Clase Genomica Hemoparasitos 2011

Dra. Silvina E. Wilkowsky Lab. de Hemoparsitos Inst. de Biotecnologa

INTA Castelar

La genmica de parsitos comenz en el ao 2002

QUE PARTICULARIDADES TIENEN LOS DATOS GENOMICOS?

Acceso a informacin comparativa (patgeno vs. no-patgeno, rango de hospedadores): blanco en genes involucrados en patognesis o

resistencia a frmacos

GENOMICA COMPARATIVA

Qu genes estn compartidos entre genomas?

Qu familias gnicas son compartidas o fueron amplificadas o reducidas?

Qu fuerzas evolutivas estn actuando sobre los genes?

Qu otras secuencias no gnicas estn conservadas?

Como fue cambiando la estructura genmica?

MALARIA Causada por Plasmodium spp.

4 especies de Plasmodium infectivas para el ser humano: P.vivax, P.falciparum,

P.ovale, P. malariae

300-500 millones de casos,1.5-2.7 millones de muertes/ao

Cada 40 segundos muere un nio por causa de malaria Existe resistencia a la droga cloroquina, la ms barata existente y est presente

en casi todos los pases endmicos

Ha aparecido resistencia a la mayora de las nuevas drogas antimalricas

No existe vacuna disponible

NECESIDAD DE NUEVOS METODOS PARA PREVENCION Y TRATAMIENTO

DISTRIBUCION MUNDIAL DE LA MALARIA

Sachs and Malaney, Nature 415: 680-685 (2002)

El parsito causante de la malaria es intracelular. Permanece la mayor parte de su ciclo de vida residiendo y dividindose en la clula hospedadora. Presenta mecanismos de evasin de la respuesta inmune y su localizacin le permite el acceso a una variada provisin de nutrientes.

Las vacunas contra la malaria deben estar dirigidas contra los estados hepticos, sexuales o las formas invasivas.

Los frmacos de uso humano deben alcanzar los estados parasitarios hepticos o eritrocitarios.

22.853.764 bp

19.4% GC

1 gen cada 4.3kb (52% codificantes)

Set mnimo de tRNAs

7 operones de RNA ribosomales (no repetidos en tandem)

~90% de los genes no haban sido previamente descriptos in Plasmodium.

~50% no tienen homlogos conocidos

Gardner, Hall and Fung et al (2002) Nature, 419:498

GENOMA DE

PLASMODIUM FALCIPARUM

QUE UTILIDAD TIENEN ESTOS DATOS.?

Factores de virulencia en Plasmodium falciparum

La virulencia particular de P.falciparum estara dada por la forma en la cual el parsito altera la superficie del glbulo rojo

Aproximadamente 16 hs despus de entrar al eritrocito, las protenas Pfemp1 (Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1) aparecen en la superficie del glbulo rojo.

Promueven la unin a una gran variedad de tipos celulares, llevando a una enfermedad severa Inducen una respuesta inmune protectora que el parsito evade cambiando continuamente estas protenas Pfemp1

EFECTOS?

Estructura de PfEMP-1

59 genes var en total.

Un tipo predominante (tipo 1)

Estructura cromosmica de P. falciparum

El principal antgeno y factor de virulencia de P. falciparum (Pfemp1) es predominantemente subtelomrico.

Solo uno de los tipos mayoritarios es adyacente al telmero Muchas otras familias antignicas tambin estn localizadas en ubicaciones subtelomricas.

Mapas de sintenia de los cromosomas del gnero Plasmodium

Comparacin de ortlogos putativos de los proteomas de P. falciparum (Pf), P. vivax (Pv), P. knowlesi (Pk), P. y. yoelii (Py) De los 3,336 ortlogos encontrados entre las 6 especies (P.berghei y P.chabaudi son completamente sintnicos a P.y.yoelii), 3,305 (99%) estn conservados posicionalmente. La sintenia se corta en los genes especie-especficos.

Nature. 2008 October 9; 455(7214): 757763.

QUE UTILIDAD TIENE LOS DATOS GENMICOS? PARTE I Existe resistencia a los antimalricos tradicionales (cloroquina)Qu

pasa con las drogas de nueva generacin como la artemisinina?

Artemisinina ATPasa 6

P.vivax

A263

S1008

P.falciparum

L263

N1039

El cambio en el residuo 263 de Leucina a Alanina resulta en una disminucin de 3 veces de la susceptibilidad de P. falciparum a la artemisinina. La IC50

(concentracin inhibitoria por la cual el 50% de los parsitos mueren) para

algunas cepas de P. vivax podra ser mas alta que la IC50 para P. falciparum

Se estudiaron las interacciones entre las drogas antimalricas y las protenas parasitarias involucradas en unin al frmaco y resistencia analizando las estructuras cristalinas y desarrollando modelos de homologa entre las protenas de P.vivax y los ortlogos de P. falciparum en donde se hayan reportado mutaciones que otorgan resistencia.

