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Jaume C. Morales
Especialista de Producto MS
Agilent Technologies Spain
20 Octubre 2011
Madrid
Herramientas LC/MS de masa exacta para
el cribado de pesticidas.
• Necesidad de métodos de screening; confirmacion y cuantificación únicamente
de positivos.
• Necesidad de métodos “listos para usar” incluyendo la fase de preparación de
muestra
• Mayor número de muestras:
• Necesidad de métodos más rápidos con menos preparación de muestra
• Necesidad de análisis multi-componente
• Necesidad de una solución eficaz de gestión de datos
• Ideal:
• Facilidad en la preparación de muestra
• Identificación sin riesgo
• Screening y cuantificación en el mismo run
Retos en análisis alimentario
Principales retos del análisis
alimentario
La cuantificación por LC/MS de compuestos CONOCIDOS suele ser más
sensible y robusta con un equipo basado en Quadrupolo(s). (SQ/QQQ)
Análisis de Compuestos Conocidos
Una cuantificación para ser aceptable requiere, al menos, entre 10-15
puntos a lo largo del pico cromatográfico.
4 x10
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
Counts vs. Acquisition Time (min)
0.49 0.495 0.5 0.505 0.51 0.515 0.52 0.525 0.53 0.535 0.54 0.545 0.55 0.555 0.56
W1/2 = 0.63 s
W = 1.8 s
Buena calidad datos:
Avg W1/2 = 0.63 s
Avg. W = 1.8 s
5 puntos W1/2
13 puntos W
Area RSD [%] = 4.7
SNR (3RMS) = 1672
A medida que los
picos son más
estrechos … el
detector debe “barrer”
más deprisa. Los
tiempos de ciclo se
reducen por lo que,
los MRMs/cambios de
polaridad deben ser
más rápidos.
Principales retos del análisis
alimentario
La cuantificación por LC/MS de compuestos CONOCIDOS
suele ser más sensible y robusta con un equipo basado en
Quadrupolos. (SQ/QQQ)
Sin embargo :
1- Cuantificar a la vez un gran número de compuestos (> 300 compuestos) en una sola
inyección puede llegar a mermar la sensibilidad pues para un compuesto la sensibilidad
depende del tiempo que el cuadrupolo se dedica a ése compuesto. Por ello las técnicas de
Screening o Barrido nos permiten primero “detectar” qué compuestos están presentes y
luego confirmar los POSITIVOS “robustamente” con un sistema LC SQ/QQQ.
2- Aunque tradicionalmente los equipos de barrido han sido menos sensibles, los últimos
desarrollos en LCMS están permitiendo niveles de sensibilidad muy cercanos a algunos
sistemas LC SQ/QQQ.
Análisis de Compuestos Conocidos
Flujo de trabajo habitual en
alimentación/medioambiente con LCMS
Screening Confirmacion Cuantificación
Principales retos del análisis
alimentario
El análisis por LC/MS de compuestos DESCONOCIDOS tiene como objetivo
identificar ésos compuestos a través de la masa exacta, perfil isotópico y
opcionalmente a través del espectro MS/MS.
Además, el cromatograma Full Scan permite el análisis retrospectivo.
Masa exacta :
Los equipos que calificamos como de masa exacta son aquellos que permiten
medir con errores máximos de masa de < 5ppm.
Los sistemas basados en SQ/QQQ suelen mostrar un error de masa > 150ppm.
Análisis de Compuestos DESConocidos o Barrido
(Masa Medida - Masa Calculada) X 1,000,000
Masa Calculada
= ppm
Resolución y exactitud de masa
R = 614/0.68 = 903
Δmz = 0.1/614
= 160 ppm
Pw=0.68
Mz=614
SQ
TQ
IT
TOF
Q-TOF R = 614/0.0423 = 14522
Δmz = 0.0004/613.96
= 0.7 ppm
Resolución:
R=mz/FWHM
Exactitud de masa Δmz=dm/mz*106,
partes por million (ppm)
PFTBA masa 614
C12F24N=613.964203
1 Da.
1 Da.
Pw=0.0423
Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo Masa Exacta Inferior a 5 ppm
Aportaciones de la Masa Exacta
1. Especificidad en la comparación.
2. Muy Elevada Selectividad Cuantitativa para la extracción de información
específica de cada compuesto con métodos de adquisición genéricos (modo
barrido).
