I. INTRODUCCÌÒN

Una amplia gama de interacciones ocurren entre las plantas y los

microorganismos, de estos, algunos pueden ser perjudiciales, resultando en

pérdidas millonarias por daños a los cultivos agrícolas (Birch y col. 2000), debido

a que las plantas proveen un atractivo reservorio de nutrientes y son un nicho

ecológico para las bacterias patógenas. En muchas plantas superiores, la

colonización de las bacterias acarrea una variedad severa de enfermedades, las

bacterias Gram-negativas fitopatógenas han desarrollado sofisticadas

estrategias para colonizar a las plantas que son hospederas. Ellas entran a las

plantas a través aberturas naturales como son los estomas, o por heridas y se

multiplican en los espacios intercelulares a expensas del hospedero (Büttner y

Bonas, 2002).

Las interacciones entre las bacterias fitopatógenas y las plantas son complejas,

requieren que el patógeno se adapte al ambiente in planta, para modular la

fisiología del hospedero. Para el éxito de infectar y causar enfermedad, las

bacterias patógenas de plantas deben ser capaces de crecer epifitamente en la

superficie de las hojas, brotes, vainas, etc., se desconoce la identidad de los

factores de los patógenos involucrados en estos procesos, y no se entiende

como estos funcionan para promover el parasitismo y la enfermedad (Boch y col.

2002).

1.1. Género Pseudomonas.

El género Pseudomonas, es el grupo de bacterias más diverso del planeta. Se

han encontrado miembros de este género en la mayoría de los ambientes

naturales como son suelo, agua dulce y salada, y por lo tanto, establecen

asociaciones intímas con las plantas y los animales, esta distribución universal,

sugiere un grado notable de adaptabilidad genética y fisiológica (Spiers y col.

2000). Debido a esto, las bacterias fitopatógenas del género Pseudomonas

presentan diferencias dentro de una misma especie y son conocidas como

variedades patógenas o patovares (pv.) dependiendo de la gama de plantas que

infectan (Agrios, 1998). Tal es el caso de las cepas de Pseudomonas syringae,

que se han notado por su gran diversidad en la interacción específica con las

plantas hospederas y así pueden ser asignadas a una de las 50 patovares

basadas en su especificidad. Por ejemplo, Pseudomonas syringae pv. tomato

(infecta al jitomate), Pseudomonas syringae pv. glicinea (infecta a la soya),

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (infecta al fríjol), y Pseudomonas

syringae pv. maculicola (infecta a crucíferas) por mencionar algunos ejemplos

(Bender y col. 1999).Las bacterias del género Pseudomonas son bacilos cortos

rectos o curvos, Gram-negativos, con dimensiones de 0.5 a 1.0 x 1.5 a 4.0 μm

(Figura 1). Se desplazan por medio de uno o muchos flagelos polares. La

mayoría de las especies patógenas de este género infectan plantas y sólo

algunas de ellas a los animales y al hombre. (Silver y col. 1990).

Figura 1. Imagen de microscopía electrónica de una bacteria del género

Pseudomonas syringae (Nach., B., 1975).

2

1.2. Pseudomonas syringae pv. maculicola.

Infecta principalmente cruciferas como cultivos de col, coliflor y brócoli, entre

otros. Esta bacteria es utilizada como patógeno modelo en el estudio de genes

de resistencia de Arabidopsis thaliana (Cordeiro y col. 1998; Gabriel, 1999).

Relación taxonómica: Bacteria; Proteobacteria; subdivisión gamma; grupo

Pseudomonaceae/Moraxellaceae; familia Pseudomonaceae ; género

Pseudomonas ; especie Pseudomonas syringae; patovariedad maculicola.

Propiedades microbiológicas: Gram-negativa, aeróbica, motil, bacilo, lofotrica,

psicrotrófica. En cultivos jóvenes tienen una longitud de 0.6 a 3.4 μm y de 0.5 a

1.0 μm de diámetro, sin embargo, en cultivos viejos o en altas temperaturas los

bastones son más largos e incluso pueden tener forma filamentosa que forma

colonias blancas o amarillas, oxidasa negativo, arginina dihidrolasa negativa,

contenido de GC en el DNA de 58-60%, provoca respuesta de hipersensibilidad

en tabaco. Su temperatura óptima de crecimiento oscila entre 25 y 28 °C.

Variedad de hospederos: En un principio estudiada como el agente causal de

la mancha del jitomate y como modelo patogénico de A. thaliana, aunque a sido

aislada de una extensa variedad de crucíferas como son col, coliflor y algunas

hortalizas como brócoli y rábano (Figura 2).

3

Figura 2. Hojas, tallos y floretes de brócoli infectados con Pseudomonas

syringae pv. maculicola. A: florete de brócoli presentando síntomas de clorosis,

B: florete de brócoli presentando síntomas de necrosis, C: tallo de brócoli con

necrosis, D: hoja de brócoli presentando respuesta de hipersensibilidad

(Fotografías facilitadas por el Dr. Gustavo Hernández G.).

A B

DC

Síntomas de enfermedad: Manchas superficiales obscuras en frutas verdes,

lesiones húmedas dispersas, en ocasiones rodeadas por un margen clorótico en

A. thaliana.

Epidemiología: Sobrevive como saprófita en restos de plantas, suelo y

superficies foliares. Algunas bacterias tienen nutrición quimioorganotrófica, sin

embargo, se conocen especies que han vivido autotróficamente, cuentan con

poli-hidroxibutarato (PBH) como material de reserva el cual estimula el

crecimiento de células en un medio deficiente de nitrógeno, es esparcida por

lluvia. El desarrollo de síntomas es favorecido por la humedad en las hojas y las

temperaturas entre 13 y 25 °C.

4

Aproximadamente 80 especies de bacterias fitopatógenas están clasificadas en

numerosas patovariedades, con base en las especies vegetales que infecta, de

ahí que los síntomas varíen según la especie de la planta hospedera. Los

síntomas que presentan las plantas generalmente se deben a la liberación de

una o varias de las siguientes substancias (Madigan, 1998; Alberts, 1994):

• Toxinas que afectan a la planta.

• Enzimas líticas.

• Factores de crecimiento vegetal.

• Substancias que destruyen o modifican el tejido vegetal.

Las cepas de Pseudomonas syringae pv. maculicola, además de tener todas las

características morfológicas antes descritas, tiene la capacidad de crecer en un

medio nutritivo con bajo contenido de hierro, lo cual hace que se lleve a cabo la

producción de pigmentos fluorescentes (pioverdina) de un color que oscila entre

verde y amarillo, y con capacidad de difundirse al medio (Madigan, 1998;

Alberts, 1994).

1.3. Sistema de secreción tipo III.

Muchos patógenos bacterianos Gram-negativos de mamíferos y plantas, usan

un Sistema de Secreción de Proteínas de Tipo III (SSTT), también llamado

sistema Hrp en patogenos de plantas, para transferir proteínas y factores de

virulencia directamente a una célula hospedera (Jin y col. 2001) o al medio. El

SSTT, fue descubierto primeramente en Yersinia spp. un patógeno de humanos.

Este sistema está conservado en muchos patógenos Gram-negativos de plantas

(Ralstonia sp., Xanthomonas sp., Pseudomonas sp.) y animales (Escherichia

coli, Salmonela y Pseudomonas aeruginosa ; He y col. 2002).

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El SSTT puede translocar proteínas efectoras directamente dentro de la célula

eucariótica huésped y al ambiente extracelular (Figura 3), una vez que la

interacción se a dado con el huésped (Jin y col. 2001; van Dijk y col., 2002). En

el ensamblaje de este sistema, participan diferentes proteínas, las cuales se

organizan en una estructura similar al pilum conjugativo o al flagelo con

proteínas que están localizadas en la membrana citoplasmática, en el

periplasma, en la membrana externa bacteriana y en lo que se cree qué sea el

pilum como se muestra en la Figura 3 (Alfano y col. 1997; Wolfgang y col. 2000).

En las bacterias fitopatógenas, los genes relacionados con el pili de secreción

están conservados como en Psm M2, el SSTT está compuesto por la proteína

HrpA (Figura 3), que es la proteína principal del pili de secreción y es codificada

por el gen hrpA (Jin y col. 2001). Otro gen llamado hrpC, que codifica para una

proteína de membrana esencial para el SSTT y que tiene un papel principal para

la translocación de proteínas a través de la membrana externa de la bacteria es

llamada HrpC (Preston y col. 1998). Estas dos proteínas mencionadas son de

las más importantes, pero el SSTT exhibe una arquitectura más compleja ya que

esta compuesto de alrededor de 20 proteínas involucradas en la formación de la

estructura filamentosa de este aparato (Hueck y col. 1998).

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Figura 3. SSTT de PsmM2, la regulación general de los genes hrp y avr está

mediada por las condiciones del apoplasto vegetal, baja osmolaridad,

asimilación de nutrientes, señales metabólicas y de contacto con la célula

huésped (Modificado de: Willis y col. 1991; Alfano y col. 1996; Preston y col.

1998; Hueck y col. 1998; Collmer, 1998; Galan y Collmer, 1999; Wolfgang y col.

2000; Jin y col. 2001; Katagiri y col. 2002; Büttner y Bonas, 2002; He y col. 2002;

Buell y col. 2003).

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1.4. Proteínas secretadas por el SSTT.

El SSTT secreta dos clases de proteínas efectoras principales hacia el exterior

de la célula bacteriana y probablemente hacia el interior de la célula vegetal

(Figura 3). Estas proteínas efectoras son las harpinas y proteínas Avr.

Las harpinas son proteínas pequeñas, estables al calor y ricas en glicina,

carentes de cisteina y son codificadas por los genes hrpZ y hrpW, secretadas en

un medio de cultivo como proteínas HrpZ y HrpW cuando se expresa el sistema

Hrp. Además, las harpinas poseen capacidad de producir HR o necrosis en

hojas de tabaco y en otras plantas, y son secretadas al medio extracelular

(apoplasto) in planta (Figura 3).

