UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

ZARAGOZA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL II

PARASITOLOGÍA

PRÁCTICA NO. 4: “HEMOPARÁSITOS”

GRUPO:2752

EQUIPO: 4

HERNÁNDEZ ÁVILA MÓNICA MONSERRAT ROMERO MARTÍNEZ MARCO ANTONIO

SANTANA ESLAVA YATZIRI SOTO ALCANTAR MARÍA DE LOS ÁNGELES

OBJETIVO Aprender a realizar técnicas hematológicas para

determinar parásitos presentes en la sangre. Adquirir el conocimiento de las técnicas que se

utilizan actualmente para determinar parásitos en sangre.

Familiarizarse con el manejo de muestras sanguíneas para su análisis posterior.

¿QUÉ ES UN HEMOPARÁSITO? En general, este término

incluye todos aquellos

organismos (parásitos,

protozoos, helmintos) que

viven en la sangre de su

huésped.

Entre los que

frecuentemente

encontramos: Trypanosoma

cruzi, Plasmodium sp,

Microfilarias.

HEMOPARÁSITOS EN MÉXICO

PARÁSITOS AGENTE FORMAS INFECTIVAS

PARA EL HOMBRE

MECANISMO DE INFECCIÓN

Malaria Plasmodium sp Esporozoitos Picadura del mosquito Anopheles hembra/ transmisión

congénita

Leishmaniosis Leishmania sp Promastigotes Picadura de flebótomos

Enfermedad de chagas

Trypanosoma cruzi

Tripomastigotes Deyecciones de Triatóminos/transmisi

ón congénita

Filariosis Wuchereria bancrofti/

Brugia malayi

Larva filariforme metacíclica

Picadura de dípteros hematófagos

Oncocercosis Onchocerca volvulus

Microfiliarias Picadura de simulido

PALUDISMO

Transmitido por el

mosquito Anopheles

hembra (Huésped

definitivo).

Se caracteriza por

episodios febriles

típicos de acuerdo a

la especie de

Plasmodium.

P. malariae P. falciparum

P. vivax P. ovale

Plasmodium que parasitan al humano.

LEISHMANIASIS• Es transmitida por la picadura de las

moscas de la familia Psychodidae y

subfamilia Phlebotominae, (Huéspedes

intermediarios) afecta a piel, mucosa y

vísceras.

• Algunos agentes causantes de

leishmaniasis son:

Leishmania mexicana (daño cutáneo)

Leishmania brasiliensis (daño muco-

cutáneo)

TRIPANOSOMIASIS

Enfermedad de hombres y animales

principalmente hay 2 tipos:

Mal de chagas:

Es causada por Trypanosoma cruzi, se

transmite por Triatoma infestans

(Huésped Intermediario). Se presenta

en tres fases, aguda, intermedia y

crónica donde resulta mortal.

Enfermedad del sueño (África):

Es causada por Trypanosoma brucei,

se transmite por medio del vector

Glossina sp.

MICROFILARIAS

Nematodos largos delgados, transmitidas por artrópodos.

Se alojan en sistema linfático y tejido subcutáneo y conectivo profundo.

Hombre:• Wuchereria bancrofti• Brugia malayi

Brugia malayi

Wuchereria bancrofti

TÉCNICAS HEMATOLÓGICAS

FUNDAMENTO Varias especies parasitarias pueden ser halladas en la sangre

de los seres humanos en algún estadio de sus ciclos vitales.

Casi en la totalidad de los casos, el parásito se identifica sobre

la base de sus características morfológicas si ha sido

preparado de manera adecuada para su estudio microscópico.

TOMA DE MUESTRA Y SITIO DE PUNCIÓN

Los frotis deben prepararse con muestra de sangre anticoagulada lo antes posible después de la recolección.

La exposición prolongada al anticoagulante puede distorsionar la morfología de los ezquizontes maduro y de gametocitos.

Es preferible la recolección de muestra de sangre capilar.

¿QUÉ ES UN FROTIS?

Es la extensión de una gota de sangre sobre un

portaobjetos, al cual se le aplica una tinción para

ser analizado posteriormente.

En la mayoría de los laboratorios los colorantes

más empleados para la tinción hematológica se

basan en el de Romanowsky constituido

fundamentalmente con la mezcla de eosina

(ácido) y azul de metileno (básico).

GOTA FINA Se forma con sangre esparcida, una capa de tal manera que

el espesor disminuya hacia el borde, donde los eritrocitos no se superponen .

Su utilidad es principalmente en la identificación definitiva de especies de plasmodios y otros parásitos intraeritrocitos y para estudiar detalles de los hematíes y de los parásitos en la sangre.

Al prepararlas hay que tener cuidado que la cola este esparcida en forma regular, no presente espacios vacios, rayas u otro artefacto de técnica.

GOTA GRUESA

Consta de una capa gruesa de eritrocitos lisados.

Estos frotis contienen una concentración 30X de

elementos parasitarios cuando se compara con una

área igual de una de gota fina.

Es útil para el diagnostico rápido de las parasitemias,

pero no sirve para estudios anatómicos finos.

Por lo tanto, tiene una utilidad particular para la

detención de los parásitos del paludismo.

La sangre debe obtenerse por punción(por lo general

la parte lateral de la falange terminal de un dedo, en

los lactantes, el lobulo de la oreja o el talón) dejar que

fluya libremente.

Se limpia con alcohol al 70% y se seca con gasa limpia.

XENODIAGNÓSTICO

Se emplea fundamentalmente para diagnosticar la enfermedad de chagas.

El xenodiagnóstico, uno de los métodos que se aplica durante la etapa crónica de la enfermedad y cuyo resultado final en algunas ocasiones se consigue después de los 90 días.