•Requerimientos en Análisis Alimentario
1. “Masa Exacta” independiente de la concentración del analito.
2. Buena Sensibilidad en modo barrido (métodos genéricos MS-SCAN).
Exactitud Masa (ppm) Nº posibles fórmulas
empíricas Tecnología
165 ppm 209 QUAD/TRAP
10ppm 13
5 ppm 7
2 ppm 2 TOF /Q-TOF
Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z
Número de fórmulas posibles según el error
1
10
100
1000
10000
0.1 1 10 100 1000
# P
oss
ible
Ch
emic
al F
orm
ula
s
mass uncertainty, ppm
Possible Number of Chemical Formulas at m/z 272
Fórmulas a partir de:
C,H,N,O,F, y Cl
error
ppm amu Posibles Fórmulas
1000 0.3 7657 368 0.1 4050 100 0.03 1223
37 0.01 466 10 0.003 120
4 0.001 43 1 0.0003 11
0.4 0.0001 5 0.1 0.00003 2
Octafluoronaphthalene (CAS
313-72-4)
C10F8 = 271.98667
La masa exacta reduce el riesgo de confundir el compuesto
Parámetros de Identificación
Masa Monoisotópica
(varia en ppm)
Isotope spacing
(varia en ppm)
Distribucion Isotópica
(varia en %)
Scoring basado en
Masa
Exacta
Data Base
CH3 N
CH3
OH OH
C16H25NO2
5 x10
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
Cpd 246: O-Desmethylvenlafaxine (Desvenlafaxine): +ESI MFE Spectrum ( …
264.1961 (M+H)+
265.1994 (M+H)+
266.2023 (M+H)+
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
264 264.5 265 265.5 266 266.5
Búsqueda en Base de datos
Masa Monoisotópica
(varia en ppm)
Isotope spacing
(varia en ppm)
Distribucion Isotópica
(varia en %)
Scoring basado en
Propuesta de Fórmula
MFG
C16H25NO2
M = 263.1885
5 x10
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
Cpd 246: O-Desmethylvenlafaxine (Desvenlafaxine): +ESI MFE Spectrum ( …
264.1961 (M+H)+
265.1994 (M+H)+
266.2023 (M+H)+
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
264 264.5 265 265.5 266 266.5
Masa Monoisotópica
(varia en ppm)
Isotope spacing
(varia en ppm)
Distribucion Isotópica
(varia en %)
Scoring basado en
Page 13
BARRIDO CON LCMS
MASA EXACTA
OK
PERO
¿COMO?
Page 14
Existe nueva tecnología que puede ayudarle a ser más
productivo
¿Implementarlo, requiere tiempo y personal
cualificado?
Agilent tiene la solución
Aportando las nuevas tecnologías justo a la línea de SALIDA
Nuevos Analizadores y Kits de Agilent
Trabajar mejor y más rápido,
Con resultados de mayor confianza
Analizadores y Kits
Kits LCMS de Pesticidas Agilent
Page 17
Rápida puesta a punto
• Última tecnología para el análisis de multiresiduos
Fácil adaptación
• Soluciones para sus NECESIDADES
Soluciones disponibles para Pesticidas
HOY
#SP1 7890-0456 GC/MSD Pesticide DRS Screening Analyzer
#SP1 7890-0457 GC/MSD Japanese Positive list Analyzer
#SP1 7890-0473 GC/MS/FPD/uECD Pesticide DRS Screening analyzer
#SP1 7890-0501 GC/MS/MS Pesticides CP Analyzer
#SP1 7890-0502 GC/MS/MS Pesticides CF Analyzer
G6854AA LC/(Q)TOF Pesticide Personal Compound Database kit
G1733AA LC/QQQ Pesticides Dynamic MRM Database Kit
Pesticide Solution Suite
Agilent Restricted
Page 18
Level II, Application
kits
Level III
Agilent Analyzers
Barrido LCMS - Kit de Pesticidas Rapidez y facilidad para sus peores problemas
•Reduzca el coste de implementar nuevas tecnologías •Incremente la confianza en sus resultados, a la primera •Reduzca el tiempo para convertirse en especialista
Page 19
Iníciese rápidamente
•Columnas, consumibles y mezcla test
•Nota de aplicación y Guía de inicio rápida
•CD con los parámetros del método
•Bases de datos LCMS/PCDL para el rápido cribado
Application kit
LC/MS TOF Y QTOF
Kit de Base de Datos con Masa Exacta, Tiempo
de Retención y Librerías de Pesticidas para
Page 21
6230 TOF
6530 QTOF
6540/50
QTOF
Matriz Compleja de Pimiento extraída con método
QUECHERS . ¿Cómo identifiar los pesticidas
presentes en este cromatograma FullScan?