Interesantemente, se encontró que las harpinas de Pseudomonas syringae se

unen a la membrana plasmática de la célula vegetal, formando un poro que

causa la liberación de iones y otros nutrientes, que alcalinizan el medio y que

ayudan a promover el parasitismo de la bacteria (Alfano y col. 1996; Collmer,

1998; Collmer y col. 2000; Büttner y Bonas, 2002;).

Las proteínas Avr son los segundos efectores más estudiados y son productos

de los genes avr. Estas proteínas disparan una reacción de defensa en las

plantas no hospederas debido al producto de un gen de resistencia R específico

que presenta la planta y que interactúa específicamente con la proteína Avr

translocada por el SSTT al interior de la célula y que culmina en una HR (Figura

3; Büttner y Bonas, 2002; Galan y Collmer, 1999; Katagiri y col. 2002). Las

proteínas Avr colectivamente promueven el parasitismo (Alfano y col. 1996)

probablemente como factores de virulencia manipulando los procesos celulares

y fisiológicos del hospedero por el patógeno invasor, ayudando a la adaptación

bacteriana dentro del tejido infectado y la formación de síntomas en plantas

susceptibles (Büttner y Bonas, 2002; Alfano y col. 1996).

8

1.5. Regulación de la expresión de los genes avr y hrp.

Las bacterias usan estrategias variadas y específicas para regular la expresión

de sus maquinarias del SSTT (Galan y Collmer, 1999). La producción de

determinantes de virulencia es controlada por una compleja cadena regulatoria

que responde a múltiples señales ambientales así como carencia de nutrientes

(Figura 3; Genin y Boucher, 2002).

Las condiciones de expresión de los factores de patogenicidad es similar en

todas las bacterias fitopatogenas estudiadas, son parecidas a las que

prevalecen en el apoplasto vegetal (baja concentración de osmolitos,

temperatura, cationes divalentes en particular Ca+2, pH ligeramente ácido y bajo

contenido de nutrientes) y son reprimidos en medios ricos (Grimm y col., 1995;

Jianzhong y col., 1995; Missiakas y col., 1998; Preston, 2002;). Estas

condiciones pueden ser emuladas en un medio mínimo como el M9. Las

concentraciones mayores de 50 mM de algunos osmolitos como NaCl, KCl,

MgCl2, MgSO4, sorbitol y sacarosa, inhiben fuertemente la expresión de estos

genes y en el caso de algunos metabolitos como la sacarosa, fructosa y el citrato

a una concentración de 5 mM incrementan la expresión de los genes hrp y el pH

optimo de expresión es de 5.5. La temperatura también influye en la expresión

de algunos genes, y se ha determinado que diversos fitopatógenos producen

toxinas entre 10 y 20 °C (Budde y col., 1998; Budde y col., 2000), en lugar de 28

°C que es la temperatura óptima de crecimiento en el laboratorio. Como es el

caso del patovar glycinea que produce coronatina a 18 °C (Budde y col., 2000);

esto nos sugiere la presencia de secuencias reguladoras que responden a

factores físicos y que probablemente estén relacionados con aquellos genes que

responden a temperatura (Fang y col., 1998).

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Tambien el contacto con la célula huésped puede ser una señal fisiológica que

estimule la red de regulación, como lo demostraron Aldon y col. (2000) con

Ralstonia solanacearum, que posee un receptor de señal por contacto con la

célula huésped llamado Par, que estimula la secreción y translocación de

proteínas efectoras a través del sistema de tipo III (Galan y Collmer, 1999).

1.6. Proteínas como factores de virulencia y patogenicidad. Se definen como factores de virulencia aquellos productos de los genes que son

indispensables para la colonización y sobrevivencia de un patógeno en un

hospedero causándole daño (Wren, 2000; Jungblut y col. 2000; Boch y col,

2002). Pseudomonas syringae, produce una gran variedad de productos

extracelulares que contribuyen para la colonización de plantas hospederas y

para causar síntomas de enfermedad (Genin y Boucher, 2002), en

Pseudomonas existe una larga lista de estos factores ya identificados como son:

exopolisacáridos (EPS), lipopolisacáridos (LPS), enzimas pécticas, celulasas,

sideróforos. Existen otros factores de virulencia que todavía no están bien

documentados pero se sabe que tienen alguna función de virulencia como son:

proteínas de membrana y proteínas requeridas para movilidad como las

proteínas del flagelo (Jungblut y col. 2000).

Cabe mencionar que todos los factores de virulencia que se han documentado

son productos de genes relacionados con la patogenicidad y que pueden ser

expresados bajo ciertas condiciones idóneas de la bacteria. Por ejemplo, si la

bacteria crece en condiciones de no expresión, los productos génicos no serán

sintetizados y por ende, no habría factores de virulencia, por otro lado, si la

bacteria crece en condiciones de expresión, estos serán expresados

(Comunicación personal de Cesar Álvarez M.; Guttman y col. 2002).

10

1.7. Electroforesis bidimensional.

La electroforesis bidimenional es una técnica de alta resolución, cuyo objetivo

es la separación de mezclas complejas de proteínas. Los geles en 2D, pueden

separar mezclas de 1000 hasta 10,000 especies de proteínas en dos corridas

electroforéticas (Wilkins y col. 1996; Rabillout, 2000; Washburn y col. 2000;

Encarnación, 2002; Vázquez, 2003). Estos geles involucran la combinación

ortogonal de dos diferentes métodos electroforéticos, la base de su elevado

poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que

las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos. En primer

lugar las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones

desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico (Figura 4A).

Cuando una mezcla de proteínas es introducida en un gel con un gradiente de

pH, tanto los extremos amino y carboxilo terminal como los grupos funcionales

de las cadenas laterales ionizables de las proteínas que captan o liberan

protones de acuerdo con el pH, de modo que la carga eléctrica global de las

proteínas dependerá del pH del entorno. El punto isoeléctrico (pI) de una

proteína, es el valor específico de pH en que la carga neta de la proteína es

cero, y por eso ya no se desplaza al aplicar un campo eléctrico.

En la primera dimension (1ªD) de enfoque isoelectrico (IEF) cuando se aplica un

campo eléctrico, todas las moléculas con carga neta positiva serán atraídas

hacia el cátodo (-), y todas las moléculas con carga neta negativa hacia el ánodo

(+). A medida que las moléculas de proteína se van acercando a su pI, irán

perdiendo carga eléctrica o ganando cargas de signo contrario, hasta llegar al

valor de pH en que la carga neta sea cero y las proteínas dejen de moverse, se

dice que las proteínas se han focalizado, ya que todas las moléculas de una

especie dada de proteína, inicialmente dispersas a lo largo de todo el gradiente

11

de pH, se han concentrado en un solo punto del gradiente que corresponde a su

pI.

Figura 4. Electroforesis bidimensional. A: electroforesis por separación de

enfoque isoeléctrico; B: electroforesis por separación en base al tamaño de las

proteínas. Juntos estos dos métodos componen a la electroforesis en 2-D

(Encarnación, 2002).

En la segunda dimension (2ªD) se utilizan geles planos que contienen un

detergente aniónico dodecil sulfato de sodio (SDS) que desnaturaliza las

proteinas rompiendo los puentes de hidrogeno, bloquea las interacciones

hidrofóbicas y parcialmente desdobla las proteínas minimizando las diferencias

en la forma molecular, eliminando las estructuras terciaria y secundaria y un

agente reductor que permitira separar los puentes disulfuros entre cadenas

polipeptídicas (las cistinas intercadena). Sobre este gel se coloca el gel de la 1ªD

y se aplica una corriente electrica, ahora las proteínas se separan de acuerdo a

su tamaño. Por último para detectar las proteínas en el gel es indispensable

útilizar una técnica de tinción específica para proteínas, con colorantes como

azul de Comassie o tinción con plata, las proteínas aparecen formando manchas

12

circulares (Rabillout, 2000; Washburn y col. 2000; Encarnación, 2002; Vázquez,

2003).

1.8. Proteómica en microorganismos.

La meta básica del estudio de la proteómica, es identificar proteínas que están

involucradas en un proceso en particular, en un organismo o en alguna

interacción con otro y es deseable tener su genoma ya secuenciado.

Generalmente un organismo se cultiva bajo diferentes condiciones

experimentales (Figura 5), para poder estudiar la expresión diferencial de

proteínas y que posteriormente son resueltas en electroforesis 2D (Washburn y

col. 2000).

SDS-PAGE (segunda dimension)

Solubilización de proteinas Reducción Condición A

Figura 5. Secuencia esquemática de una investigación típica en proteómica.

(Pandey y Mann., 2000).

Usando esta metodología de proteómica, se han identificado grupos funcionales

de proteínas en Bradyrhizobium japonicum, cultivado bajo condiciones

Alquilación

Enfoque isoeléctrico en geles o tiras preenfocadas (primera dimension)

Condición B

Tinción 1. Plata 2. Comassie 3. Fluorescencia 4. Autorradiografia

Identificación de manchas por

espectrometría de masas

Corte de spots de interés Condición A Condición B Análisis de imagen

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anaerobias y aeróbicas (Dainese y col. 1999) y sujetas a condiciones

ambientales como el estrés por calor (Münchbach y col. 1999). También se

determinaron los cambios en los patrones o modelos de expresión de proteínas

en Sinorrhizobium meliloti expresados durante la fase de crecimiento

exponencial temprana y tardía (Vasseur y col. 1999).

Estos son ejemplos de estudios donde se ha contribuido exitosamente en el

conocimiento de nuevos descubrimientos en la biología de microorganismos. Sin

embargo, en Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 el empleo de estas

herramientas abrirá nuevos horizontes en los estudios diferenciales de proteínas

expresadas en distintas condiciones de crecimiento.

