HIDROGELURI CU STRUCTURI

CONTROLATE PENTRU REŢINEREA

ŞI ELIBERAREA MEDICAMENTELOR

ŞI A ALTOR COMPUŞI BIOACTIVI

Rezumatul tezei de doctorat

Conducător Ştiinţific

C.S. I Dr. Valeria HARABAGIU

Doctorand

Ing. Sanda-Maria ROTAR (căs. BUCĂTARIU)

Iaşi

2016

Academia Română

INSTITUTUL DE CHIMIE MACROMOLECULARĂ

“PETRU PONI” IAŞI

Mulţumesc Bunului Dumnezeu şi tuturor celor ce mi-au fost alături şi mi-au călăuzit paşii pe drumul reuşitei!

Elaborarea şi fundamentarea ştiintifică a unei teze de doctorat este posibilă numai

cu condiţia unei îndrumări riguroase de calitate realizate cu profesionalism şi a unor

condiţii adecvate necesare desfăşurării activităţii de cercetare specifice temei abordate.

Adresez respectuase mulţumiri conducătorului ştiinţific, dnei Dr. Ing. Valeria

Harabagiu, pentru toată încrederea, răbdarea şi îndrumarea academică acordată pe

întreaga perioadă de desfăşurare a doctoratului.

Mulţumesc dlui Acad. Prof. Bogdan C. Simionescu pentru încrederea,

îndrumarea şi posibilitatea desfăşurării stagiului de doctorat.

Cele mai alese sentimente de recunoştinţă, respect şi mulţumire se îndreaptă către

dna Dr. Ing. Marieta Fundueanu-Constantin şi dnul Dr. Ing. Gheorghe Fundueanu-

Constantin care, cu răbdare, generozitate şi profesionalism mi-au oferit sfaturi, idei,

comentarii oportune, critici constructive şi sprijin deplin pentru elaborarea tezei,

contribuind la formarea mea profesională.

Mulţumesc membrilor comisiei de doctorat, dnei Dr. Ing. Geta David, dnei Dr.

Mariana Pinteală şi dnei Dr. Maria Butnaru, pentru răbdarea cu care au analizat teza

de doctorat şi pentru sugestiile formulate.

Mulţumesc tuturor colegilor din cadrul Laboratorului „Polimeri Naturali,

Materiale Bioactive şi Biocompatibile”, care au fost alături de mine, m-au încurajat şi

m-au ajutat pe parcursul acestei teze, arătându-mi astfel ce înseamnă implicarea,

angajarea şi lucrul în echipă, precum şi tuturor colegilor din Institutul de Chimie

Macromoleculară “Petru Poni” și IntelCentru pentru sprijinul oferit în realizarea

caracterizării compuşilor prezentaţi în cadrul tezei.

Mulţumesc de asemenea prietenilor pentru susţinerea morală pe care mi-au

oferit-o.

Teza prezintă rezultatele cercetării susţinute financiar din proiectele PN-II-PT-

PCCA-2013-4-1570 şi PN-II-ID-PCCE-2011-2-0028.

Mulţumiri Academiei Române, pentru suportul financiar acordat pe parcursul

stagiului de pregătire a tezei de doctorat.

Recunoştinţă, preţuire şi respect iubitului meu soţ Florin, care ne-a susţinut

cu multă dragoste şi implicare, pe mine şi copiii noştri, în tot acest răstimp!

Mulţumesc din suflet familiei extinse pentru înţelegere, sprijin şi încurajări în toţi

aceşti ani. Vă iubesc şi îi mulţumesc Domnului pentru că existaţi şi îmi sunteţi

alături!

Mulţumesc Bunului Dumnezeu şi tuturor celor ce mi-au fost alături şi mi-au călăuzit paşii pe drumul reuşitei!

Dedic această teză tuturor acelora care, de-a lungul anilor, au contribuit la formarea mea umană, la omul care am devenit.

„Mâinile care ajută sunt mai sfinte decât gurile care se roagă.” Sai Baba

4

CUPRINS Pag. teză/ rezumat

PARTEA I. STUDIU DE LITERATURĂ........................................................................... 1

CAPITOLUL I. STADIUL ACTUAL AL CERCETĂRILOR ÎN DOMENIUL SISTEMELOR DE ELIBERARE CONTROLATĂ A COMPUŞILOR BIOACTIVI ............. 3

I.1. Consideraţii generale ................................................................................................... 3 I.2. Sisteme de eliberare controlată a medicamentelor.................................................... 4

I.2.1. Conceptul de „eliberare controlată”. Aspecte fundamentale ............................... 4 I.2.2. Clasificarea mecanismelor şi a sistemelor de eliberare controlată ...................... 6 I.2.3. Principalele direcţii de utilizare a sistemelor de eliberare controlată ................... 11 I.2.4. Avantajele şi dezavantajele sistemelor de eliberare controlată............................ 12 I.2.5. Profiluri ideale pentru eliberare controlată............................................................. 13

I.3. Polimeri sensibili la stimuli externi............................................................................ 15 I.3.1. Polimeri sensibili la temperatură........................................................................... 16 I.3.2. Polimeri sensibili la pH......................................................................................... 18 I.3.3. Copolimeri sensibili la temperatură şi pH ............................................................ 21

I.4. Hidrogeluri cu structuri controlate sensibile la stimuli externi ............................... 24 I.4.1. Definirea şi clasificarea hidrogelurilor ................................................................... 24 I.4.2. Metode de obţinere a hidrogelurilor ...................................................................... 28

PARTEA a-II-a. REZULTATE ORIGINALE.................................................................... 49

CAPITOLUL II. PARTEA EXPERIMENTALĂ................................................................ 51 II.1. Materiale utilizate.......................................................................................................... 51

II.1.1. Polimeri ................................................................................................................ 51 II.1.2. Polimeri sau substanţe folosite ca etalon ............................................................ 51 II.1.3. Monomeri, iniţiatori şi acceleratori pentru reacţia de polimerizare ...................... 51 II.1.4. Agenți de reticulare .............................................................................................. 52 II.1.5. Reactivi și solvenți ............................................................................................... 52 II.1.6. Agenți de stabilizare şi surfactanţi ....................................................................... 52 II.1.7. Medicamente ....................................................................................................... 52 II.1.8. Enzime ................................................................................................................. 53 II.1.9. Soluții tampon – preparate în laborator ............................................................... 53 II.1.10. Soluții ................................................................................................................. 53

II.2. Metode de analiză ........................................................................................................ 54 II.2.1. Analize fizico-chimice .......................................................................................... 54 II.2.2. Metode specifice structurilor reticulate ................................................................ 58 II.2.3. Evaluarea in vitro a degradării enzimatice ........................................................... 61 II.2.4. Tehnici de lucru ................................................................................................... 61

II.3. Metode de sinteză ....................................................................................................... 62 II.3.1. Sinteza β-CD cu legături duble ............................................................................ 62 II.3.2. Sinteza oligomerilor semitelechelici de poli(NIPAAm-co-HEAAm)....................... 62 II.3.3. Sinteza polimerilor sensibili la temperatură ......................................................... 62 II.3.4. Sinteza microsferelor ........................................................................................... 63 II.3.5. Sinteza microgelurilor .......................................................................................... 65

CAPITOLUL III. HIDROGELURI SENSIBILE LA TEMPERATURĂ PE BAZĂ DE POLI(NIPAAm-co-HEAAm) ............................................................... 66

III.1. Microsfere obţinute din copolimer preformat ......................................................... 66/9 III.1.1. Prepararea copolimerului liniar termosensibil .................................................... 67/9 III.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a copolimerului .................................................... 68/9 III.1.3. Prepararea microsferelor de poli(NIPAAm-co-HEAAm) ..................................... 73/10 III.1.4. Caracterizarea fizico-chimică a microsferelor ..................................................... 74/10 III.1.5. Sisteme de eliberare pulsatorie a indometacinului ............................................. 78/11 III.1.6. Concluzii ............................................................................................................. 83

5

III.2. Microgeluri obţinute prin polimerizare precipitantă ................................................ 85/12 III.2.1. Sinteza și caracterizarea structurală a microgelurilor ......................................... 85/12 III.2.2. Caracterizarea fizico-chimică a microgelurilor .................................................... 86/12 III.2.3. Investigarea proprietăţilor de termosensibilitate a microgelurilor ....................... 89/13 III.2.4. Caracterizarea morfologică prin microscopie de forţă atomică (AFM) ............... 97/14 III.2.5. Sisteme de eliberare controlată a propranololului pe bază de microgeluri

termosensibile de poli(NIPAAm-co-HEAAm) ..................................................... 99/14 III.2.6. Concluzii.............................................................................................................. 100

CAPITOLUL IV. HIDROGELURI SUB FORMĂ DE MICROSFERE SENSIBILE LA pH ŞI TEMPERATURĂ ............................................................... 102/15

IV.1. Microgeluri pe bază de poli(NIPAAm-co-AMet) ....................................................... 104/15 IV.1.1. Prepararea copolimerului liniar poli(NIPAAm-co-AMet) ..................................... 104/5 IV.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a copolimerului ................................................... 105 IV.1.3. Sinteza și caracterizarea oligomerilor de poli(NIPAAm-co-HEAAm) ................. 111 IV.1.4. Prepararea hidrogelurilor de poli(NIPAAm-co-AMet) ........................................ 114/16 IV.1.5. Caracterizarea fizico-chimică a hidrogelurilor ................................................... 115/16 IV.1.6. Determinarea cantității minime de agent de declanșare ................................... 118/17 IV.1.7. Mecanismul de eliberare cu „autoreglare” a medicamentului............................ 120/17 IV.1.8. Concluzii ............................................................................................................ 122

IV.2. Microgeluri pe bază de poli(NIPAAm-co-AMal) ...................................................... 124/18 IV.2.1. Prepararea copolimerului liniar poli(NIPAAm-co-AMal)..................................... 124 IV.2.2. Caracterizarea fizico-chimică a copolimerului ................................................... 125 IV.2.3. Prepararea hidrogelurilor de poli(NIPAAm-co-AMal) ........................................ 130 IV.2.4. Caracterizarea fizico-chimică a hidrogelurilor ................................................... 130 IV.2.5. Determinarea cantității minime de agent de declanșare .................................. 134 IV.2.6. Mecanismul de eliberare cu „autoreglare” a medicamentului ........................... 135 IV.2.7. Concluzii ............................................................................................................ 136

CAPITOLUL V. HIDROGELURI PE BAZĂ DE CICLODEXTRINE ........................... 138/19 V.1. Microsfere pe bază de dextran și ciclodextrine ...................................................... 139/19

V.1.1. Prepararea microsferelor pe bază de dextran și ciclodextrină ........................... 140/19 V.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a microsferelor .................................................... 142/19 V.1.3. Studii de înglobare și eliberare ........................................................................... 149/20 V.1.4. Concluzii ............................................................................................................. 153

V.2. Microgeluri pe bază de poli(NIPAAm-co--CD) ....................................................... 155/21

V.2.1. Funcţionalizarea -CD cu legături duble ............................................................ 156

V.2.2. Prepararea microgelurilor de poli(NIPAAm-co--CD) ........................................ 158/21 V.2.3. Caracterizarea fizico-chimică a microgelurilor ................................................... 160/21 V.2.4. Sisteme termosensibile de eliberare a diclofenacului ........................................ 165/22 V.2.5. Studiul degradării enzimatice ............................................................................. 167 V.2.6. Concluzii ............................................................................................................. 169

CAPITOLUL VI. MICROSFERE DE PLGA PENTRU ELIBERAREA CONTROLATĂ A DEXAMETAZONEI ..................................... 171/23

VI.1. Studii preliminare asupra stabilităţii dexametazonei libere şi complexate ......... 172 VI.1.1. Studiul formării complecşilor de incluziune prin metoda JOB ........................... 172 VI.1.2. Determinarea constantelor de asociere a DM cu ciclodextrinele ...................... 174

VI.2. Prepararea şi caracterizarea microsferelor de PLGA ............................................ 178/23 VI.2.1. Obţinerea microsferelor de PLGA încărcate cu dexametazonă ........................ 178/23 VI.2.2. Analiza morfologică şi dimensională ................................................................. 181/23 VI.2.3. Studiul cineticii de eliberare a dexametazonei .................................................. 183/24 VI.2.4. Concluzii ............................................................................................................ 185

CONCLUZII GENERALE...................................................................................................... 187/25 BIBLIOGRAFIE................................................................................................................... 196/26

6

INTRODUCERE Domeniul eliberării de principii biologic active s-a dezvoltat continuu şi exploziv în paralel cu

dezvoltarea chimiei polimerilor. Perfecţionarea continuă a tehnicii de livrare a medicamentului, constând în scăderea toxicităţii şi creşterea eficacităţii acestuia, conduce atât la beneficii potenţiale pentru pacient, cât şi la deschiderea de noi pieţe pentru companiile farmaceutice.