Tanto si el cromatograma tiene pesticidas
como si no, el aspecto del cromatograma es
muy parecido
Respuesta: Búsqueda automatizada en bases de
datos de masa exacta
Pero, ¿cómo se llega realmente de la transparencia anterior a esta?
Pesticide Personal Compound Database
1600 Pesticides and Related compounds
El usuario puede generar sus propias bases de datos en función de que el
método usado pueda mejorarse para una matriz en particular
Masa Monoisotópica
(varia en ppm)
Isotope spacing
(varia en ppm)
Distribucion Isotópica
(varia en %)
Scoring basado en
Paso 1: Analizar un set o sets de estandares de
pesticidas y Procesar con MassHunter (MFE)
Paso 2: Importar fichero en PCDB y “Find
Compounds”. Resolución de posibles conflictos
Los posibles conflictos (p.e. misma masa a dos RTs distintos) aparecen en color rojo.
Una vez resueltos el color rojo desaparece. La base de datos puede además adaptarse
añadiendo/quitando compuestos
Paso 3: Batch Summary Actualizar tiempos de retención para análisis target/no-target
Cuando se hace el update de RTs la base de datos puede usarse para compuestos target y
no-target …. Aunque presentes en la base de datos
Paso 4: Repetir el proceso para una muestra real: Target/No-Target.
Automatización de la búsqueda desde MassHunter
Cualitativo
Una vez adaptada/comprobada la base de datos suele usarse desde MassHunter Qual
Análisis de un extracto real de pimiento extraído
con el método QUECHERS
Resultados del Screening usando MFE + PCDB de
pesticidas COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos – Estándares inyectados
COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero presentes en la DB – Estándares no inyectados
Extracted Ion Chromatogram m/z 202.0433±0.002
de extracto de Lechuga
Page 32
Thiabendazole a 0.1 ppb
Espectro del pico de Thiabendazole
Page 33
3 x10
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0.55
0.6
0.65
0.7
0.75
0.8
0.85
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
1.3
1.35
1.4
1.45
+ESI Scan (2.501-2.660 min, 13 scans) Frag=120.0V Pest MX_20 Lettuce_01 ppb in 1_3 ater.d Subtract
202.0431
(M+H)+
201.1091
204.1217
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
201 201.2 201.4 201.6 201.8 202 202.2 202.4 202.6 202.8 203 203.2 203.4 203.6 203.8 204 204.2 204.4 204.6 204.8 205 205.2 205.4 205.6
Espectro del pico de Thiabendazole a 0.1 ppb en el
extracto de Pimiento
Page 34
Resolución = 15.000
Fórmula Calculada para el Thiabendazole a 0.1 ppb
en extracto de Pimiento
Page 35
Masa Monoisotópica
(varia en ppm)
Isotope spacing
(varia en ppm)
Distribucion Isotópica
(varia en %)
Scoring basado en
36
TOF : Análisis Retrospectivo TIC of +TOF MS: from Sample 3 (Aceite MSPD 10 ppb) of Aceite MSPD calibration.wiff Max. 5.9e6 cps.
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Time, min
0.0
2.0e5
4.0e5
6.0e5
8.0e5
1.0e6
1.2e6
1.4e6
1.6e6
1.8e6
2.0e6
2.2e6
2.4e6
2.6e6
2.8e6
3.0e6
3.2e6
3.4e6
3.6e6
3.8e6
4.0e6
4.2e6
4.4e6
4.6e6
4.8e6
5.0e6
5.2e6
5.4e6
5.6e6
5.8e6
5.9e6
Inte
nsity, c
ps
21.0
19.4
25.1
28.5
22.8 29.1 14.5
27.9 18.1 23.5 27.7 2.2 16.9 24.6 21.5
16.1 26.5 2.4
25.7 17.6
19.0 13.7
20.1 15.8
3.5 11.6
4.1 4.4 12.6
Muestra analizada buscando
15 pesticidas solicitados…
(El Diuron no se encontraba en
la lista…)
3 meses después, el cliente tiene
problemas con Diuron.