14

II. JUSTIFICACIÓN

Existe mucho interés en estudiar las bacterias fitopatogenas a nivel genético,

molecular, bioquímico y biofísico para comprender cuáles son los mecanismos

de patogenicidad y virulencia. Hasta el momento en nuestro laboratorio se

cuenta con investigaciones referentes en Pseudomonas syringae pv. maculicola

M2, como son una colección de mutantes que están relacionadas con la

patogenicidad, la secuencia de los genes mutados y el mapa físico de restricción

del cromosoma de la bacteria, en donde se localizan físicamente estos genes de

patogenicidad que contienen la información. Pero todavía no se sabe como las

proteinas como productos génicos proveen la manera de ejecutar esta

información. Todavia no se conocen perfiles proteínicos de esta bacteria en

condiciones de expresión y no expresión, y esto será muy útil para detectar qué

proteínas están relacionadas con la patogenicidad, es por eso, que realizar el

“Estudio de la Expresión Proteínica de Pseudomonas syringae pv. maculicola

M2 Bajo Diferentes Condiciones de Crecimiento”, nos ayudará a encontrar

cuales proteínas son diferentes y cuándo son expresadas bajo ciertas

condiciones de crecimiento al comparar los perfiles proteínicos de cada

condición de crecimiento.

Hasta el momento con en esta bacteria todavía no existen investigaciones donde

se haya utilizado la electroforesis bidimensional (2D) así como realizar

búsquedas informáticas de proteínas con otras bacterias patógenas para saber

qué proteínas están relacionadas con la patogenicidad.

15

III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Este trabajo preliminar es parte de una investigacion tendiente a descifrar la red

de regulacion de la patogenicidad de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2

(Psm M2), que infecta crucíferas de gran interés agrícola como col, coliflor,

brócoli, produciéndoles clorosis y necrosis, también infecta a Arabidopsis

thaliana que es utilizada como planta modelo. Psm M2 utiliza un SSTT que es un

factor indispensable de patogenicidad y que es codificado por la isla de

patogenicidad Hrp. Los genes que codifican para este sistema y otros

relacionados con la virulencia y patogenicidad no son expresados cuando la

bacteria crece en medio rico (KB), pero sí son expresados cuando la bacteria

crece en medio mínimo (M9), parece haber una sobreexpresión cuando la

bacteria reconoce metabolitos y componentes de la planta, como en un jugo de

hojas. Entonces usando herramientas poderosas como la electroforesis

bidimensional, en muestras provenientes de diferentes condiciones de

crecimiento y comparando los perfiles proteínicos, se identificarán cuáles

proteínas están relacionadas con la patogenicidad. Por lo tanto, se eligió esta

técnica para la separación de extractos proteínicos totales de bacterias

cultivadas en cuatro condiciones de expresion: KB, KB más jugo de hojas de

Arabidopsis, M9 y M9 más jugo. Para el análisis comparativo de estos perfiles se

usará el programa llamado PDQuest®, que permite identificar todas las

diferencias entre dos o más perfiles proteínicos y llegar hasta la identificación

por homología de las proteínas expresadas diferencialmente.

16

IV. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general. Determinar el patrón de expresión proteínica de Pseudomonas syringae pv.

maculicola M2, en medio rico y medio mínimo en presencia y ausencia de jugo

de hojas de Arabidopsis thaliana.

4.2. Objetivos particulares.

• Determinar las cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv.

maculicola M2 en medio rico (KB); medio rico mas jugo de hoja de

Arabidopsis thaliana (KB +j ); medio mínimo (M9) y medio mínimo mas

jugo de hoja de Arabidopsis thaliana (M9 + j).

• Determinar el contenido total proteínico de Pseudomonas syringae pv.

maculicola M2 de cada una de las condiciones de crecimiento.

• Comparar los perfiles proteicos de Pseudomonas syringae pv. maculicola

M2 obtenidos mediante electroforesis en 2D.

17

18

V. HIPÓTESIS

La comparación de expresion de proteínas de Pseudomonas syringae pv.

maculicola M2, cultivada en medio rico y medio mínimo más en presencia o

ausencia de metabolitos y otros componentes de Arabidopsis thaliana presentes

en el jugo de la planta, mostrarán patrones diferenciales de expresión de

proteínas entre cada condición de crecimiento. Estos patrones diferenciales

indicarán la magnitud del cambio fisiológico de la bacteria, cuando se inducen

los genes relacionados con la patogenicidad.

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Materiales, medios de cultivo, reguladores, soluciones y métodos. 6.1.1. Materiales.

Se utilizaron micropipetas pipet-lite de la marca RAININ de 2 a 1000 μl.

La marca de los reactivos usados fueron: Gibco, KEM, BIORAD y Sigma-Aldrich.

Se utilizó KLETT-SUMMERSON Photoelectric Colorimeter MOD. 800-3 y los

matraces nefelométricos de BELLCOR 300 ml y paraverificar el crecimiento de las

bacterias y para mediciones de pH se utilizó el potenciómetro BECKMAN Φ340

pH/Temp Meter.

Para centrifugar se utilizó Centrifuge 5415 C de eppendorf y la ultracentrífuga

SORVALLTM T21 de DUPONT.

Para comprobar la concentración de proteínas; se utilizó el espectrofotómetro DU-6

SPECTOPHOTOMETER de la marca BECKMAN.

Se utilizarón anfolinas con gradiente de pH de 3.5-8, 4-7 y 3-10 de las marcas

Sigma-Aldrich y Amersham Bioscences, Uppsala, Sweden.

Se utilizaron tiras para enfoque isoeléctrico (IEF) de 7 y 18 cm con gradiente de 3-10

y 3-5.6 de la marca Immobiline DryStrip de Amersham Bioscences, Uppsala,

Sweden.

20

Para las corridas de enfoque isoeléctrico, se utilizó el sistema IPGphorTM Isolectric

Focusing System de Pharmacia Biotech. (Amersham Bioscences, Uppsala, Sweden).

Para todas las corridas de electroforésis en geles de poliacrilamida se utilizó el

equipo PROTEAN® II xi Cell de BIORAD.

La fuente de poder utilizada fue de Pharmacia Biotech. PS500 XT-115 V.

El análisis de los geles se llevó a cabo con PDQuestTM 2-D analysis software de

BIORAD.

La cepa utilizada para este trabajo fue Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.

Las cuales se conservaron a -70ºC en un congelador REVCO.

6.1.2. Medios de cultivo. Para la elaboración de este trabajo, se utilizaron los siguientes medios de cultivo:

Medio KB (King’s B)

Proteosa peptona # 3 (Difco) 20 g

K 2HPO4.3H2O 1.5 g

MgSO4.7H2O 1.5 g

Glicerol 15 ml

*Agar bacteriológico 15 g

Agua destilada 1000 ml

* Solamente cuando es medio sólido.

Se esteriliza a 15 lb/pulg2 por 15 min.

Medio M9 (medio mínimo)

Na2HPO4 6.0 g

21

KH2PO4 3.0 g

NaCl 0.5 g

NH4Cl 1.0 g

*Agar bacteriológico 15.0 g

Agua destilada c.b.p. 1,000.0 ml

* Sólo para preparar medio sólido.

Ajustar el pH a 7.0 y esterilizar en autoclave a 121°C/15 min.

Antes de usar agregar en condiciones de esterilidad, para 1,000 ml:

MgSO4 1 M 2.0 ml

Glucosa 20 % 10.0 ml

CaCl2 1 M 0.1 ml

6.1.3. Reguladores.

Regulador de corrida 10X para geles de poliacrilamida

SDS 10 g

Trisma-base 30.275 g

Glicina 144.1344 g

Agua desionizada (c.b.p) 1000 ml

No ajustar el pH; la mezcla de los reactivos debe dar un pH de 8.3. cuando se

corre una electroforesis el regulador debe estar a 1X.

Regulador de muestra de Laemmli 4X para marcadores de tamaño

Trisma-base 1M 0.605 g

Glicerol 40 ml

SDS 4 g

Azul de bromofenol 5 mg

Agua desionizada (c.b.p) 100 ml

22

En una probeta medir el agua desionizada y el glicerol, adicionar el Trisma-base y

disolver; adicionar el SDS disolver y adicionar el azul de bromofenol. Revisar que el

pH sea 6.8, si es necesario ajustar con HCl y aforar, por último guardar a – 20 °C.

Regulador de equilibrio para tiras de IEF antes de la segunda dimension

Tris-HCl; pH 8.8 50 mM 5 ml

Urea 6 M 36.035 g

Glicerol (87% v/v) 30% (v/v) 34.5 ml

SDS 2% 2 g

Azul de Bromofenol trazas pocos granos

Agua desionizada c.b.p 100 ml

Alícuotar en volúmenes de 10 ml y almacenar a -20°C. Se adiciona DTT al

momento de equilibrar y posteriormente se adiciona iodoacetamida.

Regulador de rehidratación para tiras de IEF

Urea 9.5 M 5.7 g

NP-40 2% 2 ml

β-mercaptoetanol 5% 0.5 ml

Anfolinas* 2% -

Agua desionizada c.b.p 10 ml

*Las anfolinas se agregan al momento de usar el regulador. El volumen de anfolinas

es de 3.5 μl para 350 μl de regulador de rehidratación.

Regulador de extracción UNS (Urea; Nonidep-40; SDS)

Urea 9.5 M 5.7 g NP-40 20 % 1 ml SDS 20% 1 ml PMSF 0.2 mM 10 μl

β-mercaptoetanol 5% -

23

Agua desionizada c.b.p 10 ml

El β-mercaptoetanol; se adiciona en campana, ya que es hepatotóxico. Se

adicionan 6 μl. También se adicionan 4 mg de vidrio finamente molido para la lisis

celular.

6.1.4. Soluciones.

Soluciones para elaborar un gel de electroforesis de poliacrilamida y dodecil sulfato

de sodio (SDS-PAGE)

Bis-acrilamida 30% (29:1)

Acrilamida 29 % 29.2 g

N,N-metilenbisacrilamida 1% 0.8 g

Agua desionizada c.b.p 100 ml

Tris 1M pH 8.8

Trisma-base 12.11 g

Agua desionizada c.b.p 100 ml

Disolver el Trisma-base en agua y antes de aforar ajustar el pH con HCl 6 N.

