he proteomik dan GenomicTeratogenisitas ditimbulkan oleh valproat Acid IsDicegah dengan Resveratrol dana-TokoferolYeh Chen1, Ping-Xiao Lin2, Chiu-Lan Hsieh2 *, Chiung-Chi Peng3 *,Robert Y. Peng1,41. Lembaga Penelitian Bioteknologi, Hungkuang University, 34 Chung-Chie Rd., Shalu County, TaichungHsien, Taiwan 43.302, 2. Graduate Institute of Biotechnology, Changhua Universitas Pendidikan, 1 Jin-De Rd.,Changhua, Taiwan 50.007, 3. Graduate Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, Taipei MedicalUniversitas, 250 Wu-Shing St., Taipei, Taiwan 11031, 4. Lembaga Penelitian Obat Sciences, College ofKedokteran, Taipei Medical University, 250 Wu-Xing St., Taipei, Taiwan 11031*ypeng@seed.net.tw (PKC); clhsieh@cc.ncue.edu.tw (CLH)AbstrakLatar Belakang: Sebelumnya, kami melaporkan bahwa asam valproik (VPA), umumobat antiepilepsi dan ampuh teratogenik, dowregulates RBP4 dalam embrio ayamModel (CEM) ketika diinduksi oleh VPA. Apakah teratogenicity tersebut terkait denganlebih maju perubahan proteomik dan genomik, kita lanjut dilakukan inipenelitian ini.Metodologi / Kepala Temuan: VPA (60 mM) diterapkan untuk 36 ayamembrio pada HH tahap 10 (hari-1,5). Resveratrol (RV) dan vitamin E (vit E) (masing-masing di0,2 dan 2,0 mM) yang diterapkan secara bersamaan untuk mengeksplorasi efek pengentasan. Theprotein dalam otot serviks hari-1 anak ayam dianalisis menggunakan 2Delectrophoresisdan LC / MS / MS. Sementara genomik yang terkait dengan setiap spesifikperubahan protein diperiksa dengan RT-PCR dan qPCR. Pada embrio sebelumnyapanggung, VPA menurunkan regulasi PEBP1 dan BHMT gen dan pada saat yang samaMYL1 diregulasi, ALB dan FLNC gen secara signifikan (p, 0,05) tanpa mempengaruhiGen PKM2. Atau, VPA langsung menghambat folat-independen (atau-betaine tergantung) remetilasi jalur. Fitur-fitur ini secara efektifdiatasi dengan RV dan vit E.Kesimpulan: VPA mengubah ekspresi PEBP1, BHMT, MYL1, ALB dan FLNCyang terkait erat dengan miopati metabolik, myogenesis, gen albuminekspresi, dan anemia hemolitik. Di sisi lain, VPA langsung menghambat-betaine tergantung remetilasi jalur. Secara bersama-sama, VPA memunculkan hemoragikAKSES TERBUKACitation: Chen Y, Lin P-X, Hsieh C-L, Peng C-C,Peng RY (2014) The proteomik dan GenomicTeratogenisitas ditimbulkan oleh valproat Acid IsDicegah dengan Resveratrol dan a-Tokoferol. PLoS ONE 9 (12): e116534. doi: 10.1371 / journal.pone.0116534Editor: Gianpaolo Papaccio, Kedua UniversitasNaples, ItaliaDiterima: 6 Agustus 2014Diterima: November 28, 2014

Diterbitkan: 31 Desember 2014Copyright:? 2014 Chen et al. Ini adalah OpenAccessArtikel didistribusikan di bawah ketentuanCreative Commons License Attribution, yangmemungkinkan penggunaan tak terbatas, distribusi, dan reproduksidalam media apapun, asalkan penulis aslidan sumber dikreditkan.Data Ketersediaan: Para penulis mengkonfirmasi bahwa semua datamendasari temuan sepenuhnya tersedia tanpalarangan. Semua data yang relevan yang terkandung dalamkertas dan Pendukung file Informasi nya.Pendanaan: pekerjaan ini didanai oleh NationalDewan ilmu NSC 102-2313 B-018--001 -MY3dan NSC 101-2320 B-039-040-dan TaipeiUniversity Medical [TMU101-AE1-B11]. Pendanatidak memiliki peran dalam desain penelitian, pengumpulan datadan analisis, keputusan untuk mempublikasikan, atau penyusunannaskah.Bersaing Interests: Para penulis telah menyatakanbahwa tidak ada kepentingan bersaing ada.PLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 20/01myoliposis melalui mekanisme aksi ini, dan RV dan vit E yang efektif untukpengentasan efek samping tersebut.

