IAPORAN HASIL FENELlTlAN FUNDAMENTAL I1

PERUBAHAN STRUKTUR SITOSKELETON BERBASIS MIKROTUBULUS DAN ULTRASTRUKTUR OOSlT

PASCA KRIOPRESERVASI DENGAN METODE VITRIFtKASI

Ole h Dr. Ir. Sri Wahj~n~ingsih, MSf.

Dr.lr. M.Sasrnko Djati,MS

Dibiayai sleh Direktmt Penelitian dan Pengabdian Kepada Wf&syaraW Dengan Swat Perjanjian Pelaksanaan Hibah Penugasan Penelitisrn

Desentralisasi Momor 0 1 ?!SP2fllPPID.~Mfi1112007 Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi

'Departemen Pendidikan Nasi~nal

UNIVERSITAS BRAWlJAYA PESEMBER 2007

I. Judul Penelitian : Pmubahan Stwldur Sitoskeleton Bwbasis MikrotubuCus dan UKraetruktur Oosit Pas= Kri~raservasi Dewan Metode ViWfiks t 2. Ketua PenelitF a.Nma : Dr. Ir. Srf Wahjuningsik,MGi b. Jenis kelarnin : P m p u a f l c.NIP : 131 759 598 d .ParrgkatlGabngan : PernMna /lV-A e.Jaba2an hngslnnal : Lelstor; Kepalal f.Juntsadf akultas : Praduksi TernaWPetemakah g .Perguruam Ting~i : Urriversitas Brawijaya 3. Jurn1.a Tim Peneliti : 2 orang 4. Lokasf hneliiian : Laborahdurn Reproduksi T-mak Fapet W-rikbpaw

dan Biolagi MslekirIer Eijlrmtm 5. K e r j a m dmgarr Institusi lain a. Warn Instans1 - 6. Masa P d i t i a n : 8 bukn 7. Bhya yen9 diwukan : Rp 24.0W.000 (duapduh empat juta rupim)

PERUBAHAN STRUKTUR SITOSKELETON BERBAStS MIKROTUEULUS DAM ULTRASTRUKTUR OOSIT PASCA KR1OPRESERVASI DENGAN

METODE VlTRIFiKkI

Sri WahjunCngsih dan Sasrnlto Djati

Tujuan perreMan dalah mengkaji uitrastnrhr olosit pas= vitrifikasi rnenggunakan konsmtmsi EG 30 Oh dqn lama papawn 8 medt menggunakanl TE.M (Transmisi EtMron Mikmkop). AnaJisa dat4 smra dwkriptlf. Hasil penelitian menunjukkan -sit hasil 4tMkasi rnempunyai =ria pdusida yang abnormal (fraktur), rnernbran plasma lapis gartdb mengalami ILis, bebermpa Wir korteks mengalami degenemsi dengan demjat rang yang leterlihal dan perpindahan butir kmteks di ruang psrivielin. Kesimpulan dari penelitian Ini adaleh terdapat penlbahan ultrasttwktur pada i t h v;mkasi mnggunakan EG 30 74 ctengan lama pqparan 3 menit. Keywords: V ~ k a s ~ , u ~ ~ r I ~ i t hmbing

THE CHANGE OF CtTOSCELETON STRUCTURE BASED ON MICROTUBULUS AND OOCYtE ULTRASTRUCTURE AFTER

CRYOPRESERVATION USING VtTR1FICATION METHOD

The aim af this research far the second year was to nnaliiped wltm~dufal d cryop~nred czooyte using vitrification method by Twnsmissi~n Electlrone Miomscope UEM). The results of the research showed that cryapresenred mcyk using vitrification had ultrastructural change :mna frastUre, lysSs of membrane plasm, chamge d wr@aC granule position to per vit&in space and degeneration of mttical gmnub. The condusbm of ,this research was that vitrification use 30% EG and the time af exposum during 3 minutes caused ultrastructural &aflge in goat w@e Keywords: WWlcation, ~ISrastructural, goat mcyte

Pvji dan syukur .Icehadid Allah SVVT karma b e h t rahmat dan

k,ar~niaNYA, ,pbksanaan Ipemlitian dan plembwtan laporan penelithn

Fundamental h h u n prtama ini dapat did-ikan. Petaelitian ihi dibiayai dengan dana dari Direfdaraf .i endera1 Pendidikah