¿Contenían las muestras
Diuron hace 3 meses?
37
TOF : Análisis Retrospectivo
DIURON
Fórmula empírica: C9H10Cl2N2O
Masa Exacta : 243.0243 (El software incluye una calculadora de masas)
Max. 1.4e4 cps.
16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 Time, min
0.0
500.0
1000.0
1500.0
2000.0
2500.0
3000.0
3500.0
4000.0
4500.0
5000.0
5500.0
6000.0
6500.0
7000.0
7500.0
8000.0
8500.0
9000.0
9500.0
1.0e4
1.1e4
1.1e4
1.2e4
1.2e4
1.3e4
1.3e4
1.4e4
1.4e4 1.4e4
Inte
nsity
, cps
21.3
XIC 233.0243 diuron
Page 38
¿REQUIERE AÚN MAYOR
SEGURIDAD DE IDENTIFICACIÓN?
MASA EXACTA
+
Quant Target MS/MS
Ion Pulser
Turbo 2
Octopole
Rough Pump
Turbo 1
Turbo 1
Turbo 2
Quad Mass Filter (Q1)
Collision Cell Lens 1 and 2
Ion Beam Compressor
Agilent
Jet
Stream
Plataforma QTOF
6550 iFunnel
Máxima
Sensibilidad
Y
Alta Resolución
Exactitud de Masa
inferior a 1 ppm
6530
Sensibilidad
Exactitud de Masa
< 2ppm
6520
Robustez
Exactitud de Masa
< 2ppm
UHD
> 40.000 res
HiRes
> 20.000 res
6540
Alta Sensibilidad
Y
Alta Resolución
Exactitud de Masa
inferior a 1 ppm
ECC de 100 Pesticidas en 3 min usando LC Agilent
1290 Infinity con el QTOF Agilent 6540
FULL SPECTRA & FAST RUN TIMES
Page 40
m/z Abund Abund% Charge Sat Width Res
294.1366 21636 100 1 0.0095 31044
295.1396 3591 16.6 1 0.0101 29122
296.1337 6601 30.51 1 0.01 29608
Alta Resolución a 10 spectros por segundo
Ejemplo del espectro en el análisis de 3 min con
LC 1290 Infinity y QTOF 6540
Page 41
6550/40 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MS System
Alto rendimiento para aplicaciones de altos requisitos - SIN CONCESIONES
Prestaciones UHD
• Resolución >40.000
• Excelente fidelidad isotópica
• Errores de exactitud de masa por debajo de los 500 ppb
• Rango dinámico de 5 decadas
• Sensibilidad al nivel de atogramo con Agilent Jet Stream (6550)
• Ultra Rapidez de adquisición para el acople a sistemas UHPLC 50 spec/segundo
(6550)
Que permiten un Análisis Cualitativo Superior
• Non-targeted food/environmental screening
•Proteomics/metabolomics
• Impurity analysis
• Metabolite ID
42
43
Dual-stage
ion mirror
(resolution)
Ion Beam Compression
Technology (resolution +
mass accuracy)
Orthogonal spray
source (signal-to-noise)
Ion acceleration in hexapole
collision cell (faster MS/MS spectra)
Longer flight tube
(resolution)
INVAR flight tube
(mass accuracy)
ADC (dynamic range)
4 GHz electronics
(resolution, mass
accuracy, sensitivity,
dynamic range)
Excellent Mass accuracy
Scan speed
High Resolution
Innovación
Tecnológica
6540
UHD
Ion Beam Compression (IBC)* Technology
Mejor Resolución
Aceleración iónica axial aplicada a un diseño de guías de iones que
disminuyen la anchura del haz de modo progresivo
Salida de celda de colision
Entrada a slicer y región del pulser
Rendijas de haz más estrecho
facilitan un poder de resolución
entorno a 40K
La compresión activa del haz de iones maximiza simultáneamente
la transmisión iónica y reduce la divergencia del haz
6540 Ultra High Definition QTOF
Maintaining Resolving Power – Across the Mass Range
5 x10
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800
922
R=42424 622
R=38702
1221
R=43674
1521
R=42750 322
R=30218 2121
R=41825 1821
R=40405 2421
R=39332 2721