PengantarAsam valproik (VPA, asam 2-propylpentanoic)) adalah asam lemak rantai pendekbiasa digunakan sebagai antikonvulsan [1] dalam pengobatan jangka panjang epilepsi[2-5], yang baru-baru diidentifikasi sebagai deacetylase histone (HDAC)inhibitor, yang mengarah ke asetilasi ekor histone dan regulasi genekspresi [6, 7]. VPA memodulasi status epilepsi melalui menghambat asam sitrat

siklus dan elevating kadar asam c-aminobutyric dalam sistem saraf pusat [2].Baru-baru ini, kami telah melaporkan bahwa VPA diinduksi keragaman fitur teratogenik diModel embrio ayam (CEM) [4, 8, 9]. VPA menurunkan regulasi kadar superoxidedismutase (SOD), glutathione (GSH), HDAC dan folat; sementara VPA diregulasiH2O2 dan homosistein [3]. VPA dowregulates protein yang mengikat retinol 4 (RBP4)[4]. Analisis microarray mengungkapkan 17 gen menurunkan regulasi dan empatdiregulasi [5]. Relevansi tertutup terjemahan (23%), transduksi sinyal(23%), transkripsi (16%), adhesi sel (16%), migrasi sel saraf (8%),transportasi (7%), dan pengembangan organisme (7%). VPA menurunkan regulasi beberapagen seperti faktor pertumbuhan seperti insulin 2 receptor (IGF2R), pengatur G-proteinsinyal 4 (RGS4), alpha 3 (VI) kolagen (COL6A3), endothelin jenis reseptor b(EDNRB), Kru¨ppel-seperti faktor 6 (KLF6) dan folat reseptor 1 (folr1), yanglangsung berhubungan dengan cacat tabung saraf (NTD) [5]. VPA menginduksi hemoragikliposis otot serviks pada model embrio ayam (CEM) [6].Farmakologi VPA memunculkan teratogenicity pada tiga tingkatan, yaitu genom, yangproteomik dan tingkat metabolomic. Pada tingkat genom, VPA menghambat HDACgen [8, 10, 11]; kompromi DNA dengan mengurangi folat pasokan [12] dan langsungkerusakan DNA [13].Asetilasi histon memodulasi transkripsi dalam berbagai cara. Enzim yang,acetyltransferases, dan deacetylases dapat mengatur transkripsi dengan memodifikasinegara asetilasi histon atau faktor transkripsi promotor-terikat lainnyaAsetilasi histon efektif mengurangi muatan positif dari histon, dan inimemiliki potensi untuk mengganggu interaksi elektrostatik antara histon dan DNA[14]. Ini mungkin mengarah ke struktur kromatin kompak kurang, sehinggamemfasilitasi akses dari DNA ke mesin molekuler yang terlibat dalam transkripsicontrol. Sebaliknya, histone deasetilasi nikmat transkripsi represi olehmenginduksi kromatin pemadatan [15].Menegola dkk. menunjukkan bahwa VPA diberikannya efek teratogenik yang dengan menghambathistone deacetylases dan dengan mengikat asam retinoat (RA) reseptor [10]. Pada 24hpf, paparan 320 mM VPA diinduksi meningkat Aldh1a2 (aldehida dehidrogenase1 keluarga, anggota A2) ekspresi dalam somit dan ekspresi menurundi branchialarches [16].Asam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 20/02Ekspresi gen profil dari multiple myeloma (MM) sel terkena VPAdownregulation menunjukkan gen yang terlibat dalam perkembangan siklus sel, DNAreplikasi dan transkripsi, serta peningkatan regulasi gen yang terlibat dalamapoptosis dan kemokin jalur [17].Demikian pula dengan pola Aldh1a2, pola ekspresi sitokrom P450,keluarga 26, subfamili A, polipeptida 1 (Cyp26a1) pada embrio terkena VPA pada 24hpf juga menunjukkan bukti up-regulasi. Dalam embrio yang lebih tua / larva ($ 48 hpf),pola ekspresi Cyp26a1 dalam kelompok terkena VPA adalah samamenurunkan regulasi sebagai kelompok kontrol [16].Pada tingkat proteomik, VPA menimbulkan kekurangan asam folat melalui perlambatanmetilen tetrahydrofolate reduktase (MTHFR) [3, 4, 18-20]. Selain itu, VPA

juga SOD menghambat, HDAC dan RBP4 dll [3, 4]. Kekurangan MTHFR ringan danmengurangi konsentrasi eritrosit folat ibu dianggap risiko yang kuatfaktor untuk NTD [21]. Dalam CEM, VPA secara substansial mengubah tingkat RBP4,SET protein, apolipoprotein A-1, karbonat anhidrase 2, NADH-sitokrom b5reduktase, 60S protein ribosom 122 (ovotransferrin), dan menurunkan regulasisuperoksida dismutase [5]. Sementara di tingkat metabolomic, VAP berkurang serum folat,menyebabkan hyperhomocysteinemia yang telah dianggap sebagai mediator daripotensi teratogenik dari VPA [5, 18]. VPA menurunkan regulasi glutathione (GSH) dandiregulasi tingkat serum H2O2 untuk memprovokasi stres oksidatif yang parah [5, 22],yang pada gilirannya memicu b- dan v-oksidasi [23]. Selain itu, VPA aktifmenginduksi antiangiogenesis [24], hepatotoksisitas, steatosis hati, dan perubahanfungsi mitokondria [25]. Baru-baru ini, di hari-1 anak ayam kami menemukan VPAunik diinduksi otot hemoragik liposis pada otot rahim ketikadiberikan pada tahap embrio awal (HH tahap 10, hari-1,5 embrio) [9]. Thepenyebab utama ditunjukkan berhubungan erat dengan peningkatan regulasi simultanasetil CoA karboksilase (ACC) dan downregulation dari karnitin palmitoil(CPT1) gen di HH tahap 22 (3,5 hari) 1 transferase-CEM [9]. Namun,Mekanisme aksi detail dari VPA memainkan peran di genomik dan proteomiktingkat dalam CEM untuk menginduksi perdarahan myoliposis sampai menetas masih tetapjelas. Sementara itu, apakah perubahan ekspresi gen yang terkenaVPA dapat dicegah dengan nutraceutics seperti resveratrol dan vitamin E, kami melakukanpenyelidikan sekarang ini.