Tris 1M pH 6.8

Trisma-base 12.11 g

Agua desionizada c.b.p 100 ml

Disolver el Trisma-base en agua y antes de aforar ajustar el pH con HCl 6 N.

SDS 20 %

SDS 20 g

24

Agua desionizada c.b.p 100 ml

Disolver lentamente el SDS en agua y filtrar antes de usar.

TEMED (N,N,N’N’-tetrametiletilendiamina)

Solución al 100%

Persulfato de amonio 10 % (PSA)

PSA 100 % 100 mg

Agua desionizada c.b.p 1 ml

Proteínas como marcadores de tamaño molecular para geles de SDS-PAGE

BSA 67 kDa 6 μl/μl H2O 2 μl

Citocromo 12 kDa 6 μl/μl H2O 2 μl

Anidrasa carbónica 29 kDa 3 μl/μl H2O 4 μl Fosforilasa 90 kDa 3 μl/μl H2O 4 μl Ovoalbúmina 45 kDa 3 μl/μl H2O 4 μl Buffer de Laemmli 4X 1X 15 μl

Solución para desteñir geles teñidos con azul de Comassie

Metanol 100 % 100 ml

Ácido acético 100 % 100 ml

Agua desionizada c.b.p 1000 ml

Soluciones para teñir geles con plata

Solución I

Etanol 100 % 300 ml

Eliminado: Mioglobina

25

Ácido acético 100% 100 ml

Agua c.b.p 1000 ml

Solución II

Etanol 100 % 300 ml

Acetato de sodio (4 M) 10 % 100 ml

Glutaraldehido 25 % 20 ml

Ácido acético 0.3 % 3 ml

Tíosulfato de sodio 0.1 % 1 g

Agua desionizada c.b.p 1000 ml

Solución III

Nitrato de plata 100 % 1 g

Formaldehído 37 % 0.24 ml

Agua desionizada c.b.p 1000 ml

Solución IV

Carbonato de sodio 100 % 25 g

Formaldehído 37 % 0.4 ml

Agua desionizada c.b.p 1000 ml

Solución V

Ácido acético 100 % 50 ml

Agua desionizada c.b.p 1000 ml

26

6.2. Metodos. 6.2.1. Preparación de un jugo de hojas de Arabidopsis thaliana.

Para preparar un jugo de hojas de Arabidopsis thaliana, se cosechan hojas

(aproximadamente 100 g) de 4 a 6 semanas se edad y se lavan dos veces con agua

corriente y una con agua destilada estéril y se colocan en un mortero estéril, se

agrega nitrógeno líquido y se maceran las hojas hasta formar una pasta. El macerado

se coloca en tubos de centrífuga estériles y se centrifuga a 2,800 x g por 15 min a

4°C y el sobrenadante se extrae con pipeta en tubos de plástico estériles, que se

congelan a -20°C hasta su uso.

6.2.2. Subcultivos de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.

6.2.2.1. Día 1. Pseudomonas syringae pv. maculicola M2. fue cultivada en cuatro condiciones: la

primera en medio rico (KB); en medio rico con jugo de hojas de A.thaliana (KB+jugo)

y en medio mínimo (M9); en medio mínimo con de hojas de A.thaliana (M9+ jugo).

1. Sembrar por estría cruzada un inoculo de la cepa Pseudomonas syringae pv.

maculicola M2 (conservada a –70 °C) en una placa con agar KB

suplementado con 120μl de MgSO4 2 M y en otra placa igual pero

suplementado con 40μl de jugo de hojas de Arabidopsis thaliana.

Por otro lado sembrar por estría cruzada un inoculo de la cepa Pseudomonas

syringae pv. maculicola M2 en una placa de medio mínimo (M9) y medio mínimo

suplementado con 40μl de jugo de hojas de Arabidopsis thaliana.

2. Incubar las placas a 28°C por 24 horas.

27

6.2.2.2. Día 2.

Estos inóculos servirán para las cinéticas de crecimiento

1. Preparar en matraces independientes; 20 ml de medio liquido KB y 120 μl de

MgSO4 2 M; 20 ml de medio KB+jugo y 120μl de MgSO4 2 M, 20 ml de

medio M9; 20 ml de medio M9+jugo.

2. Inocular los matraces con una asada gruesa de los cultivos que crecieron en

la correspondiente placa.

3. Incubar los matraces a 28°C en agitación (250 r.p.m) por 48 horas.

6.3. Elaboración de cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.

6.3.1. Día 4.

1. Preparar 4 matraces nefelométricos con 20 ml de KB y 120μl de MgSO4 2 M; 4

con KB+jugo y 120μl de MgSO4 2 M; 4 con M9 y 4 con M9+jugo.

Nota: para cada condición elaborar un blanco.

2. Inocular cada matraz con 500 μl del inóculo correspondiente para llevar cada

matraz a 25 Unidades Kletts (UK).

3. Incubar los matraces a 28°C en agitación (250 r.p.m).

28

4. Hacer lecturas cada 2 horas.

5. Graficar Unidades Kletts (UK) contra tiempo.

6.3. Obtención de biomasa celular de Pseudomonas syringae pv. maculicola

M2. 6.3.1. Día 1.

1. Cultivar cepa de PsmM2 por 48 horas en 20 ml de medio KB; 20 ml de

KB+jugo; 20 ml en medio M9 y en 20 ml de medio M9+jugo.

2. Se incuban a 28°C en agitación (250 r.p.m) por 48 hrs.

6.3.2. Día 3.

1. Preparar matraces con 500 ml de KB con 3 ml de MgSO4 2M; 500 ml de

KB+jugo con 3 ml de MgSO4 2M y 1 ml de jugo de hojas de Arabidopsis

thaliana; 1000 ml de M9 y 1000 ml de M9+jugo con 2 ml de extracto de

Arabidopsis thaliana.

2. Se inoculan 12.5 ml en los medios KB y KB+jugo; en M9 y M9+jugo 50 ml en

cada uno.

3. tomar una alícuota y verificar las UK.

4. Incubar los matraces a 28°C en agitación (250 r.p.m).

5. Sacar los matraces a las 10 horas del crecimiento.

29

6. Colocar los matraces en baño de hielo.

7. Centrifugar a 10,000 rpm por 10 min a 4°C.

8. Descartar el sobrenadante de cada medio. La pastilla resultante congelarla

con nitrógeno líquido o congelarla con hielo seco y guardarla a – 70°C.

6.5. Lisis y obtención de extractos proteicos.

1. Pesar un tubo eppendorf de 1.9 ml y anotar el peso. Agregar

aproximadamente 100 mg de pastilla celular. Adicionar 600 μl de regulador de

lisis UNS, 1 μl de PMSF, 4 mg de vidrio molido limpio y estéril, 5 μl de β-

mercaptoetanol.

2. Introducir un pistilo de vidrio esmerilado de la punta y dar 25 golpes

(homogenización).

Nota: trabajar estos pasos en campana.

3. Homogenizar con un vortex al máximo por 2 min.

4. Extraer por 14 horas en agitador eppendorf a temperatura ambiente.

5. Centrifugar 20 min al máximo a temperatura ambiente.

6. Extraer la fracción soluble de la fracción celular, medir y anotar los volúmenes

extraídos. Las fracciones separadas se congelan con nitrógeno líquido o con

hielo seco y guardarlas a – 70°C.

30

6.6. Precipitación de proteínas por el método del ácido tricloroacetico (TCA).

1. Se mide el volumen de muestra y se precipita con un volumen igual de TCA

preenfriado (4°C).

2. Se deja por 1 hr a 4°C ó baño de hielo.

3. Centrifugar 20 min a 4°C a 10,000 rpm en la microfuga.

4. Eliminar el sobrenadante (SN) por aspiración .

5. Lavar la pastilla agitando en el vortex, con 250 μl de etanol al 75% preenfriado

(-20°C).

6. Centrifugar 15 minutos a 4°C a 10,000 rpm en la microfuga.

7. Eliminar el SN por aspiración.

8. Repetir pasos 5 a 7 tres veces.

9. Lavar la pastilla agitando en el vortex, 250 μl de etanol al 95% preenfriado (-

20°C).

10. Centrifugar 15 minutos a 4°C a 10,000 rpm en la microfuga.

11. Eliminar el sobrenadante (SN) por aspiración.

12. Secar las pastillas 5 minutos hasta que no huela a etanol.

13. Resuspender la pastilla en 50 μl de agua ó en 50μl de 0.1N NaOH sólo si no

se puede disolver en agua y se va a utilizar para cuantificar proteína por el

método de BAC.

31

6.7. Determinación de la concentración de proteína mediante el método del ácido bicinconínico (BAC).

El rango de medición es de 0.5 a 50 μg. Esta determinación se basa en la unión del ión

cobre (Cu+2) en un medio alcalino, al enlace peptídico de las proteínas, cambiando su

estado de oxidación a ión cuproso (Cu+1) en una primera etapa. En la segunda etapa

el ácido bicinconínico (BAC) forma un complejo colorido con el ión cuproso en medio

alcalino y se lee a 562 nm. Se requiere de una curva estándar, la cual se hace

variando la cantidad de seroalbúmina bovina (BSA). La determinación se lleva a cabo

ajustando el volumen final de la muestra y el estándar a 50 μl. En seguida se

adiciona 1.0 ml del reactivo de BAC, se mezcla y después de 30 minutos de

incubación a 37°C, se determina la Absorbancia a 562 nm. Los datos se grafican

para tener la curva estándar.

6.8. Preparación del reactivo de BAC. Esté es estable por una semana a 4°C en un frasco ámbar.

1. Para 10 ml; adicionar 10 ml de solucion A y 200 μl de solucion B y homogenizar.

2. preparar la solución estándar de seroalbumina bovina (BSA): 1mg/ml H2O.