APLICACIN DE LOS DATOS GENMICOS I

CMO LOS PARSITOS DESARROLLAN VARIABILIDAD GENTICA LIGADA A SU RESPUESTA A CAMBIOS AMBIENTALES U OTROS FENOTIPOS ADAPTATIVOS

APLICACIN DE LOS DATOS GENMICOS II

Core genome: set de genes ortlogos derivados de un ancestro comn y compartidos por todas las cepas de una especie Son combinaciones hipotticas de genes, no existen en la naturaleza

CORE GENOME DE 6 ESPECIES DE PLASMODIOS

2 especies de Plasmodium infectivas para el ser humano: P.vivax, P.falciparum

1 especie: P. knowlesi, infectiva para los monos Macacos

3 especies: P. yoelii yoelii, P. berghei y P. chabaudi infectivas para los roedores

Anlisis de los genomas completos: http://www.plasmodb.org

Identificacin de genes ortlogos y parlogos: BLASTP all-against-all

CRITERIOS E-value < e-10 Similitud (I) >30% si L>150 aa. Si L50% de la protena ms larga Se filtran las regiones de baja complejidad

Agrupacin de genes en gene clusters usando OrthoMCL (algoritmo de Markov)

Alineamientos con Clustal W y T-Coffee, anlisis filogentico por Neighbour-Joining y clasificacin funcional en la base de datos de Gene Ontology

LSE: lineage specific expansion: surgimiento de copias gnicas mltiples por duplicacin o transferencia lateral de genes en

un linaje especfico

*: ORF predichos, anotacin incompleta de los 2 genomas

*

Genes duplicados en slo un genoma sin ortlogos en los otros 5 genomas. Estos genes tienen probablemente mayor impacto

en el genoma porque llevan una marca especie-especfica

REPLICATION: DNA replication factors TRANSCRIPTION: RNA polymerase II transcription factors and cofactors TRASLATION: initiatior, elongation and termination regulators REPAIR CELL MOTION: microtubule and actin-based movement

PROCESAMIENTO DE LA

INFORMACION GENETICA

CELL CYCLE: meiosis, mitosis, cyclin-dependent protein kinase activity SIGNAL TRANSDUCTION: Rho, G-protein, PKC RESPONSE TO ENVIRONMENTAL CHALLENGES: oxidative stress, heat PATHOGENESIS: entry, response to drugs, cytoadherence

APLICACIN DE DATOS GENOMICOS: PARTE III

SE PUEDE SECUENCIAR UN GENOMA DIRECTAMENTE DE UNA MUESTRA CLINICA?

Eritrocitos infectados de 5-mL de sangre provenientes de un paciente febril, positivo al frotis para malaria por P. vivax con parasitemia de 1.9% (IQ07)

La muestra se pas por un filtro de leucocitos CF11 y se aisl el DNA genomico

Se descart coinfeccin con P. falciparum y se confirm por RFLP para el antgeno merozoite surface protein 3 (msp3)- que la infeccin fuese monoallica

El DNA genmico total se someti a Whole-Genome Amplification (WGA) y se secuenci utilizando la plataforma Illumina

WGA =>Lisis-Desnaturalizacin alcalina-Neutralizacin-PCR isotrmica a 300C overnight con DNA Pol

Validacin de datos de SNPs utilizando whole-genome tiling microarray Comparacin de datos IQ07 vs. Sal I (cepa referencia genoma, El Salvador 1972)

58 millones de lecturas

40pb promedio

Cobertura promedio 30X

El aislamiento peruano IQ07 estuvo sometido a 35 aos de presin selectiva con drogas modernas en comparacin con la cepa SalI de 1972

TILING MICROARRAY

Ambos mtodos encontraron mutaciones en los genes pvhdfr (dihidrofolato reductasa), pvdhps

(dihidropteroato sintetasa) y pvmdr1 (gen de resistencia multidroga). Este ltimo gen present un cociente dN/dS infinito

P-valorproblemas de alineamiento en regiones de baja complejidad

PRESION POSITIVA

HEMOPARSITOS BOVINOS

Babesia bovis

Babesia bigemina

Anaplasma marginale

Theileria parva

Theileria annulata

Ausentes en el continente americano

Babesia spp.