MetodeHewanProyek percobaan hewan seluruh telah disetujui oleh NationalChanghua Universitas Pendidikan Komite Etika dengan Panduan untuk Perawatan yangdan Penggunaan Laboratorium Hewan sebagai diadopsi dan diumumkan oleh US NationalInstitutes of Health. Sebelumnya, kami menunjukkan bahwa VPA pada tingkat jaringan60 mmolL21 (yaitu 100 mL 30 molL21 VPA per telur untuk memberikan tingkat jaringan akhir60 mmolL21) menghasilkan tingkat malformasi optimum 36.5¡3.0% dengan angka kematian yangTingkat 47.7¡0.5% [4], maka ini dosis tunggal 60 tingkat mmolL21 diadopsiAsam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 3 20 /seluruh percobaan ini. Kecuali dinyatakan lain, protokol dilakukan itumirip dengan yang dikutip sebelumnya [4]. Secara singkat, telur dibuahi dibeli dari Haw-Yang Pertanian Pertanian (Taichung, Taiwan) dibagi menjadi 10 kelompok, masing-masing 36

telur. Telur ini diinkubasi pada 37uC dan RH 70-80% sampai HH tahap-10 (hari1,5 embrio). Perlakuan yang berbeda yang diterapkan sebagai berikut: kelompok 1, normalcontrol; kelompok 2, VPA (60 mM) -Kontrol; kelompok 3 dan 4, Resveratrol (RV)0,2 mm dan 2,0 mM kontrol; kelompok 5 dan 6, VPA 60 mM ditambah RV 0,2 mM danVPA 60 mM ditambah RV 2.0 mM; kelompok 7 dan 8, vitamin E (vite) 0,2 mM dan2,0 kontrol mM; kelompok 9 dan 10, VPA 60 mM ditambah vit E 0,2 mM dan VPA 60 mMditambah Vite 2.0 mM, masing-masing. Inkubasi dilanjutkan sampai tahap HH46 (hari-1) anak ayam menjadi sasaran CO2-euthanesia [26]. Otot-otot leher rahimyang dipotong dan dibilas dua kali dengan PBS 4uC penyangga. Bagian dari jaringan bekusegera untuk Hematoxylin-Eosin pewarnaan dan sampel otot yang tersisayang homogen dengan 4uC PBS di atas es (EMH).Ekstraksi proteinEkstraksi protein dilakukan seperti yang dilaporkan sebelumnya [27]. Secara singkat, 500 mLcampuran buffer lisis (masing-masing 10 mL buffer lisis + protease inhibiter 100 mL) adalahditambahkan ke 100 mg EMH. Campuran lembut gelisah pada batu es untuk10 menit untuk memfasilitasi reaksi dan kemudian dihomogenisasi di 4uC dan disentrifugasi pada14000 g dan 4uC selama 20 menit. Campuran supernatan yang mengandung intraseluler yangprotein disimpan di 280uC untuk digunakan (ekstrak protein, pra). Ekstraksi untukprotein diulang setidaknya dengan enam ulangan.2D-gel elektroforesis2D-membersihkanPra (3 mg) dipindahkan ke mL tabung 1,5, yang 300 mL endapan itumenambahkan. Campuran diaduk selama 4-5 dan dibiarkan berdiri di 4uC selama 15 menit. Coprecipitant(300 mL) ditambahkan dan gelisah. Campuran disentrifugasi pada8000 g di 4uC selama 10 menit. Supernatan hati-hati dihapus. Sisapelet itu kembali disentrifugasi pada 8000 g di 4uC selama 5 menit untuk menghilangkan sisasupernatan. Untuk pelet 40 mL air suling ganda ditambahkan. Proteindidispersikan menggunakan spatula tipis dan kemudian ultrasonicated selama 1 menit. Cuci penyangga(1 mL), sebelumnya didinginkan sampai 220uC, diperkenalkan dengan 5 mL aditifsolusi untuk campuran dan gelisah di 220uC pada 10 interval menit selama 30 menit. Thesolusi yang tersisa untuk berdiri di 220uC selama 30 menit dan disentrifugasi pada 8000 g di 4uCselama 10 menit. Supernatan hati-hati dihapus. Pelet itu gas nitrogenditiup kering selama 5 menit. Residu dilarutkan kembali pada suhu kamar di420 mL rehidrasi buffer yang mengandung DDT. Larutan dibiarkan selama30 menit dan disentrifugasi pada 8000 g selama 10 menit untuk menghilangkan partikel yang tidak larut.Sebuah alikuot dari supernatan (350 mL) digunakan untuk melaksanakan IEFelektroforesis.Asam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 20/04Analisis elektroforesis IEFPegangan strip pertama kali dibilas dengan deterjen netral untuk menghapus proteinresidu kiri dari pekerjaan sebelumnya, kemudian dicuci dua kali dengan suling gandaair dan dibiarkan kering pada suhu kamar. Sampel protein (3 mg) disiapkanseperti yang dijelaskan dalam di atas itu merata ke pegangan strip (Hoefer TM