În ultimele decenii, micro- şi nano-sferele, micelele polimerice, materialele de tip hidrogel, nanocapsulele si-au demonstrat capacitatea de a îmbunătăţi dirijarea la ţintă a medicamentelor, scăderea toxicităţii sistemice a acestora, creşterea eficienţei tratamentului şi asigurarea protecţiei pentru substanţele active împotriva degradării biochimice.

Hidrogelurile sunt reţele tridimensionale alcătuite din lanţuri polimerice hidrofile care pot reţine cantităţi mari de apă sau fluide fiziologice. Din punct de vedere al interacţiunilor biologice la nivel molecular, al conţinutului în apă şi al elasticităţii, acestea sunt similare ţesuturilor biologice naturale. Hidrogelurile înglobează medicamentul fizic sau prin legături chimice pentru ca ulterior să-l elibereze treptat prin difuzie sau eroziune, în funcţie de proprietăţile lor fizico-chimice.

Necesitatea de a concepe noi tipuri de dispozitive de transport şi eliberare a medicamentelor a condus la diversificarea metodelor de obţinere a hidrogelurilor în funcţie de tipul de eliberare dorită, obţinându-se o varietate a structurilor chimice ale acestora. Un interes deosebit a fost acordat obţinerii de hidrogeluri pe bază de polimeri sensibili la stimuli externi, denumiţi şi polimeri inteligenţi. În epoca modernă a formulărilor farmaceutice, obţinerea sistemelor de eliberare a medicamentelor sub formă de hidrogeluri sensibile la stimuli externi a deschis noi orizonturi în acest domeniu deoarece sunt concepute şi realizate sisteme cu proprietăţi îmbunătăţite care, pe lângă eliberarea medicamentului ca răspuns la perturbarea condiţiilor fiziologice normale, controlează atât momentul cât şi viteza de eliberare a medicamentului.

Întrucât temperatura corpului uman este un indicator important al sănătăţii iar modificarea acesteia este semnul unei afecţiuni, în această teză s-au conceput şi elaborat noi dispozitive inteligente termosensibile. Majoritatea sistemelor de eliberare a medicamentelor care sunt controlate de temperatură s-au obţinut sub formă de hidrogeluri prin reticularea chimică a poli(N-izopropilacrilamidei).

Obiectivul general al cercetărilor întreprinse în cadrul tezei de doctorat a constat în elaborarea unor noi hidrogeluri cu structuri variate cu potenţial aplicativ în eliberarea controlată a medicamentelor.

Teza este alcătuită din două părţi: prima parte cuprinde date de literatură privind domeniul sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor sub formă de hidrogeluri sensibile la stimuli externi, iar partea a II-a, structurată în cinci capitole, cuprinde rezultatele originale.

Capitolul I prezintă selectiv informaţii de literatură privind conceptul de eliberare controlată, precum şi clasificarea şi avantajele sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor şi a altor substanţe biologic active. De asemenea, au fost prezentate proprietăţile, clasificarea, sinteza, caracterizarea şi aplicaţiile hidrogelurilor sensibile la stimuli externi.

Capitolul II cuprinde date referitoare la materialele utilizate în teză şi metodele de sinteză şi caracterizare a hidrogelurilor sensibile la stimuli externi, sub formă de microgeluri, precum şi ale complecşilor polimerici termosensibili obţinuţi în acest studiu.

Capitolul III prezintă rezultate originale privind prepararea şi caracterizarea unor noi microgeluri sensibile la temperatură, obţinute prin reticularea în suspensie a polimerului preformat (poli(NIPAAm-co-HEAAm)) sau prin polimerizarea precipitantă a NIPAAm şi HEAAm. Polimerul preformat de poli(NIPAAm-co-HEAAm) a fost astfel conceput încât să prezinte o tranziţie de fază rapidă în condiţii fiziologice de pH şi temperatură. A fost studiată influenţa dimensiunii microsferelor pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm) asupra temperaturii de tranziţie şi a cineticilor de umflare/colapsare. Indometacinul (compus model) a fost inclus în microsferele de poli(NIPAAm-co-HEAAm) după procesul de obţinere a hidrogelurilor prin metoda evaporării solventului. Eliberarea in vitro a medicamentului a urmat un mecanism de tip pulsatoriu şi a demonstrat eficacitatea acestor sisteme de eliberare controlată. Propranololul (compus model) a fost inclus în microgelurile pe bază de NIPAAm şi HEAAm. Mecanismul de reţinere/eliberare s-a bazat pe capacitatea de umflare/colapsare a microgelurilor termosensibile care funcţionează ca o pompă ce absoarbe medicamentul prin răcire şi îl expulzează prin încălzire.

Capitolul IV cuprinde rezultate originale privind sinteza şi caracterizarea unor noi hidrogeluri, sub formă de microparticule sensibile atât la pH, cat şi la temperatură pe bază de

7

poli(NIPAAm-co-AMet) respectiv poli(NIPAAm-co-AMal). Pentru a schimba balanţa hidrofil/hidrofobă a copolimerilor şi a obţine o valoare LCST apropiată de valoarea temperaturii fiziologice au fost testaţi diferiţi compuşi biologic activi capabili să reactiveze termosensibilitatea copolimerului datorită interacţiunilor electrostatice dintre grupele aminice încărcate pozitiv ale acestora şi grupele carboxilice ale AMet din poli(NIPAAm-co-AMet), respectiv AMal din

poli(NIPAAm-co-AMal). Hidrogelurile sensibile la pH şi temperatură au fost obţinute printr-o

metodă originală ce are la bază reticularea cu BisAAm la o temperatură aflată uşor sub valoarea LCST. Microgelurile obţinute în acest studiu pot reprezenta suportul generaţiei viitoare de sisteme de eliberare controlată cu autoreglare constituite dintr-un senzor şi o componentă de livrare.

Capitolul V prezintă rezultate originale privind obţinerea microgelurilor pe bază de ciclodextrine. În acest capitol este prezentată obţinerea microsferelor pe bază de Dex/CD într-o singură etapă prin reticulare cu epiclorhidrină şi prepararea microgelurilor pe bază de

poli(NIPAAm-co--CD) prin polimerizare radicalică reticulantă. Utilizându-se ca fază staţionară microsferele umflate de Dex/CD, s-a determinat prin cromatografia de excludere sterică inversă (ISEC) volumul poros şi dimensiunea porilor, precum şi capacitatea CD incluse în reţeaua polimerică a microsferelor de a forma complecşi de incluziune cu medicamentele. Microgelurile de

poli(NIPAAm-co--CD) sunt sensibile la temperatură datorită comonomerului NIPAAm şi

biodegradabile datorită -CD utilizată atât ca monomer, cât şi ca agent de reticulare. Diclofenacul

(compus model) a fost inclus în microgelurile de poli(NIPAAm-co--CD) prin imersarea microparticulelor într-o soluţie concentrată în medicament. S-a obţinut o eficienţă de înglobare de

95,5 % ceea ce demonstrează că aproape fiecare moleculă de -CD reţine o moleculă de diclofenac.

Capitolul VI prezintă rezultate originale privind îmbunătăţirea metodei evaporării solventului din dublă emulsie pentru obţinerea microsferelor de PLGA. Pentru stoparea difuziei medicamentului (dexametazona) din faza apoasă primară în cea secundară, precum şi pentru

reducerea vitezei de eliberare s-au utilizat agenţi de complexare precum HPCD, -CD şi PEI. De asemenea, au fost prezentate studii preliminare asupra fotostabilităţii dexametazonei libere şi complexate.

Teza se încheie cu concluziile generale, precum şi cu lista bibliografiei consultate.

OBIECTIVE

Obţinerea unor microsfere stabile prin reticularea grupelor hidroxilice în suspensie apoasă a unei soluţii de copolimer poli(NIPAAm-co-HEAAm), la o temperatură situată sub LCST, care păstrează proprietăţile termosensibile ale copolimerului liniar;

Prepararea unor microgeluri termosensibile cu diferite grade de reticulare pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm) prin polimerizare precipitantă la diferite concentraţii de surfactant;

Sinteza unor microgeluri sensibile la pH şi temperatură pe bază de poli(NIPAAm-co-AMet) şi poli(NIPAAm-co-AMal) care păstrează proprietăţile termosensibile ale copolimerilor liniari, precum şi proprietatea de reactivare a termosensibilităţii în prezenţa unor compuşi hidrofobi încărcaţi cu sarcini de semn contrar;

Obţinerea unor microparticule pe bază de Dex şi CD prin reticularea covalentă cu ECH a

unui amestec de Dex şi -, - sau - CD;

Prepararea unor microgeluri de poli(NIPAAm-co--CD) ca materiale biodegradabile termosensibile capabile să reţină şi să elibereze controlat medicamente;

Sinteza unor microsfere de PLGA, prin metoda evaporării solventului din dublă emulsie,

metodă îmbunătăţită prin utilizarea unor agenţi de complexare precum HPCD, -CD şi PEI.

Teza de doctorat intitulată „Hidrogeluri cu structuri controlate pentru reţinerea și eliberarea medicamentelor și a altor compuși bioactivi”, are 218 pagini împărţite în 6 capitole care includ 20 Tabele, 107 Figuri, 13 Scheme, 20 Ecuaţii şi 330 indicaţii bibliografice.

În cele ce urmează se prezintă aspecte semnificative abordate în cadrul tezei de doctorat, urmărind îndeaproape cuprinsul lucrării. Rezumatul respectă numerotarea capitolelor, figurilor, schemelor, tabelelor, ecuaţiilor şi a bibliografiei cuprinse în teză.