Tinggi, Departemen Pendidkan Nasionai, Kontrak: Nornor: Surat Perjanjian

Pelaksanaan Wibah Penugasan Penelitian Des~~ralisasi Nomor

01 ?1SP2HIPP;tDPZMIl'IlI2007

Pa& kesempatan ini kaml menyampalkan tex3ma kasih kepada yang

terhomnat: 9. Dimktorat Jenckmi Pendid;ikm f inmi, Departemen Pdidikan bfasidnd,

2. Rekot Uniuersltas Bmwijaya

3. Ketua lLmbaga PenefKbtr Unibraw

4. Dekan lFakulhs Peternaka Unibraw

5 Kepala dan gtaf Laboratorim TEM dan Hisiologi bboratarim Bjolpgi

Maiekufe~ Eiijkman, Jakarta

6. Smua pihak ymg klah mwnbsrikan rekomendasi, menyetyjui dan membantu

pelaksanaan serta penyusunan laporan peneiitiw mP. Sernoga basil penelaim ymg ditrsangkan ddam lapran ini bemanfaat

bagi pihak-pi hak yang mmerfukan.

Mabng, 3 DesmWr 2007

Tim Peml'hi

DAFTAR IS1

H A M A N PENGESAHW RFMGKASAN PRAKATA DAFTAR IS1 DAFTAR GAMBhR MI3 I. PENDAHULUAN BAB 11. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kriopmrvasi Ooslt ~Mesaggunakan M W s viiflbsf

2.2. KualFbs Oasit Pasca Vitrifihi 2.3. Penrbahan UltWrukur Omit Setelah WbiBkasi

8A8 )!I. TUJUAM'DAAI MANFAAT PENELINAN BAB IV. METODE PENELiTIAN BAB V. MSIL DAN PEMBP~HASAN BPI6 V1. KESIM PULAN DAN SARAN

6.1. Kesirnpulan 6.2. Swan

DAFTAR PUSTAKA

Gam bar

Satah satu kernajuan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang biulogi

rtproduksi adalah teknologi tmnsfer embrio. Sakh satv hambatan dalam

pelaksanaan program transfer embrio (TE) pada tern* di Indonesia adahb

f a k t ~ r ketersediaan smbrio yang berkualitas unggui. Upaya ini dapat . d i r ~ k h

dari beberiapa surnber (1) koleksi embriu dari ternak M n a danar yang

disupemvulasi (2) pFoduksi embrio melaiui ,proses fertiIIsasi in M t m (FIV).

Produksi embria secara in wive memerlukan biay yang relatif tinggi dan

jumlahnya sangat terbatas, khususnya jika mempruduksi embrio yang dikWsi

dari safurrtn reproduksi betina donor yang disupero~w1ad. Pdulcsi embrio in

d b merupakan alternatif yang bLa dirnanfaatka~ untuh me'idap-n embrio.

Secara umum ptoduksi embrio secara in vitm yang meliputi maWrasi omit,

ferttflsasi dan ku#ur in vitm telah dnaporkan pada hewan tern& kambing dan

sapi (Djati, 4999; Wahjuningsih dkk., 2 0 I )

Teknologi FIY saat ini di Ind~nesia dilakwkan dangsln mmanbakan -sit

segar yang d i b l e h langsurtg dhri Rumah P o w Hewn (RPH). Nm-uri

demikian, kendala yang dihadapi adalab oosit mamalia rnerniliki daya tahan

hidup )fang sangat terbatas sehiqgga tMak dapat dlsjmpasl d&rn waI$u yang

lama pada suhu kamar. kteibatasan waMu simpan ini dapat diatasl &man

teknIk penyirnpanan beku atau kriupresti)rvasi wsit unbk mempertahankan

blangsungan htdup sel sehingga viahilitas omit dapt dipemhankan .

Teknologi rekayasa reprodwksi khususnya k r iopremi telah

dikernbangkan untuk spematozoa dan embrio, narnun wjawh ini kebrhasilan

kriopraservasi oosit yang ktah dilaprkan masih sang& terbatas dan varidif.

Penggunaan prosedur kriapmsewasi msit secara kornenial rnasih sangat

teeat?? [fajta, 2000). Pa& awa! studi tenbng Mopres~rvasi, - - e l a k h n

k r t o p r e w a s i menggunakan metode konvensional, namun saat i i meide

vltrifikasi lebih sering diaptikasikan- Metode tersebut sedsrhana, murah dan

tidak memartukan alat khusus untuk manumnkan auhu secata brkthap dan

dapat merninirnalkan pernbentukan kristai es sehtngga nudah diaplikaskkan di

tempat yang rnsmiiiki kuntainer nitrogen cair. (Shaw ef aJ., 2OOU),

Selma proses kriapmniasi dipdidcan suatu kriogrotektm.

