não é
habitualmente reconhecida pelos laboratórios e clínicos. Quando presente, este
anticorpo resulta em teste falso positivo (Preissner e cols, 2003). Como alguns
pacientes são tratados com base na elevação da Tg sérica, a não identificação do
anticorpo heterofílico pode resultar em tratamento desnecessário.
Uma vez na circulação, a meia-vida da Tg é de 3 a 65 horas, dependendo do grau
de modificações pós-traducionais (Izumi e cols, 1986) e a sua metabolização é feita
primariamente pelo fígado. O nível sérico da Tg depende de 2 fatores principais: o
volume tireoideano e o nível de TSH sérico.
- Volume tireoideano
Em geral, quanto maior a massa de tecido tireoideano (normal ou neoplásico) maior
o nível de Tg sérica. Desta forma, nos pacientes submetidos à terapia ablativa (cirurgia
22
associada à dose ablativa de 131I) a Tg permanece indetectável numa maior proporção
de casos em relação aos pacientes tratados de forma mais conservadora, 98% e 50%,
respectivamente (Tabela 1).
TABELA 1: Detecção da Tg sérica de acordo com o tipo de tratamento e o
nível de TSH
% Pacientes com Tg sérica indetectável
TSH suprimido Em hipotireoidismo
Cirurgia + ablação com 131I 98% 90%
Tireoidectomia
(total ou subtotal)
93% 80%
Lobectomia unilateral 50% ~0%
Baseado em Schlumberger e Pacini, 1999.
- Nível de TSH
Como o TSH é um importante estimulador da função tireoideana e mesmo células
neoplásicas mantém expressão de seu receptor, é esperado que o nível de Tg sérica
varie de acordo com a concentração de TSH (Tabela 1). Desta forma, ao interpretar o
valor da Tg deve-se sempre avaliar o nível de TSH.
Cerca de 20% dos pacientes com metástases para linfonodo e 5% dos pacientes
com pequenas metástases à distância apresentam Tg indetectável durante terapia
23
supressora de TSH com levotiroxina. Esta percentagem cai para 10 e menos de 1%,
respectivamente, quando induzido o hipotireoidismo (Schlumberger, 1998).
Outro fator importante para a determinação do nível de Tg sérica é a capacidade
intrínseca do tumor de sintetizar e secretar esta glicoproteína. A determinação pré-
operatória da Tg sérica talvez possa ser útil para avaliar esta habilidade tumoral
(Spencer e cols, 1999).
Desta forma, observa-se que, apesar da Tg ser um marcador tumoral bastante útil
no acompanhamento pós-operatório, resultados falso-negativos ocorrem (Tg sérica
indetectável em vigência de persistência ou recorrência tumoral). Estes casos são
geralmente explicados pela menor sensibilidade do exame durante terapia supressora
de TSH ou por interferência com anticorpo anti-Tg. Na tentativa de superar estas
dificuldades, estudos têm sido realizados com o objetivo de desenvolver métodos
alternativos de investigação.
IV. RNA MENSAGEIRO DA Tg COMO POSSÍVEL MARCADOR TUMORAL
O conceito de detecção molecular altamente sensível de células tumorais na
corrente sangüínea foi descrito no início da década de 90 para tumores sólidos, como
carcinoma de próstata (Moreno e cols, 1992), neuroblastoma (Mattano e cols, 1992) e
carcinoma de mama (Datta e cols, 1994). Especialmente no câncer de próstata, a
detecção por reação em cadeia de polimerase após transcrição reversa (RT-PCR) de
células neoplásicas no sangue parecia preceder a elevação dos demais marcadores
séricos, favorecendo ao diagnóstico mais precoce da recidiva (Ghossein e cols, 1995).
24
No primeiro estudo de mRNA de Tg no acompanhamento de pacientes com CDT,
Ditkoff e cols (1996) conseguiram detectar por RT-PCR este mRNA em todos os 9
pacientes com doença metastática e em menos de 10% (7 de 78) dos pacientes sem
metástases. Neste grupo, a detecção do mRNA de Tg foi mais freqüente naqueles com
história prévia de metástase (5 de 22) do que naqueles sem história de metástase (2 de
56). Nos voluntários normais e nos pacientes com doença benigna não foi vista
amplificação. Estes resultados iniciais sugeriram, que a presença na circulação
sangüínea do mRNA de Tg poderia representar doença tireoideana disseminada via
hematogênica.
Posteriormente, Tallini e cols (1998) conseguiram detectar mRNA de Tg e
tireoperoxidase (TPO) em 54,2% dos indivíduos em acompanhamento de CDT,
incluindo 5 de 8 pacientes sem evidência de doença no momento do exame. Entretanto,
4 destes 5 casos apresentaram invasão extratireoideana ou metástase para linfonodo
no momento da cirurgia. Já a amplificação do mRNA de RET/PTC 1 foi observada em
apenas 1 dos 18 pacientes com carcinoma papilífero e em nenhum paciente com
doença benigna. O mRNA de Tg e de TPO foram também detectados em 10% (2 de
20) dos pacientes com doença tireoideana benigna. No entanto, no pós-operatório o
mRNA não foi mais encontrado. Este achado demonstra que a presença no sangue de
mRNA específico da tireóide não está necessariamente relacionada à metástase.
Em 1998, utilizando metodologia de extração de RNA total diferente dos demais,
Ringel e cols (1998) detectaram mRNA de Tg em todos os 10 indivíduos normais
eutireoideanos testados. Dentre os 87 pacientes com CDT, o mRNA de Tg foi detectado
em 26 de 33 pacientes (79%) com remanescente em leito tireoideano ou doença
metastática confirmada em PCI, ao passo que a Tg sérica foi detectada somente em 12
25
destes pacientes (36%) durante terapia supressora de TSH. Nos pacientes com PCI
negativa, a Tg sérica estava detectável em 2 e o mRNA em 7 pacientes. Neste estudo a
amplificação do mRNA de Tg apresentou maior sensibilidade que a Tg sérica para
pesquisa de doença residual, pelo menos durante supressão de TSH. Entretanto, sua
especificidade foi inferior. Neste mesmo trabalho, através de técnica de
imunocitoquímica foram demonstradas células com expressão de receptor de TSH e Tg
na corrente sangüínea de indivíduos normais, sugerindo que a presença de tireócitos
no sangue não estaria relacionada apenas à disseminação hematogênica do carcinoma
da tireóide.
Este mesmo grupo (Wingo e cols, 1999) desenvolveu um método de RT-PCR
quantitativo e amplificou o mRNA de Tg em todos os 32 voluntários normais. A
concentração média encontrada foi de 433 ± 69 ng de RNA total tireoideano / litro de
sangue, com variação de 26 a 1502 ng/L. Aplicando metodologia semelhante em 107
pacientes com CDT e utilizando o valor de 3pg de mRNA de Tg / µg RNA de tireóide
como cutoff, o mRNA de Tg foi encontrado em 38% dos pacientes sem captação
anormal de iodo na PCI, 75% daqueles com captação em leito tireoideano, 84% com
doença cervical e 94% com metástases à distância (Ringel e cols, 1999).
A amplificação do mRNA do transportador de sódio-iodeto (NIS) também já foi
testada (Biscolla e cols, 2000). O interesse maior no estudo do NIS como marcador
tumoral é avaliar se há correlação entre sua expressão e a captação de iodo, tentando
explicar a discordância entre Tg sérica e PCI encontrada em alguns pacientes.
Entretanto, a amplificação do mRNA do NIS por nested PCR (2 ciclos seguidos de
amplificação, utilizando 2 pares de seqüências de oligonucleotídeos iniciadores
26
distintos) mostrou baixa acurácia (sensibilidade de 16,6% e especificidade de 54%),
não havendo necessariamente correlação com a captação. A baixa especificidade pode
ser explicada, pelo menos em parte, pela expressão deste transportador em tecidos
não tireoideanos. Neste mesmo estudo, a sensibilidade e especificidade da
amplificação do mRNA da Tg por nested PCR foram de 83% e 71% e da Tg sérica 50 e
89%, respectivamente.
A detecção de mRNA de TPO foi novamente estuda (Roddiger e cols, 2002),
desta vez em um grupo maior de pacientes: 120 com carcinoma tireoideano, 85 com
doença benigna e 54 voluntários normais. Dentre os indivíduos com doença maligna, o
mRNA da TPO foi detectado em 70% daqueles com metástases (7/10), sendo que em 3
a Tg sérica foi negativa (< 5 ng/mL). Naqueles sem metástase documentada, o mRNA
da TPO foi detectado em 36% (39/110). Nestes, observou-se correlação positiva com a
presença de metástase para linfonodo (p = 0,05), estadiamento (p = 0,01) e Tg elevada
(p = 0,03).
A avaliação do mRNA de Tg por RT-PCR quantitativo em crianças com doença
tireoideana benigna e maligna não mostrou diferença significativa entre os 2 grupos.
Entretanto, nos pacientes previamente tratados por carcinoma papilífero, o nível de
mRNA de Tg correlacionou-se com a PCI e com a Tg sérica (Fenton e cols, 2001).
Apesar destes resultados iniciais promissores, questiona-se atualmente o
verdadeiro valor e acurácia da detecção do mRNA de Tg no acompanhamento do CDT.
Vários pacientes em aparente remissão clínica (Tg sérica indetectável e PCI negativa)
apresentam mRNA circulante detectável (falso-positivo) e alguns pacientes
sabidamente com doença metastática apresentam mRNA indetectável (falso-negativo).
27
A expressão no sangue do mRNA da Tg por RT-PCR semi-quantitativo (com
variação do número de ciclos de 32 a 36) foi comparada entre pacientes submetidos a
tireoidectomia total por outra patologia que não CDT (carcinoma medular de tireóide,
carcinoma de laringe e bócio multinodular atóxico) e indivíduos normais (Bugalho e
cols, 2001). Não foi encontrada diferença significativa da expressão do mRNA de Tg
entre os 2 grupos. Além disso, o RNA foi detectado tanto na camada de células
mononucleares quanto de polimorfonucleares, sugerindo que células sangüíneas talvez
possam expressar o mRNA da Tg. Entretanto, deve ser salientado que neste estudo os
pacientes tireoidectomizados não foram avaliados com cintilografia da tireóide para
avaliar possível remanescente tireoideano pós-operatório.
No estudo por RT-PCR quantitativo com 57 pacientes tireoidectomizados não foi
encontrada diferença de expressão do mRNA de Tg entre indivíduos com e sem
metástase de CDT, questionando-se a especificidade deste método (Takano e cols,
2001). Entretanto, a metodologia adotada foi diferente da anteriormente descrita por
Ringel e cols (1999). Não foi realizado tratamento com DNAse para prevenir
amplificação de DNA genômico, e a padronização da curva de concentração foi feita
com a amplificação do gene da GAPDH e não com RNA total de tireóide.
Diante de resultados tão conflitantes, é difícil avaliar o verdadeiro valor do mRNA
de Tg. No entanto, realizando uma análise criteriosa da metodologia utilizada pelos
diversos grupos observa-se uma enorme variedade de protocolos, o que certamente
justifica a discrepância entre os resultados. Em relação ao processamento da amostra
de sangue, observa-se variação quanto a: 1) tipo de tubo em que a amostra é coletada
(com heparina, citrato, EDTA ou diretamente no tubo de extração contendo substância
estabilizadora de RNA), 2) volume de sangue utilizado (0,3 a 10 mL), 3) separação de
28
camadas celulares por gradiente ou utilização de sangue total, 4) Kit de extração de
RNA (6 diferentes kits utilizados) e 5) tratamento ou não do RNA extraído com DNAse
(Tabela 2). Estudo de determinação de carga viral em pacientes infectados pelo HIV
demonstrou variação significativa de acordo com o tubo utilizado: o nível de RNA viral
no plasma coletado em tubo contendo EDTA foi, em média, 14% e 31% mais elevado
que no tubo com citrato e heparina, respectivamente (Dickover e cols, 1998). Eszlinger
e cols (2002), estudando pacientes com CDT, comparou a eficácia de extração de
vários métodos (tubos com citrato ou EDTA, separação ou não de camada
mononuclear e processamento imediato, 24 horas ou 48 horas após a coleta) e concluiu
que a utilização de tubos com citrato com subseqüente separação da camada
mononuclear e extração imediata garantem um melhor resultado. Entretanto, não foi
comparada esta metodologia com um dos métodos de extração mais utilizados
(amostra de sangue adicionada diretamente em tubo estéril contendo substância
estabilizadora de RNA).
Os diversos estudos também divergem quanto à metodologia de RT-PCR: 1)
quantidade de RNA total utilizado para a síntese de cDNA (1,0 ng a 11,5µg), 2)
quantidade de cDNA empregada para realização da PCR, 3) seqüência de
oligonucleotídeos iniciadores escolhida, 4) tipo de amplificação (PCR qualitativo,
nested, semiquantitativo, quantitativo) e 5) número de ciclos (Tabela 2).
Com relação ao número de ciclos, Bojunga e cols (2000) compararam 2 métodos
com sensibilidades distintas, o primeiro utilizando PCR com 30 ciclos (com capacidade
de detectar 50 a 100 células expressando mRNA de Tg) e o segundo com 40 ciclos
(com capacidade de 20 a 30 células). Foi extraído RNA total de vários tecidos e de
29
sangue de indivíduos com CDT (com e sem metástase), doença benigna tireoideana e
voluntários normais. Após 30 ciclos de amplificação, o mRNA de Tg foi encontrado no
sangue de 9 dos 13 pacientes (69,2%) com metástase. Com aumento para 40 ciclos,
observou-se incremento da sensibilidade, detectando em 11 destes 13 pacientes;
entretanto, houve perda da especificidade, com detecção do mRNA da Tg em várias
amostras de tecido não-tireoideano, como timo, supra-renal, hipófise, pulmão, testículo
e apêndice.
Da mesma forma que se acreditava que a expressão do mRNA do receptor de
TSH era exclusiva do tireócito e hoje se sabe que é encontrado também em adipócitos
e linfócitos (Francis e cols, 1991; Endo e cols, 1995), pode ser que o mRNA da Tg
também seja expresso por outras células, fenômeno denominado de transcrição
ilegítima.