3. La curva estandar se prepara de la siguiente manera:

4. Curva estandar

Tubo # (1xduplicado)

BSA Estándar 1 mg/ml

Agua Desionizada V. Total = 50 μl

ReactivoBAC

1 0.0 μl 50.0 μl 1 ml 2 2.0 μl 48.0 μl 1 ml 3 5.0 μl 45.0 μl 1 ml 4 10.0 μl 40.0 μl 1 ml 5 15.0 μl 35.0 μl 1 ml 6 20.0 μl 30.0 μl 1 ml

32

7 25.0 μl 25.0 μl 1 ml 8 30.0 μl 20.0 μl 1 ml 9 35.0 μl 15.0 μl 1 ml 10 40.0 μl 10.0 μl 1 ml 11 50.0 μL -- 1 ml

5. Incubar a 37 °C por 30 minutos y leer a 562 nm. La curva se hace por duplicado y se grafica.

Para la determinación de la concentración de proteína de cualquier muestra, por

duplicado se precipita el volumen de la proteína. La precipitación se hace con ácido

tricloroacetico (TCA) frío al 20%. Con la precipitación de la proteína, se elimina la

posible interferencia que pueden ocasionar cualquier componente de la muestra y

diferentes soluciones de extracción, que se utilizan para extraer proteínas.

En la curva estándar se extrapola el valor de absorbancia de la muestra, para

conocer la concentración de la proteína. Si las lecturas de absorbancia no quedan

dentro del rango de la curva estandar, diluir la muestra de proteína y volver a hacer la

determinación y un blanco. Si la muestra está muy diluída, concentrar por liofilización

dos muestras independientes y volver a cuantificar con un blanco.

6.9. Precipitación de extractos proteicos de Psm M2.

1. Tomar 5 μl del sobrenandante crudo proveniente de cada extracción y

condición de crecimiento (KB, KB+j y M9, M9+j) y adicionar 15 μl de TCA al

20%.

2. Dejar precipitar por 1 hr en baño de hielo.

3. Centrifugar a máxima velocidad por 15 minutos a 4 °C.

33

4. Adicionar 250 μl de etanol al 75%.

5. Centrifugar a 4°C al máximo y descartar el sobrenadante (repetir el paso

anterior 3 veces).

6. Adicionar 250 μl de etanol al 95%.

7. Centrifugar a 4°C al maximo y descartar el sobrenadante (repetir el paso

anterior 2 veces).

8. Secar las pastillas 5 minutos hasta que no huela a etanol.

9. Disolver la pastilla en100 μl de NaOH 0.1 N y tomar por triplicado 30 μl para

cuantificar.

10. Adicionar 20 μl de NaOH 0.1 N y 1 ml de BAC a cada muestra.

11. Leer a 562 nm.

12. Extrapolar en la curva estándar con los resultados obtenidos.

6.9.1. Electroforesis de enfoque isoeléctrico de tiras con gel para primera dimension (1D).

1. Precipitar la muestra requerida; y adicionar 350 μl de regulador de

rehidratación para solubilizar la muestra y colocarla en agitador eppendorf.

2. Colocar 3.5 μl de anfolinas de cada rango (3.5-5 y 4-7); adicionar azul de

bromofenol y agitar en vortex.

34

3. Pipetear la muestra y colocarla en el deposito de corrida.

4. Colocar la tira Immobiline DryStrip en el deposito de corrida.

5. Colocar el deposito de corrida en el sistema IPGphorTM Isolectric Focusing

System.

6.9.2. Elaboración de un SDS-PAGE, segunda dimensión (2D).

De acuerdo a la metodología de Laemmli, un SDS-PAGE está constituido por un gel

concentrador y un gel separador. El gel separador es el que se debe elaborar

primero. Los dos geles son de diferente concentración y para cada uno de los geles

(el grosor del gel es de 0.75 mm) se hacen las siguientes mezclas:

6.9.1.1. Preparación de un gel concentrador al 5 % .

Para 6 ml:

Bis-acrilamida (30 %) 1 ml

Tris-HCl 1M pH 6.8 0.75 ml

Agua desionizada 4.18 ml

SDS 20% 30 μl

TEMED 6 μl

PSA 10 % 30 μl

6.9.1.2. Preparación de un gel separador al 14 %. Para 40 ml :

Bis-acrilamida (30 %) 18.56 ml

Tris-HCl 1M pH 8.8 15.04 ml

35

Agua desionizada 5.92 ml

SDS 20% 200 μl

TEMED 40 μl

PSA 10 % 200 μl

6.9.2.3. Pasos para elaborar un gel separador y concentrador.

1. Armar el equipo de electroforesis PROTEAN® II xi Cell de BIORAD para

proteínas y verificar que no existan fugas, las dimensiones del gel que se

forma es de 22 cm por 18 cm.

2. Hacer la mezcla del gel separador al 14 % y mezclar suavemente. Aplicar los

40 ml al equipo electroforético, después de aplicar toda la mezcla, verificar que

no exista ninguna burbuja y aplicar un poco de isopropanol para equilibrar el

borde superior del gel separador, por último dejar polimerizar.

3. Hacer la mezcla del gel concentrador al 5 % y mezclar suavemente. Aplicar los

3 ml sobre el gel separador al 14% ya polimerizado. Introducir un diente para

cargar los marcadores de tamaño, verificar que no existan burbujas y aplicar

isopropanol por ultimo dejar polimerizar.

4. Colocar la tira con gel de enfoque isolelctrico y aplicar agarosa fundida al 0.8

% para que no se mueva la tira.

5. Preparar las proteínas como marcadores de peso molecular y calentarlos a 90

°C por 5 minutos y aplicarlos al gel.

6. Colocar regulador de corrida 1X y correr las muestras a 90 volts.

7. Teñir los geles con azul de Comassie o tinción con plata.

36

8. Analizar los geles con el programa PDQuest® de BIORAD.

6.9.2.4. Procedimiento para teñir geles con plata.

1. Incubar el gel con la solución I por 15 minutos y decantar.

2. Incubar el gel con la solución II por 15 minutos y obscuridad. Decantar en un

deposito adecuado para no contaminar.

3. Enjuagar el gel con agua desionizada por 15 minutos. Se hacen 3 lavados y

en obscuridad.

4. Incubar el gel con la solución III por 15 minutos y obscuridad. Decantar en

depósitos adecuados.

5. Adicionar un poco de solución IV homogenizar un poco (la solución se torna

café) y decantar; adicionar más solución IV e incubar por 15 minutos, decantar

en depósitos adecuados.

6. La tinción se detiene al adicionar la solución V al 5% por 1 hr, el gel puede

dejarse en esta solución para almacenarlo.

37

38

VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1. Cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.

Se determinaron las cinéticas de crecimiento para cada condición. Mediante estas

cinéticas de crecimiento (Figura 6) se estableció que a la mitad de la fase

exponencial (10 horas del crecimiento logarítmico) se recuperara la biomasa celular

de cada condición de crecimiento para la obtención de los extractos proteínicos.

Cinéticas de crecimiento de Psm M2

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (h)

KB KB+jugo M9 M9+jugo

Figura 6. Cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 en

diferentes medios de crecimiento. Las flechas indican el momento en que los cultivos

fueron cosechados. KB: medio King’s B; KB+j: King’s B + jugo de Arabidopsis; M9:

medio mínimo; M9+j: medio mínimo + jugo de Arabidopsis. Todas las cinéticas fueron

repetidas cuatro veces. Las barras verticales indican el error de la desviación

estandar.

Como se ve en la figura 6, los cuatro tipos de cultivos se ajustaron para que las

cinéticas de crecimiento iniciaran de 25 unidades Klett. Se tomaron lecturas cada dos

horas hasta las treinta horas. Teniendo las cuatro cinéticas se decidió cosechar las

células a la mitad de la fase logarítmica, que en todos los casos fue a las 10 horas de

incubación. Las correspondientes unidades Klett para cada condición a las 10 horas

se detallan en la Tabla 1.

Al comparar las cuatro cinéticas de crecimiento, se observa que la mayor biomasa

se encuentra en el medio KB. Esto se puede explicar por el gran contenido de

nutrientes esenciales que la bacteria tiene a su disposición y que fácilmente puede

asimilar del medio para el crecimiento celular (Brook 1997). En la condición de

crecimiento KB de Psm M2 suplementado con jugo de hojas de Arabidopsis, se logra

ver una disminución de la biomasa en un 33% aproximadamente comparando con el

crecimiento en el medio sin jugo. Por otro lado en el medio minimo el jugo no afecta

el crecimiento de las bacterias, como se observa en la Figura 6.

La disminución del crecimiento de las bacterias, en el medio KB suplementado con

jugo de hojas de Arabidopsis, puede deberse a algunos compuestos fenólicos

encontrados principalmente en las hojas como: son las catequinas, el ácido

clorogénico, las epicatequinas, el ácido hidroxibenzoico, el ácido quínico y el ácido

vanílico (Mo y Gross, 1991). Es probable que la combinación de algunos de estos

compuestos que pudieran estar en el jugo de las hojas, con alguno o algunos de los

compuestos del medio KB, ejercieran un efecto inhibitorio en el crecimiento

bacteriano. Esto no es sorprendente, ya que en las plantas existen otros compuestos

como las fitoalexinas, que son compuestos antimicrobianos, así como en el jugo de

hojas existen otras substancias que pueden inhibir el crecimiento celular y que no se

descarta que se encuentren en el jugo crudo de hojas de Arabidopsis. Esto se puede

constatar, ya que el ácido clorogénico principal componente fenólico encontrado en

hojas de cereza, inhibe el crecimiento in vitro de Pseudomonas syringae pv. syringae

en alrededor del 75 % (Mo y Gross, 1991).

38

La diferencia en la velocidad de crecimiento en las bacterias en KB comparado con la

disminución en el crecimiento de la bacteria en M9 (al tratarse de un medio que sólo

tiene sales o un medio de cultivo definido), puede deberse a que la bacteria sólo

tiene como única fuente de carbono y energía a la glucosa del medio para elaborar

nuevo material celular, y que otros ingredientes se encuentran en cantidad limitante,

en cambio en KB, el medio es muy completo y no hay factores limitantes del

crecimiento.