TE22). Dua bantalan penyaring setelah sebelumnya telah dibasahi dengan suling gandaair ditempatkan ke dua terminal listrik di nampan fokus. Thepelindung meliputi membran pada strip IPG (bergerak pH gradien Strip)telah dihapus. IPG strip yang wajah tetap turun ke strip fokus.Minyak mineral (2,5 mL. IPG Sampul Fluid) ditempatkan ke strip IPG, menghindaripenguapan buffer rehidrasi. Seluruh fokus nampan ditempatkan ke sebuahProtean IEF sel (Bio-Rad Laboratories Inc) (California, AS) dan elektroforesisdilakukan di 20uC. Protokol berikutnya yang terlibat rehidrasi di50 V selama 12 jam dan penyejuk pada 250 V selama 15 menit, diikuti dengan menaikkanpotensial listrik hingga tegangan fokus. Selama elektroforesis IEF, yang 7-cm strip IPG panjang difokuskan pada tegangan 4000 V untuk V * h dari 20000 V * h.Untuk IPG panjang 11 cm dan 17 cm, nilai-nilai yang sesuai harus ditetapkan pada8000 V dan 40000 V * h, dan 10000 V dan V 6000-8000 * h, masing-masing. Setelahfokus, tegangan ditetapkan pada 500 V untuk menghindari difusi lebih lanjut dari proteinsudah terfokus. Untuk setiap sampel, enam ulangan analisis elektroforesis yangdilakukan.SDS-PAGESetelah IEF elektroforesis, strip IPG dibilas dengan air suling ganda untukmenghapus minyak mineral sisa. Cairan balancing segar (mengandung DDT) adalahditambahkan dan larutan dibiarkan selama 20 menit untuk memungkinkan equilibrium. KemudianCairan itu dihapus dan balancing cairan lebih (mengandung IAA) ditambahkan danstrip yang tersisa untuk diseimbangkan selama 20 menit. Strip IPG yang diseimbangkan yangkemudian ditempatkan ke 10% SDS-PAGE gel dan menghubungi erat. Kemudian 0,5% agarosasolusi digunakan untuk menutupi dan memperbaiki strip. Gel ditempatkan di baikSel MiniProtean II atau II xi sel 2-D Protean. Setelah penanda protein (5 mL) memilikitelah ditambahkan, elektroforesis itu mulai menggunakan kondisi: 4uC, 16 mA / gelselama 30 menit, dan kemudian 35 mA / gel hingga 5 jam sampai pewarna telah mencapaibawah gel. Untuk setiap analisis 2D, setidaknya enam ulangan dilakukan.Perak pewarnaanSDS-PAGE telah dihapus dari aparat dan noda perak dilakukansebagai berikut: i) tetap selama 30 menit dengan agen fiksasi (95% ethanol 210 mL,asam asetat 50 mL, dan air deionisasi ganda untuk membuat hingga 1000 mL); ii)peka selama 30 menit dengan solusi kepekaan (95% ethanol 158 mL, natriumtiosulfat 2,44 g, natrium asetat 34 g, dan air deionisasi ganda untuk menebus untuk500 mL; iii) dibilas dengan air deionisasi ganda enam kali, setiap kali selama 5 menit; iv)perak bernoda selama 20 menit dengan larutan pewarnaan (500 mL 0,25% perak nitratlarutan yang mengandung 200 mL formalin 37%); v) dibilas dua kali dengan duaair deionisasi, setiap kali selama 1 menit; vi) dikembangkan dengan mengembangkan solusiAsam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 20/05(natrium karbonat 12,5 g, 100 ml dari 37% formaldehida, dan double sulingair (DDW) untuk membuat hingga 1 L); dan vi) menghentikan reaksi dengan cairan berhenti(asam asetat 25 mL dan DDW 475 mL). SDSPAGE yang dikembangkan scanmenggunakan Melanie 7 software untuk menentukan titik-titik protein yang berbeda secara signifikan(p, 0,05).

