1

Cytogenetisk diagnostik 2005 (PCR, FISH, CGH)

Thue BryndorfKromosomlaboratoriet

Klinisk Genetisk Afdeling

Hvorfor er vi der ?

Dr. Lejeune

Trisomi 21 (Downs Syndrom)Oplæg

• Klassisk cytogenetik (kromosomer)• Nye metoder

– Kromosom-PCR til hurtigt at diagnosticere de hyppigste fosterkromosomfejl

– FISH og CGH til mere sensitiv kromosomdiagnostik

2

Prænatale prøvetyper

• Chorion villus biopsiFra 11u+0d

• AmniocenteseFra 15u+0d

Kromosomundersøgelse I

• Cirka 7.500/år i DK. ↓• Dyrkning af fostervands- eller chorion

villus celler i 10-12 dage• Standsning i delingsfase og herefter

– fremstilling af karyotype (d.v.s. samlet billede af alle fostrets kromosomer) og

– Kromosomoptælling• Svartid: 2-3 uger

Metafasekromosomer Karyotype

3

Kromosomundersøgelse II

• Hyppigste fund er NY-opståede sygdomme med ekstra eller manglende kromosomer (numeriske aneuploidier)

Prænatalt detekterede kromosomfejl i DK, 1993-2000

Kromosom 13, 18, 21, X og Y aneuploidier udgør 60-75% af alle prænatalt detekterede kromosomfejl, men 90-95% af alle de klinisk betydende kromosomfejl hos nyfødte

40 %Andre

16 %Kønskromosomfejl

44 %Trisomi 13, 18, 21 i alt

4 %Trisomi 13

10 %Trisomi 18

31 %Trisomi 21

Kromo-fejl i fostervandsprøver

Fra “Practical genetic counselling” af P. S. Harper, Oxford 1993.

0,739,647

0,737,746

0,716,245

0,705,044

0,614,543

0,583,742

0,582,941

0,582,340

0,571,839

0,551,538

0,521,238

0,501,036

0,450,935

Relativ andel af trisomi 21Alle kromosomfejl %Maternel alder

Kromosomundersøgelse III

• Sensivitet

Cirka 10 millioner DNA-basepar

4

CACTGTAGCTGTACTACCTTCCATCTCCTCACCTATTCCAACTATCTGAATCATGTGCC CTTCTCTGTGAACCTCTATCATAATACTTGTCACACTGTATTGTAATTGTCTCTTTTACTTTCCCTTGTATCTTTTGTGCATAGCAGAGTACCTGAAACAGGAAGTATTTTAAATATTTT GAATCAAATGAGTTAATAGAATCTTTACAAATAAGAATATACACTTCTGCTTAGGATGAT AATTGGAGGCAAGTGAATCCTGAGCGTGATTTGATAATGACCTAATAATGATGGGTTTTA TTTCCAGACTTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGGGTAAAATTAAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT TAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAA AGCATGCCAACTAGAAGAGGTAAGAAACTATGTGAAAACTTTTTGATTATGCATATGAACCCTTCACACTACCCAAATTATATATTTGGCTCCATATTCAATCGGTTAGTCTACATATAT TTATGTTTCCTCTATGGGTAAGCTACTGTGAATGGATCAATTAATAAAACACATGACCTA TGCTTTAAGAAGCTTGCAAACACATGAAATAAATGCAATTTATTTTTTAAATAATGGGTT CATTTGATCACAATAAATGCATTTTATGAAATGGTGAGAATTTTGTTCACTCATTAGTGA GACAAACGTCTCAATGGTTATTTATATGGCATGCATATAGTGATATGTGGT

e Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr Asp Glu Tyr ArgT AAA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT GAA TAT AGA

F508del

Kromosom-PCR

• Nakkefoldsscanning: Færre prøver. Flere abnorme. Mere nervøse gravide.

• Sundhedsstyrelsen 2004: Konsekvenserne ved de ofte betydelige ventetider ved kromosomdiagnostikken søges afbødet gennem anvendelse af analysemetoder med kort svartid.

Hvad er kromosom-PCR ?

• Kvantitativ PCR anvendes til at måle antallet af kromosomerne 13, 18, 21, X & Y

• Analysetid: 1½ døgn.• Svartid: 4-5 dage.

PCR – Nobelpris 1993

5

PCRPolymerase Chain Reaction

Redskab til kopiering af udvalgte DNA-segmenter 1.000.000 gange≥

1. cyklus

3. cyklus

2. cyklus

n cykler = 2n kopier

Kromosom-PCR

Kapillær-elektroforesemaskine Kromosom-PCR resultater

6

Kromosom-PCR resultater Svarbrev på Kromosom-PCR

• Resultatet af kromosom-PCR på din fostervandsprøve – den hurtige prænatale undersøgelse for kromosom 13, 18, 21 og kønskromosomerne – viser normale forhold.