Gupta e cols (2002) investigaram a especificidade de diferentes pares de
seqüências de oligonucleotídeos iniciadores (primers) em amplificar o mRNA de Tg e
do receptor de TSH (TSHR) em sangue de indivíduos normais e em amostra de câncer
de tireóide. Para isto foram escolhidos 4 pares de primers de TSHR e 3 pares de Tg já
descritos previamente na literatura (Ditkoff e cols, 1996; Arturi e cols, 1997; Ringel e
cols, 1998). Foi observado que todos os primers de TSHR e de Tg formam capazes de
amplificar os respectivos mRNAs extraídos a partir de tecido. Quando os experimentos
foram realizados com RNA extraído a partir de sangue (camada de células
mononucleares), somente 1 par de primer de TSHR e 1 de Tg não amplificou. Estes
resultados sugerem que células sanguíneas talvez possam expressar estes mRNAs.
Entretanto, é provável que o processamento pós-transcripcional (splicing) seja distinto
30
nas células tireoideanas e não-tireoideanas e que a seleção do primer possa determinar
maior especificidade ao método.
TABELA 2: Diferença da metodologia empregada para amplificação de mRNA de
tireoglobulina
Variáveis Diferenças de Protocolo
Tubo para coleta de sangue Heparinizado14;35;47; contendo citrato 37;
EDTA29;32;33;34;37;38;41;45;47; ou diretamente em
tubo contendo substância estabilizadora de
RNA13;15;30;31;43;44;46
Volume de sangue 1,031;44 a 10mL14;35
Preparo do sangue para extração Separação por gradiente de camadas
celulares14;32;33;35;38;41;47 ou extração a partir de
sangue total13;15;29;30;31;37;43;44;45;46
Kit de extração de RNA TRIzol14;15;30;31;34;35;41;43;44;47; RNA STAT 6013;
PUREscript29;33;45;46; Rneasy blood32;34;38;
QIAmp RNA blood37; PAXgene blood RNA48
Amplificação de DNA genômico ou
RNA
Tratamento do RNA com DNAse; uso de
primers em exons distintos
Quantidade de RNA 1,0ng47 a 11,5µg37
Seqüência de oligonucleotídeos
iniciadores
Escolha de primers localizados em diversas
regiões do gene de tireoglobulina, englobando
ou não áreas sujeitas a splicing alternativo.
Tipo de amplificação PCR qualitativo13;14;15;38;41;44;45; nested
PCR31;32;47; PCR semi-quantitativo34; PCR
quantitativo29;30;33;35;37;43;46;48
Número de ciclos 3014;38;41 a 35+3532
Baseado nos artigos publicados de 1996 a 2004. Ver referências no artigo em anexo.
31
Splicing alternativo do mRNA de Tg pode afetar não somente a especificidade,
como também a sensibilidade, especialmente se a sequência de oligonucleotídeos
empregada for direcionada para áreas sabidamente de risco de splicing. A possibilidade
de resultado falso negativo decorrente de splicing alternativo foi avaliada por Savagner
e cols (2002). Para estimar o risco de erro na medida do mRNA de Tg, foi calculada a
percentagem de uma das formas variantes do mRNA, comparando com o total de
mRNA de Tg em células tireoideanas circulantes. Cerca de 20% dos pacientes
avaliados apresentaram este splicing alternativo, correspondendo a até 33% do valor
total.
Mais recentemente, foram estudados 36 pacientes com CDT em aparente
remissão e com anticorpo anti-Tg negativo (Fugazzola e cols, 2002). Foram dosados Tg
sérica por 2 métodos com sensibilidade de 0,9 µg/L e 0,1 µg/L (Tg altamente sensível),
além do mRNA de Tg, antes e após a administração de TSH recombinante. Foi
avaliado o grau de concordância entre estes exames e a avaliação clínica (USG
cervical, PCI, Tg altamente sensível após TSH recombinante). A Tg com sensibilidade
de 0,9 µg/L apresentou concordância de 53% no basal e 55% após estimulação com
TSH. O RNA concordou com a avaliação clínica em 66% no basal e pós-estimulação.
Neste estudo, as condições da RT-PCR foram otimizadas para evitar transcrição
ilegítima. Foi primeiramente estabelecida a quantidade de cDNA oriundo de células
K562 (células de leucemia mielóide crônica) que não determina amplificação de Tg.
Com base neste dado, foi posteriormente feita padronização para as amostras de
sangue dos pacientes. Nestas condições, não foi observada amplificação de mRNA de
32
Tg no paciente com agenesia tireoideana. Desta forma, o emprego de uma metodologia
que diminua o risco de interferência da transcrição ilegítima talvez possa ser útil.
Apesar da possibilidade de baixa especificidade por transcrição ilegítima da Tg
ou por variantes de Tg em células não tireoideanas, não se pode, até o momento,
afastar a hipótese de alta sensibilidade do método, diagnosticando precocemente a
recidiva. Somente o acompanhamento a longo prazo dos pacientes estudados poderá
definir se aqueles com mRNA detectável apresentam maior risco de recorrência
tumoral. Nos 28 pacientes com CDT estudados por Grammatopoulos e cols (2003) a
identificação de metástases na PCI correlacionou-se melhor com mRNA do que com a
Tg sérica. Cinco destes pacientes foram estudados prospectivamente com coleta de
sangue a cada 2 meses. Quatro mantiveram Tg e mRNA de Tg indetectáveis. No outro
paciente, o mRNA estava presente apesar da Tg indetectável; no entanto, durante o
acompanhamento a Tg sérica elevou-se e a PCI identificou metástases.
Elisei e cols (2004), utilizando metodologia criteriosa (primers selecionados para
evitar formas variantes de Tg e tratamento com DNAse para evitar amplificação
genômica), estudaram 80 pacientes com CDT e 20 indivíduos normais. Foram
encontradas sensibilidade de 82,3% e especificidade de 24,2%. Os 9 pacientes com
RNA detectável, sem outra evidência de doença, foram reavaliados após 4 anos com
dosagem de Tg sérica basal e estimulada, que se manteve indetectável. Desta forma, o
mRNA não foi capaz de predizer a recorrência tumoral, sugerindo falso-positivo. Deve-
se ressaltar, entretanto, o número pequeno de pacientes envolvidos e o curto período
de acompanhamento.
Com base nestes resultados conflitantes (Tabela 3), a amplificação de mRNAs
característicos da tireóide não parece ser, até o momento, superior aos métodos
33
sensíveis de dosagem de Tg sérica já existentes. Entretanto, como muitos estudos
sugerem correlação entre mRNA e estadiamento tumoral, é possível que o
desenvolvimento de metodologia criteriosa, evitando a interferência gerada pela
transcrição ilegítima, permita que o mRNA de Tg seja empregado para o subgrupo de
pacientes com CDT e anticorpo anti-Tg.
Tabela 3: Comparação entre os resultados dos principais artigos publicados
Autor / ano Detecção nos
controles
Detecção na
doença benigna*
Detecção no CDT
em remissão
Detecção no CDT
metastático
Ditkoff / 1996 0/7 (0%) 0/6 (0%) 7/78 (9,8%) 9/9 (100%)
Ringel / 1998 10/10 (100%) _ 7/35 (20%) 14/14 (100%)
Biscolla / 2000 6/6 (100%) _ 4/20 (20%) 2/3 (66,6%)
Savagner / 2002 10/10 (100%) 12/12 (100%) 3/15 (18%) 10/10 (100%)
Fugazzola/2002 7/7 (100%) 3/3 (100%) 19/25 (76%) _
Denizot / 2003 0/4 (0%) _ 0/8 (0%) 1/7 (14,3%)
Chinnappa/2004 0/51 (0%) 3/27 (11%) 2/31 (6,4%) 8/8 (100%)
* Doença autoimune ou bócio multinodular; -: não avaliado.
34
OBJETIVOS
I. OBJETIVO GERAL
Avaliar a amplificação de mRNA de Tg por RT-PCR como possível marcador
sérico de recorrência do carcinoma da tireóide.
II. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Analisar a capacidade do método desenvolvido em detectar mRNA de Tg em
sangue periférico de indivíduos normais;
- Avaliar sua capacidade de detectar recidiva ou persistência tumoral nos pacientes
com carcinoma da tireóide;
- Comparar a acurácia deste teste com a dosagem de Tg sérica em supressão;
- Acompanhar pacientes com CDT e anticorpo anti-Tg positivo, determinando o valor
da pesquisa de mRNA no acompanhamento destes pacientes;
- Avaliar se a presença do mRNA de Tg é um fator de risco para recidiva;
- Analisar a possibilidade de transcrição ilegítima de mRNA de Tg em modelo de
linfócitos em cultura.
35
PACIENTES E MÉTODOS
I. SELEÇÃO DE PACIENTES
Inicialmente, foram selecionados 10 indivíduos sadios, laboratorialmente
eutireoideanos e com palpação normal da glândula tiróide, para compor o grupo
controle. Amostra de sangue foi coletada para padronização da técnica de extração de
RNA e de RT-PCR. Posteriormente, pacientes com diagnóstico histológico de
carcinoma tireoideano (papilífero, folicular ou pouco diferenciado) foram convocados e
classificados em 2 grupos de acordo com o status de doença:
- Pacientes tratados (tireoidectomia subtotal associada à ablação do remanescente
tireoideano com radioiodo, ou tireoidectomia total ou subtotal alargada associada ou
não à ablação com radioiodo) sem doença residual conhecida e com última Tg
sérica em supressão < 1ng/mL;
- Pacientes tratados, porém sem critério de cura, isto é, com metástases à distância
ou doença cervical conhecida.
Não foram incluídos neste estudo pacientes com grandes remanescentes cervicais,
isto é, pacientes submetidos à cirurgia conservadora (lobectomia associada a
istmectomia ou tireoidectomia subtotal) sem ablação do remanescente. Pacientes com
carcinoma anaplásico também foram excluídos.
Os pacientes selecionados foram classificados de acordo com a 5ª edição de
estadiamento tumoral definido pela International Union Against Cancer (UICC), que
36
baseia-se na extensão do tumor primário (T), acometimento de linfonodos (N), presença
de metástases à distância (M) e a idade ao diagnóstico (Hermanek e Sobin, 1992).
II. AVALIAÇÃO CLÍNICA E LABORATORIAL
Amostra de 10 mL de sangue dos pacientes com carcinoma tireoideano foi obtida
para amplificação do mRNA de Tg. A determinação da Tg sérica, TSH e anticorpo anti-
Tg foi realizada no mesmo momento. A dosagem da Tg foi realizada por
quimioluminescência, com sensibilidade analítica de 0,2 ng/mL, funcional de 0,9 ng/mL,
variação interensaio de até 8,8% e intraensaio inferior a 6% para valores superiores a
2ng/mL. O TSH foi dosado por ensaio de 3ª geração, por quimioluminescência, com
faixa de normalidade entre 0,4 e 4,0 µUI/mL. O anticorpo anti-Tg foi dosado por
quimioluminescência, com sensibilidade analítica de 10 IU/mL, funcional de 20 UI/mL
variação interensaio de até 9,1% e intraensaio inferior a 3,9 %.
III. EXTRAÇÃO DE RNA
Para a extração do RNA total a partir de amostra de sangue (Figura1) foi utilizada
solução monofásica contendo fenol e guanidina isotiocianeto (Trizol®, GibcoBRL, NY,
EUA), seguindo protocolo previamente descrito (Chomczynski e cols, 1987). Amostra de
3 mL de sangue é imediatamente colocada em tubo estéril contendo 9 mL de Trizol®. A
homogeneização é realizada pipetando-se repetidamente o material, o que determina
37
lise celular, porém mantendo o RNA íntegro. Adiciona-se 1,8 mL de clorofórmio e
depois centrifuga-se (12.000 x g, 15 min, 4ºC) para separar a fase aquosa e a fase
orgânica. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa e esta é transferida para
outro tubo contendo 4,5 mL de isopropanol, responsável pela precipitação do RNA.
Após incubação à temperatura ambiente por 10 min, realiza-se nova centrifugação
(12.000 x g, 10 min, 4ºC). Despreza-se o sobrenadante e adiciona-se 9 mL de etanol a
75% para lavagem do precipitado. Em seguida, centrifuga-se a 10.000 x g por 5 min. O
precipitado é ressuspenso em 30 µL de água livre de RNAse, isto é, água tratada com
dietilpirocarboneto – DEPC (Sigma, MO, EUA).
38
FIGURA 1: Esquema de extração de RNA
Etapas da extração de RNA total a partir de amostra de sangue, utilizando TRIzol.
O RNA total extraído é quantificado através da leitura em espectrofotômetro (Hitachi,
U 3000). A absorbância é medida a 260 e 280 nm de comprimento de onda. A
quantidade total de RNA na amostra é calculada através da seguinte equação:
RNA (µg/µL) = Absorbância a 260 nm x fator de diluição da amostra x 40 /1000
3ml de sangue+
9ml de TRIzol®
Centrifugação(12000 x g, 4°C, 15min) Transferência
da fase aquosa
4,5 ml de isopropanolCentrifugação(12000 x g, 4°C, 10min)
Lavagem com etanol 75%10000 x g, 4°C, 5min Ressuspensão do pellet em 30µl de água DEPC
Homogeneização+
1,8 ml de clorofórmio
39
Para a verificação da pureza do RNA extraído calcula-se a razão entre a
absorbância medida a 260 nm e a 280 nm. Valor entre 1,5 e 2,0 indica grau de pureza
satisfatória.
Este método de extração de RNA fornece em média 30 a 60 µg de RNA total por
amostra de 3 mL de sangue.
IV. SÍNTESE DE cDNA (TRANSCRIÇÃO REVERSA)
Para a síntese de fita simples de DNA complementar (cDNA), são utilizados 4 µg de
RNA total.
O RNA é incubado com 0,5 µg de oligonucleotídeo dT (Pharmacia Biotech, NJ,
EUA) e 10 µL de água DEPC a 70ºC por 10 min para hibridização com a cauda poli A
do mRNA. Posteriormente, pipeta-se 4 µL do tampão 5x first strand (Tris-HCl a 250 mM,
pH 8,3; KCl a 375 mM e MgCl2 a 25mM), 2 µL de DTT (ditiotreitol) a 100 mM
(GibcoBRL, NY, EUA), 2,5 U do inibidor de RNAse (RNAsin - GibcoBRL, NY, EUA), 0,5
µL de dNTP (coquetel de nucleotídeos) a 10mM (GibcoBRL, NY, EUA), e 200 U de
transcriptase reversa (Superscript RNAse H Reverse Transcriptase, GibcoBRL, NY,
EUA). Após a adição de todos os reagentes incuba-se à 42ºC por 50 min e
posteriormente inativa-se a reação aquecendo-a a 90ºC por 5 min.
Terminada a reação de transcrição reversa, o cDNA sintetizado é precipitado
adicionando-se 6 µL de acetato de amônia a 7,5 M e 50 µL de etanol absoluto.
Posteriormente, o cDNA é ressuspenso em 10 µL de água MilliQ.