Protozoo perteneciente al phylum Apicomplexa, junto con Plasmodium sp, Toxoplasma sp, Theileria sp y Eimeria sp. Transmitido por la garrapata Boophilus microplus.

Las especies de mayor importancia econmica en Argentina afectan al ganado bovino y son Babesia bovis y B. bigemina

2 hospedadores: invertebrado (garrapata) y vertebrado (bovino) donde se desarrolla como parasito intraeritroctico

CICLO DE VIDA DE B. BOVIS

Hembra adulta de B. microplus

kinetos

Gland. salival

esporonte

esporozotos

gametas

merozotos

cigota

Clula intestinal

Eritrocitos

Sintomas: anemia hemoltica, daos neurolgicos, renales, shock respiratorio, alta mortalidad en adultos. Importantes perdidas econmicas a la ganadera de Argentina: 9.900.000 bovinos expuestos (19% de la poblacin total del pas) Mtodos de control:

- Tratamiento farmacolgico: imidocarb y derivados - Control de garrapatas: acaricidas (resistencia) - Vacunas vivas

Laboriosas Inestables, necesidad de cadena de fro Morbilidad elevada Posible infeccin con otros patgenos Permanencia del parsito en el rea

Babesiosis bovina

Anaplasma marginale

Estrategia de secuenciacin: ADNg digerido con Hind III Separacin por Pulse Field Gel Electrophoresis Clonado en BACs y screening con sondas bovinas y especficas Ruptura del DNA de los clones positivos con Hydroshear y clonado en pCRScript Secuenciacin Big Dye Chemistry (ABI) Long distance PCR y genome walking para completar gaps

Cepa: St. Maries aislada de caso agudo. Transmisible por garrapatas.

Purificar o no? Shotgun?

1 leucocito bovino=3000 genomas de A. marginale!

Library de BACs de DNA bovino y del

patgeno

GENOMA ANAPLASMA MARGINALE

ANOTACION

Prediccin de ORFs y CDSs por Glimmer y Orpheus

BLAST y RBSFINDER para determinar inicio de CDSs

Pptido seal por SignalP

Determinacin de familias y superfamilias por Pfam

Asignacin de CDSs a categoras en la base de datos de COGs (Cluster of Orthologous Groups) y a rutas metablicas utilizando KEGG y ECOCYC

La base 1 se asign arbitrariamente por anlisis del sesgo de GCs (G-C/G+C). Los genes dnaA, gyrA, gyrB y otros tpicos del origen de replicacin se encuentran dispersos en el genoma.

Sesgo GC

rRNA

tRNA

CDS reverse

CDS forward

BACs

msp2

msp1

CARACTERISTICAS GENERALES DEL GENOMA DE ANAPLASMA MARGINALE

Tamao genoma, bp 1,197,687

G C, % 49 Densidad de genes codif. % 86 Genes codif. protenas 949 Asignacin funcional 567 Asignacin funcional conservada 107 Hipotticas conservadas 126 Hypotticas 151 Pseudogenes funcionales 14 ORFs con dominios partidos 8 Densidad de genes 0.79

Long. promedio de genes 1,077 Ribosomal RNAs 3 Transfer RNAs 37

Alto (Rickettsiales: 31%) Alta: tpica de bact. intr. obligadas

Pseudogenes?

Copias truncadas de genes que solo se expresan como parte de una proteina full length luego de recombinar en un sitio nico de expresin

Superfamilia msp2

Comprende los genes msp2,msp3 y msp4

Son protenas inmunodominantes, antignicamente variables: evasin del SI

msp2 se transcribe como parte de un opern de 4 genes: a los 3 restantes se los denomina operon associated genes (opags) 1-3

Este opern muestra una expresin diferencial: opag1 no se traduce, opag2 y msp2 se expresan en el eritrocito y en el intestino y glnd.salivales de la garrapata y opag 3 solo se expresa en el eritrocito.

Se encontraron adems 15 genes no identificados previamente con identidad de secuencia a la superfamilia msp2-4. Se los denomin OMP1-15

Existen ortlogos de msp2 en miembros del gnero Erlichia (E. ruminantium, E.canis y E. chaffensis). Anaplasma y Erlichia pertenecen al orden Rickettsiales

Aunque existe sintenia entre estos genes de Erlichia y msp2, el mecanismo para generar variacin antignica es muy distinto: las especies de Erlichia usan varios genes de un arreglo en tndem de OMPs mientras que Anaplasma utiliza el mecanismo de recombinacin.

Una explicacin a esto es que la enzima mutL (reparacin de mismatches) en A. marginale contiene un segmento variable de residuos G que muchas veces resulta en un frameshift y por ende en una molcula inactiva. Por ende, la tasa de mutacin y recombinacin en este organismo es alta.