Identifikasi protein oleh LC-MS / MSMS persiapan sampelBintik-bintik pada SDS-PAGE dibilas dua kali dengan mencuci air tambang Q, setiap kali untuk10 menit. Bintik-bintik dipotong dari gel bernoda diproses sesuai denganstandar MS persiapan protokol [28, 29]. Dalam-gel pencernaan protein adalahdilakukan dengan menggunakan MS-grade Trypsin Emas (Promega, Madison, WI) semalam di37uC. Mencerna Tryptic diekstraksi menggunakan 10 mL Milli-Q air awalnya, diikutioleh dua kali ekstraksi dengan total 20 mL pelarut campuran (mengandungasetonitril / asam trifluoroasetat 550% / 0,1%). Ekstrak gabungan dikeringkandalam konsentrator vakum pada suhu lingkungan. Residu kering adalahdilarutkan dalam 1 mL pelarut campuran yang mengandung 5% asetonitril / 0,5% trifluoroasetatAC id.EIS-MS / MS analisis dan identifikasi proteinEIS-MS / MS spektrometer massa Thermo LTQ Orbitrap (Thermo Scientific,UK) dipergunakan untuk analisis protein. Sinyal MS / MS dianalisis dengan menggunakanMaskot mencari mesin (www.matrixscience.com). Parameter pencariandidefinisikan sebagai berikut: Database, NCBInr 20130609; Taksonomi, Lainnya lobefinnedikan dan clade tetrapod; Toleransi peptida MS, ¡0,5 Da; Fragmen MStoleransi, ¡0,5 Da dan tunjangan satu terjawab belahan dada.Sebelum setiap analisis sampel, 50 fmol standar BSA tryptic digunakan untukmengkonfirmasi efisiensi kolom dan sensitivitas EIS-MS / MS. Untuk maskot yangpencarian, data yang deisotoped dan diubah oleh Versi Analisis Data 4.0(Build 275).Analisis EIS-MS / MS diulang selama setidaknya enam ulangan. Peptida yangdianggap sebagai diidentifikasi jika skor maskot ion individu mereka lebih tinggi dariMaskot skor 30 (p, 0,001).PCR untuk kuantifikasi gen ACC (asetil CoA karboksilase) dan-CPT 1Ekstraksi RNAProtokol yang digunakan untuk ekstraksi RNA dilakukan sesuai denganprodusen instruksi (Sigma; Poole, Inggris). Untuk 100 mg peckingjaringan otot yang diperoleh dari hari-1 (HH-tahap 46) anak ayam, 1 mL TriReagent(Sigma; Poole, Inggris) ditambahkan dan homogen. Dan sisanyaprosedur dilakukan seperti yang diperintahkan (Sigma; Poole, Inggris). KandunganRNA diuji dengan Nono-Drop 1000 Spectrophotometer (Thermo FisherScientific Inc, Waltham, MA, USA) dengan menghitung rasio OD260 / OD280Asam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 6/20(grading standar harus mencapai A260 / A28051.7-1.9). Ekstraksi RNA adalahdiulang selama setidaknya enam ulangan untuk memastikan akurasi. RNA dimurnikandiperoleh diuji dan disimpan di 280uC untuk digunakan. Percobaan diulangselama enam kali.RT-PCRSampel RNA hati-hati diukur dan RT-PCR dilakukan untukmenghasilkan c-DNA Menurut instruksi pabrikan (Genemark, Taiwan

mengandung MMLV reverse transcriptase). RT-PCR diulang untuk setidaknyaenam ulangan untuk memastikan akurasi.qPCRCDNA yang diperoleh dikalikan dengan qPCR MJMini (Bio-Rad, USA) kit menggunakanprimer dengan urutan nukleotida yang ditunjukkan di bawah. Primer yang dipilihgen target yang tercantum dalam Tabel 1. Jumlah c-DNA yang diperoleh diujidengan GelPro31 seperti yang dijelaskan sebelumnya [9]. OD pada 260 nm dan 280 nm yangdiambil. Rasio A260 / A28051.7-2.0 dianggap optimal. Produkdiperoleh disimpan di 220uC untuk digunakan.Elektroforesis gel agarosaJumlah yang diperlukan dari Agarose Ultra kelas untuk biologi molekuler (Agarose JenisII, Sigma Co, USA) tergantung pada ukuran molekul fragmen DNA menjadidianalisis. Dalam percobaan ini, 2% digunakan. Secara singkat, Agarose Ultra kelas adalahdiukur secara akurat dan dilarutkan dalam 5 kali lipat-diencerkan TAE buffer dengan bantuan sebuahmicrowave pemanas. Campuran dilarutkan tampak transparan tanpakontaminasi. Untuk setiap 100 mL yang agarosa solusi 3 mL aman noda pandangan DNAagen pencelupan internal yang ditambahkan dan dibiarkan dingin pada suhu kamar untuk10 menit. Campuran didinginkan dituangkan ke dalam cetakan casting. Gelembung udarahati-hati didorong off dan proses pendinginan dilanjutkan di sekitarSuhu menghindari sinar matahari langsung sampai benar-benar dipadatkan. The selesaiCampuran agarosa ditempatkan ke dalam ruang elektroforesis. TAE penyangga (65)digunakan sebagai solusi elektroforesis penyangga. Jumlah yang diperlukan dari c-DNA(sekitar 100 ng / mL) dengan hati-hati diukur, dicampur dengan 6 kali lipatdiencerkan pemuatan pewarna, dan disuntikkan ke dalam SDS-PAGE ruang cekung. Sebuah 100-Potensi volt diterapkan selama 20 menit dan gambar diambil denganLuminescence / UV Gambar Sistem. Sampel band ini kontra-dilihat denganTangga DNA untuk memastikan lebar pita cahaya untuk sebagai besar seperti yang diharapkan danFoto diambil untuk kuantifikasi. Gel elektroforesis agarosa diulangsetidaknya selama enam ulangan untuk memastikan akurasi.

HasilMalformasi dan kematian tarif terjadi pada embrioTingkat malformation- dan kematian yang disebabkan oleh asam valproik (60 mM) danEfek alleviative resveratrol dan vitamin E dapat dilihat pada Tabel 2.