Sin embargo, a diferencia del efecto inhibitorio del jugo en KB, en M9 no tuvo efecto.

Una explicación podría ser que los componentes del medio mínimo mimetizan las

condiciones del apoplasto vegetal para la bacteria, y además, los metabolitos de la

planta presentes en el jugo pueden inducir la expresión de factores de patogenicidad

relacionados con la defensa contra los metabolitos tóxicos de las plantas.

Se ha demostrado que el medio mínimo estimula el crecimiento de una mutante

PsmMut8 de P. s. maculicola M2 cuando se añade cloranfenicol (150 μg/ml) al medio

en comparación con el crecimiento en KB con cloranfenicol, la mutante tiene un

transposón insertado en el operón hrpAZBCDE, que codifica para la formación del pili

Hrp del sistema de secreción de proteínas tipo III y que es un factor esencial en la

patogenicidad, el transposón tiene el gen cat (cloranfenicol acetiltransferasa) que se

expresa bajo el promotor del operón. Cuando se agrega jugo de planta al medio

mínimo, se incrementa todavía más el crecimiento, sin embargo, cuando el medio

contiene casaminoácidos, se abate el incremento inducido por el jugo, pero no el

inducido por el medio mínimo, lo que indica que alguno o algunos aminoácidos

presentes en los casaminoácidos, inhiben la expresión del operón (Álvarez M. y R.

Marsch comunicación personal).

Por otro lado, usando Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, se obtuvo una

mutante en un gen homólogo a MexB de P. aeruginosa, el promotor de este gen

mutado se induce en medio mínimo y también cuando se añade jugo de plantas, el

producto de este gen forma parte de una bomba que está relacionada con la

39

expulsión de compuestos tóxicos del interior de la bacteria y hace a la bacteria

resistente a compuestos fenólicos y a antibióticos entre otros (Álvarez,M. C. Tesis de

maestría. 1999).

En resumen, es posible que los componentes del medio rico inhiban la expresión de

genes relacionados con la defensa o resistencia de la bacteria contra compuestos

tóxicos en el jugo de hojas de Arabidopsis, por lo que las bacterias sufren el efecto

de esos compuestos y disminuye su crecimiento. Por otro lado, tanto el medio

minimo como el mismo jugo inducen la expresion de factores de resistencia a estos

compuestos, por ello el crecimiento bacteriano no se ve afectado significativamente

por los compuestos toxicos del jugo en el medio minimo.

7.2. Morfología de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 en medios diferentes. Cuando Psm M2 crece en los correspondientes medios existen diferencias

morfológicas, como se ven en la Figura 7. Comparando la morfología celular entre

los medios a las diez horas del crecimiento (mitad de la fase logarítmica ) se ve que

las células en los medios KB y KB más jugo son de forma bacilar (Figura 7A y 7B).

Mientras que la morfología de las células en los medios mínimos, las células

presentan una forma de bacilos cortos (Figura 7C y 7D).

El cambio de forma indica que hay un cambio en el área superficial de la célula, en

KB la cantidad de nutrientes es excesiva, y la célula requiere de suficiente cantidad

de moléculas de transporte para aminoácidos y otros componentes, por lo que podría

requerír más área superficial, en cambio en el medio mínimo, sólo necesita

transportar glucosa como única fuente de carbono y la célula necesita emplear toda

su maquinaria enzimática para poder sintetizar lo necesario y poder desarrollarse,

entonces la célula, tendería a ser más pequeña y con menor área superficial para

dividirse a la misma velocidad que en medio rico.

40

A B

C D

Figura 7. Tinción al Gram de células de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2

provenientes de diferentes medios de cultivos. A . Psm M2 en KB; B. Psm M2 en KB

+ jugo de Arabidopsis; C. Psm M2 en M9; D. Psm M2 en M9 + jugo de Arabidopsis.

41

42

7.3. Cuantificación de proteína total en Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.

En la Tabla 1, se muestra el contenido total de proteínas proveniente de Psm M2

bajo diferentes condiciones de crecimiento. Este contenido proteínico proviene de

100 mg de células empacadas en base a peso fresco. Una observación interesante,

es que el contenido de proteína se incrementó en las células creciendo en los medios

mínimos siendo más alto que en los medios ricos. Sin embargo, cuando se adiciona

jugo de planta al medio rico y al medio mínimo, éste tiene un efecto de incrementar la

concentración de proteína. Comparando la concentración de la proteína cuando la

bacteria crece en medio rico en ausencia de jugo de planta el rendimiento total es de

alrededor del 6.3% contra el 7.2 % de la concentración total en medio mínimo en

ausencia de extracto de planta y para la concentración total de proteína en medio rico

y medio mínimo ambos suplementados con jugo de planta el rendimiento es del 6.8

% y 9.0 % respectivamente. En medio rico más jugo el incremento es de 7.9 % con

respecto a medio rico en ausencia de jugo de planta y para medio mínimo más jugo

la concentración aumenta en 25 % contra medio mínimo solo.

Tabla 1. Concentración total de proteínas de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 bajo diferentes condiciones de crecimiento.

μg de proteína d

Medios de cultivo a

UK a las 10 horas del

crecimiento b

Volumen de

cultivo (ml) c

Fracción soluble 1

Fracción insoluble 2

Total (100 % de 1+2)

Concentración (%) e

Efecto del jugo en la concentración total de proteína

KB 345 9.5 5580 (88%) 750 (12%) 6330 6.3 - M9 85 34 5604 (78%) 1575 (22%) 7179 7.2 -

KB+j A 227 11 6392 (94%) 412 (6%) 6804 6.8 + 7.9 %

M9+j B 94 25 7519 (83%) 1500 (17%) 9019 9.0 + 25 %

A y B Medios con 2 μl de jugo de planta/ml de medio de cultivo, en volumen final de 500 ml para KB y 1000 ml para M9. a Los cuatro medios de cultivo se ajustaron a 25 UK (unidades Klett). b Unidades Klett a las 10 horas del crecimiento correspondiente a la mitad de la fase logarítmica. c Volumen necesario para obtener 100 mg de pastilla en base a peso húmedo. d Extracción total de proteínas por 14 horas. e Concentración calculada para 100 mg de pastilla húmeda.

43

7.4. Separación bidimensional de proteína total de Psm M2 utilizando en la primera dimensión un rango de pH amplio. En este estudio se usó la fracción soluble de los extractos proteínicos de Psm M2,

para resolver la composición proteínica mediante geles grandes de 2D. La figura 9

representa el análisis de proteínas en 2D. En la primera dimensión el extracto

proteínico de la fracción soluble se separó en tiras con geles de IEF, los cuales

contienen anfolinas con un rango de pH de 3 a 10 y una longitud de 7 cm. La

segunda dimensión (2D) se desarrolló en geles planos y grandes de 18 cm de ancho

por 20 cm de longitud.

IEF SDS-PAGEkDa

90

67

45

29

12

Figura 8. Separación de proteínas provenientes de los extractos proteínicos de

Psm M2 cultivada en M9. La 1ª D un gradiente de pH de 3 a 10 en tiras con

geles de IEF de 7 cm. La 2ª D es en un SDS-PAGE al 14 %.

3pI 10 7

44

Las proteínas separadas en geles de 2D fueron visualizadas al ser teñidas con plata.

Con esta tinción (Figura 8), se encontró que los componentes totales de proteínas

estaban cargados en el lado ácido. Así que se trabajó en ampliar el lado ácido (pH de

3.0 hasta 5.6).

7.5. Análisis electroforético en geles de 2D de proteínas ácidas de extractos totales de Psm M2 expresadas bajo diferentes condiciones de crecimiento.

Para investigar el grado de diferencias en los patrones de expresión de las proteínas,

bajo cada una de las condiciones de crecimiento de la bacteria (KB, KB + j, M9 y M9

+ j), se analizaron electroforeticamente en 2D los extractos proteínicos solubles

totales de las bacterias crecidas en las condiciones señaladas. Para este análisis

comparativo de perfiles proteómicos de proteínas acidas, en la 1ª D se utilizaron tiras

de geles comerciales de IEF con rango de pH de 3.0 a 5.6 y una longitud de 18 cm,

para la 2ª D se utilizaron geles planos de 18 cm de ancho por 20 cm de largo los

cuales separan proteínas en un rango de 5 a 100 kDa. Posteriormente se analizó

cada perfil proteómico y posteriormente estos se compararon entre sí.

Al comparar los patrones de proteínas en 2D, con los de otros microorganismos,

como Salmonella enteritis (Park y col. 2003), Pseudomonas aeruginosa (Sauer y col.

2002) y Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Buell y col. 2003) se encontró

que tambien predominan las proteínas ácidas, las cuales tambien fueron

identificadas en estos patógenos.

En la Figura 9 se muestra el perfil proteómico en 2D del extracto soluble de las

proteínas ácidas de Psm M2 crecida en medio KB. En esta figura lo que salta a la

vista es el reducido número de proteínas que en esta caso fueron 24 (Tabla 2). Es

esperado el detectar un gran número de proteínas en esta región del gradiente de pH

de acuerdo con la Figura 8. Una de las explicaciones a este resultado fue que se

tuvieron que modificar las condiciones de tinción porque al teñir los geles con plata

no se podían detectar manchas únicas y se observaba un patrón proteínico saturado.

45

Por esta razón decidimos hacer tinciones rápidas con plata para detectar únicamente

las proteínas más abundantes a lapsos de alrededor de 10 min.

El perfil proteómico de las proteínas ácidas de KB + j (Figura 10), teñidas bajo las

condiciones arriba mencionadas, refleja una mayor complejidad en el número (64

proteínas; Tabla 2) y tamaño de las proteínas al compararlas con el perfil proteómico

de KB (Figura 9). La presencia del jugo de hojas de planta indujo una expresión

diferencial de 40 proteínas ácidas más abundantes. Este resultado concuerda con el

aumento de concentración de proteína total en el paquete celular (Tabla 1).