40
V. AMPLIFICAÇÃO ATRAVÉS DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE
Após a obtenção do cDNA, através da etapa de transcrição reversa, realiza-se a
amplificação através de reação em cadeia de polimerase (PCR) do fragmento de cDNA
correspondente ao mRNA da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH). Esta
enzima é amplamente expressa em células sangüíneas, sendo útil para verificar a
integridade do RNA extraído e a qualidade do cDNA sintetizado (controle interno).
Para prevenir a amplificação do DNA genômico residual, os oligonucleotídeos
iniciadores (primers) de GAPDH e Tg selecionados correspondem a seqüências de
nucleotídeos localizados em exons distintos. No caso da Tg, as seqüências estão
localizadas nos exons 2 e 4 separados por introns que juntos contém mais de 2kb
(Figura 2). O par de primer selecionado foi utilizado previamente por Ringel e cols
(1998).
FIGURA 2: Características dos oligunucleotídeos iniciadores
Tg: tireoglobulina; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase.
TGTGAGCTGCAGAGGGAAAACGGCCATACACCTCCATCCCCTCTGCGTCCACACA
CTGAGAATGGGAAACTTGTGGTCACTGTTAAAGTTGGAGG
Gene
Tg
GAPDH
Tamanho
348 bp
656 bp
Seqüência de nucleotídeos
TGTGAGCTGCAGAGGGAAAACGGCCATACACCTCCATCCCCTCTGCGTCCACACA
CTGAGAATGGGAAACTTGTGGTCACTGTTAAAGTTGGAGG
Gene
Tg
GAPDH
Tamanho
348 bp
656 bp
Seqüência de nucleotídeos
41
A reação de amplificação é realizada utilizando-se 25% do volume final de cDNA,
2,5 U de Taq polimerase (GibcoBRL, NY, EUA), 40 pmol de cada primer (sense e anti-
sense), cloreto de magnésio à 1,5 mM (GibcoBRL, NY, EUA), tampão 10 x PCR (Tris-
HCl a 20 mM, pH 8,4; KCl a 500 mM), 0,5 µL de dNTP a 10 mM. As condições de
amplificação são semelhantes para Tg e GAPDH (Figura 3):
- Desnaturação inicial à 94ºC por 4 min;
- 39 ciclos com temperatura de desnaturação de 94ºC por 1 min, temperatura de
anelamento de 60ºC por 1 min e de extensão de 72ºC por 1 min;
- Extensão final à 72ºC por 7 min.
O produto final é visualizado em gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etídio.
Para maior segurança do resultado obtido, a amplificação do mRNA da Tg é realizada
sempre em duplicata (a partir do mesmo cDNA).
Devido ao risco de resultado falso positivo decorrente de contaminação, realiza-se a
reação de amplificação sem adição do cDNA (controle negativo). Além disso, para
avaliar a possibilidade de amplificação a partir do DNA genômico contaminante, é
realizada a reação utilizando “cDNA” sintetizado sem a adição da enzima transcriptase
reversa (RT-).
42
FIGURA 3: Esquema das etapas de RT-PCR
Para síntese de cDNA são utilizados 4µg de RNA total (transcrição reversa –RT). 25% do
volume final do cDNA são utilizados para realização da PCR.
2,5µL de cDNA1,0 µL de primer sense1,0 µL de primer anti-sense2,5 µL de tampão0,75 µL de MgCl20,5 µL de dNTP0,5 µL de Taq polimerase
94ºC por 4 min
39 ciclos
Gel de agarose 1,5 % contendo brometo de etídio
RNA total (4 µg)cDNA (10 µL )RT
94ºC - 1 mindesnaturação
60ºC - 1 minanelamento
72ºC - 1 minextensão
72ºC por 10 minExtensão final
2,5µL de cDNA1,0 µL de primer sense1,0 µL de primer anti-sense2,5 µL de tampão0,75 µL de MgCl20,5 µL de dNTP0,5 µL de Taq polimerase
94ºC por 4 min
39 ciclos
Gel de agarose 1,5 % contendo brometo de etídio
RNA total (4 µg)cDNA (10 µL )RT
94ºC - 1 mindesnaturação
60ºC - 1 minanelamento
72ºC - 1 minextensão
72ºC por 10 minExtensão final
43
VI. REAVALIAÇÃO CLÍNICA
Após a realização da pesquisa do mRNA da Tg, os pacientes sem doença residual
conhecida são submetidos à nova investigação de acordo com o resultado dos exames:
- mRNA da Tg indetectável e Tg sérica < 1ng/mL → repete-se USG cervical;
- mRNA da Tg detectável e/ou Tg sérica ≥ 1ng/mL → repete-se exame de imagem
(USG cervical), PCI com 131I e Tg sérica em hipotireoidismo.
A PCI é realizada administrando-se 5 mCi de 131I via oral e após 72 horas avalia-se
a captação do radiofármaco através da gama câmara. Caso esta investigação
identifique recidiva tumoral, os pacientes serão encaminhados para tratamento
específico, isto é, cirurgia e/ou radioiodoterapia (Figura 4). Três meses após o
tratamento, nova amostra de sangue é coleta para extração de RNA e dosagem de Tg
sérica, TSH e anticorpo anti-Tg.
Após esta avaliação inicial, os pacientes são mantidos em acompanhamento com
dosagem semestral de Tg sérica em supressão e USG cervical anual. TC de tórax, TC
da região cervical, PCI e Tg sérica estimulada são reservadas para os casos com
suspeita de recidiva. Ao final do acompanhamento, os pacientes são classificados de
acordo com o resultado destes exames como livres de doença (Tg sérica em supressão
de TSH < 1ng/mL, Tg sérica em hipotireoidismo < 2ng/mL, USG, TC e PCI normais) ou
não.
44
FIGURA 4: Fluxograma do acompanhamento dos pacientes
Classificação dos pacientes com carcinoma tireoideano quanto à persistência tumoral e
esquema de avaliação de acordo com a pesquisa do mRNA de tireoglobulina (Tg).
Pacientes comcarcinoma tireoideano
Doença residual conhecida Sem doença residual conhecida
Pesquisa de mRNA Pesquisa de mRNA
Detectável Indetectável
USG cervical, PCI eTg sérica em hipotireoidismo
USG cervical
Confirmação de recidiva tumoral
Tratamento específico
Após 3 meses
Pesquisa de mRNA
Pacientes comcarcinoma tireoideano
Pacientes comcarcinoma tireoideano
Doença residual conhecida Sem doença residual conhecida
Pesquisa de mRNA Pesquisa de mRNA
Detectável Indetectável
USG cervical, PCI eTg sérica em hipotireoidismo
USG cervical
Confirmação de recidiva tumoral
Tratamento específico
Após 3 meses
Pesquisa de mRNA
45
VII. ESTUDO DA EXPRESSÃO DE mRNA DE Tg POR CÉLULAS NÃO
TIREOIDEANAS
Para avaliar a possível interferência da expressão do mRNA de Tg por células
não tireoideanas, foram realizados experimentos com cultura primária de linfócitos.
Para tal, foram coletados 20 mL de sangue de 3 indivíduos normais e de 1 paciente
com CDT em remissão e com mRNA de Tg indetectável, pela técnica descrita
previamente.
Os linfócitos de sangue periférico são obtidos através de centrifugação por
gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (400 x g por 30 minutos em centrífuga clínica).
A fração contendo os linfócitos é lavada três vezes (250 x g por 7 minutos em centrífuga
clínica) e ressuspensa em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino (SFB). O número
de células é contado na câmara de Neubauer e ajustado para 106 células/mL. Os
linfócitos são mantidos em cultura por 24, 48 e 72 horas.
A separação dos linfócitos por gradiente de densidade e a cultura foram
realizadas no Laboratório de Imunologia Tumoral do Instituto de Bioquímica da UFRJ.
Posteriormente, alíquotas contendo aproximadamente 1,5 x 106 células são separadas
para extração de RNA. Realiza-se centrifugação a 3.000 x g por 5 minutos em
temperatura ambiente, sendo desprezado o sobrenadante (contendo meio de cultura).
Sobre o pellet de células é adicionado 0,5 mL de TRIzol e segue-se o protocolo de
extração já descrito, obedecendo à proporção de TRIzol utilizada.
46
Após a extração, o RNA isolado é visualizado em gel de agarose contendo
brometo de etídio para verificação da integridade e, em seguida, quantificado através
da leitura em espectrofotômetro (Hitachi, U 3000).
A quantidade de RNA total extraída por amostra de 1,5 x 106 células variou de 2 a
10 µg, rendimento inferior ao obtido na extração de RNA a partir de sangue total (30,1
µg de RNA por amostra de 3 mL, em média). Desta forma, para a síntese de cDNA foi
utilizada uma quantidade inferior (1 a 2 µg de RNA) à padronizada para sangue (4µg).
As demais condições utilizadas para amplicação do mRNA de Tg através de RT-PCR
foram semelhantes às descritas para amplificação a partir de RNA extraído de sangue
total.
VIII. ANÁLISE ESTATÍSTICA
O teste qui-quadrado foi utilizado para comparar a distribuição de pacientes com
mRNA de Tg detectável entre os diferentes grupos de estadiamento tumoral. O mesmo
teste foi aplicado para comparar o evento recidiva entre os grupos com e sem mRNA de
Tg no sangue.
47
RESULTADOS
I. CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES
Foram avaliados 32 pacientes com carcinoma da tireóide, 27 do sexo feminino e 5
do sexo masculino, com idade ao diagnóstico variando de 18 a 78 anos (média de 43,5
e mediana de 43). De acordo com a histopatologia, 26 foram classificados como
carcinoma papilífero, 5 como carcinoma folicular e 1 como folicular pouco diferenciado
(Tabelas 4 e 5).
Tabela 4: Casuística - Característica dos pacientes com persistência tumoral
Pacientes Sexo Idade ao
diagnóstico
Histologia Estadiamento Cirurgia Dose
cumulativa131I
Tempo de
seguimento
Doença
atual
1.1 Fem 62 anos P T4N0M0 (III) T 400 mCi 7 anos RC
2.1 Fem 40 anos P T2N1aM1 (II) T + EG 400 mCi 6 anos MP
3.1 Masc 43 anos P T4N1bM1 (II) T 400 mCi 3 anos RC+MP
4.1 Fem 54 anos P T4N1aM0 (III) STA 100 mCi 19 anos RC+MP
5.1 Fem 29 anos F T4N1bM1 (II) STA 200 mCi 10 anos RC+MP
6.1 Fem 56 anos F T3N0M0 (II) T 400 mCi 20 anos MO
7.1 Fem 49 anos FPD T4N1aM1 (IV) T 250 mCi 3 anos RC+MP
Fem: sexo feminino; Masc: sexo masculino; P: carcinoma papilífero; F: carcinoma folicular; FPD: carcinoma
folicular pouco diferenciado; T: tireoidectomia total; STA: tireoidectomia subtotal alargada; EG: esvaziamento
ganglionar; RC: remanescente cervival tumoral; MP: metástases pulmonares: MO: metástases ósseas.
48
Tabela 5: Casuística - Característica dos pacientes com Tg sérica prévia < 1ng/mL
em supressão
Pacientes Sexo Idade ao
diagnóstico
Histologia Estadiamento Cirurgia Dose
cumulativa 131I
Tempo de
seguimento
Doença
atual
1.2 Fem 18 anos P T2N0M0 (I) T 100 mCi 6 anos remissão
2.2 Fem 50 anos P TxN0M0 T 100 mCi 6 meses remissão
3.2 Masc 25 anos P TxN0M0 (I) T 100 mCi 1 ano e 1/2 remissão
4.2 Masc 42 anos P TxN0M0 (I) T 30 mCi 4 meses remissão
5.2 Fem 43 anos F TxNxM1 (II) T 100 mCi 5 anos remissão
6.2 Fem 41 anos P TxN0M0 (I) T 100 mCi 10 anos remissão
7.2 Fem 49 anos P T1N0M0 (I) T 100 mCi 2 anos remissão
8.2 Fem 43 anos P T1N0M0 (I) T 100 mCi 1 ano e 1/2 remissão
9.2 Fem 39 anos P T4N0M0 (I) T 350 mCi 5 anos remissão
10.2 Fem 69 anos P TxNxM0 T 100 mCi 8 meses remissão
11.2 Fem 36 anos P T2N0M0 (I) T 100 mCi 4 anos remissão
12.2 Fem 40 anos P T2N0M0 (I) T _ 3 anos RT
13.2 Fem 48 anos P T2N1aM0 (II) T 150 mCi 6 anos remissão
14.2 Fem 24 anos P TxN1aM0 (I) T _ 1 ano RT
15.2 Fem 78 anos P TxN1aM0 (III) T _ 1 ano RT
16.2 Fem 56 anos P TxN0M0 T 100 mCi 4 anos remissão
17.2 Masc 51 anos P T2N1aM0 (II) T 100 mCi 4 anos remissão
18.2 Fem 40 anos P TxN1aM0 (I) T 150 mCi 2 anos remissão
19.2 Fem 24 anos F T2N0M0 (I) T 100 mCi 5 anos remissão
20.2 Fem 27 anos P T2N0M0 (I) T 100 mCi 5 anos remissão
21.2 Fem 26 anos F T3N0M0 (I) ST 100 mCi 3 anos remissão
22.2 Fem 48 anos P T2N0M0 (II) ST 100 mCi 1 ano remissão
23.2 Masc 61 anos P TxN1aM0 (III) T 100 mCi 7 anos remissão
24.2 Fem 56 anos P T2N0M0 (II) T 300 mCi 5 anos remissão
25.2 Fem 26 anos P T1N0M0 (I) T 100 mCi 1 ano remissão
Fem: sexo feminino; Masc: sexo masculino; P: carcinoma papilífero; F: carcinoma folicular; FDP: carcinoma
pouco diferenciado; T: tireoidectomia total; ST: tireoidectomia subtotal; RT: remanescente em leito tireoideano
identificado na cintilografia, com captação de até 3%.
49
Vinte e oito pacientes foram submetidos a tireoidectomia total, 2 a tireoidectomia
subtotal alargada e 2 a apenas subtotal. Todos os pacientes foram tratados com iodo
radioativo, exceto 3 dos 28 submetidos a tireoidectomia total. A dose cumulativa variou
de 30 a 400 mCi de 131I (Tabelas 4 e 5).
Amostra de sangue para pesquisa do mRNA de Tg foi colhida com intervalo mínimo
de 4 e máximo de 240 meses em relação à última intervenção terapêutica.