8

LISTĂ DE ABREVIERI AFM Microscopie de forţă atomică AMal Acid maleic AhMal Anhidridă maleică AMet Acid metacrilic AG Aldehidă glutarică AIBN N,N’-azoizobutironitril AMP Acid 3-mercaptopropionic APS Persulfat de amoniu

ACD Acriloil ciclodextrină BisAAm N,N’- metilen bisacrilamidă BD Dextran “blue” CA Clorură de acriloil CAB Aceto-butirat de celuloză CD(e) Ciclodextrină(e) C.S. Capacitate de schimb ionic DCM Diclormetan Dex Dextran DE Degradare enzimatică DF Diclofenac DLS Difuzia luminii în regim dinamic DM Dexametazonă (forma fosfat de sodiu) D2O Apă deuterată DPH Difenilhidramină DT Dextrani cu mase moleculare standard ECH Epiclorhidrină GPC Cromatografia pe gel permeabil HEAAm Hidroxietil acrilamidă ISEC Cromatografia de excludere sterică inversă IP Indici de polidispersitate KPS Persulfat de potasiu LCST Temperatura critică inferioară de solubilitate Lyd Lidocaină AMet Acid metacrilic MBA Acid 3-metil benzoic MeOH Metanol MPA Acid mercaptopropionic NaBH4 Borohidrură de sodiu NIPAAm N-izopropilacrilamidă PBS Soluţie tampon cu pH = 7,4 PC Metoda „punctului de ceaţă” PEI Poli(etilenimină) PLGA Poli(acid lactic-co-acid glicolic) Poli(NIPAAm) Poli(N-izopropilacrilamidă)

Poli(NIPAAm-co--CD) Poli(N-izopropilacrilamidă-co-beta ciclodextrin) Poli(NIPAAm-co-HEAAm) Poli(N-izopropilacrilamidă-co-hidroxietilacrilamidă) Poli(NIPAAm-co-AMet) Poli(N-izopropilacrilamidă-co-acid metacrilic) Poli(NIPAAm-co-AMal) Poli(N-izopropilacrilamidă-co-acid maleic) Poli(NIPAAm-co-TREGMA) Poli(N-izopropilacrilamidă-co-trietilenglicol metacrilat) RMN-1H Spectrometrie de rezonanță magnetică nucelară de proton SDS Dodecil sulfat de sodiu SEM Microscopie electronică de baleiaj SEC Sisteme de eliberare controlată TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamină VPTT Temperatura de tranziţie de fază volumică

Hidrogeluri sensibile la temperatură pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm)

9

CAPITOLUL III. HIDROGELURI SENSIBILE LA TEMPERATURĂ PE BAZĂ DE POLI(NIPAAm-co-HEAAm)

III.1. Microsfere obţinute din copolimer preformat

Obiectivul acestui capitol îl reprezintă obţinerea unui nou copolimer termosensibil pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm) care să prezinte, în condiţii fiziologice simulate, o valoare LCST apropiată de temperatura corpului uman. Din acest copolimer se doreşte obţinerea unor microgeluri stabile, termosensibile cu aplicaţii în eliberarea controlată a medicamentelor.

În acest scop, poli(NIPAAm-co-HEAAm) a fost sintetizat ca un copolimer sensibil temperatură (cu LCST în jurul temperaturii corpului uman) apoi a fost reticulat în suspensie cu AG.

III.1.1. Prepararea copolimerului liniar termosensibil Copolimerii sensibili la temperatură au fost obținuți prin copolimerizarea radicalică în dioxan a NIPAAm şi HEAAm, în prezenţă de AIBN utilizat ca iniţiator, la 80 oC, timp de 10 ore, cu diferite rapoarte molare între comonomeri (10:0, 10:1, 10:1,5, 10:2) în amestecul de reacţie iniţial. S-a optat pentru HEAAm drept comonomer din următoarele considerente: este un monomer hidrofil; structura sa chimică asigură continuitatea secvenţelor acrilamidice în copolimer păstrându-i astfel proprietăţile termosensibile [237]; posedă grupe hidroxil reticulabile, esenţiale în obţinerea de hidrogeluri stabile.

III.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a copolimerului Confirmarea structurii chimice şi determinarea compoziţiei chimice a copolimerului poli(NIPAAm-co-HEAAm) s-a realizat prin spectrometrie RMN-1H. Valorile obţinute pentru fracţiile molare de NIPAAm şi HEAAm în copolimer sunt apropiate de cele din amestecul iniţial de reacţie.

III.1.2.3. Determinarea LCST

Într-o primă etapă a fost investigată influenţa raportului comonomerilor asupra LCST, astfel că s-au realizat o serie de sinteze în care s-a variat raportul molar dintre aceştia. Pentru fiecare copolimer s-a determinat LCST în tampon fosfat cu pH = 7,4 (Figura III.2) şi s-a constatat că un raport molar dintre NIPAAm şi HEAAm de 10:2 permite obţinerea unui copolimer cu valoarea LCST de 37,6 oC, temperatură apropiată de temperatura corpului uman. În cea de-a doua etapă s-a studiat influenţa concentraţiei soluţiei de polimer asupra temperaturii critice de insolubilizare şi a intervalului tranziţiei de fază. După cum se poate observa în Figura III.3, valoarea LCST determinată prin metoda “punctului de ceaţă” (PC) scade odată cu creşterea concentraţiei. În cazul soluţiilor concentrate de polimeri, tranziţia de fază are loc într-un interval de temperatură îngust. Totuşi, soluţiile concentrate prezintă valori ale absorbanţei mai mari decât ale soluţiilor diluate. Din moment ce această caracteristică poate influenţa stabilirea exactă a LCST, s-a determinat şi temperatura la care începe tranziţia de fază atât prin metoda PC, cât şi prin analiza microcalorimetrică.

Figura III.2. Curbele de tranziţie ale poli(NIPAAm-co-HEAAm) în

PBS (pH = 7,4), la diferite rapoarte molare dintre

comonomeri:

(C1) 10/1 (▲), (C2) 10/1.5 ();

(C3) 10/2 (), (C0) poli(NIPAAm) (■). Concentraţia soluţiilor de

polimer este de 1 % (g/v). 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Temperatura (°C)

Absorb

anta

(4

50

nm

)

Capitolul III

10

Figura III.3. Curbele de tranziţie pentru poli(NIPAAm-co-HEAAm)

(C3 în Tabelul III.1) în PBS la diferite concentraţii de

copolimer: 0,25 % (▲), 0,5 %

(), 1 % (♦), 3 % (■), 5 %, (∆) şi 10 % (●).

Temperatura de declanşare a tranziției de fază determinată prin PC scade odată cu creşterea concentraţiei. Când se doreşte reticularea polimerului cu scopul de a obţine un hidrogel care să păstreze proprietăţile polimerului liniar de plecare, metoda PC este cea mai indicată pentru caracterizarea acestuia deoarece pune în evidenţă cel mai bine interacţiunile hidrofobe dintre lanţurile polimerice după deshidratare, oferind astfel informaţii la nivel macroscopic.

III.1.3. Prepararea microsferelor de poli(NIPAAm-co-HEAAm) Microsferele sensibile la temperatură pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm) au fost obţinute prin reticularea grupelor hidroxilice cu AG (25 %, g/v) în prezenţă de H2SO4 0,5 M.

Ţinând cont de temperatura de tranziţie determinată, microsferele de poli(NIPAAm-co-HEAAm) au fost obţinute folosind procesul de reticulare în suspensie prin dispersarea soluţiei acide apoase de polimer în ulei mineral, la o temperatură situată sub LCST (36 ºC) şi reticularea ulterioară a picăturilor suspensiei cu AG.

III.1.4. Caracterizarea fizico-chimică a microsferelor Analiza morfologică şi dimensională a microsferelor s-a realizat prin SEM şi microscopie

optică. După cum se poate observa în Figura III.6A şi B, microsferele în stare uscată prezintă formă sferică, o suprafaţă netedă şi o distribuţie relativ largă a dimensiunilor (între 5 şi 350 μm). După reticulare, microsferele păstrează proprietăţile termosensibile ale polimerului liniar după cum indică şi microfotografiile prezentate în Figura III.6C, D.

Figura III.6. Microfotografii (SEM) ale microsferelor: vedere generală (A) şi detaliu în secţiune (B). Microfotografii ale microsferelor de poli(NIPAAm-co-

HEAAm) în stare umflată în PBS (pH = 7,4), sub LCST la 25 ºC (C) şi

deasupra LCST, la 45 ºC (D). Linia corespunde la 1000 μm (pentru C şi D)

33 34 35 36 37 38 39 40 41 420.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Temperatura (°C)

Absorb

anta

(4

50

nm

)

Hidrogeluri sensibile la temperatură pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm)

11

III.1.4.2. Determinarea VPTT Metoda utilizată pentru determinarea temperaturii de tranziţie a microsferelor are la bază

determinarea gradului de umflare al acestora la diferite temperaturi, atât sub, cât şi peste LCST. Pentru acest experiment s-au utilizat microsfere de dimensiuni diferite (d.m. = 5 - 60 μm şi respectiv d.m. = 125 - 220 μm) şi se pare că dimensiunea microsferelor termosensibile nu influenţează temperatura de tranziţie sau forma curbei tranziţiei volumice, deoarece atât microsferele de dimensiuni mari, cât şi cele mici au fost echilibrate în PBS timp de 24 ore. Totuşi, dimensiunea microsferelor poate avea influenţă asupra cineticilor de umflare/colapsare a microsferelor.

Figura III.7. Influenţa temperaturii asupra gradului de umflare a microsferelor

termosensibile de poli(NIPAAm-co-HEAAm) de diferite dimensiuni: d.m. = 5-60 μm (●) şi

d.m. = 125-220 μm (○).

Din Figura III.7 se poate observa că gradul de umflare scade cu creşterea temperaturii chiar la temperaturi mai mici decât LCST. Această comportare este oarecum surprinzătoare întrucât polimerul liniar nu prezintă nici un răspuns termic sub LCST. Prin urmare, polimerul reticulat se comportă diferit de cel liniar, motivul fiind prezenţa punţilor ce apar între lanţurile polimerice. În ciuda faptului că forma curbelor (Figura III.3) este discontinuă în jurul valorii LCST, tranziţia de fază a microsferelor nu este la fel de abruptă ca în cazul polimerului liniar, datorită mobilităţii reduse a lanţurilor din reţeaua polimerică.

III.1.5. Sisteme de eliberare pulsatorie a indometacinului Pentru evaluarea influenţei dimensiunii microsferelor de poli(NIPAAm-co-HEAAm) asupra

eliberării pulsatorie a medicamentelor s-a folosit ca medicament model indometacinul, un compus des utilizat pentru încărcarea matricelor termosensibile [228, 226].

Includerea medicamentului s-a realizat în soluţie de etanol, prin metoda evaporării solventului, datorită atât a solubilităţii ridicate, cât şi a gradului mare de umflare a microsferelor în acest solvent. S-a obţinut un conţinut de indometacin în microsfere de 7,92 % (g/g) şi o eficienţă de 86 %.