'Krioprotektan slain dapat melihdungi sel juga temyata diduga &pat

rnenirnbulkan kerusakan pada sel akibat pengaruh toksisitasnya. Derajat

ptoteksi dari bahan krioprotektan terhadap proses krEstalCsasi pad4 masa

~lpembekuwn tergantung dari jenis clan Isonsentmsi krioprotektan yang dipakai

serrta lama paparan (Leoni ef a\., 2002). Dan bebrapa p n s l i i n tentang

ktiopreservasi omit, dikehhui ada bemamm-macam krioprotektan yang dapat

digsrgunakan untu'k vitrifikasi oasit, namun demikiarr telah diketahui bahwa

etilen gllkol (EG) mernpunyai efek hksih yang lebih rendah dtbandingkan

krbprotektail @iiQ Jain (Gotdon, 19W,;; Hachi et a],, 1995).

Pada tahun peama telah dipersteh hasil bahwa haitas oasit twbaik

ditzgsifkan pasca vitrifikasi memggunakan Etilen Gtikd 30 % dan h a paparan

3 menk. Evaiuasi pngaruh sitologis setelah perlakuan menunju'bkan brrrsakan

pmanen yam t i i k tampak setelah paparan krhyroWan [Han et al.,20[b4!)-

Uleh wbb itu ,pendihn pada tahun kedua adalah mengarmati uttr~b'uktur oosit

owit hasil tVM yang blah mengalami proses v'rtrifikasi pa$a tahun perkma.

2.f. K r i c r p r ~ ~ s ~ ~ i nos& menggunakan mewe 4W1)rasi

Secara garis besar ada dua metode kriopresewasi yaitu 'konvensional

(sbw hexihg) dam metode vitriflkasi. Pehdaan yang merldasar dr'mtgr;?

kedua metode tersebut addah pada metode konvensiongll terjadi pemsdabn

airan melalui pmbntukan khstal es, sedangkan pada vitMikasi pemadabn

cairan tanpa mlaIui pembnttrkan krisial es intrasetuler (Men et al 2003).

Ktiopreservasi dngan metoda konvensional mmedukan perslatan W i n g

machine (cryoeelt) yam harganya sangat rnahal unbk menufunkan swhw

berhhap, prbses kribpresemsi memeduk8n waMu yang relatif iama serta

terbmtuk krislall es intraMuler sehingga mehsak organs1 oasit. DWndingkan

sistirn komndonal, keuntungan kriopreservdsi secara vittflkasi &ah tidak

mmerlukan freezing rnaclrjne {Cfyo#Ci',l dbsl prows ktiopresevasi wpat,

narm un kelernahannya adalah seringkali teljddi toksisitars karma tingginya

molaritas lamtan wWkad (Acker ef ale, 20Da;lhn eta/., 2004)

Tidak seperti pada krlopmsemi embrio, pnggunaan pmsedur

kriapraewasi aosit secara 1 komersial rnasih s a n e * tehatas. Sifat yang

berbeda pada ooi t dan ernbrio sepbrfi wkuran, bbfltuk, pemeabillbs, kuafitas

dan sensNvitas, btgantung path spasies, tahap perkernbangan akan

menentukan kondjsi yang paling @at urrtuk keh~hasilan 'Mopmervasi

(VaJta, 20Ml; Qwllo d a!. ,2004).

Pada pr;mes wtYrlPikasi dihutuhkan kriopmtetdan. Ada dua sisi ymg

berlwanan dari penggunaan krisrprotektqn, ygRu salain dapert mdindmgi =I,

kdoprotekhn &pat rnenimbutbn kermakan pa& sel What pengaruh

kukdsitasnya. Konsmtrad kdqwcdektan yang mdah daIam mdlrsm

kriqobktan a b n mnyehbkan kerus&n msit menfanya ~kristal-

kriaB8 es intramtuler, aka tebpi knnsentrasi , k r i o i p r w n yang tinggli dapat

Wsik dan menyebibkan kemsakan osrmtk pa& amit. Diantara

kriopraZekbn irrtraseluler, @film glikd rnetwakan yaog paling 'banyak

digunakan dalain proses pernbekuan (Saha et &., ?Sf%). Dibndingkan

Mgan glisml dan proclplien glukd. dilm glikol rnemifild tokisitas yamg bbth

~mdah'kwena elen gIiko1 paling mudah menyerap air datm -it Bibanditytkan

kriopeoMZan blnnya (Motgmisligil et d., 1936, Wahjuningsih, 2002).