VPA pada 60 mM diinduksi tingkat malformasi dan tingkat kematian 36.5¡2.5dan 47.7¡0.5%, masing-masing, dibandingkan dengan 0,0% dan 8.5¡2.5 untuk kontrol(p, 0,05) (Tabel 2). RV dan vit E kontrol semua menunjukkan hasil yang sebanding. Padapengobatan dengan RV (0,2 mM dan 2.0 mM) dan vite (0,2 mM dan 2.0 mM), yangtarif malformasi dikurangi menjadi di bawah 12.0¡1.5% oleh RV dan bawah8.3¡2.9% oleh Vite. Tingkat kematian yang sesuai ditekan ke bawah17.4¡6.2% dan 16.7¡12.6%, masing-masing (p, 0,05) (Tabel 2). Dosis yang lebih tinggi dari RVdan Vite tampaknya lebih bermanfaat untuk pengentasan tersebut.VPA diinduksi hemorrahgic myoliposis di otot leher rahimVPA (60 mM) diberikan pada tahap awal perkembangan embrio disebabkanmyoliposis hemoragik berat (Gbr. 1A vs 1B). Tingkat prevalensi mencapai36.5¡3.0% [9]. Karena hemoragik myoliposis, otot-otot leher yangrusak parah, sehingga kemampuan mematuk dinonaktifkan. Hematoxylin-Eosinpewarnaan mengungkapkan jelas garis keturunan myofibre sepenuhnya dihancurkan oleh liposisterjadi di jaringan otot rahim (Gambar. 1C vs 1D).Ekspresi protein dipengaruhi oleh perlakuan yang berbedaLC / MS / MS mengungkapkan 16 protein tempat di 2D-elektroforesis telah secara substansialdiubah karena administrasi VPA pada tahap embrio awal (HH tahap 10,hari 1,5 embrio). Bintik-bintik ini yang dilambangkan No 1, 3, 9, 10, 13, 42, 43, 55, 65, 66,67, 70, 74, 88, 95, dan 240 (Gambar. 2), masing-masing, dan intensitasnya dibandingkandengan bahwa dari PBS diobati kontrol (Gambar. 3).

HasilMalformasi dan kematian tarif terjadi pada embrioTingkat malformation- dan kematian yang disebabkan oleh asam valproik (60 mM) danEfek alleviative resveratrol dan vitamin E dapat dilihat pada Tabel 2.VPA pada 60 mM diinduksi tingkat malformasi dan tingkat kematian 36.5¡2.5dan 47.7¡0.5%, masing-masing, dibandingkan dengan 0,0% dan 8.5¡2.5 untuk kontrol(p, 0,05) (Tabel 2). RV dan vit E kontrol semua menunjukkan hasil yang sebanding. Padapengobatan dengan RV (0,2 mM dan 2.0 mM) dan vite (0,2 mM dan 2.0 mM), yangtarif malformasi dikurangi menjadi di bawah 12.0¡1.5% oleh RV dan bawah8.3¡2.9% oleh Vite. Tingkat kematian yang sesuai ditekan ke bawah17.4¡6.2% dan 16.7¡12.6%, masing-masing (p, 0,05) (Tabel 2). Dosis yang lebih tinggi dari RVdan Vite tampaknya lebih bermanfaat untuk pengentasan tersebut.VPA diinduksi hemoragik myoliposis di otot leher rahimVPA (60 mM) diberikan pada tahap awal perkembangan embrio disebabkanmyoliposis hemoragik berat (Gbr. 1A vs 1B). Tingkat prevalensi mencapai36.5¡3.0% [9]. Karena hemoragik myoliposis, otot-otot leher yangrusak parah, sehingga kemampuan mematuk dinonaktifkan. Hematoxylin-Eosin

pewarnaan mengungkapkan jelas garis keturunan myofibre sepenuhnya dihancurkan oleh liposisterjadi di jaringan otot rahim (Gambar. 1C vs 1D).Ekspresi protein dipengaruhi oleh perlakuan yang berbedaLC / MS / MS mengungkapkan 16 protein tempat di 2D-elektroforesis telah secara substansialdiubah karena administrasi VPA pada tahap embrio awal (HH tahap 10,hari 1,5 embrio). Bintik-bintik ini yang dilambangkan No 1, 3, 9, 10, 13, 42, 43, 55, 65, 66,67, 70, 74, 88, 95, dan 240 (Gambar. 2), masing-masing, dan intensitasnya dibandingkandengan bahwa dari PBS diobati kontrol (Gambar. 3).

diskusiPenyebab kelainan dan kematian yang disebabkan oleh VPASebelumnya kami melaporkan bahwa penyebabnya memunculkan malformasi dan kematian olehVPA terlibat multi-mekanisme, seperti penghambatan histone deacetylase(HDAC), ditekan superoksida dismutase (SOD) dan glutathione regeneratifsiklus; ditingkatkan ROS stres, dan cacat tabung saraf (NTD) [3, 5, 6], menurunkan regulasifolr1 gen, IGF2R, RGS2, COL6A3, EDNRB, KLF6, dan pax-3 [5]. VPA dihambatmetionin biosintesis dengan menghambat metilasi homosistein. VPAmenurunkan regulasi karnitin otot rahim, ekspresi CPT1 dan GSH, dan padasaat yang sama, peningkatan kadar trigliserida, H2O2, dan malondialdehid (p, 0,05)[6].