R=37207
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
Scan Rate Independent
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
622.00822
623.01059
624.01219 625.01471
m/z 622 and isotopes
6540 Ultra High Definition Q-TOF
Mass Accuracy – Repetitive Injections
+ESI EIC(609.28066)
Scan Frag=240.0V Reserpine_40pgms3.d
0.511
Counts vs. Acquisition Time (min)
0.0 0.25 0.5 0.75 1
5 x10
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2 609.28081
610.28425
611.28650
612.28987
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
609 610 611 612 613 614
613.29210
Isotope Obs % Calc % Obs m/z Calc m/z Diff (ppm)
1 100 100 609.28081 609.28066 0.25
2 35.87 37.24 610.28425 610.28393 0.52
3 8.58 8.59 611.28650 611.28671 -0.34
4 1.41 1.48 612.28987 612.28941 0.75
5 0.14 0.21 613.29210 613.29203 0.11
Run
Error (ppm)
1 0.96
2 -0.17
3 0.25
4 0.02
5 0.39
6 0.13
7 0.01
8 0.52
9 0.04
10 0.30
Mean 0.25
Std Dev 0.32
40 pg reserpine on-column, 10 injections
Exactitud de masa de 250 ppb y ratio isotópico de confianza
6540 Ultra High Definition Q-TOF
Sensitivity – Full Scan MS Mode – 1 picogram
3 x10
0
1
2 609.280347
(M+H)+
610.283168
611.287790
612.292649
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)
607 608 609 610 611 612 613 614 615 616
4 x10
0
1
2
Counts vs. Acquisition Time (min)
0.0 0.5 1 1.5
S/N = 319 RMS
Ratio m/z Diff. Theor. Expt. Theor. Expt. (ppm) 100.00 100.00 609.2807 609.2803 -0.51 37.24 36.36 610.2839 610.2832 -1.25 8.59 8.39 611.2867 611.2878 1.77 1.48 1.45 612.2894 612.2926 5.29
Resolution ~ 33,000
Excelente sensivilidad, exactitud y resolución a 1 pg en column
48
Dual-stage
ion mirror
(resolution)
Ion Beam Compression
Technology (resolution +
mass accuracy)
Orthogonal spray
source (signal-to-noise)
Ion acceleration in hexapole
collision cell (faster MS/MS spectra)
Longer flight tube
(resolution)
INVAR flight tube
(mass accuracy)
ADC (dynamic range)
4 GHz electronics
(resolution, mass
accuracy, sensitivity,
dynamic range)
Excellent Mass accuracy
Scan speed
High Resolution
Innovación
Tecnológica
6540
UHD
49
Ion acceleration in hexapole
collision cell (faster MS/MS spectra)
Longer flight tube
(resolution)
ADC (dynamic range)
4 GHz electronics
(resolution, mass
accuracy, sensitivity,
dynamic range)
Orthogonal spray
source (signal-to-noise)
Ion Beam Compression
Technology (resolution +
mass accuracy)
Dual-stage
ion mirror
(resolution)
INVAR flight tube
(mass accuracy)
10 x Sensitivity
Greatest Sensitivity
Excellent Mass accuracy
Scan speed
High Resolution
QUAL / QUANT
Innovación
Tecnológica
6550
UHD + iFunnel
Resumen
Page 54
• La Tecnología de masa exacta permite screening de alta velocidad.
•El “Screening” en MS le ayuda a ganar tiempo y confianza en los
resultados.
• Agilent le ayuda a poner a punto la técnica desde el primer día.
• El Kit de pesticidas incluye 1600 pestcidas para hacer Screening
• La Base de datos es abierta y permite adaptarla a sus necesidades
• La Tecnología QTOF le permite además poder cuantificar por MS/MS
C L E A R LY B E T T E R M S S O L U T I O N S
Mass Spectrometry
Technology
Products
Solutions
NUEVO
¿Preguntas?
Jaume C. Morales
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