Panggunaan elllan gfikal &bagai kribprofektan htraselulreri juga biungkapkrt

otet~ Gordon (I*).

2.2. Kuaf Stas wsit pasca kriopresewasi

Hasil permtitian Kbwayarna et d., (t!3Q9) p d a aasit mus ia bahwa

mQade vitrifikasi ddengam carrrplrwn 30 % EG dan 6.5 M S u b = dapat menjaga

viabititas oosit miefah dibekukarr s e k r 00%. Wsai (19963 rnembuktfbian

behw penamkhan N% EG padn larutan PfJS menh$ka%n tingk&t

kelangsungan Ridup ataw survirral mte in vW oolsit ~fiius sam,pi cferrgan 98%.

Mmun demikian ~ n d i t i ~ a n b e M a dibandingkan dengsn hasil penditian

Otoi ef el. (1 W8) yang menw rajukkan b h w a penggmaan ~kriaprotebn EG 40

% daIam lamban vitrZfjkasi kbih balk penganrhnya krhadap viabititas

dibondingkan EG 50 %. Perbedaan ini disebabkan lama paparan yang &&&a.

Hasil penditianl bhun pertarma rnenunjukksm bahwa persentase morfologi

oasit normal berbeda pada komtmsi dan lama paparan yang beheda. k i n a

,paparan 3 menit dam kansentrasi EG 30 % mmberikan maffologi normal

terbaik. ~srldkuan EG 30% ckhgan lama paparan 4 menit dan EG 50% den@ii

lama paparan 5 menFt rnenunjllrkkan nilai rnarfohgi aosit normal yang terendah.

Konsentrasi EG berpengaruh sangat nyata [p<O,Ol) terhadap yang hidug,

sedangkan lama paparan tidak msmpunyai pengaruh (p>0,01) terhadap Wsit

yang hiidup Konsentrasi EG dan bma paparan berpsngaruh nyata brhadap

uiabilitas oosit. (P<O,Ol). Kunsentrasi 30% EG dengan lama papman 3 menil

~merupakan konssentrasi opiirnal yang dapat rnenjaga viabilks omit hasil

vitMbsi. (Wahjuningsih dan Djadli, 2006). Narmun demikian penerrtian ini berbeda

klbandingkan dengan hasil penelMan Otoi et at. (1998) yang mehunjukkan

'bahwa ,pcnggunaan krioprotektan EG 40 % dalam fanitan vitdflkasil lebih baik

pengamhnya terhadap viahifitas dibandindkan EG 30 %. Perbethan ini

disebabkan lama paparah yang beheda.

Be-pa faktor yang dWuga ciapat rnengaklbatlcan perubahq a-fukgi

dan fungsi blotogis oosit addah pemaparan tmhadap kbprotektan (Taha dan

Sceliander, 1982; Kubota ef a]., 79981, proses pertdinginan (Aman dart Park,

11994) serta kdstat es yang t&enOuk ( Asada et a!., 2002; Vajta, 1997).

Hasill penelltian ini menunjukkatl h h w a penurunan tingfcat fdtlsasi oosit

hasii vizrifikasi di$&atjbn prubahan rnarfologj, viabilitas dan struktur oosit.

Vihikasi diduga msit dapat mengakibdbn kawsaLan pada zona peiudda,

membran plasma dan, organel sitoptasma mrti s k o s k e h sel (Amv @t a!.,

1903; Hochi et aL, 1996; Vajta 1B7) dan butir-bul kod& (Fukui et a!., 1995;

Hyttel ef al., 2001)).

Pemdingfnan dtduga dapat daprrt rnenumnkan tingkat fertilisasil kamna

kerusakan organel oosit (Didion eZ d, 19210). Pengamatan ultragtruMur wsit

mengguWn transrnisi elektmn mikr&kclp yahg dilakukan oteh Fukui et el.