II. RESULTADOS DA PESQUISA DE mRNA NO GRUPO CONTROLE
Foi realizada padronização da extração de RNA total e da síntese de cDNA,
permitindo amplificação satisfatória do mRNA da GAPDH em todas as amostras de
sangue dos indivíduos normais.
Inicialmente foi tentada amplificação do mRNA de Tg a partir de 1µg de RNA total,
conforme descrito previamente por Ringel e cols (1998). Entretanto, nestas condições
não foi observada amplificação do mRNA de Tg no sangue de voluntários normais,
somente amplificação do mRNA da GAPDH. Conseqüentemente, foi aumentada de
forma progressiva a quantidade de RNA total, até conseguir a amplificação desejada,
com 4 µg de RNA total (Figura 5).
A reação de amplificação sem adição do cDNA (controle negativo), afastou a
possibilidade de resultado falso-positivo decorrente de contaminação. Além disso, a
reação utilizando “cDNA” sintetizado sem a adição da enzima transcriptase reversa não
50
evidenciou amplificação, afastando a possibilidade de amplificação do gene da Tg a
partir do DNA genômico contaminante.
FIGURA 5: Fragmentos de mRNAs da Tg e GAPDH amplificados através da técnica de
RT-PCR
Eletroforese em gel de agarose a 1,5% do produto de PCR. 1: Amplificação do mRNA de
tireoglobulina (Tg) extraído a partir de tecido tireoideano; 2 e 3: a partir de amostra de sangue
de indivíduo normal, em duplicata; 4: Amplificação do mRNA da gliceraldeído-3-fosfato-
desidrogenase (GAPDH) a partir de amostra de sangue.
Tg Tg Tg GAPDH
348pb
656pb
sanguetecido
1 2 3 4
348pb
656pb
sanguetecido
348pb
656pb
sanguetecido
1 2 3 4
Tg Tg Tg GAPDH
348pb
656pb
sanguetecido
1 2 3 4
348pb
656pb
sanguetecido
348pb
656pb
sanguetecido
1 2 3 4
51
III. RESULTADOS DA PESQUISA DE mRNA NOS PACIENTES
Após a padronização das técnicas de extração de RNA e de RT-PCR, iniciou-se a
pesquisa do mRNA de Tg nos pacientes sem critério de cura, isto é, aqueles com Tg
sérica > 1ng/mL e metástases à distância e/ou doença cervical conhecida. Sete
pacientes preencheram este critério: 1 com lesão tumoral irressecável em região
cervical (paciente 1.1), 1 com metástases pulmonares (paciente 2.1), 1 com metástases
ósseas (paciente 6.1) e 4 com remanescente cervical e doença à distância (pacientes
3.1, 4.1, 5.1, e 7.1). A idade média ao diagnóstico foi de 55,5 anos. De acordo com a
classificação histopatológica, 5 apresentavam carcinoma papilífero, 1 folicular e 1 pouco
diferenciado. Baseado na 5ª edição da UICC para estadiamento do carcinoma da
tireóide, 4 pacientes foram classificados como estágio II, 2 como estágio III e 1 como
estágio IV (Tabela 4).Os exames realizados na mesma amostra de sangue utilizada
para pesquisa do mRNA de Tg demonstraram Tg sérica elevada (variando de 4,1 a
2.287 ng/mL) e anticorpo anti-Tg indetectável em todos os 7 pacientes. O TSH
encontrava-se suprimido (<0,1µUI/mL) em 6 e em 1 paciente o TSH estava dentro da
faixa de normalidade. O mRNA de Tg foi detectado em todas as amostras (Tabela 6),
concordando em 100% com o status de doença.
A PCR realizada sem adicionar o cDNA (controle negativo), não demonstrou
amplificação, afastando a possibilidade de resultado falso-positivo decorrente de
contaminação.
52
Tabela 6: Exames dos pacientes com doença residual conhecida
Pacientes TSH
(0,4 – 4,0 µUI/mL)
Anti-Tg
(< 20 UI/mL)
Tg sérica
(ng/mL)
mRNA
1.1 0,011 < 20 20,6 +
2.1 0,03 < 20 74,8 +
3.1 0,033 < 20 4,1 +
4.1 0,006 < 20 54,3 +
5.1 0,017 < 20 40,1 +
6.1 0,064 < 20 2.287 +
7.1 0,643 < 20 72,5 +
+: mRNA de Tg detectado em amostra de sangue.
Vinte e cinco pacientes com CDT apresentavam a última Tg sérica dosada
previamente ao estudo < 1 ng/mL, durante terapia supressora de TSH. Destes, 22
foram classificados como carcinoma papilífero e 3 como carcinoma folicular. A idade
média ao diagnóstico foi de 42,4 anos. Quanto ao estadiamento tumoral, 15 pacientes
foram classificados como estágio I, 5 como estágio II, 2 como estágio III. Em 3
pacientes não foi possível realizar o estadiamento devido a não definição do tamanho
tumoral pela histopatologia (Tabela 5).
53
Os exames laboratoriais, realizados no mesmo momento da coleta de sangue
para pesquisa do mRNA, evidenciaram TSH abaixo de 0,4 µUI/mL em 20 dos 25
pacientes, sendo que em 18 o valor do TSH era inferior a 0,1 µUI/mL. Nos 5 pacientes
restantes, o TSH encontrava-se acima da normalidade (Tabela 7).
A pesquisa do anticorpo anti-Tg confirmou título superior a 20 UI/mL em 5 casos.
Dos 20 pacientes com anti-Tg indetectável, a Tg sérica encontrava-se abaixo de 1
ng/mL em 19 (sendo indetectável em 18) e em apenas 1 caso a Tg sérica estava acima
de 1 ng/mL (1,6 ng/mL com TSH = 13,2 µUI/mL). Dos 5 pacientes com anti-Tg, a Tg
sérica encontrava-se elevada (2,2 e 2,9 ng/mL) em 2 (Tabela 7).
Do total de 25 pacientes sem persistência ou recidiva tumoral previamente
conhecida, 9 (36%) apresentaram mRNA de Tg detectado no sangue (Figura 6). No
grupo de pacientes com anticorpo anti-Tg, o mRNA foi detectado em 40% (2 de 5
casos) e naqueles com anti-Tg indetectável o mRNA de Tg foi encontrado em 35% (7
de 20 casos). Nos 3 pacientes com Tg sérica acima de 1 ng/mL e nos pacientes não
submetidos à terapia ablativa com radioiodo (pacientes 12.2, 14.2 e 15.2), não foi
observada amplificação do mRNA na amostra de sangue (Tabela 7), indicando que o
mRNA de Tg pode apresentar-se como resultado falso negativo.
54
FIGURA 6: mRNA de Tg no sangue de pacientes em aparente remissão detectado
através da técnica de RT-PCR
Eletroforese em gel de agarose a 1,5% do produto de PCR de 2 pacientes em aparente
remissão. 1:peso molecular; 2 e 3: experimento em duplicata evidenciando ausência de
amplificação do mRNA de Tg no paciente 8.2; 4 e 5: experimento em duplicata evidenciando
amplificação do mRNA de Tg no paciente 25.2.
348pb
600pb
Paciente 8.2 Paciente 25.2
1 2 3 4 5
348pb
600pb
Paciente 8.2 Paciente 25.2
1 2 3 4 51 2 3 4 5
55
Tabela 7: Exames dos pacientes com Tg sérica prévia < 1 ng/mL em supressão
Pacientes TSH
(0,4 – 4,0 µUI/mL)
Anti-Tg
(< 20 UI/mL)
Tg sérica
(ng/mL)
mRNA
1.2 0,016 < 20 < 0,2 -
2.2 40,7 < 20 < 0,2 -
3.2 0,081 < 20 < 0,2 -
4.2 0,04 < 20 < 0,2 -
5.2 0,032 < 20 < 0,2 -
6.2 0,03 < 20 < 0,2 -
7.2 0,02 < 20 < 0,2 -
8.2 0,038 < 20 < 0,2 -
9.2 0,035 < 20 < 0,2 -
10.2 0,04 < 20 < 0,2 -
11.2 0,01 < 20 < 0,2 -
12.2 6,36 < 20 < 0,2 -
13.2 13,2 < 20 1,6 -
14.2 0,072 65 2,9 -
15.2 0,311 380 2,2 -
16.2 0,09 591 < 0,2 -
17.2 0,004 1142 < 0,2 +
18.2 11,2 287 < 0,2 +
19.2 43,8 < 20 0,7 +
20.2 0,002 < 20 < 0,2 +
21.2 0,024 < 20 < 0,2 +
22.2 0,034 < 20 < 0,2 +
23.2 0,002 < 20 < 0,2 +
24.2 0,08 < 20 < 0,2 +
25.2 0,004 < 20 < 0,2 +
-: mRNA de Tg indetectável; +: mRNA de Tg detectável em amostra de sangue.
56
A reavaliação dos pacientes com anticorpo, Tg sérica e mRNA indetectáveis foi
possível em 11 dos 12 casos (pacientes 1.2 – 12.2). Um paciente não retornou ao
HUCFF para realização de exames (paciente 10.2). Foi observada concordância entre o
resultado do teste do mRNA da Tg e a investigação clínica (Tg sérica em supressão e
USG cervical) em 90,9 % dos casos (10 de 11). A paciente 5.2 foi submetida à
avaliação mais detalhada (Tg sérica estimulada, PCI e TC de tórax) devido ao histórico
de metástases à distância. Esta investigação confirmou a remissão da doença.
Nos 13 pacientes com anticorpo anti-Tg, Tg sérica e/ou mRNA detectável
(pacientes 13.2 – 25.2), a investigação clínica com Tg sérica em hipotireoidismo, PCI,
USG cervical e TC de tórax demonstrou recidiva tumoral em 2 casos. No primeiro
(paciente 23.2), o mRNA estava presente no sangue, a Tg sérica em supressão foi
indetectável, a PCI não evidenciou captação anormal e a Tg estimulada foi inferior a 2
ng/mL (0,9 ng/mL). Entretanto, a USG cervical demonstrou 2 linfonodos suspeitos com
calcificação e a citologia do material obtido pela punção aspirtiva por agulha fina
(PAAF) confirmou metástases ganglionares. O paciente foi encaminhado à cirurgia e
posteriormente à radioioterapia (150 mCi de 131I). No segundo caso, o mRNA também
foi detectado no sangue, a Tg sérica em supressão de TSH foi indetectável, a PCI, a
USG cervical e a TC de tórax sem anormalidades, porém a Tg sérica elevou-se para 19
ng/mL quando induzido o hipotireoidismo. Esta paciente foi tratada com 1mg/kg/dia de
isotretinoína (via oral) por 5 semanas e a seguir submetida à radioioterapia (100 mCi de
131I). A PCI realizada 7 dias após a dose terapêutica evidenciou captação cervical
anterior. A isotretinoína foi utilizada com o objetivo de aumentar a captação tumoral de
iodo, como já demonstrado em estudo prévio (Coelho e cols, 2004; Coelho e cols,
2005).
57
Tabela 8: Concordância entre mRNA e investigação clínica
Pacientes mRNA Tg em
supressão
Anti-Tg
(< 20 UI/mL)
USG TC tórax PCI Tg em
hipotireoidismo
Concordância
1.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
2.2 - < 0,2* < 20 negativa X X X sim
3.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
4.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
5.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
6.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
7.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
8.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
9.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
10.2 - < 0,2 < 20 X X X X sim
11.2 - < 0,2 < 20 negativa X X X sim
12.2 - < 0,2** < 20 Leito tir X X X não
13.2 - 1,6** < 20 negativa X negativa 1,9 sim
14.2 - 2,9 65 Leito tir X cervical 12 não
15.2 - 2,2 380 linfonodo X X X não
16.2 - < 0,2 591 negativa normal negativa < 0,2 sim
17.2 + < 0,2 1142 negativa normal negativa < 0,2 não
18.2 + < 0,2* 287 negativa normal negativa < 0,2 não
19.2 + 0,7* < 20 negativa X negativa 1,03 não
20.2 + < 0,2 < 20 negativa X negativa < 0,2 não
21.2 + < 0,2 < 20 negativa normal negativa < 0,2 não
22.2 + < 0,2 < 20 negativa normal negativa < 0,2 não
23.2 + < 0,2 < 20 linfonodo normal negativa 0,9 sim
24.2 + < 0,2 < 20 negativa normal negativa 19 sim
25.2 + < 0,2 < 20 negativa normal negativa < 0,2 não
-: mRNA de Tg não detectado no sangue; +: mRNA detectado; Tg*: Tg sérica dosada com TSH acima da
faixa de normalidade (porém não superior a 14 µUI/mL) ; Tg**: Tg sérica dosada em hipotireoidismo (TSH >
30 µUI/mL); X: exame não realizado.
58
Neste grupo de 13 pacientes com anticorpo anti-Tg, Tg sérica e/ou mRNA
detectável, a concordância entre a investigação clínica e o mRNA de Tg foi de 23,1% (3
de 13). Somente 1 paciente (15.2) não foi submetido à avaliação completa, em virtude
do diagnóstico de leucemia linfocítica crônica na mesma ocasião (Tabela 8).
Para avaliar a qualidade dos testes diagnósticos (cálculo de sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo) foram excluídos 2
pacientes: 10.2 (não realizou exames complementares) e 13.2 (Tg sérica dosada sem
supressão do TSH). Desta forma, considerando todos os 30 pacientes avaliados, o
mRNA de Tg foi detectado em 16. A concordância entre a presença do mRNA e a
confirmação da recidiva ou persistência tumoral através dos exames realizados ocorreu
em 9 dos 16 pacientes com mRNA de Tg (valor preditivo positivo de 56,25%). Dos 14
pacientes com mRNA não detectável, 11 estavam realmente livres de doença de
acordo com a reavaliação, correspondendo a um valor preditivo negativo de 78,6%
(Tabela 9).
Tabela 9: Comparação da sensibilidade e especificidade entre os testes de mRNA de
Tg e Tg sérica em supressão
Teste Sensibilidade Especificidade VPP VPN
mRNA de Tg* 75% 61,1% 56,2% 78,6%
Tg sérica
em supressão* 75% 100% 100% 85,7%
*: total de 30 pacientes analisados (foram excluídos os pacientes 10.2 e 13.2); VPP: Valor
preditivo positivo; VPN: Valor preditivo negativo.
Padrão ouro considerado: conjunto de exames disponíveis (Tg sérica em supressão, em
hipotireoidismo, PCI, USG cervical, TC de tórax).