Peran fosfatidiletanolamin gen protein 1 mengikat (PEBP 1)Protein PEBP (identik Raf Kinase Hambat Protein, RKIP) menghambat Raf /MEK / ERK kaskade, muncul untuk mendukung diferensiasi makrofag melalui

penghambatan jalur NFkB dan bertindak sebagai efektor novel apoptosissinyal [30, 31]. Gen RKIP dinyatakan dalam epitel prostat, otak, hati,paru-paru, testis, otot dan perut [32, 33]. Sementara RKIP terlokalisir disitoplasma dan pada spermatid membran plasma, sel Leydig, saluran telur danovarium, kelenjar susu, uterus, tiroid, sel-sel steroidogenik dari kelenjar adrenalzona fasciculata, usus kecil, sel plasma, sel Schwann, dan sel-sel Purkinje danlambung (Atlas Genetika dan Sitogenetika di Onkologi dan Hematologi). Kerugiandari RKIP menginduksi radioresistance pada kanker prostat [34]. Sementara didokumentasikanefek langsung dari VPA di PARP1 gen (RKIP) masih kurang, untuk kami percaya kamipertama yang menunjukkan VPA menurunkan regulasi PARP1 (RKIP) di embrio awaltahap, melibatkan berbagai-macam beragam, jika tidak sistematis, defisit terkait denganTerapi VPA. RV dan Vit E benar-benar diselamatkan defisit tersebut (Gambar. 4A).Peran MYL1 gen (MLC1, myosin rantai ringan 1)Modifikasi molekuler dan seluler di jaringan otot rangka yang tercerminperubahan besar dalam pola ekspresi protein [35]. VPA telah dikenal sebagaiampuh histone deacetylase (HDAC) inhibitor (HDI) [4, 10, 11]. Sebagaimana dimaksud,VPA diberikannya efek teratogenik yang dengan menghambat deacetylases histon dan dengan mengikatdengan reseptor RA [10]. VPA diinduksi peningkatan ekspresi Aldh1a2 disomit dan penurunan ekspresi dalam branchialarches [16].Acetyltransferases nuklir mempromosikan dan meningkatkan IPM diferensiasi otot[36], sementara MyoD mengatur diferensiasi otot [37]. Fungsi MyoD adalahuntuk melakukan sel mesoderm garis keturunan skeletal selama pengembangan dan mengaturmemperbaiki otot [37].Perubahan yang cukup besar dalam jenis serat rasio terjadi sebagai akibat dari fisiologisadaptasi, dalam hubungan dengan banyak gangguan otot dan selama alamproses penuaan [38]. MLC1 dinyatakan dalam lambat tapi tidak otot rangka cepat [39].Dalam transisi otot cepat-to-lambat selama penuaan otot, profil proteomik memilikijelas membentuk pergeseran yang berkaitan dengan usia untuk isoform protein lebih lambat dari myosin beratrantai rantai (MHC) dan myosin light (MLC) [40]. Latihan daya tahan, kronisstimulasi frekuensi rendah, hiper-eksitabilitas dan penuaan biasanya memicu cepat toslowtransformasi otot [41]. Atau, transisi otot lambat-to-cepatdapat biasanya diamati pada atrofi disuse, gayaberat mikro dan diperpanjang periodeistirahat [41]. Dengan demikian, hasil kami terlibat hubungan dekat dari liposis hemoragik dengan atrofi otot yang dapat ditimbulkan oleh lambat-to-cepattransisi otot.VPA dapat langsung upregulate MLC1 gen dan pada saat yang sama tidak langsungmerangsang MCL aktif (yaitu dephosphorylated MCL) [27, 42]. Carnitinetransferase (CPT1) defisiensi palmitoil telah dianggap sebagai salah satu yang palingpenyebab umum terisolasi rhabdomyolysis [27, 42]. Hasil serupa telah ditemukanberdasarkan [9].Peran gen ALB (serum albumin prekursor)Konsentrasi serum albumin menurun mengikuti terapi VPA telahdiidentifikasi dalam beberapa penelitian [43]. Berdasarkan literatur yang tersedia, VPA tampaknyamenghambat enzim (s) baik secara langsung atau tidak langsung terlibat dengan sintesis albumin