III.1.5.2. Eliberarea in vitro prin mecanism pulsatoriu Microsferele de poli(NIPAAm-co-HEAAm) au toate aceleaşi caracteristici cu excepţia diametrului, acestea fiind grupate în două clase în funcţie de dimensiuni (d.m. = 5-60 μm, respectiv d.m. = 125-220 μm). În plus, temperatura influenţează atât viteza de difuzie a medicamentului, cât şi dimensiunea porilor. Studiile cinetice de eliberare in vitro s-au efectuat sub şi deasupra VPTT prin introducerea a 50 mg de microsfere încărcate cu medicament în 100 ml PBS, sub agitare uşoară.

În Figura III.11A sunt redate cineticile de eliberare a indometacinului din microsferele cu dimensiuni cuprinse între 125 şi 220 µm, la temperaturi sub şi peste VPTT. Astfel, se poate observa că viteza de eliberare este mai mică deasupra temperaturii de tranziţie a microgelurilor, datorită interacţiunilor sterice dintre medicament şi microsfere. La temperaturi ridicate viteza de difuzie creşte şi dimensiunea microsferelor scade, ceea ce ar trebui să conducă la creşteri ale vitezei de eliberare. Totuşi, contribuţia interacţiunilor sterice asupra eliberării este mai mare deoarece prin colapsarea microsferelor, moleculele de medicament sunt prinse în reţeaua polimerică, reducând astfel viteza de eliberare.

Cineticile de eliberare a indometacinului din microsferele cu dimensiuni mai mici (5 – 60 µm) sunt prezentate în Figura III.11B. În cazul acestora, se poate observa că vitezele de eliberare sub şi peste VPTT sunt apropiate deoarece contribuţia impiedicărilor sterice este comparabilă cu cea dată de difuzia medicamentului şi diametrul microsferelor.

0 10 20 30 40 500

5

10

15

Temperatura (°C)

Gra

d d

e u

mfla

re (

q)

Capitolul III

12

În Figurile III.11C şi D sunt prezentate cineticile de eliberare pulsatorie a indometacinului care au loc ca urmare a variaţiei ciclice a temperaturii între 32 şi 40 oC. Cantitatea de medicament eliberată peste VPTT, când microsferele sunt colapsate, este mai mare pentru microsferele cu dimensiuni mari (125 – 220 µm) (Figura III.11C), comparativ cu cele de dimensiuni mici (5 – 60 µm) (Figura III.11D). Pe de altă parte, în cazul microsferelor mici (5 – 60 µm), viteza de eliberare nu se modifică la alternarea temperaturii.

Figura III.11. Efectul variaţiei temperaturii (A şi B), a variaţiei ciclice a temperaturii (C şi D) şi a vitezei iniţiale de

eliberare (E şi F) asupra eliberării

indometacinului din microsferele de

poli(NIPAAm-co-HEAAm) cu dimensiuni diferite: 125 -220 μm (A,C şi E) şi 5-60 μm

(B, D şi F), la 32 oC (○) şi 40 oC (●).

III.2. Microgeluri obţinute prin polimerizare precipitantă

În capitolul de faţă s-a urmărit prepararea şi caracterizarea unor noi microgeluri termosensibile, stabile, sferice şi cu o distribuţie îngustă a dimensiunilor, destinate conceperii de noi sisteme de eliberare controlată a medicamentelor.

III.2.1. Sinteza si caracterizarea structurală a microgelurilor Microgelurile pe bază de poli(NIPAAm-

co-HEAAm) au fost obţinute prin polimerizare precipitantă [162], variindu-se cantitatea de reticulant şi surfactant în amestecul iniţial de reacţie.

În sinteza microgelurilor a fost utilizat un raport dintre comonomeri de 10:2. Probele astfel obţinute au fost denumite MxSy, unde x reprezintă concentraţia milimolară de reticulant (BisAAm), iar y reprezintă concentraţia milimolară de surfactant (SDS). Compoziţia amestecului iniţial de reacţie este redată în Tabelul III.3, pentru fiecare probă în parte.

Tabelul III.3. Compoziţia amestecului iniţial de reacţie şi valorile VPTT pentru microgelurile de poli(NIPAAm-co-HEAAm)

Cod probă

BisAAm (g)

SDS (g)

VPTT (oC) în apă

DLS UV-viz

M1.1S1.5 0,0136 0,034 39,5 39

M1.9S1.5 0,0238 0,034 39,2 39

M2.75S1.5 0,034 0,034 39,5 39

M1.9S2.1 0,0238 0,0484 39,5 39

M1.9S2.7 0,0238 0,0623 39,8 39 Raport molar NIPAAm:HEAAm=10:2; [NIPAAm-HEAAm] =150mM; [KPS] =1,045 mM

III.2.2. Caracterizarea fizico-chimică a microgelurilor Structura chimică a microgelurilor pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm) a fost confirmată prin spectrofotometrie FT-IR şi RMN-1H. Fracţia molară dintre NIPAAm şi HEAAm s-a determinat din spectrul RMN-1H. Valorile obţinute sunt de 82,98 mol % pentru NIPAAm şi 17,02 mol % pentru HEAAm, fiind apropiate de cele ale copolimerului liniar poli(NIPAAm-co-HEAAm) obţinut folosind dioxan ca solvent.

0 100 200 300 400 5000

25

50

75

100

A

Timp (min)

Elib

era

rea in

dom

eta

cin

(%

)

0 100 200 300 400 5000

25

50

75

100

B

Timp (min)E

libera

re in

dom

eta

cin

(%

)

0 25 50 75 100 1250

25

50

75

100

C

Timp (min)

Elib

era

re in

dom

eta

cin

(%

)

0 25 50 75 100 1250

25

50

75

100

D

Timp (min)

Elib

era

re in

dom

eta

cin

(%

)

0 25 50 75 100 1250.0

0.5

1.0

1.5

2.0

E

Timp (min)

Vite

za in

itialã

de e

libera

re

a in

dom

eta

cin

ulu

i (%

min

-1)

0 25 50 75 1000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

F

Timp (min)

Vite

za in

itialã

de e

libera

re

a in

dom

eta

cin

ulu

i (%

min

-1)

Hidrogeluri sensibile la temperatură pe bază de poli(NIPAAm-co-HEAAm)

13

III.2.3. Investigarea proprietăţilor de termosensibilitate a microgelurilor Analizele DLS au evidenţiat prezenţa unor distribuţii monomodale a dimensiunii microgelurilor (Figura III.15) cu indici de polidispersitate (IP) situaţi în jurul valorii de 0,1 (Tabelul III.4), rezultate specifice amestecurilor monodisperse, conform Standardului Internaţional ISO 22412 pentru măsurarea dimensiunilor particulelor prin DLS [247].

Figura III.15. Distribuţia

mărimii după intensitate a

particulelor de microgel la 25 oC (a) şi 45 oC (b)

Tabelul III.4. Valorile diametrului hidrodinamic pentru microgelurile de poli(NIPAM-co-HEAM)

Cod probă

25 oC 50 oC αb

DH(nm)a IP DH(nm)a IP

M1.1S1.5 366,5 0,111 138,2 0,73 0,054

M1.9S1.5 318,4 0,100 154,9 0,023 0,115

M2.75S1.5 175,6 0,090 108,3 0,011 0,234

M1.9S2.1 309,1 0,157 141,0 0,042 0,095

M1.9S2.7 252,3 0,203 102,5 0,045 0,067 aDiametrul hidrodinamic a fost determinat din distribuţia mărimii

după intensitate în apă cu ajutorul aparatului Delsa Nano Submicron Particle Size Analyzer (CONTIN analysis)

Din Figura III.15a se poate observa că polidispersitatea microgelurilor creşte pe măsură ce creşte şi concentraţia surfactantului (SDS) în amestecul de polimerizare. În Figura III.15b este vizibilă influenţa creşterii temperaturii peste VPTT asupra distribuţiei mărimii particulelor de microgel care se îngustează şi se deplasează spre valori mai mici ale diametrului hidrodinamic, fără ca microgelurile să prezintă tendinţă de aglomerare.

Pentru a investiga proprietatea de sensibilitate la temperatură a microgelurilor sintetizate s-a măsurat variaţia diametrului hidrodinamic cu temperatura. Rezultatele sunt prezentate în Figura III.16 din care se poate observa că probele au prezentat o scădere a mărimii particulelor de microgel pe măsură ce temperatura a crescut. Curbele au prezentat alură sigmoidală cu un punct de inflexiune pe baza căruia s-a determinat valoarea temperaturii de tranziţie de ~39,5 oC, aceeaşi pentru toate probele investigate.

Figura III.16. Modificarea dimensiunii

particulelor de microgel în funcţie de

temperatură, determinată

prin DLS

Temperatura de tranziţie, VPTT, a fost determinată atât prin DLS, cât şi prin UV-Viz, obţinându-se valori similare, apropiate de temperatura corpului uman în condiții fiziologice de pH și temperatură, ceea ce le recomandă în aplicaţii biomedicale.

10 100 10000

2

4

6

8M1.1S1.5

M1.9S1.5

M1.9S2.1

M1.9S2.7

M2.75S1.5

b

DH (nm)

Inte

nsita

tea (

%)

20 25 30 35 40 45 50 55

100

150

200

250

300

350

400

M2.75S1.5

M1.9S1.5

M1.1S1.5

M1.9S2.7

M1.9S2.1

a

Temperatura (C)

Dia

metru

l (nm

)

20 25 30 35 40 45 50 55

0.9

1.1

1.3

1.5

1.7

1.9

2.1

2.3

2.5

2.7

2.9

M2.75S1.5

M1.9S1.5

M1.1S1.5

M1.9S2.7

M1.9S2.1

b

Temperatura (C)

DH

(T)/D

H(5

0 C

)

Capitolul III

14

III.2.4. Caracterizarea morfologică prin microscopie de forţă atomică (AFM) Morfologia şi polidispersitatea particulelor de microgel a fost investigată prin măsurători AFM. Aşa cum se poate observa în Figura III.21, microgelurile au formă sferică şi sunt monodisperse. Totusi, microgelurile obţinute cu o cantitate mai mică de surfactant (M1.9S1.5) sunt mai puţin uniforme şi au o formă alungită. Microgeluri cu dimensiuni mai mici şi forme mai sferice au fost obţinute prin folosirea unei concentraţii mai mari de surfactant.

Figura III.21. Imagini AFM în modul semi-contact (coloana din

stânga) şi amplitudine (coloana din mijloc)

pentru o dispersie de microgeluri (C=0.001 %,

g/v) depusă pe o suprafaţă de mică. În

coloana din dreapta este prezentat profilul

secţiunii transversale pentru aceleaşi probe.

III.2.5. Sisteme de eliberare controlată a propranololului pe bază de microgeluri termosensibile de poli(NIPAAm-co-HEAAm) Pentru studiile de reţinere şi eliberare a fost ales propranololul ca medicament model. S-a obținut o eficienţă de înglobare de 24 %. Cinetica de eliberare a propranololului din microgeluri s-a studiat în condiţii fiziologice simulate (PBS, pH = 7,4) la temperaturi aflate sub şi peste VPTT (25, 37 şi 42 oC) (Figura III.23). Aceste studii au demonstrat că eliberarea este influenţată puternic de temperatură astfel: sub VPTT microgelurile sunt în stare umflată şi nu formează cu medicamentul interacţiuni sterice sau hidrofobe, eliberarea având loc rapid; peste VPTT microgelurile sunt în stare colapsată iar viteza de eliberare este redusă, chiar dacă este expulzată o cantitate mare de medicament în primele cinci minute din cauza „efectului de pompă”.