59
Do total de 12 pacientes que ao final da investigação foi confirmada doença, 9
apresentaram mRNA de Tg detectado no sangue (Figura 7), conferindo uma
sensibilidade ao teste de 75%. Dentre os 18 pacientes sem confirmação de recidiva
tumoral, 11 tinham mRNA de Tg indetectável, o que corresponde a uma especificidade
de 61,1% (Tabela 9). Para o cálculo da acurácia da Tg sérica em supressão foi
considerado o valor de corte de 1 ng/mL. A sensibilidade da Tg sérica foi semelhante a
do mRNA de Tg (75%), porém a especificidade foi bastante superior (100%). O valor
preditivo negativo da Tg sérica em supressão (85,7%) também foi superior ao do mRNA
de Tg (78,6%), porém inferior ao da Tg sérica em hipotireoidismo (91,7%). Para avaliar
a qualidade do teste da Tg sérica em hipotireoidismo, foram considerados os 14
pacientes em que a dosagem foi realizada.
60
Figura 7
61
Ao avaliar o estadiamento tumoral, observa-se que em 33,3% dos pacientes em
estágio I (5 de 15), 77,8% dos pacientes em estágio II (7 de 9), 80% em estágio III ou IV
(4 de 5, sendo 1 paciente em estágio IV) o mRNA da Tg estava presente no sangue
(Figura 8). Apesar da aparente tendência de aumento da detecção do mRNA de Tg nos
estágios mais avançados de doença, não houve diferença estatística entre os grupos (p
> 0,25). Entretanto, foi observada diferença significativa quando comparado o grupo de
pacientes em estágio I com os pacientes em estágios não-I (p < 0,005).
Figura 8: Percentual de pacientes com mRNA de Tg detectável de acordo com o
estadiamento tumoral
Estadiamento tumoral segundo a 5ª edição da UICC.
0
20
40
60
80
100
I II III e IV
Estadiamento tumoral
% d
e m
RN
A +
62
IV. RESULTADO DO ACOMPANHAMENTO DOS PACIENTES
Durante o acompanhamento dos pacientes com carcinoma da tireóide avançado
(1.1 – 7.1), 1 foi reoperado e submetido à radioioterapia (paciente 1.1), 3 foram
retratados com radioiodo e posteriormente radio- e/ou quimioterapia (pacientes 3.1, 4.1
e 7.1) e 3 foram sumetidos à radioiodoterapia somente (2.1, 5.1 e 6.1). Alguns destes
pacientes fizeram parte do protocolo de tratamento com isotretinoína (Coelho e cols,
2004). Apesar da terapia combinada, 2 pacientes evoluiram para o óbito (3.1 e 7.1) e os
demais permanecem com Tg sérica elevada, mesmo em supressão.
Nos 2 casos em que a detecção do mRNA de Tg auxiliou no diagnóstico de recidiva,
a avaliação 3 meses após o tratamento foi negativa no paciente 23.2, porém o mRNA
de Tg permaneceu detectável no outro (paciente 24.2).
Do grupo de 25 pacientes considerados inicialmente em aparente remissão
(pacientes 1.2 – 25.2), 18 permaneceram em acompanhamento por pelo menos 1 ano
após a coleta de sangue para pesquisa do mRNA de Tg. Dentre os 16 pacientes com
mRNA de Tg indetectável, 12 foram acompanhados por este período (Tabela 10). Dos 3
pacientes com anticorpo anti-Tg detectável, porém mRNA de Tg indetectável, 1
(paciente 14.2) foi submetido à ablação de remanescente cervical com 100 mCi de 131I,
com posterior normalização dos níveis de Tg sérica e anticorpo. Os outros 2 pacientes
não foram submetidos a tratamento adicional de imediato. Destes, um apresentou
diminuição progressiva do título do anticorpo (paciente 15.2) e o outro evolui com
recidiva cervical diagnosticada através da USG (paciente 16.2).
Entre os pacientes com anti-Tg e mRNA de Tg indetectáveis, um paciente evoluiu
com recidiva tumoral (paciente 9.2) ao final do segundo ano de acompanhamento. A
63
USG cervical detectou linfonodo suspeito, a PCI evidenciou captação cervical e a Tg
sérica em hipotireoidismo foi de 0,67 ng/mL. O paciente foi reencaminhado à cirurgia.
Nos demais pacientes, a Tg em supressão manteve-se indetectável e a USG cervical
sem anormalidades. Desta forma, a taxa de recidiva tumoral no grupo de pacientes com
mRNA negativo foi de 18,18% (2 de 11), sendo excluído do cálculo a paciente que foi
retratada durante o período de acompanhamento (paciente 14.2).
No grupo de 7 pacientes (Tabela 11) com mRNA presente no sangue, porém com
investigação clínica negativa, 2 apresentavam anticorpo anti-Tg. Destes, 1 (paciente
18.2) manteve título elevado apesar de re-tratamento com iodo radioativo (100 mCi de
131I), porém sem outra evidência de recidiva ou persistência tumoral. O outro paciente
(17.2), após o segundo ano de acompanhamento, evoluiu com recidiva em linfonodo
cervical, identificada pela USG. Dos 5 pacientes sem anticorpo anti-Tg, 4
permanecerem em acompanhamento e encontram-se livres de doença. Desta forma, a
taxa de recidiva no grupo de pacientes com mRNA de Tg detectável foi de 16,67% (1
de 6), não diferindo do grupo com mRNA indetectável (p > 0,75).
64
Tabela 10
65
Tabela 11
66
V. RESULTADO DO ESTUDO DA EXPRESSÃO DE mRNA DE Tg EM
LINFÓCITOS
Foi observada amplificação do mRNA de Tg a partir dos linfócitos em cultura
extraídos de 3 indivíduos normais e do paciente com CDT em remissão e com mRNA
de Tg indetectável extraído de sangue total (Figura 9). A amplificação foi observada
independente do tempo de cultura (24, 48, ou 72 horas).
Figura 9: Resultado da extração de RNA e RT-PCR de linfócitos
Eletroforese em gel de agarose a 1,5%: 1) RNA total extraído de 3 amostras de linfócitos; 2)
amplificação de fragmento do mRNA da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH); 3)
amplificação de fragmento do mRNA de tireoglobulina (Tg).
1
2
3
1
2
3
67
DISCUSSÃO
Os objetivos do acompanhamento dos pacientes com CDT são avaliar possível
recidiva ou persistência tumoral e manter terapia de reposição de levotiroxina
adequada. Como o prognóstico dos pacientes que apresentam persistência ou recidiva
do câncer depende, pelo menos em parte, do tamanho da massa tumoral
(Schlumberger e cols, 1986; Lin e cols, 2004), quanto mais precoce o diagnóstico,
melhor a resposta ao tratamento (Schlumberger e cols, 1996). Desta forma, os testes
utilizados no monitoramento dos pacientes com CDT devem apresentar alta
sensibilidade. No entanto, é fundamental também utilizar exames com boa
especificidade, uma vez que a suspeita da recidiva deverá ser confirmada, o que
implica em custo e estresse ao paciente. Além disso, o re-tratamento, seja cirúrgico ou
com radioiodo, não está isento de riscos.
Tradicionalmente, os pacientes com CDT eram acompanhados com palpação do
leito tireoideano e das cadeias de linfonodos cervicais, dosagem seriada da Tg sérica e
PCI. A USG cervical era reservada para os pacientes com suspeita clínica de recidiva e
naqueles classificados como alto risco de recorrência (Schlumberger, 1998). No
entanto, a USG vem demonstrando importante papel no diagnóstico de recidiva local,
pois apresenta alta sensibilidade, além de guiar a punção de lesões suspeitas
(Frasoldati e cols, 2003; Torlontano e cols, 2004). Um dos pacientes deste estudo em
que o mRNA de Tg foi detectado (paciente 23.2), a investigação com PCI diagnóstica e
dosagem de Tg sérica em supressão e em hipotireoidismo não conseguiu definir a
68
recidiva. Entretanto, a USG cervical evidenciou linfonodos suspeitos e guiou a punção,
confirmando a metástase por exame citopatológico.
Nos últimos anos, o papel da PCI diagnóstica (realizada com 2 a 5 mCi de 131I)
para o acompanhamento dos pacientes com CDT vem sendo questionado. Estudos têm
demonstrado que este exame apresenta baixa sensibilidade (Pacini e cols, 2003;
Mazzaferri e cols; 2003;Torlontano e cols, 2004). No entanto, a PCI realizada após dose
terapêutica apresenta alta sensibilidade, sendo de grande importância, especialmente
nos pacientes com Tg sérica elevada, porém sem outra evidência de lesão (Pacini e
cols, 1987; Kamel e cols, 2004). No presente estudo, a Tg sérica em supressão de
TSH, a PCI diagnóstica e a USG cervical não foram capazes de evidenciar doença em
um dos pacientes com mRNA de Tg presente no sangue (paciente 24.2). Já a Tg sérica
estimulada concordou com a presença do mRNA de Tg, e a PCI após dose terapêutica
definiu a recidiva em leito tireoideano.
Em pacientes classificados como baixo risco de recidiva, após a confirmação do
sucesso do tratamento ablativo, o acompanhamento com Tg sérica em supressão
associada a USG cervical parece ser bastante satisfatório (Torlontano e cols, 2004). A
combinação de Tg sérica indetectável durante supressão de TSH e USG negativa
apresentou alto valor preditivo negativo (99,1%), no estudo realizado por Rosário e cols
(2005). Baseado nestas evidências, no presente trabalho, optou-se por reavaliar os
pacientes em que o mRNA de Tg encontrava-se indetectável com USG cervical e
dosagem da Tg sérica em supressão de TSH. Reservou-se a dosagem de Tg sérica
estimulada (através de hipotireoidismo induzido) e exame de imagem da região torácica
para os pacientes com mRNA de Tg presente no sangue ou com história prévia de
metástases à distância.
69
Dentre todos os exames de monitoramento do paciente com câncer, a dosagem
da Tg sérica é o mais utilizado e com melhor acurácia. A Tg sérica menor ou igual a 2
ng/mL dosada sob estímulo de TSH recombinante apresenta alto valor preditivo
negativo (Robbins e cols, 2002; Mazzaferri e cols, 2003). Nos 14 pacientes avaliados
durante a indução do hipotireoidismo, a Tg sérica foi superior a 2 ng/mL em 2 casos e
recidiva tumoral foi confirmada em 3. O valor preditivo negativo foi de 91,7%,
semelhante ao valor encontrado por Robbins e cols (2002).
As desvantagens, no entanto, da dosagem da Tg sérica são a dependência da
estimulação do TSH para melhorar a sensibilidade e a interferência do anticorpo anti-
Tg, causando valores hiper- ou subestimados de Tg sérica. Neste estudo, 5 pacientes
apresentaram anti-Tg detectado no sangue. O único paciente que apresentou
normalização do título do anticorpo foi aquele submetido à ablação com 131I do
remanescente tireoideano ao longo do acompanhamento. Dos 3 pacientes em que não
houve normalização do título do anticorpo, 2 evoluíram com recidiva em linfonodo
cervical diagnosticada através da USG e ambos apresentavam Tg sérica indetectável.
Este achado está de acordo com o conceito da produção de anticorpo depender da
persistência do antígeno no organismo (Chiovato e cols, 2003). Como observado por
outros autores (Spencer e cols, 1998; Chung e cols, 2002), a presença do auto-
anticorpo pode ser um marcador de persistência / recidiva tumoral.
A possibilidade de detecção de células tumorais na corrente sangüínea através de
técnicas de biologia molecular trouxe uma nova perspectiva para os pacientes com
CDT. Acreditou-se inicialmente que este exame permitiria avaliar com alta sensibilidade
os pacientes mesmo em uso de terapia supressora de TSH e, em particular, o subgrupo
70
de pacientes com anticorpo anti-Tg. No entanto, estudos recentes mostram resultados
conflitantes, questionando-se a aplicação clínica deste teste.
As divergências entre os trabalhos são observadas desde a metodologia
empregada. No presente estudo, a padronização da técnica de extração de RNA foi
realizada utilizando solução monofásica contendo fenol e guanidina isotiocianeto
(TRIzol®). Esta solução é utilizada desde a década de 80 (Chomczynski e cols, 1987).
A partir de 1998, estudos de mRNA de Tg também foram realizados empregando esta
substância para a extração de RNA total (Tallini e cols, 1998; Ringel e cols, 1998),
sendo esta técnica ainda bastante utilizada (Tabela 2).
Mesmo nos trabalhos utilizando TRIzol®, há diferenças metodológicas,
especialmente quanto ao volume da amostra de sangue utilizado e quanto à separação
ou não de camadas celulares por gradiente. Em geral, utiliza-se um menor volume de
sangue (1 a 3 mL) quando se extrai RNA a partir de sangue total (Ringel e cols, 1998;
Biscolla e cols, 2000; Bugalho e cols, 2001; Savagner e cols, 2002; Fugazzola e cols,
2002; Denizot e cols, 2003). O volume de sangue utilizado para extração após
separação das camadas celulares varia geralmente de 5 a 10 mL (Tallini e cols, 1998;
Takano e cols, 2001; Chinnappa e cols, 2004).
A extração de RNA a partir de sangue total, colocado diretamente em tubo estéril
contendo TRIzol®, parece melhorar a eficácia da extração (Ringel, 2004), além de não
haver contato com substâncias que possam interferir com o método, como por exemplo
a heparina (Dickover e cols, 1998). A quantidade média de RNA total extraído dos 32
pacientes avaliados foi 30,1 µg por amostra de 3 mL de sangue. Já no estudo de Ringel
e cols (1998) a eficiência da extração foi superior (30 a 60 µg de RNA total por amostra
71
de 3 mL). Isto talvez possa ser explicado pelo maior volume de TRIzol® utilizado por
este grupo, 6mL para cada 1 mL de sangue. No presente trabalho foi utilizada a relação
de 3 para 1 e no restante da literatura observa-se uma variação de 2,6 a 9 para cada
mL de sangue.
A maioria dos trabalhos utiliza 1 µg de RNA total para síntese de cDNA, com
amplificação do mRNA de Tg em 100% do grupo controle (Ringel e cols, 1998; Wingo e
cols, 1999; Takano e cols, 2001; Fenton e cols, 2001; Bugalho e cols, 2001). Entretanto,
utilizando esta quantidade de RNA não se conseguiu amplificar o mRNA de Tg em
nenhum dos 10 indivíduos do grupo controle deste trabalho. Isto também foi encontrado
em alguns outros estudos (Ditkoff e cols, 1996; Denizot e cols, 2003; Chinnappa e cols,
2004). Desta forma, foi aumentada progressivamente a quantidade de RNA total até
obter amplificação do mRNA de Tg em todos os indivíduos normais. A quantidade
padronizada de 4 µg de RNA total foi também utilizada por Fugazzola e cols (2002).