(1995) membuktlkan bahwa vitrf~k&ai dapat rneny8bblcan aleh skositmis

gr;anrha, kart&, nawn bagaimaria rnekanismenya blum dapat mdijel=km

3.1. Tujuan Penelltian

Mengkaji kualitas omit paaca $ i k a s i menggunakan konwntrasi EG

30 % d m lama paparan 3 inenit terhadw aftrastmktur rnenggunakan

TEM (Twnsmisi Ebktmn Mlkroskop)

3.2. Manfaat Fendlaan

Mempem1e.h informasi tentang ultm&mktur oosit pasca vltrifl kasi

mngglrnakan konsenfrasi EGj30 % dan Ima paparan 3 menit

Mengembattgkan Wnolagi kfiopmerv~si osif

Penelltian dlahkan di hkraturiurn Replduksi Temak Fakultas

Pemakan Unibraw dan Labomtotiurn Hietolqgi dan Tmrrsrnisi Efdctron

Mitcroskop Lernbaga Biologi Molekuler Eijkman - Jakarta

Tahapan Penel iibn

Kobksi omit:

Ovadurn dikurnputkan dari RPH Sukun Malang balam Readaan sqar dan

dirn~ukkan dalgm medium bsrisi k C I D,9% + Penislbn 100 Ill + Strwtornisin

100 IU pada suhu 35'C. Kokksi mil dengan cam aspirasi. dari bilk4

mengg~nakan jarurn dengan ukumta 118 G. hrtediurn aspi$& yang 4ig~naCran

TCM 199 powder (GIBCQ, Cat Fa 211200b760) dihrmbahkan Hepes dan

NaHC03, media ini difiltrasi dengan men$gjUhakan membran filter bewkuran

diameter 0.22 urn. Medium aspirei disia@kan dln diinkllbasikan minimal dua jam

seblum dlpergunakan. Evalumi ku(is3s boa# immature dilakukan berdbsarkan

krkteda Mozclrni (ZCKII). Hanya omit berkuaIIhs A prig digunakan untuk

penditian sdanjutnya (SiP+a$m kompak m r a sempwrna dengan sd~sel

kurnulus hraturan menempel di kes&lh~han bagian omit)

Mabml UOsSt in v m

Setetah dilakukan ktasifikasi kualitas oost, maka &€ yaw klrkuditas A

dimatvrasli secara in v i h dengan medium TCM199 + FCS 10% + PMSG 110 IU +

HCG 10 IU sekrna 24 jam rlalarn inkubat~t pada suhu 3g°C dan 5% .C02,

kelembaban 95%.

Kriopresewasi -sit rnengwnakan n n d & viMAkasr

Omit hsisil lVM dipaparkan ke dalam larutan vitrifikasi yang yaw

rnsngandtr-ng 30 5% + 0.5 M Strkfosa dengan lama waMu paparan 3 menit.(hasil

tahun peama). Omif dimasulckan ke dalam minishw transparant 0,25 a:

(Fmmk s b w ) masing-masing W$i 10 omit. Setelah pernaparan di dalam uap

nitrogen selama 10 ddk, m i n i d m yang tserisi -it dimasuklcan dalarn

kon&i'ner httrogen cab dan tiisimpan setarner 2 rninggu unfuk analisa LeMh lanjut.

Warning omsit

Setelah msit dalslm mjnistmw disimpan dalam kontainer seiarna 2 minggu, o~s i t

yang telah mengahrni vitrifikasi dihkukan thewing &ngan cara penghangan

(warning) di udara selarna 10 detik kernudian dirnasukkan daiam penangas air

suhu 35% sekma 1 menit. Isi mdnisCmw dituangkan ke &lam cawan petri dan

ousi? dlbllas d m kalE dengan sukrcsa 0.5 M untuk rnenghilangkan krioprektan

seperti prasedur yang dilakukan oleh Sun et aL(t995).

AnarlPsis ultrastruktur QOS# pasca vitriflkasl

Metode yang dtgunakan herdasarkan t-tytbl cfan Madsen (11987) dengan

rnodfhsi. Owlt segst d m wsit Mi-ll hasil \EitNkasi yang tekh mengalami

warming difiiFlaesi bC &lam larutan PBS (pH 7,2 - 7.4) 0.1 M yang rnengandung

paradomaldehid 2.0 % &an glwtamtdehid 0.1 M pada suhu 4 o C sefarna 60

men# W i t dkuci due kali dalarn PBS 0.1 M suhu 4 & masingmesing =lama

5 mnit ditanam pada agar 4 % dan difiksasi ~ ~ l I dalam lamb IPBS p n g

rnengandung Os04 I ?4 pad suhu 4 oC *lama I jam. Selanjutmya didehidra~i

daiam serial a n d ' krtingkat &#I dftrtnam dl dalarn epon. Setelah difakukan

petnotongah serbl setebal2 mihameter pmpamt diwamai dengan foluidine biue

dan dipriksa dl bawah mikroskop caMya. Ssri potrmgran 2 mikrometer yan$

ferpilih danjutnya dbnam brnbaTr [mkdding) dan dilakukan pernotongan

setebal, 60 nm. Potongan uB,m @pb tersebut dbkatkan dt atas grid termbaga dan

dikomltmskan bwturutlturut dmgaq uranfl a- ~ d m a 30 mmit dam lead sitrat

selama 1 5 menit. Pengamahn u l t ~ ~ ktur msit dmgarl Tmsmission

EImimne Micmwpe 0 dikklrhn tiwhdap keadaan rnembmat plasma

wrta organel loosit .