El perfil proteómico de las bacterias crecidas en M9 (figura 11) revela la presencia de

30 proteínas ácidas más abundantes. Por otro lado la adición de jugo de hojas a las

bacterias crecidas en este medio (Figura 12), reveló la expresion de 42 proteínas

(Tabla 2) más abundantes, esto concuerda con el aumento del contenido total de

proteína (Tabla 1).

En este trabajo, se analizaron los geles teñidos con un lapso aproximado de 10 min

lo que permitió poner de manifiesto solamente las proteínas ácidas más abundantes.

Bajo las condiciones experimentales utilizadas en este trabajo, se observó una gran

diferencia en los patrones de expresión de proteínas de la bacteria en las diferentes

condiciones de cultivo.

46

IEF SDS-PAGEkDa

90

67

45

29

12

pI 3.0 3.7 4.3 5.0 5.6

Figura 9. 2D de Psm M2 en medio KB. Los cuadros negros indican las proteínas

ausentes en KB + j, los cuadros amarillos indican las proteínas ausentes en M9, los

cuadros verdes las proteínas ausentes en M9 + j. Las dimensiones del gel son 18 x

20 cms.

47

IEF SDS-PAGEkDa

90

67

45

29

12 pI

5.6 3.0 3.7 4.3 5.0

Figura 10. 2D de Psm M2 en medio KB + j. Los cuadros negros indican las

proteínas ausentes en KB, los cuadros azules indican las proteínas

ausentes en M9 + j, los cuadros naranjas indican las proteínas ausentes en

M9. 48

SDS-PAGE IEF kDa

90

67

45

29

12

pI 3.0 3.7 4.3 5.6 5.0

Figura 11. 2D de Psm M2 en medio M9. Los cuadros negros indican las proteínas

ausentes en M9 + j, los cuadros amarillos indican las proteínas ausentes en KB, los

cuadros naranjas indican las proteínas ausentes en KB + j.

49

IEF SDS-PAGEkDa

90

67

45

29

12

pI 3.0 3.7 4.3 5.0 5.6

Figura 12. 2D de Psm M2 en medio M9 + j. Los cuadros negros indican las proteínas

ausentes en M9, los cuadros verdes indican las proteínas ausentes en KB, los cuadros

azules indican las proteínas ausentes en KB + j.

50

Al hacer un análisis comparativo lo primero que se observó fue un incremento en el

número de las proteínas expresadas por efecto del jugo de hojas de Arabidopsis. Por

otro lado también se observó la inhibicion en la expresión de algunas proteínas.

Tabla 2. Número de las proteínas ácidas solubles más abundantes en cada gel y su

expresion diferencial en cada condicion.

Muestra Proteínas

totales KB KB+j M9 M9+j

KB 24 - 5 11 5

KB+j 64 43 - 38 44

M9 30 21 12 - 16

M9+j 42 21 21 24 -

Comparación y proteínas diferenciales

En la Tabla 2, se muestran las combinaciones hechas, para obtener el número de

proteínas que estan ausentes en cada condición de crecimiento, se observó que las

variaciones más altas en el número de proteínas expresadas diferencialmente se

detectó cuando la bacteria creció en presencia de jugo de planta, pero cuando se

compara KB y M9 existen más proteínas que fueron expresadas en este último

medio. Cuando se compara KB + j y M9 + j, existe mayor expresión en el medio rico

suplementado con extracto de planta.

7.6. Análisis de los patrones de expresión de proteínas comparando las cuatro condiciones de inducción.

Para hacer un análisis de las manchas de las proteínas que se observaron en cada

uno de los geles, primero se generó una figura con la sobreposicion de los cuatro

51

geles, tomando como referencia la posicion de las tres proteínas que estan presentes

en todos los geles (Tablas 3 y 4), enseguida se etiquetaron cada una de las proteínas

como se muestra en la Figura 13. Las proteínas se etiquetaron con números en

orden progresivo de proteína con mayor peso molecular a menor peso molecular (en

las figuras, de arriba hacia abajo, se etiquetaron 124 proteínas. Se comparó cada

uno de los geles mostrados en las Figuras 9, 10, 11 y 12 con la Figura 13 y se

preparó la Tabla 3, en donde se resumió en qué condiciones se presentó cada

proteína. Finalmente, se analizaron las condiciones en las que las proteínas se

presentaban (1; Tabla 3) o estaban ausentes (—; Tabla 3). En este análisis no se

tomó en cuenta la intensidad de la mancha solamente si estaba presente o ausente.

52

IEF SDS-PAGE

kDa

Figura 13. Sobreposición de los cuatro perfiles de proteínas de Psm M2 expresadas

en las cuatro condiciones de crecimiento. Se identificó cada proteína con un número

progresivo del 1 al 124 empezando por la de mayor peso molecular. Los números

con flecha señalan las proteínas identificadas teóricamente de acuerdo a secuencias

de genes mutados en el laboratorio (Medina, 2003).

53

Tabla 3. Relación de las manchas de proteínas numeradas y su presencia o ausencia

en los geles de las figuras 9a, 10, 11 y 12.

#b K KJ M MJ EXc # K KJ M MJ EX # K KJ M MJ EX # K KJ M MJ EX 1 —d 1e — — KJ 32 — 1 — — KJ 63 — — 1 1 M-MJ 94 — 1 1 — KJ-M 2 — 1 — — KJ 33 — 1 — — KJ 64 — 1 — — KJ 95 1 1 1 1 TODOS 3 1 — — 1 K-MJ 34 — 1 — — KJ 65 — — — 1 MJ 96 — — — 1 MJ 4 1 — — 1 K-MJ 35 — 1 — — KJ 66 1 — — — K 97 — — — 1 MJ 5 — 1 — — KJ 36 — — — 1 MJ 67 — 1 — — KJ 98 — 1 — — KJ 6 — 1 — — KJ 37 — — — 1 MJ 68 — — — 1 MJ 99 1 1 — — K-KJ 7 — — 1 — M 38 — — — 1 MJ 69 — 1 — — KJ 100 1 1 — — K-KJ 8 — 1 — — KJ 39 — — — 1 MJ 70 — 1 — 1 KJ-MJ 101 1 1 — — K-KJ 9 — — — 1 MJ 40 — 1 — — KJ 71 — — — 1 MJ 102 — 1 — — KJ 10 — — — 1 MJ 41 — 1 — — KJ 72 — 1 — — KJ 103 — 1 — — KJ 11 — 1 — — KJ 42 — — 1 — M 73 — — — 1 MJ 104 — 1 1 — KJ-M 12 — 1 — — KJ 43 — — — 1 MJ 74 — — — 1 MJ 105 — 1 1 — KJ-M 13 — — — 1 MJ 44 1 1 — — K-KJ 75 — 1 — — KJ 106 1 1 — — K-KJ 14 — — — 1 MJ 45 1 1 — — K-KJ 76 1 — — 1 K-MJ 107 — — 1 1 M-MJ 15 — — 1 — M 46 — — 1 — M 77 1 — — 1 K-MJ 108 — 1 — — KJ 16 — — 1 — M 47 1 — — — K 78 1 1 — — K-KJ 109 1 1 1 — K-KJ-M 17 — — 1 — M 48 — — — 1 MJ 79 1 — — — K 110 — — — 1 MJ 18 1 1 1 1 TODOS 49 — — — 1 MJ 80 — — 1 1 M-MJ 111 — 1 — — KJ 19 — 1 — — KJ 50 — — 1 — M 81 — — 1 1 M-MJ 112 — 1 — — KJ 20 — 1 — — KJ 51 — — 1 — M 82 — 1 — — KJ 113 — — — 1 MJ 21 — 1 — — KJ 52 — 1 — — KJ 83 — 1 1 — KJ-M 114 — 1 — — KJ 22 — — 1 — M 53 — 1 — — KJ 84 1 1 — — K-KJ 115 — 1 — — KJ 23 1 1 1 1 TODOS 54 — 1 — — KJ 85 1 1 — — K-KJ 116 — — 1 — M 24 — 1 — — KJ 55 — — — 1 MJ 86 — — 1 1 M-MJ 117 — 1 — — KJ 25 — 1 — — KJ 56 — — — 1 MJ 87 — — 1 1 M-MJ 118 — 1 1 — KJ-M 26 — — — 1 MJ 57 — 1 — — KJ 88 — — 1 — M 119 — 1 — — KJ 27 — — — 1 MJ 58 — — — 1 MJ 89 — — 1 1 M-MJ 120 — 1 — — KJ 28 — — — 1 MJ 59 — 1 — — KJ 90 — — 1 — M 121 1 — 1 1 K-M-MJ 29 — — — 1 MJ 60 — 1 — — KJ 91 1 — — — K 122 — 1 1 — KJ-M 30 — 1 — — KJ 61 — — — 1 MJ 92 — — 1 — M 123 — 1 — — KJ 31 — 1 — — KJ 62 — 1 — — KJ 93 — — 1 — M 124 — 1 1 — KJ-M

a Figura 9, K; Figura 10, KJ; Figura 11, M; y Figura 12, MJ. b Número asignado a la mancha en la figura . c Condiciones en que se expresó la mancha: K, King’s B; KJ, King’s B suplementado con jugo de Arabidopsis thaliana; M, M9; y MJ, M9 con jugo de A. thaliana. d — significa “no se expresó la proteína en este medio, porque está ausente la mancha en este gel”. e 1 significa “se expresó la mancha en este medio, porque está presente la mancha en este gel”.

Se encontró que tres proteínas se expresan constitutivamente, es decir, se encontró

la mancha correspondiente en todos los geles. Se encontró que 14 proteínas se

54

expresan en medio rico y no en medio mínimo, y el jugo de hojas de Arabidopsis

thaliana no tiene ningún efecto en su expresión (K-KJ).