Figura III.23. Influenţa temperaturii asupra cineticii de eliberare a propranololului din

microgeluri în PBS (pH = 7,4). Pentru comparaţie, este reprezentată şi eliberarea propranololului liber la 25 0C.

M1.9S1.5

M1.9S2.1

M1.9S2.7

0 60 120 180 240 300 360 420 480 5400

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

25oC

42oC

Medicament liber

37oC

Timp (min)

Pro

pra

no

lol e

libe

rat (%

)

Capitolul IV

16

CAPITOLUL IV. HIDROGELURI SUB FORMĂ DE MICROSFERE SENSIBILE LA pH ŞI TEMPERATURĂ

IV.1. Microgeluri pe bază de poli(NIPAAm-co-AMet)

În acest studiu a fost dezvoltat un nou sistem dual de livrare a medicamentelor bazat atât pe un „biosenzor” reprezentat de unităţile sensibile la pH, cât şi pe o componentă de livrare reprezentată de hidrogelul sensibil la temperatură. Se doreşte ca hidrogelul obţinut să fie capabile să-şi recapete proprietăţile termosensibile atunci când unităţile sensible la pH interacţionează electrostatic cu un anume compus biologic activ care acţionează ca un agent de declanşare.

IV.1.1. Prepararea copolimerului liniar poli(NIPAAm-co-AMet) NIPAAm a fost copolimerizat cu acidul metacrilic utilizându-se două rapoarte molare diferite dintre comonomeri (10:1 respectiv 10:2). Reacţia de polimerizare are loc în soluţie apoasă în prezenţa sistemului redox de iniţiere format din APS şi TEMED.

IV.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a copolimerului Întrucât poli(NIPAAm-co-AMet) prezintă atât grupe sensibile la pH, cât şi unităţi sensibile la temperatură, este esenţială determinarea LCST la diferite valori ale pH-ului simulând diferite fluide fiziologice. Prin creşterea cantităţii de acid metacrilic, copolimerul poli(NIPAAm-co-AMet) prezintă în PBS (pH = 7,4) o modificare dramatică a valorii LCST spre temperaturi mai ridicate. De fapt, la acest pH grupele carboxilice sunt complet ionizate (pKa = 5,4) şi deci mai hidrofile. În consecinţă, tranziţia de fază devine foarte lentă (Figurile IV.2 şi IV.3), ceea ce conduce într-o mare măsură la pierderea termosensibilităţii copolimerului destinat aplicaţiilor biomedicale. Dimpotrivă, în condiţii acide (pH = 1,2) grupele carboxilice ale acidului metacrilic din copolimer sunt complet protonate iar LCST scade cu mult sub temperatura corpului uman. Mai mult, la acest pH tranziţia de fază este foarte abruptă pentru ambele probe de poli(NIPAAm-co-AMet) (P1, Figura IV.2 şi P2, Figura IV.3).

Figura IV.2. Curbele de tranziţie ale poli(NIPAAm-co-AMet) (raport molar

comonomeri 10:1) în soluţie tampon acidă cu pH = 1,2 (●), apă distilată (■) şi tampon fosfat

cu pH = 7,4 (▲). Concentraţia soluţiilor de polimer este de 1% (g/g). Valorile absorbanţei

reprezintă media a trei experimente independente, cu o abatere de 2-7 %.

Figura IV.3. Curbele de tranziţie ale poli(NIPAAm-co-AMet) (raport molar

comonomeri 10:1) în soluţie tampon acidă cu pH = 1,2 (●), apă distilată (■) şi tampon fosfat

cu pH = 7,4 (▲). Concentraţia soluţiilor de polimer este de 1% (g/g). Valorile absorbanţei

reprezintă media a trei experimente independente, cu o abatere de 2-7 %.

25 30 35 40 450.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5pH = 1.2

H2O

pH = 7.4

Temperatura (oC)

Absorb

anta

(4

50

nm

)

20 25 30 35 40 45 50 550.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

H2O

pH = 7.4

pH = 1.2

Temperatura (oC)

Absorb

anta

(4

50

nm

)

Capitolul IV

16

În condiţii fiziologice simulate (pH = 7,4) şi în prezenţa unui compus biologic activ încărcat pozitiv şi care prezintă un caracter hidrofob, copolimerul poli(NIPAAm-co-AMet) îşi recapătă proprietăţile termosensibile prezentând o tranziţie de fază mult mai abruptă şi o valoare LCST aproximativ egală cu temperatura corpului uman. Propranololul s-a dovedit a fi cel mai hidrofob deoarece conţine două cicluri benzenice şi astfel complexarea acestuia cu grupele carboxilice din copolimer a condus la obţinerea celei mai mici valori LCST (33,4 oC, Figura IV.4).

Figura IV.4. Curbele de tranziţie ale poli(NIPAAm-co-AMet) (P2 în Tabelul IV.1) în absenţa

medicamentului (●); „complexat” cu o cantitate stoichiometrică de medicamente încărcate pozitiv: PRP (▲), Lid (♦), Met (■), KS(□) şi în prezenţa unei cantităţi stoechiometrice de medicament

„necomplexat” NaB(○). Concentraţia soluţiilor de polimer este de 1 % (g/g). Valorile absorbanţei reprezintă media a trei experimente independente, cu o abatere de 2-8 %.

IV.1.4. Prepararea hidrogelurilor de poli(NIPAAm-co-AMet) Hidrogelul pe bază de poli(NIPAAm-co-AMet) a fost obţinut prin copolimerizarea radicalică a NIPAAm şi AMet în prezenţă de BisAAm utilizată ca reticulant şi APS cu TEMED, utilizat ca sistem de iniţiere redox. Cantitatea de BisAAm a fost ajustată astfel încât să se obţină un hidrogel cu o stabilitate mecanică bună şi o capacitate de umflare mare. Pentru a obţine o structură poroasă care îmbunătăţeşte capacitatea de umflare/colapsare a hidrogelurilor s-au utilizat în amestecul de polimerizare oligomeri de poli(NIPAAm-co-HEAAm) ca agenţi porogeni. Ţinând cont de toate studiile preliminare, hidrogelul a fost obţinut în PBS la 22 oC, sub valoarea LCST a copolimerului poli(NIPAAm-co-AMet) dar deasupra valorii LCST a oligomerului utilizat ca agent porogen.

IV.1.5. Caracterizarea fizico-chimică a hidrogelurilor Hidrogelul obţinut în prezenţă de agent porogen prezintă o structură mai poroasă şi regulată (Figura IV.7B) comparativ cu cea obţinută în lipsa agentului porogen (Figura IV.7A). Dimensiunea porilor pentru microgelurile poroase este cuprinsă între 60-80 μm (Figura IV.7B).

Figura IV.7. Microfotografii SEM ale hidrogelului uscat de

poli(NIPAAm-co-AMet) (secţiune transversală) obţinut în absenţă (A) şi în prezenţă

(B) de agent porogen.

25 30 35 40 45 50 550.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

polimer pur

PRP

Lid

NaB

KS

Met

PBS, pH = 7,4

Temperatura (oC)

Absorb

anta

(4

50

nm

)

15 20 25 30 35 40 45 50 550.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

polimer pur

PRP

Lid

KS

NaB

Met

Apã distilatã

Temperatura (oC)

Absorb

anta

(4

50

nm

)

Hidrogeluri sub formă de microsfere sensibile la pH şi temperatură

17

IV.1.5.3. Determinarea VPTT prin măsurarea gradului de umflare la echilibru Pentru a verifica dacă microgelurile de poli(NIPAAm-co-AMet) păstrează proprietăţile de sensibilitate la pH şi temperatură ale copolimerului liniar, acestuia i s-a determinat temperatura de tranziţie (VPTT) în condiţii fiziologice simulate (PBS, pH = 7,4). Microgelurile au fost echilibrate iniţial în PBS în prezenţă de propranolol aflat în raport stoichiometric cu acidul metacrilic din microgeluri, apoi s-a măsurat gradul de umflare la diferite temperaturi. În Figura IV.8 se poate observa că tranziţia de fază a avut loc în jurul valorii LCST a complexului format de copolimerul liniar şi medicament. Microgelurile poroase prezintă o tranziţie volumică mai abruptă decât cea a hidrogelurilor neporoase. De asemenea, se mai poate observa că în absenţa medicamentului, microgelurile nu prezintă nici o temperatură de tranziţie volumică, manifestând acelaşi comportament ca al copolimerului liniar.

Figura IV.8. Efectul temperaturii asupra gradului de umflare al microgelurilor poroase

de poli(NIPAAm-co-AMet) necomplexate (●) şi complexate cu PRP (Δ), în condiţii fiziologice

simulate (PBS, pH =7,4). Pentru comparare, s-a reprezentat şi tranziţia

volumică a microsferelor neporoase complexate cu PRP (▲)

IV.1.6. Determinarea cantităţii minime de agent de declanșare

Figura IV.11. Titrarea turbidimetrică a copolimerului liniar

poli(NIPAAm-co-AMet) cu o soluţie de PRP (2,5 mg/ml) în PBS la 42 oC.

După cum se poate observa în Figura IV.11, adăugarea progresivă de propranolol conduce la scăderea liniară a transmitanţei soluţiei de copolimer. Când jumătate din grupele carboxilice sunt „complexate” cu PRP, transmitanţa a scăzut cu aproximativ 92,4 %. Continuarea complexării grupelor carboxilice rămase a determinat scăderea transmitanţei cu încă aproximativ 7 %. Prin analogie, se poate presupune că descreşterea transmitanţei soluţiei de copolimer cu 92,4 % poate fi corelată ipotetic cu o colapsare dramatică şi aproape completă a microgelurilor.

Trebuie subliniat faptul că acidul metacrilic din copolimerul liniar interacţionează aproape instantaneu cu PRP. Dimpotrivă, în hidrogeluri, care prezintă o reţea polimerică tridimensională, interacţiunea dintre acidul metacrilic şi PRP este controlată de difuzie. Prin urmare, colapsarea microgelurilor a fost investigată ţinând cont de cineticile de absorbţie ale propranololului şi de capacitatea de absorbţie a microgelurilor.

IV.1.7. Mecanismul de eliberare cu „autoreglare”a medicamentului Pentru o mai bună înţelegere a modului de acţiune a unor astfel de microgeluri folosite drept sisteme de eliberare cu „autoreglare” a medicamentelor s-a propus schema de mai jos (Schema IV.5). În absenţa PRP (agent de declanşare) hidrogelul este “inert” (nu este termosensibil) (Schema IV.5A). Atunci când condiţiile fiziologice sunt perturbate, organismul

0 10 20 30 40 50 605

7

9

11

13

15

17

19

21

23

Temperatura (oC)

Gra

d d

e u

mfla

re (

q)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

20

40

60

80

100

120

1:4 1:2 1:1

Volum (mL)raport molar PRP:COOH

Tra

nsm

itanta

(%

)

Capitolul IV

18

eliberează în primul rând o substanţă biochimică (în cazul nostru agentul de declanşare). Ca urmare, grupele carboxilice încărcate negativ, corespunzătoare unităţilor sensibile la pH ale reţelei, vor complexa cu substanţa biochimică la temperatura corpului uman prin interacţiuni electrostatice şi astfel, sistemul este “activat”. Mai mult, interacţiunile dintre grupele carboxilice ale hidrogelului, care acţionează ca un senzor, şi PRP, cu rol de agent de declanşare, induc la început o modificare parţială de volum şi eliberarea unei cantităţi mici de medicament în condiţii fiziologice (PBS, pH = 7,4, T = 36 °C) (Schema IV.5B). Din punct de vedere biomedical, această colapsare progresivă a microgelurilor poate determina eliberarea unui medicament ce a fost înglobat anterior în microgeluri. Pe măsură ce temperatura organismului creşte peste temperatura de tranziţie a microgelurilor (T > VPTT), creşte şi cantitatea agentului de declanşare din organism, determinând o colapsare considerabilă a microgelurilor, eliberându-se astfel o cantitate mai mare de medicament (Schema IV.5C).

