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Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución
1. Definición2. Formas de Cromatografía Líquida3. Instrumentación4. El cromatograma• componentes• Parámetros de retención, separación, eficiencia
2. Formas de Cromatografía LíquidaLíquido - Sólido (Adsorción)Fase Unida
NormalInversa
Intercambio IónicoExclusión molecularAfinidad
Cromatografía de Adsorción
•La fase estacionaria es un sólido.•El analito y la fase móvil compiten por los sitios activos de la fase estacionaria
Fases estacionarias: sílica, alumina
Cromatografía de Adsorción
• Sílica y alúmina son las fases más utilizadas
• Soluto y solvente son atraídos por los sitios activos de la fase estacionaria
• La separación es posible si los solutos tienen diferentes grados de atracción
La separación se basa en la diferencia de afinidad (solubilidad) del soluto entre la fase móvil y la fase
estacionaria
Partición
KD =
Conc. analito en fase estacionaria
Conc. analito en fase móvil
Cromatografía de Partición
•Basada en el mismo principio de extracción
•Las especies más retenidas son las que tienen mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria
•La separación de los solutos está basada en las diferencias de solubilidad
Tipos de fase unida
Normal: La fase estacionaria es polar y el solvente es no polar
Inversa: Fase estacionaria no polar y solvente polar
Cromatografía de Exclusión molecular
La separación se basa en la diferencia en el volumen molecularPartículas más pequeñas son retenidas más tiempo
INTERCAMBIO IÓNICO
+ +
+
+ + + +
---
----
IntercambiadoresCatiónicos: ácido sulfónico R- SO3
-H+
ácido carboxílico R- CO-H+
Aniónicos: sales de amonio cuaternarias R-NH3
+OH-
Características de los solventes
•No reaccionen químicamente con analito ni la fase estacionaria
•Transparente a la región UV visible
•Bajas presiones de vapor
•No tóxicos
•Bajo costo
Clases de solventes
Aceptor de protones
Donador de protones polares
Solventes comunes en fase reversa
•Metanol acido•acetonitrilo base•THF altamente polar•agua modificador de polaridad
Todos poseen: baja viscosidad transparente al UV miscibles disponibles de alta pureza
Ventajas de la elución con gradiente
• reducción del tiempo de análisis• mejor resolución• mejora forma del pico
Ventajas de la elución con gradiente
• reducción del tiempo de análisis• mejor resolución• mejora forma del pico
a.Reservorio y controlador de gradiente
b Bomba
c Inyector
d Columna
e Detector
f Registrador
Equipo básico HPLC
Detectores empleados en HPLC
•Indice de Refracción•Ultravioleta - Visible (DAD)•Fluorescencia•Electroquímico•Espectrómetro de masas
to
tR1 tR
2
R.D.
tiempo ( min )
w1 w2
El cromatograma
Línea base ancho del pico (w)Tiempo de retención (tR) tiempo muerto ( tRo)Tiempo de retención corregido (tR´)
OPTIMACIÓN DE PARÁMETROS
Retención tR, k´Separación Resolución REficiencia: N, H
resolución
to
tR1 tR2
R.D.
tiempo (min)
w1 w2
Grado de separación entre dos picos
Su valor óptimo es 1,5
2 (tR2 - tR1)R = w1 + w2
resoluciónresolución
R = k’ k’+ 1
- 1
Factor de capacidadnumero deplatos teóricos
selectividad
N4
factor de capacidad k’
# de moléculas de soluto en fase estacionaria # de moléculas de soluto en fase móvila mayor k’ mayor tR
tRk’ = to
tR
to
K’ = tR to
factor de capacidad k’factor de capacidad k’
R.D.
tiempo
Para mezclas simples k’ entre 2 y 10
Para mezclas complejas k’ entre 0,5 y 20
Variación de k’
k’ k’+ 1
k’
K’ depende de la fuerza de la fase móvil
k’ k’+ 1
0 0 1 0.5 2 0.67 3 0.7510 0.91
Número de platos teóricos N
Representa la eficiencia de una columna
N = 16 tR
w
2
H = LN
Número de platos teóricos N
Se optimiza modificando:• flujo • longitud de columna• tamaño de partícula
N N4
100 2.5200 3.5400 5.0
Factor de selectividad
to
tr1 tr2
w1 w2
selectividad de la fase estacionariahacia dos solutos
tr2
tr1
==
Variación de
Depende de las interacciones entrefase estacionaria-soluto y
fase móvil-soluto
- 1 Se optimiza:
• Cambiando solventes• Optimizando el empaque• Cambiando fase estacionaria
Selectividad
1.00 01.05 0.051.10 0.091.50 0.33
valor óptimo es mayor de 1,2
Desarrollo del Método
Selección de Fase Estacionaria
Desarrollo de un método
• preparación de la muestra
• elección del sistema cromatográfico
fase móvil fase estacionaria
• optimización del métodoajuste de parámetros cromatográficos
Selección del solvente
Factores a considerar:
*Fuerza del solvente: medida relativa de la polaridad (Capacidad para desplazar al soluto)
*Escala basada en sílica o alúmina
Indice de polaridad: indice de polaridad relativo usado en fase reversa
Fuerza de solvente e índice de polaridad
Clases de solventes
Aceptor de protones
Donador de protones polares
Ventajas de la elución con gradiente
• reducción del tiempo de análisis• mejor resolución• mejora forma del pico
Elución con gradiente
Se usa en
Intercambio iónicofase unidaadsorción
*No es posible emplearlo en exclusión molecular
Clasificación de la muestra
• peso molecular• solubilidad• carácter iónico o polar
Desarrollo de un métodomuestra objetivos
Sistema preliminar
•Preparación de la muestra
• Elección del sistema cromatográficofase móvil fase estacionaria
•Optimización del método
Muestra
PM menor de 2000P M
Mayor de 2000
Soluble en agua
Filtración en gel
Soluble en Solventes orgánicos
Permeación en gel
Exclusión molecular
Elección del Sistema Cromatográfico
Muestra
PM menor de 2000PM mayor de 2000
Soluble en hexano
Soluble en metanol
Soluble en solventes orgánicos
Soluble en Agua
•Adsorción
•Fase Unida Normal
•Fase Unida Normal
•Fase Unida Reversa
Muestra
PM menor de 2000
No iónicoIónico oionizable
Soluble en Agua
Soluble en solventes orgánicos
Fase Unida Reversa
Par iónico
Intercambioiónico
resoluciónresolución
R = k’ k’+ 1
- 1
Factor de capacidadnumero deplatos teóricos
selectividad
N4
Optimización de parámetros
selectividad
k’ factor de capacidad
N número de platos teóricos
R resolución
resoluciónresolución
R = k’ k’+ 1
- 1
Factor de capacidadnumero deplatos teóricos
selectividad
N4
Optimización en Adsorción y Fase Normal
Inyectar muestra.Solvente polar
compuestos compuestos salen rápido salen lento
disminuir polaridad cambiar fase de solvente ajustar k’
cont….
Cont…
¿k’ = 2 - 10?
medir es mayormenor a
cambiar fase móvil usar sílica más activa
optimizar N
flujo longitud de columna
Optimización en Fase Reversa
Inyectar muestra.100% metanol
compuestos compuestos salen rápido salen lento
adicionar agua cambiar fase ajustar k’
continua….
Cont…
¿k’ = 2 - 10?
medir es mayormenor a
cambiar fase móvil
optimizar N
flujo longitud de columna