METABOLISMO La mayora de las enzimas glucolticas estn presentes Ni la glucokinasa ni transportadores de azcares estn presentes: utilizacin de gluconeognesis No se detectaron pathways completos de sntesis de aminocidos A.marginale realiza respiracin aerbica a travs del ciclo TCA Se hallaron todas las enzimas necesarias para la sntesis de cidos grasos y sntesis de novo de purinas

y pirimidinas

TRANSPORTADORES A pesar de que A.m. sintetiza muy pocos aminocidos, se hallaron pocos transportadores de los

mismos (solo se pudo asignar 1 para Prolina y un putativo para Alanina) Sin embargo se hallaron muchos transportadores de tipo ATP binding-cassettes que podran realizar

esta funcin. Se identificaron tambin sistemas transportadores de cationes, aniones, oligopptidos, dos bombas

de resistencia a multidrogas, ribonucletidos y fosfatos. La va sec de secrecin de polipptidos y el sistema de secrecin IV estn presentes y el sistema tat

contiene solamente tatC

COMPONENTES DE LA PARED CELULAR Varios genes de sntesis de LPS estn ausentes y tambin todos los genes de la biosntesis del lpido A No se encontr la va completa de sntesis de pptidoglicano La falta de una pared celular tradicional parece ser una caracterstica comn de la familia

Anaplasmataceae, pero no del orden Rickettsiales, en donde algunos miembros pueden sintetizar LPS y peptidoglicano.

A.marginale sera capaz de reforzar su pared de modo alternativo: muchas de las MSPs estan ligadas covalente y no covalentemente en complejos homomricos y heteromricos en la superficie celular.

Hemoparsitos protozoarios transmitidos por vectores

Vector Clula Huesped Sndrome clnico

Babesia bovis

Garrapatas Eritrocitos

bovinos

(citoplasma)

Anemia,

secuestro de

eritrocitos en

capilares,

alteraciones

neurolgicas,

aborto

Theileria

spp.

Garrapatas Eritrocitos

bovinos

(citoplasma) y

linfocitos

Fiebre,

linfoadenopatas,

distrs

respiratorio,

signos

neurolgicos

Plasmodium spp. Mosquito Hepatocitos y

eritrocitos

humanos

(vacuola

parasitfora)

Anemia,

secuestro de

eritrocitos en

capilares,

alteraciones

neurolgicas,

aborto

Genoma de Babesia bovis

Features Species

P. falciparum T. parva B. bovis

Size (Mbp) 22.8 8.3 8.2 Number of chromosomes 14 4 4 Total GC composition (%) 19.4 34.1 41.8 Size of apicoplast genome (kbp) 35 39.5 33 Size of mitochondrial genome (kbp) ; 6 linear 6 linear 6 linear Number of nuclear protein coding genes 5,268 4,035 3,670 Average protein coding gene length (bp)a 2,283 1,407 1,514 Percent genes with introns 53.9 73.6 61.5 Mean length of intergenic region (bp) 1,694 405 589 G+C composition of intergenic region 13.8 26.2 37 G+C composition of exons (%) 23.7 37.6 44 G+C composition of introns (%) 13.6 25.4 35.9 Percent coding 52.6 68.4 70.2 Gene densityb 4,338 2,057 2,228 a Not including introns. b Genome size/number of protein coding genes.

Cepa utilizada: T2bo

Virulenta, transmisible por garrapatas

CROMOSOMAS DE BABESIA BOVIS

Cromosoma 1: 2,623,761 pb




Mitocondria: 6005 pb

Plstido:35107 pb

3.13

2.70

2.35 1.81 1.66 1.37 1.05

MW MW Mpb

Figure 1. Representation of B. bovis Centromeres, ves1,

and smorf Genes

Each chromosome is represented by a black line, with the

chromosome number shown on the left. Centromeres are

depicted as black dots. Ves1 loci are depicted as colored boxes,

and the number of ves1 and smorf genes in each locus is shown

above or below the colored boxes, respectively. Red and blue

boxes indicate the presence of at least one ves1a/ves1b or

ves1a/ves1a pair, respectively, within the cluster.

El perfil metablico predicho de Babesia bovis es similar al de Theileria parva

APICOPLASTO Organela semiautnoma similar a un plstido presente en muchos miembros del phylum

Apicomplexa

Derivado de un evento endosimbintico secundario

El genoma del apicoplasto de B. bovis es similar

en tamao, contenido gnico y orden a los de

Eimeria tenella, P. falciparum, T. parva, y

Toxoplasma gondii

Es extremadamente rico en AT (78.2%), en contraste

al genoma nuclear (58.2%).