Schema IV.5. Reprezentarea schematică a

construcţiei şi a principiului de funcţionare a

microgelurilor de poli(NIPAAm-co-AMet) sensibile la pH/temperatură în

prezenţa unui agent de declanşare

(PRP)

IV.2. Microgeluri pe bază de poli(NIPAAm-co-AMal)

În acest studiu s-a utilizat AMal drept comonomer întrucât prezintă două grupe carboxilice. S-a constatat că, în condiţii fiziologice simulate (PBS, pH = 7,4), copolimerul poli(NIPAAm-co-AMal) îşi pierde total proprietăţile termosensibile pe care însă şi le recapătă complet atunci când grupele carboxilice ale AMal din copolimer au interacţionat electrostatic cu compuşi biologic activi cu sarcini opuse şi cu caracter hidrofob, cum ar fi DPH. Prin titrare turbidimetrică realizată la o temperatură mai mare decât temperatura de tranziţie a complexului polimer-medicament (38 oC), a fost determinată concentraţia minimă de agent de declanşare necesară amorsării procesului de eliberare a medicamentului. Astfel, s-a dovedit că un procent de complexare de 50 % este suficient pentru a declanşa eliberarea potenţială a unei doze de medicament, fapt ce le recomandă pentru aplicaţii biomedicale. Hidrogelul sensibil la temperatură pe bază de poli(NIPAAm-co-AMal) a fost obţinut şi caracterizat ca în studiul anterior şi s-a arătat că un astfel de hidrogel este capabil să colapseze şi să elibereze o anumită cantitate de medicament în prezenţa unui agent de declanşare. Microgelurile astfel obţinute păstrează proprietăţile termosensibile ale copolimerilor liniari, precum şi proprietatea de reactivare a acestora în condiţii fiziologice şi în prezenţa unor compuşi hidrofobi încărcaţi cu sarcini de semn contrar. Caracteristicile acestor microgeluri se pliază perfect pe cerinţa unei noi generaţii de sisteme de eliberare controlată cu autoreglare, fiind constituite dintr-un senzor şi o componentă de livrare.

Hidrogeluri pe bază de ciclodextrine

19

CAPITOLUL V. HIDROGELURI PE BAZĂ DE CICLODEXTRINE

Legarea ciclodextrinelor într-o rețea polimerică se poate realiza atât într-o singură etapă prin reticularea a doi componenți [288], cât şi în două etape prin cuplarea ciclodextrinelor funcționalizate la o rețea polimerică [289]. Ciclodextrinele incluse în hidrogeluri vor putea forma în continuare complecşi de incluziune atâta timp cât accesul la cavitatea acestora nu va fi blocată.

V.1. Microsfere pe bază de dextran şi ciclodextrine

În capitolul de față s-a urmărit obținerea unor microgeluri pe bază de dextran şi ciclodextrină, într-o singură etapă prin reticulare cu epiclorhidrină.

V.1.1. Prepararea microsferelor pe bază de dextran şi ciclodextrină Microparticulele pe bază de Dex/CD au fost obținute prin reticularea covalentă cu epiclorhidrină (ECH) a unui amestec de Dex şi CD, aflate în raport masic de 2:1. Randamentul de

obținere a microparticulelor a crescut uşor odată cu creşterea masei moleculare a CD (de la -CD

la -CD) deoarece s-a mărit numărul grupelor hidroxilice responsabile de legarea CD de dextran. Totuşi, randamentul de obținere a microparticulelor Dex/CD este mai mic decât cel al microparticulelor Dex (proba „oarbă”) deoarece probabilitatea formării rețelei tridimensionale este mai mică în cazul ciclodextrinei cu masă moleculară mică decât în cazul dextranului cu masă moleculară mare (Tabelul V.1). Tabelul V.1. Caracterizarea microsferelor Dex/CD

Probă Randament

(%) Grad de umflare

(q=Vs/Vd)b

Cantitatea de PBS reținută

(g/g)

Volumul porilor (mL/g)

Dex ms 73,8 ± 4,9 7,5 ± 0,1 5,5 ± 0,2 4,57 ± 0,03

Dex/-CD 65,6 ± 3,3 7,6 ± 0,2 5,7 ± 0,2 4,65 ± 0,04

Dex/-CD 66,4 ± 4,5 7,5 ± 0,2 5,6 ± 0,2 4,60 ± 0,05

Dex/-CD 68,9 ± 4,2 7,9 ± 0,2 5,8 ± 0,2 4,75 ± 0,06 aDatele reprezintă rezultatele a trei experimente independente

bq=Vs/Vd este calculat ca raport dintre volumul microsferelor umflate şi volumul microsferelor uscate

V.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a microsferelor Analiza morfologică şi dimensională a microsferelor de Dex/CD s-a realizat prin SEM. S-a utilizat un sistem de sitare folosindu-se pentru analiză microsferele cu dimensiuni cuprinse între 60 şi 125 μm. După cum se observă în Figura V.1A şi B, microsferele în stare uscată prezintă formă sferică şi o suprafață rugoasă iar în Figura V.1C se poate observa că acestea prezintă o structură poroasă.

Figura V.1. Microfotografii SEM ale microsferelor de Dex/CD: vedere generală (A), detaliu de suprafață (B) pentru microsferele uscate şi detaliu de structură

internă (C) pentru microsferele liofilizate.

Capitolul V

20

V.1.2.3. Studii cromatografice (ISEC) Volumul porilor microsferelor a fost calculat ca diferență dintre volumul de eluție al celei mai mici molecule (apa), care difuzează prin toți porii microsferelor, şi volumul de eluție al moleculei de dextran standard (Mw = 2000000 g/mol), exclus complet din pori (Figura V.2).

Figura V.2. Cromatograma ISEC folosind ca

fază staționară microparticule pe bază de

Dex, Dex/-CD, Dex/-CD şi Dex/-CD. Faza mobilă: soluție tampon fosfat (pH=7,4); viteza de curgere: 0,3 ml/min; volum injectat:

20 l; concentrația solutului 10 g/L (detectare refractometrică).

Din Figura V.2 se poate observa că toate microsferele prezintă o structură poroasă (Figura V.1C) cu valori ale volumului porilor cuprinse între 4,57 mL/g, pentru microsferele din Dex, şi 4,75 mL/g pentru microsferele din

Dex/CD (Tabelul V.1). Capacitatea ciclodextrinei incluse în rețeaua polimerică a microsferelor de Dex de a forma complecşi de incluziune cu medicamentele a fost studiată prin cromatografie ISEC iar eluția medicamentelor şi a compuşilor chimici model a fost făcută în condiții fiziologice simulate utilizându-se PBS (pH = 7,4) ca eluent. Microsferele de Dex/CD au fost mai întâi amestecate cu o cantitate potrivită de microsfere „inerte” de Dex pentru a garanta acelaşi număr de echivalenți de

CD pe gram de microsfere.

Pentru fiecare medicament şi compus chimic model utilizat, timpul de retenție (TR) reflectă tăria interacțiunii dintre cavitatea hidrofobă a CD şi compusul respectiv. Capacitatea microsferelor de Dex/CD de a reține medicamente se datorează în principal ciclodextrinei. Pentru a demonstra acest lucru s-a determinat timpul de retenție (TR) atât pentru

microsferele de Dex/CD, Dex/CD, Dex/CD, cât şi pentru microsferele „inerte” de Dex. Prin

raportarea TR al medicamentelor trecute peste microsferele cu ciclodextrină (Dex/CD,

Dex/CD, Dex/CD) la TR obținut în cazul microsferelor „inerte” s-au obținut coeficienții de

interacțiune C, C, C. În funcție de coeficienții de interacțiune se poate face o clasificare a complecşilor de incluziune formați între medicament şi ciclodextrine: slabi (1< C < 1,5), moderați (1,5 < C < 2), puternici (C > 2).

Formarea complecşilor de incluziune cu CD şi CD a fost confirmată de valorile mari

ale coeficienților de interacțiune (C = 2,98 pentru indol şi C pentru adamantan care nu a fost detectat în eluent). Acidul p-hidroxibenzoic formează un complex de incluziune destul de puternic

cu CD, prezentând o valoare moderată a coeficientului de interacțiune (C = 1,93), în timp ce

acidul benzoic formează complecşi de incluziune slabi cu CD, prezentând o valoare mică a

coeficientului de interacțiune (C = 1,39). Diclofenacul prezintă valori mari ale coeficienților de

interacțiune în cazul microsferelor de Dex/CD, Dex/CD, Dex/CD, iar 3-nitrofenolul prezintă

cel mai mare coeficient de interacțiune în cazul Dex/CD.

V.1.3. Studii de înglobare şi eliberare Pentru studiile de înglobare şi eliberare s-a studiat capacitatea de reținere şi eliberare a diferite tipuri de compuşi bioactivi, precum indol, 3-nitrofenol, acid p-hidrobenzoic, diclofenac, fiecare dintre aceştia fiind caracterizați de un anumit timp de reținere în microsfere (înalt, moderat, scăzut). Medicamentul este reținut în microsfere prin următoarele mecanisme: includerea medicamentului în cavitatea hidrofobă a ciclodextrinei (interacțiuni specifice); înglobarea în rețeaua polimerică (interacțiuni nespecifice); solubilizarea în soluția tampon reținută în microsferele umflate (numit şi medicament liber). Cantitatea de medicament reținută fizic de microsferele de Dex/CD este aceeaşi cu cea reținută de microsferele de Dex „inerte”, fără ciclodextrină. Aceasta s-a calculat pe baza diferenței

1.0 1.5 2.0 2.5 3.00

1

2

3

4

5

6

7

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

Dex ms

Volum de elutie (mL)

Lg M

DT 2000000

DT 25000

DT 5000

DT 4000

D2O

DT 1000

Glucoza

Hidrogeluri pe bază de ciclodextrine

21

dintre concentrația inițială a medicamentului liber dizolvat în soluție tampon şi concentrația supernatantului după imersarea şi umflarea microsferelor de Dex/CD.