Outros grupos, como por exemplo, Biscolla e cols (2000) e Eszlinger e cols (2002),
utilizaram quantidades maiores de RNA total (≥ 10 µg).
Para amplificação do mRNA de Tg foi utilizado 25% do volume final de cDNA e nos
demais trabalhos já publicados observa-se uma variação de 5 a até 100% do volume.
Com o advento de técnicas de biologia molecular cada vez mais modernas, vários
trabalhos já foram publicados utilizando PCR quantitativo (real time PCR) para
determinação do mRNA de Tg (Wingo e cols, 1999; Ringel e cols, 1999; Takano e cols,
2001; Fenton e cols, 2001; Eszlinger e cols, 2002;Denizot e cols, 2003; Span e cols,
2003; Elisei e cols, 2004; Kaufmann e cols, 2004; Li e cols, 2004; Barzon e cols, 2004).
A quantificação tem como vantagem a possibilidade de acompanhar a variação do nível
72
de mRNA de Tg em resposta a uma determinada intervenção terapêutica. No entanto, o
PCR qualitativo é capaz, pelo menos em teoria, de determinar se ainda há células
neoplásicas circulantes expressando o mRNA de Tg e, portanto, se o paciente
encontra-se ou não em remissão.
No primeiro trabalho publicado sobre o emprego do mRNA de Tg como possível
marcador tumoral (Ditkoff e cols, 1996), a acurácia do método qualitativo empregado foi
extremamente elevada, com sensibilidade de 100% e especificidade de 91%. Dois
outros estudos (Gupta e cols, 2002; Chinnappa e cols, 2004), após criteriosa seleção
dos oligonucleotídeos iniciadores, encontraram resultados semelhantes (sensibilidade
variando de 83,33% a 100% e especificidade de 85,71% 91,67%). No presente
trabalho, a acurácia encontrada foi inferior, com sensibilidade de 75% e especificidade
de 61,1%. No entanto, estes valores são comparáveis aos demais estudos utilizando
RT-PCR qualitativo, em que se observa a sensibilidade variando entre 62,5% e 79% e
a especificidade entre 54% e 80% (Ringel e cols, 1998, Tallini e cols, 1998; Bojunga e
cols, 2000). Grammatopoulos e cols (2003) descrevem alta sensibilidade e
especificidade do teste empregado (93% e 84%, respectivamente), entretanto,
utilizaram como padrão-ouro a PCI diagnóstica, que sabidamente apresenta baixa
sensibilidade.
O uso de nested PCR tem como vantagem aumentar a sensibilidade da PCR, sendo
útil para estudar a expressão de mRNAs minoritários. Esta metodologia já foi
empregada em pacientes com CDT para avaliar a expressão do mRNA de Tg no
sangue. Ao contrário do esperado, Bellantone e cols (2001) encontraram uma baixa
sensibilidade (25%) e uma especificidade semelhante a da Tg sérica em hipotireoidismo
73
(80 x 85%). Já a metodologia desenvolvida por Biscolla e cols (2000) apresentou
sensibilidade de 83% e especificidade de 71%.
Nos estudos empregando RT-PCR quantitativo (real time PCR) para amplificação
de mRNA de Tg, também se observam diferenças na padronização da metodologia,
assim como resultados contraditórios. No primeiro trabalho publicado, Ringel e cols
(1999) construíram a curva-padrão a partir de RNA total extraído de tecido tireoideano
normal. Nos pacientes sem captação de iodo na PCI, a quantidade média de mRNA de
Tg foi significativamente menor que nos pacientes com captação em leito tireoideano (p
= 0,009) ou com captação em qualquer sítio (p = 0,001). Utilizando o valor de 3 pg de
mRNA de Tg / µg de RNA de tireóide como valor de corte, foi observado que apenas
38% dos pacientes sem captação de iodo apresentaram mRNA de Tg positivo. Já nos
pacientes com captação em leito tireoideano, o mRNA de Tg foi positivo em 75% (p =
0,001) e naqueles com captação em qualquer localização em 84% (p < 0,001). Apesar
desta correlação estatística entre presença de mRNA de Tg e captação de iodo,
observou-se neste estudo uma considerável superposição de valores entre os
diferentes grupos de pacientes. Savagner e cols (2002), utilizando um valor de corte
menor (1 pg de mRNA de Tg / µg de RNA total), observaram que somente 18% dos
pacientes sem evidência de doença há 5 anos apresentaram mRNA de Tg positivo,
comparado com 100% daqueles com doença metástática. Neste estudo, o mRNA de Tg
apresentou menor resultado falso negativo que a dosagem de Tg sérica.
Fenton e cols (2001) observaram correlação entre o nível de mRNA de Tg e
captação de iodo na PCI (p = 0,026) e Tg sérica (p = 0,037) em crianças com câncer.
No entanto, o número de pacientes avaliados foi pequeno (apenas 5) e não se
74
observou diferença de expressão do mRNA de Tg entre os pacientes com doença
benigna ou maligna (p = 0,67). Elisei e cols (2004) também realizaram padronização da
curva com RNA total. Entretanto, encontraram baixa especificidade do método e uma
grande superposição de valores entre os grupos com ou sem doença residual.
Outros grupos construíram a curva-padrão através da análise de genes
expressos de forma constitutiva, como GAPDH e β-actina. Esta padronização é
questionada, uma vez que existe variação de expressão destes genes em diferentes
indivíduos e em amostras pareadas de tecido normal e neoplásico (Tricarico e cols,
2002). Takano e cols (2001) e Kaufmann e cols (2004), utilizando GAPDH como
controle, não observaram diferença do nível de expressão do mRNA de Tg entre os
pacientes com ou sem metástases do CDT. O mesmo foi observado em 2 estudos
utilizando a β-actina como controle (Eszlinger e cols, 2002; Span e cols, 2003), porém Li
e cols encontraram diferença estatística entre indivíduos normais e com CDT (p <
0,0001) e correlação entre mRNA de Tg e Tg sérica (p = 0,08). Denizot e cols (2003)
realizaram padronização com o nível de RNA 18S. Ao contrário dos demais estudos em
que o fator crítico foi a especificidade, a técnica desenvolvida por este grupo
apresentou baixa sensibilidade (apenas 1 de 8 pacientes com remanescente
tireoideano e 1 de 7 pacientes com mertástases apresentaram mRNA de Tg
detectável).
A influência do nível de TSH sobre a expressão do mRNA foi avaliada em alguns
estudos. Ringel e cols (1999) e Savagner e cols (2002) observaram que nos pacientes
em uso de levotiroxina o nível de mRNA foi inferior ao encontrado nos pacientes sem
levotiroxina. Já outros autores (Fugazzola e cols, 2002; Elisei e cols, 2004; Chinnappa e
75
cols, 2004) não encontraram diferença significativa. Bellantone e cols (2001)
encontraram baixa sensibilidade do método (25%), mesmo durante hipotireoidismo
induzido.
Nos diversos estudos foram avaliados pacientes com carcinoma papilífero,
folicular e alguns também incluíram pacientes com carcinoma pouco diferenciado.
Bellantone e cols (2001), foram os únicos que relataram variação da expressão do
mRNA de Tg de acordo com o tipo histopatológico, não sendo observado amplificação
nos pacientes com carcinoma folicular. No presente estudo, a detecção foi vista em 11
dos 26 pacientes com carcinoma papilífero e 5 dos 6 pacientes com carcinoma folicular
ou pouco diferenciado, não havendo portanto, variação da expressão em função do tipo
histológico.
A expressão de mRNA de Tg nos diferentes grupos de estadiamento tumoral foi
avaliada somente em 2 trabalhos (Tallini e cols, 1998; Bellantone e cols, 2001), não
sendo encontrada diferença significativa entre os estágios tumorais. No entanto, no
presente trabalho foi observado aumento progressivo do percentual de casos com
mRNA de Tg detectável de acordo com estadiamento tumoral, sugerindo que o mRNA
de Tg no sangue possa ser um indicador de doença residual. Entretanto, significância
estatística só foi observada quando comparado estágio I com os demais (p < 0,005).
O grande questionamento do uso do mRNA de Tg como possível marcador
tumoral está na especificidade do método. Em muitos trabalhos observam-se casos em
que o mRNA de Tg está presente no sangue, porém sem qualquer outra evidência de
recidiva ou persistência tumoral, sugerindo resultado falso positivo. No entanto, não se
pode afastar a possibilidade deste teste apresentar taxa de detecção mais sensível que
os demais exames empregados e, portanto, estes pacientes apresentarem maior risco
76
de recidiva. A conclusão definitiva deste questionamento depende de estudos
prospectivos acompanhando os pacientes em que o mRNA de Tg encontra-se
detectável. Até o momento, somente 2 trabalhos realizaram este tipo de avaliação. No
primeiro, Grammatopoulos e cols (2003), acompanharam 5 pacientes por 12 meses e
observaram correlação entre a detecção do mRNA de Tg e a presença ou ausência de
doença demonstrada pela PCI. No segundo estudo, Elisei e cols (2004) reavaliaram
após 4 anos os 9 pacientes classificados como livres de doença, porém com mRNA de
Tg detectável. Nesta reavaliação, os pacientes foram submetidos a USG cervical e
dosagem de Tg sérica estimulada pela administração de TSH recombinante. Não foi
confirmada recidiva em nenhum destes pacientes, sugerindo resultado falso positivo do
mRNA de Tg. No presente trabalho, os pacientes sem evidência de persistência ou
recidiva tumoral pela avaliação inicial foram acompanhados por um período de
aproximadamente 24 meses. A taxa de recidiva encontrada não diferiu entre os
pacientes com ou sem mRNA de Tg presente no sangue (p > 0,75). Desta forma,
apesar do acompanhamento por um período relativamente curto e do pequeno número
de pacientes avaliados, estes resultados, juntamente com os dados publicados por
Elisei e cols (2004), sugerem que a detecção do mRNA de Tg não é capaz de predizer
risco de recidiva.
Outros fatores devem ser pesquisados para melhor esclarecer a baixa
especificidade do teste de mRNA de Tg. No presente trabalho, foi demonstrado que
linfócitos em cultura, extraídos de indivíduos normais e de paciente com ablação da
tireóide, eram capazes de expressar o mRNA de Tg, o que justifica a baixa
especificidade. A expressão de mRNA característico da tireóide por linfócitos já foi
descrita previamente por Francis e cols (1991), que demonstraram por RT-PCR a
77
presença de mRNA do receptor de TSH em linfócitos. A transcrição de genes tecido-
específicos é controlada de forma rigorosa por fatores de transcrição e promotores
tecido-específicos. Na ausência destes fatores, a transcrição gênica provavelmente é
muito baixa, porém não necessariamente nula. Esta pequena expressão de genes
tecido-específicos por células não específicas é denominada de transcrição ilegítima. Já
foi demonstrado que fibroblastos, linfoblastos e células hepáticas são capazes de
expressar genes específicos de outros tecidos, como por exemplo, gene da distrofia
muscular de Duchenne, fator anti-Mülleriano, β-globina e fator VIIIc (Chelly e cols, 1988;
Chelly e cols, 1989). Mais recentemente, Kimoto (1998) avaliou a expressão de 25
mRNAs em linfócitos humanos por RT nested PCR. Todos os mRNAs foram
detectados, sem exceção.
O uso de RT-PCR quantitativo, estabelecendo um valor de corte, poderia auxiliar na
distinção entre expressão ilegítima e expressão com relevância clínica. Entretanto, isto
não foi conseguido até o momento. Gupta e cols (2002), avaliaram a expressão do
mRNA de Tg e do receptor de TSH utilizando diferentes pares de primers. Foi
observado que a especificidade do método é dependente da escolha do primer. Uma
das seqüências de oligonucleotídeos estudas por Gupta e cols (2002) em que foi
encontrada baixa especificidade foi a mesma empregada no presente estudo, talvez
explicando a amplificação encontrada em linfócitos.
Nos estudos recentes de marcadores moleculares no sangue para detecção de
outros cânceres, observam-se os mesmos obstáculos encontrados no câncer de
tireóide (Schuster e cols, 2004).
78
Além de todos os dilemas já descritos, o emprego do mRNA de Tg no
acompanhamento dos pacientes com CDT ainda apresenta outras dificuldades, como
por exemplo, o alto custo e a grande variação intra- e interensaio de alguns métodos,
chegando até 35% e 38%, respectivamente (Takano e cols, 2001).
Desta forma, a metodologia desenvolvida neste estudo para pesquisar o mRNA de
Tg em amostra de sangue, não apresentou acurácia superior aos demais exames
empregados para detectar recidiva tumoral, como observado na maioria dos estudos.
79
CONCLUSÕES
1. A sensibilidade e especificidade do teste desenvolvido para detecção de mRNA
de Tg em sangue foram inferiores as da dosagem de Tg sérica em supressão.
2. A presença do mRNA de Tg no sangue não foi um fator determinante para o
desenvolvimento de recidiva ao longo de 24 meses de acompanhamento dos
pacientes com CDT.
3. Considerando isoladamente os pacientes com anticorpo anti-Tg, a presença do
mRNA de Tg também apresentou baixa correlação com o status de doença.
Neste subgrupo, a negativação ou manutenção dos títulos de anticorpo anti-Tg
foi um fator mais decisivo que a ausência ou presença do mRNA na
determinação de doença.
4. A amplificação do mRNA de Tg a partir de RNA extraído de linfócitos em cultura
permitiu esclarecer a baixa especificidade do método desenvolvido.
5. A aplicabilidade clínica do teste de mRNA de Tg só será possível após o
desenvolvimento e padronização de técnica sensível e, principalmente, capaz de
distinguir a amplificação específica da não específica. Este esforço é válido, pois
o anticorpo anti-Tg está presente em um percentual considerável de pacientes
com CDT, limitando a utilização da Tg sérica como marcador tumoral.
80
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95
ANEXO
Anexo I: Artigo de revisão submetido aos Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e
Metabologia.
Amplificação de mRNA de tireoglobulina no sangue de pacientes com carcinoma
diferenciado da tireóide: qual o seu verdadeiro significado?
Sabrina Mendes Coelho, Mário Vaisman e Denise Pires de Carvalho
Serviço de Endocrinologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho e
Laboratório de Fisiologia Endócrina do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro
96
Resumo
Aproximadamente 20-40% dos pacientes com carcinoma diferenciado da tireóide
evoluem com recidiva tumoral e o prognóstico está relacionado principalmente à
detecção precoce da doença. Desta forma, acompanhamento permanente com exames
sensíveis é fundamental. A tireoglobulina (Tg) sérica já demonstrou importância como
marcador de recidiva. No entanto, sua dosagem apresenta ainda algumas dificuldades,
como a interferência com anticorpo anti-Tg, e a sensibilidade dependente do nível de
TSH. A amplificação de mRNA tumor-específico extraído a partir de células neoplásicas
na corrente sangüínea apresentou resultados iniciais promissores. Após quase uma
década de estudo do mRNA de Tg, ainda não foi estabelecida sua real contribuição.