El medio mínimo induce la expresión de 21 proteínas que no son expresadas en

medio rico, y el jugo de planta no tuvo ningún efecto en su expresión.

En las Tablas 3 y 4 muestran las siguientes observaciones:

1. Tres proteínas se expresaron constitutivamente puesto que se encontraron en

todos los geles.

2. Catorce proteínas fueron inducidas por los componentes del medio rico y no están

afectadas por el jugo.

3. De manera similar el medio mínimo indujo la expresión de 21 proteínas que no se

afecta por la presencia del jugo.

4. El medio KB indujo la expresion de 4 proteínas que tambien son expresadas en

M9 pero en presencia de jugo. Sin embargo, este jugo inhibe estas mismas

proteínas en KB.

5. Se detectaron 45 proteínas en medio rico con jugo de hojas Arabidopsis que no

se expresan en el medio rico sin jugo y tampoco en medio mínimo con jugo. Esto

sugiere un efecto potenciador entre los componentes del medio rico y los del jugo

de planta.

6. Se observó un efecto similar al anterior con respecto al estímulo del jugo sobre la

expresión diferencial de 26 proteínas que solamente se expresan en las bacterias

crecidas en M9.

7. La proteína 70 se expresó únicamente cuando tiene jugo independientemente del

medio.

8. En el medio mínimo y en el medio rico con jugo se expresaron 6 proteínas, estas

condiciones sugieren que la expresión de estas proteínas depende de emular las

condiciones del apoplasto o de la presencia de algun metabolito de la planta. Sin

embargo, estas proteínas no estuvieron presentes en M9 con jugo.

9. La expresion de la proteína 109 se inhibió por el jugo en medio mínimo.

10. La expresion de la proteína 121 se inhibió por el jugo en el medio rico.

55

11. La expresión de 55 proteínas se inhibió simplemente por el medio KB.

12. La expresión de 8 proteínas se inhibió simplemente por el medio KB con jugo.

13. La expresión de 33 proteínas se inhibió simplemente por el medio M9.

14. La expresión de 20 proteínas se inhibió simplemente por el medio M9 con jugo.

Tabla 4. Resumen de las condiciones de expresión o represión de las proteínas

etiquetadas en la Figura 13 y de acuerdo con la Tabla 5.

Proteínas que se: Número de la proteína: Expresan constitutivamente (K-KJ-M-MJ) 18, 23 y 95 Expresan en KB (K y K-KJ) 30, 44, 45, 47, 66, 78, 79, 84, 85, 91, 99, 100,

101 y 106 Expresan en M9 (M y M-MJ) 7, 15, 16, 17, 22, 42, 46, 50, 51, 63, 80, 81,

86, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 107 y 116 Expresan en KB o en M9 con jugo (K-MJ) 3, 4, 76 y 77 Expresan en KB con Jugo (KJ) 1, 2, 5, 6, 8, 11, 12, 19, 20, 21, 24, 25, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 40, 41, 52, 53, 54, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 72, 75, 82, 98, 102, 103, 108, 111, 112, 114, 115, 117, 119, 120 y 123

Expresa por algún metabolito de la planta, pero sólo en M9 (MJ)

13, 14, 26, 27, 28, 29, 36, 37, 38, 39, 43, 48, 49, 55, 56, 58, 61, 65, 68, 71, 73, 74, 96, 97, 110 y 113

Se induce por el jugo de planta en cualquier medio (KJ-MJ)

70

Se inducen por algún metabolito de la planta y por el medio mínimo (KJ-M)

94, 104, 105, 118, 122 y 124

Se reprime su expresión por el jugo de planta en M9 (K-KJ-M)

109

Se reprime su expresión por el jugo de planta en KB (K-M-MJ)

121

Se reprime su expresión en KB 5, 6, 8, 44, 12, 19, 20, 21, 24, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 41, 44, 45, 52, 53, 54, 57, 59, 60, 62, 64, 67, 69, 60, 62, 64, 67, 69, 70, 72, 75, 78, 82, 83, 98, 102, 103, 104, 105, 108, 111, 112, 114, 115, 117, 118, 119, 120 y 123

Se reprime su expresión en KJ 3, 4, 47, 66, 76, 78, 91 y 121 Se reprime su expresión en M9 3, 4, 9, 10, 13, 14, 26, 27, 28, 29, 36, 37, 38,

39, 43, 48, 49, 55, 56, 58, 61, 65, 68, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 96, 97, 110 y 113

Se reprime su expresión en MJ 7, 15, 16, 17, 22, 42, 46, 50, 51, 83, 88, 90, 93, 94, 104, 105, 109, 116, 118 y 122

56

7.7. Identificación funcional de proteínas inducidas por jugo o medio mínimo de Psm M2. En un estudio anterior, se usó una mutante de P. s. maculicola M2, la PsmMut8, que

tiene la inserción de un transposón artificial en el gen hrpZ. Con un segundo

transposón artificial se obtuvieron dobles mutantes. Se seleccionarón aquellas dobles

mutantes en las que la segunda mutación alteró la regulación de hrpZ y dobles

mutantes en las que el segundo gen mutado se expresaba más en medio minimo con

jugo que en KB. Se clonarón y secuenciaron 22 de estos genes mutados. Con las

secuencias se identificaron preliminarmente estos genes (Medina, 2003). En este

trabajo, se identificaron los productos de estos genes en base a su pI, tamaño y se

relacionaron con las proteínas de la Figura 13, se señalan las proteínas que

corresponden a los valores calculados y que están incluidos entre los límites de pH

analizados. En la Tabla 5, se indica cuál es la identidad de estas proteínas, cuales

fueron las condiciones de expresión y las condiciones de selección de las mutantes

(Medina, 2003).

Tabla 5 . Proteínas propuestas como candidatos expresados diferencialmente en las

condiciones probadas.

# Proteína Proteína Inducida Afecta expresión de hrpZ

Inducida en MJ

1 GacS KB + j sí - 2 P5CR M9 sí - 3 PGDH KB + j sí - 4 EX5C M9 + j sí - 5 PYRB M9 y M9 + j sí - 6 DAMX M9 + j sí - 7 RuvA M9 + j sí - 8 PUR4 M9 + j sí - 9 FABH M9 + j sí - 10 FdhD M9 + j - sí 11 PORB KB + j - sí 12 PlsX KB + j - sí 13 CYOC KB + j - sí 14 RPR KB + j - sí

57

En la Tabla 6 se muestran los datos relacionados con estas proteínas. Estos incluyen

la posible función, el microorganismo con el gen homólogo y el numero de acceso

con la secuencia completa a partir de la que se calculo el pI y el peso molecular.

Tabla 6. Proteínas de Psm M2 identificadas en 2D por su tamaño, pI y posible

función. #. de

Proteína

Proteína

Microorganismo

no. de

acceso

Función

kDa pI

1 GacS Pseudomonas syringae pv. syringae

P48027 Forma parte de un sistema regulador de dos componentes GACA/GACS (LEMA). Puede estar involucrado en la formación de lesiones, swarming y en la producción de proteasa extracelular, siringomicina y acil-homoserinlactona. Es requerida para la patogenicidad en frijol.

52 4.2

2 P5CR Pseudomonas aeruginosa

P22008 Pirrolina-5-carboxilato reductasa, participa en la ruta de biosíntesis de prolina.

31 4.1

3 PGDH Escherichia coli

P08328 En bacteria participa en el primer paso de la biosíntesis de serina.

47 6.0

4 EX5C Escherichia coli

P07648 Exodeoxiribonucleasa V cadena gama. Exhibe una extensa variedad de actividades catalíticas incluyendo exonucleasa ATP-dependiente, helicasa ATP-dependiente y ATPasa DNA dependiente.

67 4.1

5 PYRB Pseudomonas putida

Q59711 Participa en el segundo paso de la biosíntesis de la pirimidina.

43 3.9

6 DAMX Serratia marcescens

P45459 Directa o indirectamente interfiere con la división celular.

53 4.2

7 RuvA Pseudomonas aeruginosa

Q51425 El complejo ruvA-ruvB, en presencia de ATP, renaturaliza la estructura cruciforme en DNA superenrollado con secuencia palindrómica, indicando que este puede promover las reacciones de intercambio en recombinación homóloga. ruvA es una helicasa que regula la migración y empalme de la estructura Holliday por desnaturalización y realineamiento. ruvA, en presencia de DNA, estimula la débil actividad ATPasa de ruvB.

63 3.9

8 PUR4 Pseudomonas aeruginosa

Q9HXN2 Síntesis de purina de novo. 66 3.8

9 FABH Rhodobacter capsulatus

P30790 Cataliza la reacción de condensación de síntesis de ácidos grados por la adición a un acil aceptor de dos carbonos de malonyl-acp. KASIII cataliza la primera reacción de condensación la cual inicia la síntesis de ácidos grasos y puede por lo tanto destacar en la conducción de la producción de ácidos grasos.

42 4.3

10 FdhD Escherichia coli P32177 Necesaria para la actividad de formiato deshidrogenasa inducible por nitrato.

63 3.8

11 PORB Pseudomonas aeruginosa

Q51485 Precursor de la porina B, que funciona como canal selectivo de sustrato, para una variedad de azucares diferentes. Facilita la difusión de glucosa a través de la membrana externa.

55.4 4.19

58

12 PlsX Salmonella typhimurium

O85138 No conocida, probablemente involucrada en síntesis de ácidos grasos o fosfolípidos.

34 4.2

13 CYOC Pseudomonas putida

Q9WWR3 Complejo de oxidasa terminal del citocromo o. Componente de la cadena respiratoria aeróbica de E. Coli que predomina cuando las células crecen a alto nivel de aireación.

67 6.0

14 HrpR Pseudomonas syringae pv. syringae

P37930 Miembro del sistema regulador de dos componentes HRPR/HRPS que regula la activación del factor sigma HRPL el cual esta involucrado con los genes de patogenicidad de plantas, hrmA y avr. Probablemente interactúa con sigma 54.

66.0 4.02

59

60

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