V. HASIL DAN PEMBAHASAM

Pada hhun p a m a tehh dipetoleh had bahwa kuatibs oosit Wbdk

dihasilkan pasta Mrifdcasi mnggunakan Etibn GIikol30 % &an lama paparan

3 m i t , selamjutnya pada penelitirrn ini dihkukan pengarnatan u!trastruktur.

Zona pehsida oosii setelah vmkasi dapat diklasifikasikan berdasarkan

marfafbgi normal dan tidak normal (gmbar I dan gambar 2). Omit basil

vitflliasi menunjukkan bentuk yang abnormal (fraktur) seperti ditunjukkan pada

Cambat 1 , sedangkan m i t segar (lida k mengalami vttrifikasi ) rnempunyai zona

pelbsida yang rnasih utuh seperti dftunjukkan pgda Garnbar 2,. Seperti dkketahui

bahwa interaksi spermatozoa dan sel blur brjadi meblui bekrapa farse pada

permrrkaan oosk yang diawat5 dmgan pedekatan pada M k s ekstmselukr

dan selarrjunta pstda membrane plasma aasit: (Evan, 2000). Pade rangkaian

proses internhi tersebut ZP memwang peranan pentinp, Terikatnya

spena40zua pada ZP adalah interaksi m i f i k yang maupakan kunci pengdur

proses fertflkasi. Setelah penembusan ZP maka spematozua be& dalam

ruang petivitelin dan menempel psrda mrnbrene wlblin. Proses vikfikasi

dapat merusalr zona pdlusida,,membran plasma dan siroplasrna mhingga

menyebabkan oosit brdegeitems1 (Park dan RWimg ,1$@2), Te jadinya,

abnsmalitas pa& ZP seperfi hktur menyebabkan hamlatan tetjadinya

proses fertilisasi* Fuku ef al ( tM ] menyebutkan bahwa pernbekuan dapat

rnenyebabbn pembahan ZP, yaRu terjadinya pengemsari (hardening) yang

d b n mertyetlabkan psnurunan angka ferhasi.

Pads penafitian ini pubahan ultrastruktur yang terS;adi pada wit Mtll

setelah vifrifikaei adaiah di ddam EG 30 % ckngan lama paparan 3 menit

adabh adalah terjadinya prpindatran p i s i erta degenerasi dari butir-butis

k o M s seda terbentuknya wsikel besar. Pew& hart distfi busi dad buti-butir

kofleks yaitw, se3ain tersusun wcara soliter juga b m p k beskelompuk dl

bebmpa lakasi, bebrapa butir kart& mengalami ciegeherasi dengan brajat

yang ~ ~ a - b e d a swta eksr~sitosis s+ yang terlihat dari adanya sha-&sa,

butir katteks di wang perivibtin. Parubahan lokad dad butir-butir k&s ini

diduga terjadi akibat proses dehidrasi rnaupun mhidrasi pada proses vitfifikasi.

Fusi dari kortikal granul dalam ornit dergan membran plasma oosk dan

deposisi kandurtgan kortikal gmriuI dalarn ruang perivitdln meyebahkam reaksi

zona untuk memblok patispermi. HahbdMn tethadap pdispemtia addah

peristiwa waI yang sangat pewng selama aktlvasi oosit Fertilisasi cm4t yang

klah lmngddmi kemsakan menyebdtikan reaksi kodikal panut bid& mpurna

yang akan rrlengakibatkan polispmia { Burkin ddh Mulbr, 2000). PewMan

pada butir&Mr kurkdcs didgga Wt wbdgal +&or penyebab taqadinya

polispernola padit a~s i t aetehh vitri@kqsi. ~erubhan tersebut serupa dengan

yaw telah dihporkan pada mit sapi set8lah vi~fllidsi (Fob el el. 1986; Hytte1

eta/., 2001).