Após análise crítica dos estudos publicados, verifica-se a enorme diversidade de
protocolos e resultados conflitantes. Desta forma, a amplificação de mRNAs tireóide-
específicos não é superior à dosagem de Tg sérica existente. A possibilidade de
transcrição ilegítima e splicing alternativo são fatores que podem interferir com a
especificidade do método.
Unitermos: câncer de tireóide, tireoglobulina, mRNA.
97
Abstract
Despite the excellent prognosis, differentiated thyroid carcinoma may recur in 20-
40%, and prognosis is particularly related to early detection of recurrent disease.
Therefore, long-term follow-up with sensitive tests is necessary. Serum thyroglobulin
(Tg) has an established role as a tumor marker of relapse. However, there are technical
limitations of Tg immunoassays, in special, the interference of anti-Tg antibodies and the
method sensitivity is dependent on TSH stimulation. The detection of circulating
malignant cells by amplification of tumor-specific mRNA showed initial promising results.
Almost one decade of Tg mRNA studies, its real contribution had not yet been
established. After a critical analysis of published data, it is clear that there are many
protocol differences and conflicting results. Therefore, it seems that amplification of
thyroid-specific mRNAs is not superior to sensitive Tg assays and illegitimate
transcription and alternative splicing of Tg are factors that may influence mRNA test
specificity.
Keywords: thyroid cancer, thyroglobulin, mRNA
98
1. Introdução
Os carcinomas diferenciados da tireóide (CDT), papilífero e folicular, estão entre as
neoplasias malignas com melhor índice de cura. A taxa de sobrevida em 20 anos é de
95% para o carcinoma papilífero e de 70 a 80% para o folicular (1). No entanto, alguns
pacientes apresentam alto risco de recorrência tumoral, ou mesmo de morte, e o
prognóstico é afetado por fatores relacionados ao paciente, ao tratamento e à própria
doença. A recidiva tumoral, local ou à distância, não é infreqüente, podendo ocorrer até
algumas décadas após o diagnóstico (2), evidenciando a necessidade de
acompanhamento permanente dos pacientes com CDT.
A forma clássica de avaliar a presença de recorrência tumoral é o acompanhamento
da tireoglobulina (Tg) sérica e a realização de cintilografia de corpo inteiro com iodo
radioativo (PCI). A ultra-sonografia (USG) cervical também vem se afirmando como
método diagnóstico importante para a detecção de recorrência cervical, com
sensibilidade superior à Tg sérica e à PCI (3).
Em pacientes com CDT, espera-se que a Tg sérica torne-se indetectável após
tratamento ablativo (tireoidectomia total ou subtotal alargada complementada com iodo
radioativo). Nesta situação qualquer nível detectável de Tg pode indicar persistência ou
recorrência da doença maligna. Vários estudos têm confirmado o importante papel da
Tg sérica como marcador tumoral no acompanhamento de pacientes com CDT (4, 5, 6).
Entretanto, o ensaio da Tg apresenta ainda alguns dilemas técnicos, em especial a
interferência com anticorpo anti-Tg, presente em cerca de 15 a 25% dos pacientes com
CDT (7, 8, 9), e a sensibilidade dependente do nível de TSH. A administração de TSH
recombinante precedendo a dosagem de Tg sérica é interessante, pois aumenta a
99
síntese de Tg pelos tireócitos, melhorando a sensibilidade do método, e evita os
sintomas indesejáveis do hipotireoidismo. No entanto, o alto custo desta substância
dificulta seu emprego no seguimento dos pacientes com CDT.
Na tentativa de melhorar o acompanhamento de pacientes com câncer,
diagnosticando precocemente a recidiva, esforço tem sido realizado para o
desenvolvimento de métodos alternativos. A amplificação de mRNA tumor específico
extraído a partir de sangue parece ser útil em detectar células neoplásicas na corrente
sangüínea (10, 11, 12). Na década de 90, iniciou-se a avaliação da pesquisa de mRNA
de Tg em amostra de sangue de pacientes com CDT, com resultados iniciais
promissores (13, 14, 15).
2. Dificuldades técnicas da tireoglobulina sérica
A Tg é uma proteína sintetizada exclusivamente pelas células foliculares da tireóide.
É codificada por um gene de pelo menos 300kb, contendo 48 exons e localizado no
cromossomo 8 (16, 17, 18). O produto final é uma glicoproteína de 660 kDa, formada
por 2 subunidades idênticas, unidas por ligação não-covalente. A Tg pode apresentar-
se de forma heterogênea em decorrência de splicing alternativo do seu mRNA.
Por muitos anos acreditava-se que a Tg era encontrada exclusivamente na glândula
tireóide. A partir da década de 40 surgiram relatos de detecção de Tg no sangue (19),
mas foram Van Herle e cols. (20) que estabeleceram o primeiro método útil
clinicamente para detectar a Tg, o radioimunoensaio (RIE) utilizando anticorpo
policlonal de coelho. Na década de 80, os ensaios radioimunométricos (IRMAs) com
anticorpo monoclonal tornaram-se disponíveis.
100
Atualmente, existem 4 imunoensaios disponíveis para a dosagem da Tg: RIA (com
duplo ou único anticorpo), IRMA, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) e ICMA
(imunoquimioluminescência). Destes, o RIE com duplo anticorpo, IRMA e ICMA são as
técnicas de escolha.
Vários fatores podem afetar a acurácia do ensaio de Tg, podendo ser divididos em
fatores ensaio-dependentes e ensaio-independentes (21):
- Fatores ensaio-independentes:
. Presença de anticorpo anti-Tg;
. Níveis extremamente elevados de Tg (efeito gancho);
. Anticorpo heterofílico;
. Outros: gamopatia monoclonal, doença renal terminal.
- Fatores ensaio-dependentes:
. Falta de padronização internacional;
. Especificidades diferentes dos anticorpos utilizados;
. Falta de precisão interensaio;
. Sensibilidade funcional sub-ótima;
. Variante de Tg não reconhecida pelo anticorpo utilizado no método.
Anticorpo anti-Tg permanece como o principal fator de erro na dosagem de Tg
sérica, uma vez que aproximadamente 15 a 25% dos indivíduos com CDT apresentam
anticorpo anti-Tg (7, 8, 9), prevalência esta mais elevada que na população geral. É
importante salientar que o grau de interferência não é proporcional ao título do
anticorpo e que nenhum método está totalmente livre desta interferência. Na presença
do auto-anticorpo, o RIE geralmente determina falsa elevação da Tg, ao passo que
IRMA e ELISA podem subestimar. Desta forma, recomenda-se screening de anticorpo
101
anti-Tg em todo paciente com CDT. Infelizmente, vários laboratórios ainda utilizam teste
de hemaglutinação para detecção de auto-anticorpo, que sabidamente apresenta baixa
sensibilidade. A discordância entre o nível de Tg medida por RIE e IRMA pode
funcionar como um indicador sensível da interferência do anticorpo (8). Uma alternativa
é o teste de recuperação, que consiste em adicionar uma quantidade conhecida de Tg
ao soro e medir posteriormente a recuperação: se < 80% sugere interferência do
anticorpo e se > 80% diminui a possibilidade de interferência. Entretanto, a acurácia
deste teste não é alta e, portanto, o mesmo não deve ser utilizado para validar a
medida da Tg sérica (22).
A Tg quando em nível bastante elevado (10 a 10.000 vezes a faixa superior de
detecção) pode ser falsamente detectada em nível normal ou mesmo baixo. Este
fenômeno é conhecido como efeito gancho e é exclusivo dos ensaios com duplo
anticorpo, como o IRMA e RIE. Neste caso, a diluição do soro é recomendada.
Ao contrário do anticorpo anti-Tg, a interferência do anticorpo heterofílico não é
habitualmente reconhecida pelos laboratórios e clínicos. Quando presente este
anticorpo resulta em teste falso positivo. Como alguns pacientes são tratados com base
na elevação da Tg sérica, a não identificação do anticorpo heterofílico pode resultar em
tratamento desnecessário.
Uma vez na circulação, a meia-vida da Tg é de 3 a 65 horas, dependendo do grau
de modificações pós-traducionais (23) e a sua metabolização é feita primariamente pelo
fígado. O nível sérico da Tg depende de 2 fatores principais: o volume tireoideano e o
nível de TSH sérico.
102
- Volume tireoideano
Em geral, quanto maior a massa de tecido tireoideano (normal ou neoplásico) maior
o nível de Tg sérica. Desta forma, nos pacientes submetidos à terapia ablativa (cirurgia
associada à dose ablativa de 131I) a Tg permanece indetectável numa maior proporção
de casos (98% x 50%), em relação aos pacientes tratados de forma mais conservadora
(Tabela 1).
- Nível de TSH
Como o TSH é um importante estimulador da função tireoideana e mesmo células
neoplásicas mantém expressão de seu receptor, é esperado que o nível de Tg sérica
varie de acordo com a concentração de TSH (Tabela 1). Desta forma, ao interpretar o
valor da Tg deve-se sempre avaliar o nível de TSH.
Cerca de 20% dos pacientes com metástases para linfonodo e 5% dos pacientes
com pequenas metástases à distância apresentam Tg indetectável durante terapia
supressora de TSH com levotiroxina. Esta percentagem cai para 10 e menos de 1%,
respectivamente, quando induzido o hipotireoidismo (24).
Outro fator importante para a determinação do nível de Tg sérica é a capacidade
intrínseca do tumor de sintetizar e secretar esta glicoproteína. Este fator pode ser
avaliado através da determinação pré-operatória da Tg sérica (5).
Desta forma, observa-se que, apesar da Tg ser um marcador tumoral bastante útil
no acompanhamento pós-operatório, resultados falso-negativos ocorrem (Tg
indetectável em vigência de persistência ou recorrência tumoral). Estes casos são
geralmente explicados pela menor sensibilidade do exame durante terapia supressora
de TSH ou por interferência com anticorpo anti-Tg. Na tentativa de superar estas
103
dificuldades, esforço tem sido realizado para o desenvolvimento de métodos
alternativos de investigação.
3. RNA mensageiro da Tg como possível marcador tumoral
O conceito de detecção molecular altamente sensível de células tumorais na
corrente sangüínea foi descrito no início da década de 90 para tumores sólidos, como
carcinoma de próstata (10), neuroblastoma (26) e carcinoma de mama (27).
Especialmente no câncer de próstata, a detecção por RT-PCR de células neoplásicas
no sangue parecia preceder a elevação dos demais marcadores séricos, favorecendo
ao diagnóstico mais precoce da recidiva (28).
No primeiro estudo de mRNA de Tg no acompanhamento de pacientes com CDT,
Ditkoff e cols. (13) conseguiram detectar por reação em cadeia de polimerase após
transcrição reversa (RT-PCR) este mRNA em todos os 9 pacientes com doença
metastática e em menos de 10% (7 de 78) dos pacientes sem metástases. Neste grupo,
a detecção do mRNA de Tg foi mais freqüente naqueles com história prévia de
metástases (5 de 22) do que naqueles sem história de metástase (2 de 56). Nos
voluntários normais e nos pacientes com doença benigna não foi vista amplificação.
Estes resultados iniciais sugeriram, que a presença na circulação sangüínea do mRNA
de Tg poderia representar doença tireoideana disseminada via hematogênica.
Posteriormente, Tallini e cols. (14) conseguiram detectar mRNA de Tg e
tireoperoxidase (TPO) em 54,2% dos indivíduos em acompanhamento de CDT,
incluindo 5 de 8 pacientes sem evidência de doença no momento do exame. Entretanto,
104
4 destes 5 casos apresentaram invasão extratireoideana ou metástase para linfonodo
no momento da cirurgia. Já a amplificação do mRNA de RET/PTC 1 foi observada em
apenas 1 dos 18 pacientes com carcinoma papilífero e em nenhum paciente com
doença benigna. O mRNA de Tg e de TPO foram também detectados em 10% (2 de
20) dos pacientes com doença tireoideana benigna. No entanto, no pós-operatório o
mRNA não foi mais encontrado. Este achado demonstra que a presença no sangue de
mRNA específico da tireóide não está necessariamente relacionada à metástase.
Em 1998, utilizando metodologia de extração de RNA total diferente dos demais,
Ringel e cols. (15) detectaram mRNA de Tg em todos os 10 indivíduos normais
eutireoideanos testados. Dentre os 87 pacientes com CDT, o mRNA de Tg foi detectado
em 26 de 33 pacientes (79%) com remanescente em leito tireoideano ou doença
metastática confirmada em PCI, ao passo que a Tg sérica foi detectada somente em 12
destes pacientes (36%) durante terapia supressora de TSH. Nos pacientes com PCI
negativa, a Tg sérica estava detectável em 2 e o mRNA em 7 pacientes. Neste estudo a
amplificação do mRNA de Tg apresentou maior sensibilidade que a Tg sérica para
pesquisa de doença residual, pelo menos durante supressão de TSH. Entretanto, sua
especificidade foi inferior. Neste mesmo trabalho, através de técnica de
imunocitoquímica foram demonstradas células com expressão de receptor de TSH e Tg
na corrente sangüínea de indivíduos normais, sugerindo que a presença de tireócitos
no sangue não estaria relacionada apenas à disseminação hematogênica do carcinoma
da tireóide.
Este mesmo grupo (29) desenvolveu um método de RT-PCR quantitativo e
amplificou o mRNA de Tg em todos os 32 voluntários normais. A concentração média
encontrada foi de 433 ± 69 ng de RNA total tireoideano / litro de sangue, com variação
105
de 26 a 1502 ng/L. Aplicando metodologia semelhante em 107 pacientes com CDT e
utilizando o valor de 3pgEq/µg RNA de tireóide como cutoff, o mRNA de Tg foi
encontrado em 38% dos pacientes sem captação anormal de iodo na PCI, 75%
daqueles com captação em leito tireoideano, 84% com doença cervical e 94% com
metástases à distância (30).