Figura V.6. Cineticile de eliberare pentru indol (A), 3-

nitrofenol (B), acid p-hidroxibenzoic (C) şi diclofenac (D) din

microsfere de Dex şi Dex/CD (Dex/CD, Dex/CD,

Dex/CD)

În Figura V.6 este redată cinetica de eliberare a medicamentelor doar din cavitatea hidrofobă a ciclodextrinei din microsfere. Se poate observa că, în primele 15 minute, are loc o eliberare rapidă pentru compuşii care prezintă un coeficient de interacțiune foarte mare, implicit care formează complecşi de incluziune foarte puternici, precum

indol (C = 2,98) şi 3-nitrofenol (C

= 6,97) cu CD şi diclofenac cu

CD (C = 6,83). Aceştia sunt eliberați în proporție de 50,7 % (indol), 45,4 % (3-nitrofenol) respectiv 66 % (diclofenac) în primul sfert de oră şi peste 20 % în următoarele două ore, după care pare să se instaleze un echilibru între eliberare şi legarea medicamentului de CD.

Instalarea echilibrului între eliberare şi re-legarea medicamentului după ce creşte concentrația medicamentului în mediul de eliberare a fost demonstrată şi confirmată prin reîmprospătarea soluției tampon. Într-adevăr, în noile condiții, aproape toată cantitatea de medicament înglobată în microsfere este eliberată.

V.2. Microgeluri pe bază de poli(NIPAAm-co--CD)

Ideea asocierii unei componente sintetice cu una naturală în cadrul aceleaşi structuri chimice, a condus la o nouă clasă de materiale ce întruneşte proprietățile fizico-chimice ale fiecărui compus în parte. Copolimerizarea N-izopropilacrilamidei cu ciclodextrine funcționalizate facilitează legarea medicamentelor [309]. Ţinându-se cont de toate aceste aspecte, s-a dorit obținerea unor microgeluri pe bază de

poli(NIPAAm-co-CD) care să prezinte sensibilitate la temperatură, respectiv capacitatea de formare a complecşilor de incluziune. Cu scopul de a asigura microgelurilor un anumit grad de

biodegradabilitate, CD a fost astfel funcționalizată încât să poată fi folosită simultan atât ca monomer, cât şi ca reticulant.

V.2.2. Prepararea microgelurilor de poli(NIPAAm-coCD) Microsferele de poli(NIPAAm-co-CD) au fost obținute prin co-polimerizarea radicalică

reticulantă a NIPAAm cu ACD în prezența KPS, utilizat ca inițiator şi TEMED, utilizat ca

accelerator de reacție. Pentru ACD s-a determinat un G.S. de 1,63, astfel că fost utilizată atât ca monomer, cât şi reticulant întrucât posedă mai mult de o legătură dublă pe moleculă. S-a optat pentru această valoare moderată a G.S. întrucât asigură obținerea unei rețele reticulate stabile şi un grad de umflare mare al acesteia.

V.2.3. Caracterizarea fizico-chimică a microgelurilor Analiza morfologică şi dimensională a microparticulelor de poli(NIPAAm-co-CD) s-a realizat prin SEM. După cum se observă în Figura V.10A, microsferele în stare uscată au

dimensiuni relativ mici (60 - 220 m) şi prezintă o structură poroasă atât la suprafață (Figura V.10B), cât şi în interior (Figura V.10C).

0 2 4 6 80

20

40

60

80

100

120

22 24 26

Dex ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

Inlocuire solutie tampon

Timp (ore)

Ind

ol e

libe

rat (%

)

0 2 4 6 80

20

40

60

80

100

120

22 24 26

Dex ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

inlocuire solutie tampon

Timp (ore)3

-nitr

ofe

no

l elib

era

t (%

)

0 2 4 6 80

20

40

60

80

100

120

22 24 26

Dex ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

inlocuire solutie tampon

Timp (ore)

p-H

BA

elib

era

t (%

)

0 2 4 6 80

20

40

60

80

100

120

22 24 26

Dex ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

Dex/-CD ms

inlocuire solutie tampon

Timp (ore)

Dic

lofe

na

c e

libe

rat (%

)

A B

C D

Capitolul V

22

Figura V.10. Microfotografiile

SEM ale microparticulelor: uscate la vid (A),

respectiv liofilizate: (B) şi (C)

V.2.3.3. Determinarea VPTT

Figura V.11. Efectul temperaturii asupra gradului de umflare al microgelurilor de

poli(NIPAAm-co-CD) în condiții fiziologice simulate (PBS, pH = 7,4)

În acest studiu, introducerea unităților

hidrofile de CD modifică secvența acrilamidică din poli(NIPAAm) care este responsabilă de proprietățile termosensibile ale polimerului. Ca urmare, este necesară o temperatură mai înaltă pentru a provoca în primul rând deshidratarea lanțurilor polimere, apoi interacțiuni hidrofobe între acestea. Determinarea VPTT a microgelurilor a fost realizată atât prin măsurarea gradului de umflare cu temperatura, cât şi prin DSC. În Figura V.11 se poate observa că sub VPTT are loc scăderea continuă a gradului de umflare odată cu creşterea temperaturii. Însă, în apropierea temperaturii corpului uman, gradul de umflare scade rapid.

V.2.4. Sisteme termosensibile de eliberare a diclofenacului Pentru acest studiu, diclofenacul a fost ales drept compus model pentru includerea şi

eliberarea acestuia în/din microgelurile de poli(NIPAAm-co-CD). S-a obținut o eficiență de înglobare de 95,5 %. Studiile de eliberare a diclofenacului au fost realizate în PBS atât la temperaturi aflate sub (32 oC) şi peste (40 oC) VPTT (Figura V.13), cât şi prin schimbarea alternativă a temperaturii pentru obținerea unui mecanism pulsatoriu de eliberare (Figura V.14). Aceste studii au arătat că microsferele pot fi utilizate ca sisteme de eliberare pulsatorie a medicamentelor.

Figura V.13. Curbele de eliberare a DF din

microgeluri în tampon fosfat cu pH = 7,4, la 32 oC (▲) şi respectiv 40 oC (●)

Figura V.14. Efectul variației ciclice a

temperaturii (32 oC (▲) şi 40 oC (●)) asupra eliberării DF din microgeluri în tampon fosfat cu

pH = 7,4

0 10 20 30 40 500

5

10

15

20

A

Temperatura (°C)

Gra

du

l de

um

flare

0 250 500 750 1000 1250 15000

25

50

75

100

Improspatare PBSA

A

Timp (min)

Dic

lofe

na

c e

libe

rat (%

)

0 25 50 75 1000

20

40

60

80

100

B

Timp (min)

Dic

lofe

na

c e

libe

rat (%

)

Capitolul VI

23

CAPITOLUL VI. MICROSFERE DE PLGA PENTRU ELIBERAREA CONTROLATĂ A DEXAMETAZONEI

Scopul acestui studiu a fost obţinerea unor noi microsfere de PLGA în care să fie împiedicată difuzia medicamentului în timpul metodei de obţinere, precum şi creşterea stabilităţii dexametazonei (DM) prin includerea acesteia în cavitatea unor ciclodextrine sau prin legarea ionică de polietilenimină (PEI), premergător încapsulării în microsfere.

VI.2. Prepararea şi caracterizarea microsferelor de PLGA

VI.2.1. Obţinerea microsferelor de PLGA încărcate cu dexametazonă Microsferele de PLGA au fost obţinute prin metoda evaporării solventului din dublă emulsie (w1/o/w2). Unul dintre dezavantajele acestei metode constă în difuzia rapidă a medicamentului în

timpul metodei de obţinere [328]. Utilizarea agenţilor de protecţie precum HPCD, -CD sau PEI are rolul de a preveni difuzia DM în timpul preparării microsferelor de PLGA. Pentru microsferele de PLGA obţinute cu DM liberă s-a obţinut cea mai mică eficienţă de înglobare. Cel mai eficient agent de complexare s-a dovedit a fi PEI, care are o masă moleculară foarte mare (750000 g/mol). După liofilizare, microsferele prezintă o structură foarte poroasă (Figura VI.8) datorită numeroaselor picături formate în prima emulsie (w1/o).

VI.2.2. Analiza morfologică şi dimensională Analiza morfologică şi dimensională s-a realizat cu ajutorul microscopului electronic cu baleiaj (ESEM). Microsferele obţinute prin metoda w1/o/w2 la un raport w1/o de 1/10 şi o concentraţie a polimerului de 8 % (g/v) au dimensiuni mari şi formă neregulată (Figura VI.8).

Figura VI.8. Microfotografii SEM ale microsferelor de PLGA obţinute prin metoda

evaporării solventului din emulsie dublă (w1/o/w2) la o concentraţie a polimerului de 8 % şi un raport w1/o de 1/10: vedere generală

(A) şi detaliu de suprafaţă (B).

Prin înjumătăţirea concentraţiei de polimer în faza organică au fost obţinute microparticule mai rotunde(Figura VI.9). După ce s-a redus şi raportul w1/o de la 1/10 la 1/25 si apoi la 1/50, s-au obţinut microparticule perfect rotunde, mai mici şi cu porozitate mai redusă (Figura VI.10).

Figura VI.9. Microfotografii SEM ale microsferelor de PLGA obţinute prin metoda

evaporării solventului din emulsie dublă (w1/o/w2) la o concentraţie a polimerului de 4 % şi un raport w1/o de 1/10: vedere generală

(A) şi detaliu de suprafaţă (B).

Figura VI.10. Microfotografii SEM ale microsferelor de PLGA obţinute prin metoda

evaporării solventului din emulsie dublă (w1/o/w2) la o concentraţie a polimerului de 4 % şi un raport w1/o de 1/50: vedere generală

(A) şi detaliu de suprafaţă (B).

Microsfere de PLGA pentru eliberarea controlată a dexametazonei

24

VI.2.3. Studiul cineticii de eliberare a dexametazonei Cinetica de eliberare a DM a fost studiată în condiţii fiziologice simulate (PBS, pH = 7,4). Viteza de eliberare a DM din microsferele de PLGA poate fi controlată, în primul rând, de desfacerea complexului dintre DM/CD sau DM/PEI, apoi de difuzia medicamentului spre exteriorul matricei polimerice.

Figura VI.11. Influenţa agenţilor de

complexare asupra cineticilor de eliberare a DM din microsfere: fără agent de complexare

(●), cu HPCD (■),-CD (▲) şi PEI (♦)

În primul set de probe, 0,5 mL soluţie DM a fost înglobată în 0,4 g PLGA. Astfel s-au obţinut microsfere cu acelaşi grad de porozitate. În Figura VI.11 se poate observa că există o diferenţă între eliberarea DM din microsferele obţinute cu/fără agent de complexare. Cea mai mare viteză de eliberare se obţine din microsferele în care DM a fost înglobată fără agent de complexare. Viteza de eliberare scade pe măsură ce creşte tăria complexului dintre DM/CD, respectiv DM/PEI. În cazul microsferelor cu DM/PEI se obţine cea mai mică viteză de eliberare a DM datorită structurii ramificate şi a densităţii mari de sarcini din PEI ceea ce conduce la formarea unor interacţiuni electrostatice puternice cu medicamentul.