Pada ocasit Mt-ll setelah vitrifikasi menunjukhan terjadilnyo kemirakan,

1Dat4 bsrgian luar tmpak bahwa membran lplasma lapis gmda rnengaktni lids,,

vesiket-uesikei baik soliter rnaupun dalam badam fwi tenusun di bawah

membrane plasma, rnarnwn batas mmbrane Wikl tat'npak ti&& jslars, ~butir-

butit but& krsusun m r a soliter rnaugun berkdampok, namun mengalami

degenerasi. Begftu pula dengan organel-organd la imp seperki mItrrlc~ndiia

dan badan golgi tampak mengolami degenemsi. Butir-Wr sisa organel yang

rnemgalarni thgenemsi 8hm&ar di &jam sitqtlagma. Kenrsakan otgeheIl

ternbut metryerupai kerusakan yang terjadi 1p;ldzi sosit sapi tahap Mt-ll akibat.

prosles pembekuan yang diduga kerllsakan tersebut didkibatkanl oleh kristai es

flng W m t u k (Sun, 1996). FaMor lain yang dapat menpbabhnl tefladnya

kewsakan adalah terjadinya deWm5 baik daci swspensi media intra $an

ebkawluhr seflingm oosit mengalami pengkerutan mau pun pmbengkakan

(swelling). Strakgi yang dgunabn ,~rltuk utltuk menghindari tokeisitas larutan

vitrifhsi adaldh memperpeek waldu pemaparan dengan ta~ubn. Marnunjib

waMu perriaparan iellalu pmdslr, m&a wk#rap~h kdoprotemn tidak akup.

sehingpa es intrabeitiier tnasih dapdt be&enikrk. Olah karma & W u

gsJnapar.mn opumal bntuk kebrhmilan ~tblflkasi~ diperluirran sebagai batran

pdimhngan untuk men~umngi bkisitas ddh mbrtjaga agar fidak t8rb0ntUk

kdstai BS intmwluler.

. - - - A , ' - % * _ - - .

- - ,4( - p - - - 1 , 3 : .L = & I 1

I .. .. 11: s7- .-3-53-- .- ;5<-# : . .*&- I- t ,*, - . I*: .$;=v ,.& 1,

VI. KESllHPLlLAW DAN SARAN

6 Kesim pulan

Terdapat perubahan ultrastfulrtur pacia omit Mt-ll setelah vitrifikasi

rnenggtlnakan EG 38 % dengan lama paparan 3 menit. Fembahan ulfrastfuktur

yang terjadi ;addah ahormerlitirs mna lpeiusida,membmn8 piasma, perpindahan

wisi wta degenerasi dari butir-butit korteks

6.2. Saran

Untuk mndapatkan analisa yang akurat tentang u!iTasbuktur omit hasit

vitrifikasi dieerankan mena&& jwmlah mpel

r P&u dikaji IaiR lanjd mkmbme dugaan tetjdinya~ aibnomslMs m a

,p#lusida pada oosit basil vitrifikasi

Acker,J.P. and Lmksley, E.M. 2003. Pr&Wve effect of inlmceliular ice during f~:8e&ld ?. Cryobidogy 46 : 197-202

Djati, M-S,, 1999. Plengaruh suplmentasl PMSG dm hCG pada proses fertilisasi in vitro dan kultur klon embrio sapi dertgan IQF-I . Diseriasi hal 25. Program Paswsarjaina lnstitut Pertanian Bogor, Bogor

Burkin,H.R. and D.J. Miller. 2000. Zana pelltmida protein binding abillity of porcine sperm during epididyrnal maturation and the acrosomal reaefEbn, Dev.Biol. 222(1) : 99-1 OQ.

Fukui, E.J., Xh, L. and Downey, B.R., 1995, Ultrastructural changes in bovine oocyte cryopressrved by vitrification. Ctycrbhlcgy 32(2): 1 3Bt 56.

Evan,J.P. 2000. Getting spem and eggs togefYEer : Things cansenred and Wing diverged. 8iol.Reprd 63 (25: 355-300.

Fwku,E.,Liu and B.R. Downey. 1995. In vitro viability and uttrastrucrtural &awes in bovine oocytes beated with a vitrification solution. Mal.Reptob.Dev. 40 :I 77-1 85

Gordon, 1. 1904. Laboratory produdion of cattle embryos. Cab. International. Cambridge. 55.65

Han, B and Bischof,J.C. 2004. birect -11 injury associated with euktic crystaIlization during fmzibg. CryobioEogy 48 : 8-21

Hochi, S., Kimura, K., lto, K, ~ i ~ b a p a ~ h l , M. 1996. Effect of nuclear stages during in vitro maturatidn on th& su,~val of bovine oocytes failawing vitdca#un. Thwiogendog), 4 8 : ~ ~ .