A amplificação do mRNA do transportador de sódio-iodeto (NIS) também já foi
testada (31). O interesse maior no estudo do NIS como marcador tumoral é avaliar se
há correlação entre sua expressão e a captação de iodo, tentando explicar a
discordância entre Tg sérica e PCI encontrada em alguns pacientes. Entretanto, a
amplificação do mRNA do NIS por nested PCR (2 ciclos seguidos de amplificação,
utilizando 2 pares de seqüências de oligonucleotídeos iniciadores distintos) mostrou
baixa acurácia (sensibilidade de 16,6% e especificidade de 54%), não havendo
necessariamente correlação com a captação. A baixa especificidade pode ser
explicada, pelo menos em parte, pela expressão deste transportador em tecidos não
tireoideanos. Neste mesmo estudo, a sensibilidade e especificidade da amplificação do
mRNA da Tg por nested PCR foram de 83% e 71% e da Tg sérica 50 e 89%,
respectivamente.
A detecção de mRNA de TPO foi novamente estuda (32), desta vez em um
grupo maior de pacientes: 120 com carcinoma tireoideano, 85 com doença benigna e
54 voluntários normais. Dentre os indivíduos com doença maligna, o mRNA da TPO foi
detectado em 70% daqueles com metástases (7/10), sendo que em 3 a Tg sérica foi
negativa (< 5 ng/mL). Naqueles sem metástase documentada, o mRNA da TPO foi
detectado em 36% (39/110). Nestes, observou-se correlação positiva com a presença
106
de metástase para linfonodo (p = 0,05), estadiamento (p = 0,01) e Tg elevada (p =
0,03).
A avaliação do mRNA de Tg por RT-PCR quantitativo em crianças com doença
tireoideana benigna e maligna não mostrou diferença significativa entre os 2 grupos.
Entretanto, nos pacientes previamente tratados por carcinoma papilífero, o nível de
mRNA de Tg correlacionou-se com a PCI e com a Tg sérica (33).
Apesar destes resultados iniciais promissores, questiona-se atualmente o
verdadeiro valor e acurácia da detecção do mRNA de Tg no acompanhamento do CDT.
Vários pacientes em aparente remissão clínica (Tg sérica indetectável e PCI negativa)
apresentam mRNA circulante detectável (falso-positivo) e alguns pacientes
sabidamente com doença metastática apresentam mRNA indetectável (falso-negativo).
A expressão no sangue do mRNA da Tg por RT-PCR semi-quantitativo (com
variação do número de ciclos de 32 a 36) foi comparada entre pacientes submetidos a
tireoidectomia total por outra patologia que não CDT (carcinoma medular de tireóide,
carcinoma de laringe e bócio multinodular atóxico) e indivíduos normais (34). Não foi
encontrada diferença significativa da expressão do mRNA de Tg entre os 2 grupos.
Além disso, o RNA foi detectado tanto na camada de células mononucleares quanto de
polimorfonucleares, sugerindo que células sangüíneas talvez possam expressar o
mRNA da Tg. Entretanto, deve ser salientado que neste estudo os pacientes
tireoidectomizados não foram avaliados com cintilografia da tireóide para avaliar
possível remanescente tireoideano pós-operatório.
No estudo por RT-PCR quantitativo com 57 pacientes tireoidectomizados não foi
encontrada diferença de expressão do mRNA de Tg entre indivíduos com e sem
metástase de CDT, questionando-se a especificidade deste método (35). Entretanto, a
107
metodologia adotada foi diferente da anteriormente descrita por Ringel e cols (1999).
Não foi realizado tratamento com DNAse para prevenir amplificação de DNA genômico,
e a padronização da curva de concentração foi feita com GAPDH e não com RNA de
tireóide.
Diante de resultados tão conflitantes, é difícil avaliar o verdadeiro valor do mRNA
de Tg. No entanto, realizando uma análise criteriosa da metodologia utilizada pelos
diversos grupos observa-se uma enorme variedade de protocolos, o que certamente
justifica a discrepância entre os resultados. Em relação ao processamento da amostra
de sangue, observa-se variação quanto a: 1) tipo de tubo em que a amostra é coletada
(com heparina, citrato, EDTA ou diretamente no tubo de extração contendo substância
estabilizadora de RNA), 2) volume de sangue utilizado (0,3 a 10 mL), 3) separação de
camadas celulares por gradiente ou utilização de sangue total, 4) Kit de extração de
RNA (6 diferentes kits utilizados) e 5) tratamento ou não do RNA extraído com DNAse
(Tabela 2). Estudo de determinação de carga viral em pacientes infectados pelo HIV
demonstrou variação significativa de acordo com o tubo utilizado: o nível de RNA viral
no plasma coletado em tubo contendo EDTA foi, em média, 14% e 31% mais elevado
que no tubo com citrato e heparina, respectivamente (36). Eszlinger e cols (37),
estudando pacientes com CDT, comparou a eficácia de extração de vários métodos
(tubos com citrato ou EDTA, separação ou não de camada mononuclear e
processamento imediato, 24 horas ou 48 horas após a coleta) e concluiu que a
utilização de tubos com citrato com subseqüente separação da camada mononuclear e
extração imediata garantem um melhor resultado. Entretanto, não foi comparada esta
metodologia com um dos métodos de extração mais utilizados (amostra de sangue
adicionada diretamente em tubo estéril contendo substância estabilizadora de RNA).
108
Os diversos estudos também divergem quanto à metodologia de RT-PCR: 1)
quantidade de RNA total utilizado para a síntese de cDNA (1,0 ng a 11,5µg), 2)
quantidade de cDNA empregada para realização da PCR, 3) seqüência de
oligonucleotídeos iniciadores escolhida, 4) tipo de amplificação (PCR qualitativo,
nested, semiquantitativo, quantitativo) e 5) número de ciclos (Tabela 2).
Com relação ao número de ciclos, Bojunda e cols (38) compararam 2 métodos
com sensibilidades distintas, o primeiro utilizando PCR com 30 ciclos (com capacidade
de detectar 50 a 100 células expressando mRNA de Tg) e o segundo com 40 ciclos
(com capacidade de 20 a 30 células). Foi extraído RNA total de vários tecidos e de
sangue de indivíduos com CDT (com e sem metástase), doença benigna tireoideana e
voluntários normais. Após 30 ciclos de amplificação, o mRNA de Tg foi encontrado no
sangue de 9 dos 13 pacientes (69,2%) com metástase. Com aumento para 40 ciclos,
observou-se incremento da sensibilidade, detectando em 11 destes 13 pacientes;
entretanto, houve perda da especificidade, com detecção do mRNA da Tg em várias
amostras de tecido não-tireoideano, como timo, supra-renal, hipófise, pulmão, testículo
e apêndice.
Da mesma forma que se acreditava que a expressão do mRNA do receptor de
TSH era exclusiva do tireócito e hoje se sabe que é encontrado também em adipócitos
e linfócitos (39; 40), pode ser que o mRNA da Tg também seja expresso por outras
células, fenômeno denominado de transcrição ilegítima.
Gupta e cols (41) investigaram a especificidade de diferentes pares de
seqüências de oligonucleotídeos iniciadores (primers) em amplificar o mRNA de Tg e
do receptor de TSH (TSHR) em sangue de indivíduos normais e em amostra de câncer
109
de tireóide. Para isto foram escolhidos 4 pares de primers de TSHR e 3 pares de Tg já
descritos previamente na literatura (13; 15; 42). Foi observado que todos os primers de
TSHR e de Tg formam capazes de amplificar os respectivos mRNAs extraídos a partir
de tecido. Quando os experimentos foram realizados com RNA extraído a partir de
sangue (camada de células mononucleares), somente 1 par de primer de TSHR e 1 de
Tg não amplificou. Estes resultados sugerem que células sanguíneas talvez possam
expressar estes mRNAs. Entretanto, é provável que o processamento pós-
transcripcional (splicing) seja distinto nas células tireoideanas e não-tireoideanas e que
a seleção do primer possa determinar maior especificidade ao método.
Splicing alternativo do mRNA de Tg pode afetar não somente a especificidade,
como também a sensibilidade, especialmente se a sequência de oligonucleotídeos
empregada for direcionada para áreas sabidamente de risco de splicing. A possibilidade
de resultado falso negativo decorrente de splicing alternativo foi avaliada por Savagner
e cols (43). Para estimar o risco de erro na medida do mRNA de Tg, foi calculada a
percentagem de uma das formas variantes do mRNA, comparando com o total de
mRNA de Tg em células tireoideanas circulantes. Cerca de 20% dos pacientes
avaliados apresentaram este splicing alternativo, correspondendo a até 33% do valor
total.
Mais recentemente, foram estudados 36 pacientes com CDT em aparente
remissão e com anticorpo anti-Tg negativo (44). Foram dosados Tg sérica por 2
métodos com sensibilidade de 0,9 µg/L e 0,1 µg/L (Tg altamente sensível), além do
mRNA de Tg, antes e após a administração de TSH recombinante. Foi avaliado o grau
de concordância entre estes exames e a avaliação clínica (USG cervical, PCI, Tg
110
altamente sensível após TSH recombinante). A Tg com sensibilidade de 0,9 µg/l
apresentou concordância de 53% no basal e 55% após estimulação com TSH. O RNA
concordou com a avaliação clínica em 66% no basal e pós-estimulação. Neste estudo,
as condições da RT-PCR foram otimizadas para evitar transcrição ilegítima. Foi
primeiramente estabelecida a quantidade de cDNA oriundo de células K562 (células de
leucemia mielóide crônica) que não determina amplificação de Tg. Com base neste
dado, foi posteriormente feita padronização para as amostras de sangue dos pacientes.
Nestas condições, não foi observada amplificação de mRNA de Tg no paciente com
agenesia tireoideana. Desta forma, o emprego de uma metodologia que diminua o risco
de interferência da transcrição ilegítima talvez possa ser útil.
Apesar da possibilidade de baixa especificidade por transcrição ilegítima da Tg
ou por variantes de Tg em células não tireoideanas, não se pode, até o momento,
afastar a hipótese de alta sensibilidade do método, diagnosticando precocemente a
recidiva. Somente o acompanhamento a longo prazo dos pacientes estudados poderá
definir se aqueles com mRNA detectável apresentam maior risco de recorrência
tumoral. Nos 28 pacientes com CDT estudados por Grammatopoulos e cols (45) a
identificação de metástases na PCI correlacionou-se melhor com mRNA do que com a
Tg sérica. Cinco destes pacientes foram estudados prospectivamente com coleta de
sangue a cada 2 meses. Quatro mantiveram Tg e mRNA de Tg indetectáveis. No outro
paciente, o mRNA estava presente apesar da Tg indetectável; no entanto, durante o
acompanhamento a Tg sérica elevou-se e a PCI identificou metástases.
Elisei e cols (46), utilizando metodologia criteriosa (primers selecionados para
evitar formas variantes de Tg e tratamento com DNAse para evitar amplificação
111
genômica), estudaram 80 pacientes com CDT e 20 indivíduos normais. Foram
encontradas sensibilidade de 82,3% e especificidade de 24,2%. Os 9 pacientes com
RNA detectável, sem outra evidência de doença, foram reavaliados após 4 anos com
dosagem de Tg sérica basal e estimulada, que se manteve indetectável. Desta forma, o
mRNA não foi capaz de predizer a recorrência tumoral, sugerindo falso-positivo. Deve-
se ressaltar, entretanto, o número pequeno de pacientes envolvidos e o curto período
de acompanhamento.
Com base nestes resultados conflitantes, a amplificação de mRNAs
característicos da tireóide não parece ser, até o momento, superior aos métodos
sensíveis de dosagem de Tg sérica já existentes. Entretanto, como muitos estudos
sugerem correlação entre mRNA e estadiamento tumoral, é possível que o
desenvolvimento de metodologia criteriosa, evitando a interferência gerada pela
transcrição ilegítima, permita que o mRNA de Tg seja empregado para o subgrupo de
pacientes com CDT e anticorpo anti-Tg.
112
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120
TABELA 1: Detecção da Tg sérica de acordo com o tipo de tratamento
e o nível de TSH
% Pacientes com Tg sérica indetectável
TSH suprimido Em hipotireoidismo
Cirurgia + ablação com 131I 98% 90%
Tireoidectomia
(total ou subtotal)
93% 80%
Lobectomia unilateral 50% ~0%
Baseado em Schlumberger e Pacini, 1999 (25).
121
TABELA 2: Diferença da metodologia empregada para amplificação de mRNA de
tireoglobulina.
Variáveis Diferenças de Protocolo
Tubo para coleta de sangue Heparinizado14;35;47; contendo citrato 37;
EDTA29;32;33;34;37;38;41;45;47; ou diretamente em tubo
contendo substância estabilizadora de
RNA13;15;30;31;43;44;46
Volume de sangue 1,031;44 a 10mL14;35
Preparo do sangue para extração Separação por gradiente de camadas
celulares14;32;33;35;38;41;47 ou extração a partir de sangue
total13;15;29;30;31;37;43;44;45;46
Kit de extração de RNA TRIzol14;15;30;31;34;35;41;43;44;47; RNA STAT 6013;
PUREscript29;33;45;46; Rneasy blood32;34;38; QIAmp RNA
blood37; PAXgene blood RNA48
Amplificação de DNA genômico ou RNA Tratamento do RNA com DNAse; uso de primers em
exons distintos
Quantidade de RNA 1,0ng47 a 11,5mcg37
Seqüência de oligonucleotídeos iniciadores Escolha de primers localizados em diversas regiões do
gene de tireoglobulina, englobando ou não áreas
sujeitas a splicing alternativo.
Tipo de amplificação PCR qualitativo13;14;15;38;41;44;45; nested PCR31;32;47; PCR
semi-quantitativo34; PCR quantitativo29;30;33;35;37;43;46;48
Número de ciclos 3014;38;41 a 35+3532
Baseado nos artigos publicados de 1996 a 2004.
122
TABELA 3: Comparação entre os resultados dos principais artigos publicados
Autor / ano Detecção nos
controles
Detecção na
doença benigna*
Detecção no CDT
em remissão
Detecção no CDT
metastático
Ditkoff / 1996 0/7 (0%) 0/6 (0%) 7/78 (9,8%) 9/9 (100%)
Ringel / 1998 10/10 (100%) _ 7/35 (20%) 14/14 (100%)
Biscolla / 2000 6/6 (100%) _ 4/20 (20%) 2/3 (66,6%)
Savagner / 2002 10/10 (100%) 12/12 (100%) 3/15 (18%) 10/10 (100%)
Fugazzola/2002 7/7 (100%) 3/3 (100%) 19/25 (76%) _
Denizot / 200349
Chinnappa/2004
0/4 (0%)
0/51 (0%)
_
3/27 (11%)
0/8 (0%)
2/31 (6,4%)
1/7 (14,3%)
8/8 (100%)
* Doença autoimune ou bócio multinodular; -: não avaliado.