El apicoplasto sera un blanco deseable

para el desarrollo de nuevas drogas antiparasitarias

dado que las vas biosintticas all representadas

son de origen cianobacteriano y muy distintas de

las del husped mamfero.

En T. gondii se ha demostrado que la sntesis de

cidos grasos en el apicoplasto es necesaria para

la biognesis y mantenimiento del mismo.

Qu pasa en B. bovis? Coding sequences (CDSs) with functional annotation are depicted in

red, while hypothetical CDSs are shown in lack. Genes encoding

tRNA genes are shown as blue bars, while rRNA genes are shown as

yellow arrows. All genes are unidirectionally encoded

MITOCONDRIA

Diagram of B. bovis mitochondrial genome. CDSs are depicted in red, large subunit

rRNA genes in blue, and inverted terminal repeats as black arrows.

La organizacin gnica es idntica a la de Theileria spp. pero diferente a la de

P. falciparum.

Cada una de las protenas codificadas emplea el codn ATG como inicio de la

traduccin, a diferencia del gen de la subunidad I del citocromo C de T. parva

que utiliza AGT como codn inicial.

PRINCIPALES FAMILIAS DE PROTEINAS EN BABESIA BOVIS

El proteoma predicho por Tribe-MCL mostr que adems de los genes housekeeping

comunes a otros eucariotas, B. bovis posee 2 grandes familias de protenas: ves y

smORFs (small open reading frames)

Otras familias minoritarias son sbp2 (spherical body protein 2) y vmsa (variable surface

merozoite antigen)

Los genes ves codifican para la protena VESA1, un heterodmero que se expresa en la superficie del

eritrocito. Son la familia de genes ms abundantes del genoma

A diferencia de lo que se encuentra en P.falciparum para los genes var de localizacin exclusivamente

telomrica, en B. bovis estos genes se encuentran dispersos por todo el cromosoma

VESA1 es un antgeno de variacin rpida implicado en evasin de la respuesta inmune y

citoadhesin PATOGENIA

El anlisis genmico predice aproximadamente 150 genes ves distribudos en los 4 cromosomas

smORFs

Asociados a los genes ves y tambin distribudos en los 4 cromosomas

Son 44 genes de entre 381 a 1,377 nucletidos sin identidad a ningn gen o protena depositada en las bases de datos disponibles

Alto grado de homologa con las protenas VESA (28-95%)

La prediccin bioinformtica indica que estaran localizadas extracelularmente

La existencia de pptidos seales cannicos en las SmORFs y su asociacin uniforme con los clusters de genes ves1 sugiere que estas protenas tendran un rol funcional en la biologa de las VESA o que por s mismas contribuiran a la variacin antignica, la evasin inmune o ambas.

ANALISIS COMPARATIVO DE LOS PROTEOMAS DE LOS HEMOPROTOZOARIOS

Agrupamiento por similitud de los proteomas predichos en COGs

Genes especficos de los

estados en mosquito o de

los esporozotos que se

expresan en el vector, no

comparten COGs con B.

bovis y T. parva

TRAP, p36, Pf12, Sir2,

PfATP6, y P0.

p36 result ser

inmunoprotectivo en

experimentos con knockout

en P.falciparum

Dado que P. falciparum, T. parva, y B. bovis tienen ciclos de vida complejos que involucran un vector

artrpodo y un husped mamfero, se utilizaron los datos de los COGs pesados por el ndice de Jaccard para buscar ortlogos de B. bovis que hayan sido caracterizados como blancos de inmunidad protectiva o

que jueguen un papel en la biologa del parsito.

Indice de Jaccard

J (A,B)=AB AUB

ANALISIS DE SINTENIA

Se realiz este anlisis debido a que por

presin evolutiva, los homlogos funcionales

de protenas de B. bovis, T. parva y P.

falciparum hayan divergido en su secuencia

de aminocidos

Los bloques sintnicos se definieron como el

par de genes que pertenecen al mismo Jf-

COG

No se pudieron identificar homlogos evidentes para la mayora de las protenas de

P. falciparum estado especficas o involucradas en la inmunidad del hospedador

Genes ortlogos a T. parva. Cada color indica uno de los 4 cromosomas de este parsito.

1: rojo, 2:verde, 3: azul, 4: naranja

Genes ves

Otros genes

Se observaron grandes bloques de sintenia entre B. bovis y T. parva.

La sintenia disminuye a medida que nos acercamos a los telmeros

Babesia bigemina: genoma en secuenciacin

Es posible realizar bsquedas

por BLAST en los contigs

disponibles.

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