Au fost obţinute microsfere mai rotunde, mai mici și foarte poroase atunci când s-au folosit doar 0,200 g de PLGA pentru înglobarea a 0,5 mL soluţie de medicament. În acest caz, viteza de eliberare a DM este foarte mare pentru microsferele obţinute cu CD ca agent de complexare (Figura VI.12). În cazul microsferelor obţinute cu PEI, viteza de eliberare este mai mică, dovedind odată în plus că desfacerea legăturilor electrostatice din complexul DM/PEI influenţează considerabil cinetica de eliberare. Prin scăderea raportului w1/o, au fost obţinute microsfere cu porozitate mai mică (Figura VI.10). Drept urmare, difuzia medicamentului este împiedicată, astfel viteza de eliberare a DM scade considerabil Figura VI.13, fiind necesare aproximativ 100 de ore pentru eliberarea completă a medicamentului.

Figura VI.12. Cinetica de eliberare din microsferele obţinute cu 0,2 g PLGA şi diferiţi

agenţi de complexare: HPCD (PLGA4) (■), -

CD (PLGA5) (▲) şi PEI (PLGA6) (♦)

Figura VI.13. Cineticile de eliberare a DM din microsferele de PLGA cu HPCD obţinute la

diferite rapoarte w1/o: 1/25 (PLGA7) () şi 1/50 (PLGA8) (▲).

0 5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

Timp (ore)

Dexa

meta

zona e

libera

ta (%

)

0 5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

Timp (ore)

Dexa

meta

zona e

libera

ta (%

)

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Timp (ore)

Dexam

eta

zona e

libera

ta (%

)

Activitatea ştiinţifică

25

Rezultatele originale prezentate în cadrul tezei au fost publicate sub formă de articole ştiinţifice în reviste internaţionale de profil (6 lucrări ştiinţifice), prezentate sub formă de

comunicări orale (8) sau postere (4) la diferite manifestări știinţifice naţionale și internaţionale, după cum urmează:

Lucrări publicate în extenso în reviste de specialitate de circulaţie internaţională recunoscute (reviste cotate ISI) 1) Poly(N-isopropylacrylamide-co-hydroxyethylacrylamide) thermosensitive microspheres: The

size of microgels dictates the pulsatile release mechanism, G. Fundueanu, M. Constantin, I. Asmarandei, S. Bucatariu, V. Harabagiu, P. Ascenzi, B. C. Simionescu, Eur. J. Pharm. Biopharm. 85, 614-623 (2013) (FI = 3,826).

2) Do cyclodextrins bound to dextran microspheres act as sustained delivery systems of drugs?, M. Constantin, S. Bucatariu, V. Harabagiu, P. Ascenzi, G. Fundueanu, Int. J. Pharm. 469, 1-9 (2014) (FI = 3,458).

3) Poly(N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid) pH/thermo-responsive porous hydrogels as self-regulating drug delivery system, M. Constantin, S. Bucatariu, V. Harabagiu, I. Popescu, P. Ascenzi, G. Fundueanu, Eur. J. Pharm. Sci. 62, 86-95 (2014) (FI = 2,987).

4) Poly(NIPAAm-co--cyclodextrin) microgels with drug hosting and temperature-dependent delivery properties, M. Constantin, S. Bucatariu, P. Ascenzi, B. C. Simionescu, G. Fundueanu, React. Funct. Polym. 84, 1-9, (2014) (FI = 2,822).

5) Synthesis and characterization of thermosensitive poly(N-isopropylacrylamide-co-hydroxyethylacrylamide) microgels as potential carriers for drug delivery, S. Bucatariu, G. Fundueanu, I. Prisacaru, M. Balan, I. Stoica, V. Harabagiu, M. Constantin, J. Polym. Res. 21, 580 (2014) (FI = 1,897)

6) Behavior of Thermo- and pH-Responsive Copolymer of N-isopropylacrylamide and Maleic Acid in Aqueous Solutions, E. Tarabukina, M. A. Simonova, S. Bucatariu, A. P. Filippov, Int. J. Polym. Anal. Ch. 21, 11-17 (2015) (FI = 1,26)

Comunicări 1) pH/Thermoresponsive microspheres obtained from preformed polymers for controlled release of

drugs, M. Constantin, I. Asmarandei, S. Bucatariu, V. Harabagiu, G. Fundueanu, the 11th Conference on Colloid and Surface Chemistry, Iaşi, România, 09 – 11.05.2013.

2) Nanoparticule termosensibile ca transportatori de medicamente antiinflamatorii, S. Bucătariu, I. Prisăcaru, I. Asmarandei, V. Harabagiu, X. Patraş, G. Fundueanu, M. Constantin, a 24-a ediţie a Congresului Internaţional „Pregătim viitorul promovând excelenţa” Appolonia, Iaşi, 27.02-01.03.2014.

3) Nanogeluri termosensibile pe bază de poli(N-izopropilacrilamidă-co-hidroxietilacrilamidă) pentru aplicaţii biomedicale, I. Prisăcaru, S. Bucătariu, I. Asmarandei ,V. Harabagiu, X. Patraş, G. Fundueanu, M. Constantin, a 24-a ediţie a Congresului Internaţional „Pregătim viitorul promovând excelenţa” Appolonia, Iaşi, 27.02-01.03.2014.

4) pH/thermo-sensitive hydrogels as smart materials for drug delivery system, G. Fundueanu, M. Constantin, S. Bucătariu, A XXXIII-a Conferinţă Naţională de Chimie Călimăneşti – Căciulata, Călimăneşti, România,1-3.10.2014.

5) Thermosensitive microgels as potential carrier for drugs, M. Constantin, S. Bucătariu, V. Harabagiu, G. Fundueanu, A XXXIII-a Conferinţă Naţională de Chimie Călimăneşti – Căciulata, Călimăneşti, România, 1-3.10.2014.

6) Smart hydrogels loaded with niacin-chitosan microspheres, S. Bucătariu, V. Harabagiu, G. Fundueanu, M. Constantin, A XXXIII-a Conferinţă Naţională de Chimie Călimăneşti – Căciulata, Călimăneşti, România, 1-3.10.2014.

7) Cyclodextrin-based microgels for self-regulated drug systems, S. Bucătariu, M. Constantin, G. Fundueanu, a 25-a ediţie a Congresului Internaţional „Pregătim viitorul promovând excelenţa” Appolonia, Iaşi, 26.02-01.03.2015

8) Poly(NIPAAm-co-MAc) ph/thermo-responsive microgels for self-regulated drug delivery systems, S. Bucătariu, M. Constantin, V. Harabagiu, G. Fundueanu, a-7-a ediţie a Simpozionului Cristofor I. Simionescu, Frontiers in Macromolecular and Supramolecular

Science, Iași, 4-5.06.2015

Activitatea ştiinţifică

26

Postere 1) pH/Thermoresponsive hydrogels activated by biologically active compounds, G. Fundueanu, M.

Constantin, I. Asmarandei, S. Bucatariu, V. Harabagiu, 4-th Bilateral Symposium on Functional Heterocyclic and Heterochain Polymers for Advanced Materials, Iaşi, România, 02-07.09.2012.

2) pH/Thermoresponsive hydrogel Incorporating Chitosan Microspheres, M. Constantin, S. Bucatariu, I. Asmarandei, V. Harabagiu, G. Fundueanu, The 11-th Conference on Colloid and Surface Chemistry, Iaşi, România, 09-11.05.2013.

3) Are cyclodextrins appropriate candidates for the release of drugs in a sustained way?, I. Asmarandei, M. Constantin, S. Bucatariu, V. Harabagiu, G. Fundueanu, EPNOE 2013 International Polysaccharide Conference, Nice, France, 21-24.10.2013.

4) Biodegradable polymeric microparticles for ocular therapy, S. Bucătariu, M. Constantin, G. Fundueanu, Romanian International Conference on Chemistry and chemical engineering (RICCCE 19), 2-5.09.2015.

Contracte/Granturi 1) „Sisteme inovative de eliberare controlată sub formă de particule pentru ţintirea segmentului posterior ocular” PN-II-PT-PCCA-2013-4-1570, contract finanţare PN II/PCCA 218/2014, director proiect: Dr. Fundueanu-Constantin Gheorghe

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ [162] R.H. Pelton, P. Chibante, Preparation of aqueous lattices with N-isopropylacrylamide, Colloid Surf 20,

247-256, 1986 [226] G. Fundueanu, M. Constantin, F. Bortolotti, P. Ascenzi, R. Cortesi, E. Menegatti, Preparation and

characterization of thermoresponsive poly(Nisopropylacrylamide-co-acrylamide-co-hydroxyethyl acrylate) microspheres as a matrix for the pulsed release of drugs, Macromol. Biosci. 5, 955–964, 2005

[228] A. D’Emanuele, R. Dinarvand, Preparation, characterization, and drug release from thermoresponsive microspheres, Int. J. Pharm. 118, 237–42, 1995

[237] B. Wang, X.-D. Xu, Z.-C. Wang, S.-X. Cheng, X.-Z. Zhang, R.-X. Zhuo, Synthesis and properties of pH and temperature sensitive P(NIPAAm-co-DMAEMA) hydrogels, Colloids Surf. B 64, 34-41, 2008

[247] International Standard ISO 22412, Particle Size Analysis-Dynamic Light Scattering, International Organization for Standardization (ISO), 2008

[248] H.M. Crowther, B. Vincent, Swelling behaviour of poly-N isopropylacrylamide microgel particles in alcoholic solutions, Colloid Polym. Sci. 276, 46–51,1998

[250] A. Guillermo, J.P. Cohen Addad, J.P. Bazile, D. Duracher, A. Elaissari, C. Pichot, C-NMR investigations into heterogenous structures of thermosensitive microgel particles, J. Polym. Sci. Pol. Phys. 38, 889–898, 2000

[252] H. Du, R. Wickramasinghe, X. Qian, Effects of salt on the lower critical solution temperature on poly(N-isopropylacrylamide), J. Phys. Chem. B 114,16594–16604, 2010

[288] G. Fundueanu, M. Constantin, D. Mihai, F. Bortolotti, R. Cortesi, P. Ascenzi, E. Menegatti, Pullulan–cyclodextrin microspheres: a chromatographic approach for the evaluation of the drug–cyclodextrin interactions and the determination of the drug release profiles, J. Chromatogr. B 791, 407–419, 2003

[289] Z. Yuan, Y. Ye, F. Gao, H. Yuan, M. Lan, K. Lou, W. Wang, Chitosan-graft--cyclodextrin nanoparticles as a carrier for controlled drug release, Int. J. Pharm. 446, 191–198, 2013

[292] N.J. Turro, T. Okubo, C.J. Chung, Analysis of static and dynamic host-guest associations of detergents with cyclo-dextrins via photoluminescence methods, J. Am. Chem. Soc. 104, 1789–1794, 1982

[309] H.-D. Wang, L.-Y. Chu, X.-Q. Yu, R. Xie, M. Yang, D. Xu, J. Zhang, L. Hu, Thermo-sensitive affinity

behavior of poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels with -cyclodextrin moietis, Ind. Eng. Chem. Res. 46, 1511–1518, 2007

[317] V.J. Stella, V.M. Rao, E.A. Zannou, V. Zia, Mechanisms of drug release from cyclodextrin complexes, Adv. Drug Deliver. Rev. 36,3–16, 1999

[328] K. Kawabata, K. Sugihara, S. Sanoh, S. Kitamura, S. Ohta, Photodegradation of pharmaceuticals in the aquatic environment by sunlight and UV-A, -B and –C irradiation, J. Toxicol. Sci. 38, 215-223, 2013