• Det endelige resultat, som omfatter analyse af alle kromosomer, forventes inden for 3 uger og du modtager endnu et brev.

• Såfremt vi finder forhold, der fraviger det første resultat, bliver du kontaktet telefonisk.

Perspektiv

• Kromosom-PCR teknikken bliver allerede nu anvendt til andre analyser– udredning af mentalt retarderede børn– skal til at anvendes inden for udredning af

cancer og fostre med hjertefejl

Hvad er FISH ?

• DNA-baseret teknik• Specifik farvning af kromosomer eller dele

af kromosomer

7

FISH FISH

FISH

• Interfase-FISH– FISH på cellekerner

• Metafase-FISH– FISH på kromosompræparater

Interfase-FISH disomi

8

Interfase-FISH trisomi Interfase-FISH multicolor

Normal (18/21-hybridisering) Trisomi 21

Aneuploidi screening for 13, 16, 18, 21, og 22

Prober: gul, rød, mørkeblå, lyseblå og grøn fluorescens

Mor med balanceret 1;5 translokation

9

Balancerede translokationsbærere

• Risiko for ubalancerede fejl i kønsceller– Nedsat fertilitet– Spontane aborter– Misdannede/retarderede børn

Præimplantatorisk diagnostik (PGD)

PGD ubalanceret 1;5 translokation Metafase FISH

• Afklaring af indviklede karyotyper

10

Translokation (ekstra materiale på kr. 18) Metafase FISH (kr. 18 maleprobe)

Metafase FISH (kr. 11 maleprobe) Henvisning fra UL

• Hjertemisdannelse hos fostret (truncus arteriosus), obs. del 22q11

11

Mikrodeletioner

• 22q11 deletions-syndrom– Medfødte hjertefejl– Aplasi/hypoplasi af thyroidea/parathyroidea– Craniofaciale misdannelser

Undersøgelse for 22q11 deletion

- Deletion + Deletion (A1600-01)

Metafase FISHFordel

• Sikker identifikation af translokeret og ekstra eller manglende materiale

Metafase FISHUlemper

• Man skal have en mistanke om, hvilket materiale som er translokeret og/eller duplikeret

• Prober er dyre• Varierende probe signal kvalitet• Visse områder dækkes ikke af maleprober• Proberne er vanskelige at kombinere i stort

tal i samme reaktion

12

Perspektiv

• FISH teknikken finder ikke nye anvendelsesområder.

• Multi-PCR overtager – bortset fra ved præimplantatorisk diagnostik

CGH

CGH hybridisering på normale kromosomer CGH-analyse

13

CGH analyse af Tali, 3 år gammel pige

• Fysisk og mentalt retarderet • Mikrocefali• Bred og flad næse• Lavtsiddende ører• Tynd øverste læbe• Lang philtrum• Høj gane

Mor gravid (10 uger)Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qterB4996-02, No. 36

Mor

CGH på foster

CGH på Tali

Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qter)

Enh(21q22->qter) Dim(22q13->qter) CVS - foster

14

1Mb chip

3000 kloner med cirka 1 millionbasepars afstand470 særligt udvalgte kloner fra områder,som er involveret i mental retardering

Array-CGH

• Måske den endelige afløser for almindelig kromosomanalyse – evt. i kombination med kromosom-PCR

• En masse ”nye” syndromer vil blive defineret –ligesom det skete i 50-60’erne, da det blev muligt at lave almindelig kromosomanalyse.

• Vi skal være med til at definere, hvad der er normalt

89

1211 11

12 1213

12 1213 13 13

1211 11 11 11 1111

01000020000300004000050000600007000080000

80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00

Prænatal diagnostik 1980-2000

0

2000

4000

6000

8000

10000

80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00

Udviklingen af prænatal diagnostik 1980-2000

0 0 0 03 4

1015 17

2025

31 3338 39 40

4339 41

4544

CVS

AC

15

6468 68

76 73 70 72 69 68 67 66 67 68 65 6157 56 54 53 5251

0

2000

4000

6000

8000

10000

80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00

Prænatal diagnostik af gravide > 35 år 1980-2000

-PD

+PD

24

37404136

303639

4339

31

484642

65

4954 514850

60

0

50

100

150

200

80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00

prænatal

postnatal

Præ- og postnatal diagnostik af trisomi 21, 1980-2000

Provokerede aborter 1989-95Antal abn. Ab. Prov %

• +21 350 349 99,7 • +18 107 107 100 • +13 30 30 100

• XXY 56 39 70 • XYY 39 24 62 • XXX 31 23 74 • X 94 72 77 • De novo transl. 35 20 57

Genetik på nettet

• Pubmed– OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)– Books

• Genetics Home Reference

16

Pubmed.com /.org / .gov Genetics Home Reference

Centers for Disease Control

• CDC