Consiste en colocar en la espalda o en el antebrazo del paciente al transmisor sano. Al alimentarse estos de la sangre del paciente se llevan los tripanosomas que se multiplicarán activamente en el aparato digestivo del insecto. De esta manera, las posibilidades de encontrar los hemoflagelados aumenta de forma importante.

TINCIÓN DE WRIGHT Y DE GIEMSA

TINCIÓN DE WRIGTH Las estructuras con carácter ácido tales como los ácidos

nucleicos o las proteínas ácidas son afines por compuestos

básicos como lo es el azul de metileno. Por el contrario las

estructuras de carácter básico tales como la hemoglobina

y otras proteínas básicas son afines a la eosina por lo que a

la vista estas estructuras tendrán un color rojo-rosado.

TINCIÓN DE GIEMSA Es una modificación de la coloración de Romanowsky,

resulta de la combinación de eosina y azul de metileno en una misma solución.

Es la tinción más confiable y preferida para identificar parásitos en la sangre (en lo frotis de gota fina o gruesa), como en el caso de la malaria (Plasmodium sp) y la tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi).

Contiene: Polvo de Giemsa (es una mezcla de azul

de metileno, eosina y varios azures) Glicerina Fosfato de sodio dibásico anhidro Fosfato de sodio monobásico

Fundamento: se basa en la distinta afinidad que demuestran las células y sus componentes a los distintos colorantes incluidos en el colorante de Giemsa.

Resultados:

-Los núcleos se tiñen de violeta

-El citoplasma se tiñe de color rosa

TÉCNICA DE ELISA

TÉCNICA DE ELISA(ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

La técnica de ELISA es un

ensayo inmunoenzimático

ampliamente empleado en el

área médica para la

cuantificación de moléculas,

especialmente de aquellas que

experimentan cambios en

diferentes estados como

pueden ser infecciones por

bacterias, virus, hongos o

parásitos o fases activas de

enfermedades autoinmunes.

FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA DE ELISA

Se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados

con una enzima.

Al estar uno de los componentes marcado con una

enzima e insolubilizado sobre un soporte, será fácilmente

revelada mediante la adición de un substrato especifico

que cuando actúa la enzima producirá un color

observable a simple vista o cuantificable mediante el uso

de un espectrofotómetro

TIPOS DE ELISA

Anticuerpos marcados:

•ELISA Directo o

ELISA sándwich.

Antígeno marcado:

ELISA Indirecto

•ELISA competitivo

ELISA "SANDWICH“ DIRECTO

1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti antígeno suele estar ya unido a la placa.

2) Se incuba con la muestra problema. 3) Se añade el conjugado. 4) Por último el sustrato.

Un anticuerpo primario (monoclonal o policlonal) se une a las paredes de la fase solida. Se añade la muestra que se sospecha que contienen el antígeno, hay una reacción antígeno-anticuerpo. A continuación, un anticuerpo secundario ligado a una enzima que es capaz de reaccionar con el antígeno se añade. Cuando un sustrato incoloro se añade, un color se desarrolla, indica la presencia de antígeno

Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

ELISA INDIRECTO

1)El 2 se pega a la placa

2)Se añade el suero problema.

3)Posteriormente, el conjugado.

4)Por último, el sustrato

Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

LOS ELEMENTOS QUE SE USAN EN LA

TÉCNICA DE ELISA SON:

1. Fase solida.

2. Etapas de lavado.

3. Muestra a ensayar.

4. Antígeno.

5. Conjugado (métodos de

Nakane o el de Avrameas).

6. Sustrato y cromógeno.

MÉTODO Utilizar las laminillas obtenidas en la práctica número tres y

teñirlas con las técnicas de Giemsa y/o Wright. *Los tiempo señalados para realizar las tinciones serán

modificados de acuerdo a la madurez de los colorantes.

TINCIÓN DE WRIGHT

No es necesario fijar el frotis

Colocar el portaobjetos en la canastilla para tinción y sumérjir en el recipiente que contiene el colorante de Wright sumergiendo por completo la canastilla.

Después de cinco minutos escurrir la canastilla para eliminar los restos decolorante y sumerjir la canastilla en solución amortiguador (amortiguador de fosfatos o agua destilada).

Después de cinco minutos enjuagar con agua de la llave.

Deje secar y leer al microscopio, enseco débil 10X, seco fuerte 40X y a inmersión 100X.

TINCIÓN DE GIEMSA

En un frotis delgado es necesaria la fijación con metanol.

Colocar los portaobjetos en canastillas para tinción y sumérjir en un recipiente con metanol durante veinte minutos.

Dejar secar el frotis al aire.

Colocar la canastilla en el recipiente que contiene colorante de giemsa durante 10 minutos.

Sacar y dejar secar la preparación ylavar con solución amortiguador(unas gotas del colorante en aguadestilada) por 5 minutos.

Si se llega a sobre teñir repetir el lavado

Secar y leer al microscopio a secodébil 10X, seco fuerte 40X e inmersión 100X.

*Es importante marcar los portaobjetos antes de realizar las tinciones, paraidentificar las diferentes preparaciones.Se recomienda el uso de lápiz con punta de diamante.*Para las improntas realizadas repita el proceso de esta tinción.

REFERENCIAS Ash L, Orihel T. Atlas de parasitología humana. 5ª ed.

Buenos Aires: Médica Panamericana, 2011.

Becerril M, Romero R. Parasitología médica de las moléculas

a la enfermedad. México: McGraw-Hill Interamericana,

2007.

Siachoque H. Inmunología diagnóstico e interpretación de

las pruebas de laboratorio. Bogotá: Centro Editorial

Universidad del Rosario, 2006.