H a i , S., ~tljimoto,~., and Oguri, N. ?fW. Yibility of immature horse oocJrtes cryttpksen/ed by vitrification. Theiogenofogy 42236

Hotdmkligil, S., Toner, M, and power, R.D. 19W. Changes in membrane integw, cytaskekl stmdum, and dewlopmenhI poterrt.iat of mudne awytes after vitrSffcatlon in ethylene gfycol. Biatogy lRepro$udon. 55:IBl-168.

Hmurni, T. 2001. Reproductive Biology ahd %fotechnoiogy, Japan Int@matlanal Coopemtion Agency. fndanesia.22-27

HyW, P., Vajta, @. and Caliasen, H. 2041Q. Vitrification of bovine oooytes with the open pulled straw method : Ulfra-structural consequences. MoI. Reprod and Dev 56~80-88

Kasai, Mi 2802. Advances En the ~ryopresewatiorr of rnarnrnafian -8s and embryos: Development of ultrarapid vitrification. Reproductive Medleitle and Bidogy. I 1 9 . http:l/www. blaclwell-synergy .corn/ IinksldoillO.1 MWj.1445781.2002.~00OLP.

Kasai, M. 1996. Simple and effiier'tt methods for vitrification of rnamalian embryos. Anirn. Reprod. Sci 42:67-75.

KUbota, C., Yang, X., Dinnyes, A,. Todoroki, J, Yqrnakuchi, H, hlkushita, K, Inohae, S, Tabara, .I. 1998. In vitro and 'In vivo survival of frozen- thawed bovine aocytes after IVF. nuclear tran$&r and parthenogenetic aEtSvatiun. Mu1 Reprod. And Dev 51 :281-286.

Kuwayama, M. and Kata, 0. 1999. All-round v'hifmtian methods for human oocytes and embryos. Kata Ladies Clinic. Tokyo f fN-OQ23, Japan.

lane, M-B,, Bavister,B.D., Lyons and Forest, K.T. 1999. Containerkss viprificatiun of mammalians eocves and embrvas. htfp: t lw, biotech. nature.com,

Leuni, G., Boglioli,L., bedinguer, F., Rasati, I., Pintus, P.P., bdda, S., Naitana, S. 2002. Defined media for vitrifidon, wdttnlhg and rehydration : effects on pbst-thaw ,protein synthesis and vi&itIty of in vitro derived wine embryos. Cryobjelogy :2W212.

Men, H.. Mofibon, R.L., Parrih, J.J., and Rutl&@, J.J. 2003. degeneration of cryopmenred bovine oocytes via apoptdsb during subquenf culture. Cryobiol~y 47 : 73-81. -

Otui. T., Yarrlam~b, K., Kqarne,'N., TachikaW, S. and Suzuki, T . 1998. Cryopresenratian of mature ,bovine by Yitrifidtion in straws. Cryobiobgy 37 : 73 -85

Shaw, J,M!, QranWnachai. A. and Trounspn, A.O. 2Q00. Fundmental cryclhiblugy of rnarmalian oocykw and wadan tissue. Tkriqenoiogy 5%. 59-72.

Swn,Q.Y., Yang, Q.Z.,Liu, Q.Y., Feng, H.L. and Qin, P.C. 1996. Cryopresenratians df bovine oocytes matured in uitro, Thelriogsndogy 42:329.

TriwulanningsR, E. 15397. Pembekwn ernhrio derrgsn bwbagai IcrbpmWcfan dan met&e pambekuan. Prosiding Seminar IUasionaI Petemelcan Veteriner. Balai Pehelitian Temak. Bogor

Vajta. G. 2000. Vimcation of bovine mcybs and enatstyo. Embryo Technalogy CemMr, Danish Institute af Prgricultutql Sciences, Denmark

Wahjuningsih, S dan Qati, M.S. 2003. K ~ ~ ~ b aosit sapi Madura untuk pelmtahan plasma numb Indanesb, Makdl'ah ssmioar Indonwia Toray Science Foundartian, Jab& 4 Pebrusri 2003.

Wahjuniilgsih, S. 2002. tn vitm maturation of bovine cwyts derived from ~opmervat ion of dlmetyi sulfoxide (DMSO), Glycerol, and ethylen glycol (IEG). Journal of Reprotech; vd. I. No. 2:9&%