atau ekspresi gen albumin [43]. VPA tidak langsung dapat menghambat sintesis protein olehmengganggu siklus urea menyebabkan konsentrasi ornithine menurun,mengakibatkan perubahan dalam sintesis albumin dan rilis [43]Peran BHMT gen (betaine-homocysteine S-methyltransferase)VPA gangguan siklus metionin. Proses remetilasi berlangsung melalui duajalur independen. Salah satunya adalah 5-mTHF tergantung [3, 4, 20, 21] jalur akting sebagaipengganggu metilen tetrahydrofolate reduktase (MTHFR) [18, 19], danlainnya, folat-independen (atau tergantung betaine) remetilasi jalurjika homocysteine hadir. Yang terakhir hasil oleh bantuan betaine-homosisteinmethyltransferase (BHMT) yang memanfaatkan gugus metil dari betaine untuk membentukdimethylglycine dan metionin. Perubahan siklus metionin oleh VPAbisa menjadi mekanisme umum yang mendasari hepatotoksik, teratogenik danefek antifolate obat [25]. Serum Overaccumulated SAM [4] downregulatesEkspresi BHMT dalam sel HepG2 sebagian oleh menginduksi NFkB, represor sebuahuntuk gen BHMT manusia [44]. Untuk kami percaya, kami adalah pelaporan pertama yangVPA langsung menghambat folat-independen (atau tergantung betaine)remetilasi jalur. Hasilnya juga mencerminkan potensi alam teratogenikVPA.Peran PKM2 gen (piruvat kinase otot isozim 2)Sferositosis herediter (HS) dan piruvat kinase (PK) kekurangan yang palingPenyebab umum dari anemia hemolitik kongenital [45]. Pasien dengan bawaananemia hemolitik yang dilaporkan terkait dengan defisiensi eritrosit PK[46]. Kekurangan eritrositik PK, pertama kali didokumentasikan pada Basenjis, adalah yang palingerythroenzymopathy umum diwariskan pada anjing [47]. Menariknya, meskipun VPAsaja tidak mempengaruhi PKM2 gen sama sekali (Gambar. 4E), RV (pada 2,0 mM) dan Vit E (0,2,2.0 mM), baik digunakan sendiri atau cotherapy dengan VPA, semua PKM2 diregulasi(Gambar. 4E), yang mendasari penindasan oleh VPA terjadi hanya di proteomik yangtingkat (tempat No 74 pada Gambar. 2, Gambar. 3).Asam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 15/20Ini layak dicatat, protein-tirosin fosfatase 1B (PTP1B) bertindak sebagai negatifregulator dari jalur sinyal insulin [48-50]. Temuan bahwa PKM2 bertindak sebagaisubstrat novel PTP1B juga memberikan wawasan baru ke dalam regulasiKegiatan PKM2 adiposa [51].Atau, VPA membangkitkan akumulasi homosistein melalui penurunansiklus metionin [4]. Homosistein penurunan viabilitas mitokondria dankegiatan PKM2 dan creatine kinase [52]. Hyperhomocysteinemia parahpasien yang terkena dengan beberapa manifestasi termasuk tingkat variabel motordisfungsi [52]. Demikian juga, VPA diinduksi atrofi otot yang parah denganhemoragik liposis di mematuk otot (otot rahim) [4, 8].Peran FLNC gen (filamin C)Kekurangan protein FLNC telah dikaitkan dengan kelemahan otot [35].Patofisiologi paling miopati metabolik adalah terkait dengan penurunanproduksi energi atau untuk produksi yang abnormal dari spesies oksigen reaktif (ROS)[27, 42].

Sastra menunjukkan bahwa rangka penghapusan-otot tertentu dari kedua HDAC1 danHasil HDAC2 di lethality perinatal dari subset dari tikus, disertai dengankelainan mitokondria dan sarkomer degenerasi [53]. VPA adalah ampuhHDAC inhibitor, sedangkan HDAC 1 dan 2 kontrol homeostasis otot rangka danfluks autophagy pada tikus [53]. VPA pasti akan memainkan bagian dari peran dalamgenerasi miopati. HDAC1 dan HDAC2 berperan dalam pemeliharaanstruktur otot rangka dan fungsi dan beberapa kondisi patologis [53].Miopati metabolik sering dapat menyebabkan gangguan ekstra-neuromuskuler[42]. Embrio pada tahap awal lebih rentan terhadap terapi VPA [9, 54].Ternyata, perubahan profil proteomik dalam kenyataannya tidak hanya terbatas pada usia,lebih dikaitkan dengan individu bawaan '' kondisi fisiologis '' sepertistatus gizi, tekanan, penyakit, pengobatan dan olahraga [9, 54].Akhirnya, masalah tentang peran HDAC telah menarik perhatian kita. BisaRV dan vit E memainkan peran yang sama seperti VPA? Yang mengherankan, RV bertindak sebagai pan-HDACinhibitor mengubah status asetilasi histon [dikoreksi] protein di humanderivedsel hepatoblastoma. In vivo tes ayam embryotoxicity menunjukkantoksisitas parah RV pada konsentrasi tinggi [55].Agen makanan lain seperti metabolit dari vite memiliki fitur strukturalkompatibel dengan HDAC penghambatan [56]. Kemampuan senyawa diet untuk derepressepigenetically dibungkam gen dalam sel-sel kanker, dan untuk mengaktifkan gen ini disel normal, memiliki implikasi penting untuk pencegahan kanker dan terapi. Di sebuahkonteks yang lebih luas, ada minat yang tumbuh di inhibitor HDAC diet dan merekaberdampak pada mekanisme epigenetik yang mempengaruhi kondisi kronis lainnya, sepertipenyakit kardiovaskular, neurodegeneration dan penuaan [56].Asam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 16/20BahanBovine serum albumin (BSA), natrium dodesil sulfat (SDS), Coomassie BrilliantBiru R (CBR) dan N, N, N9, N9-tetrametil-etilendiamin (TEMED) yangdibeli dari Sigma Co (St. Louis, MO, USA). Bio-Rad uji protein kit, BioRad solusi standar protein, solusi amfoter (Bio-Lyte 3-10Ampholyte), 30% bisacrylamide, 19: 1, dan minyak mineral adalah produk dari Bio-Rad(Hercules, California, USA). 2-D Clean-up Kit adalah produk dari GEKesehatan Bio-Science Corp (Piscataway, USA). Anti-kelinci IgG HRP-linkedantibodi, Tris buffer saline dengan Tween-20 (TBST-10X) dan lisis sel penyanggadisediakan oleh Sel Signaling Teknologi Co (Massachusetts, USA).ProteoJETTM Sel mamalia Lisis Reagent, ProteoBlockTM dan ProteaseInhibitor Cocktail adalah produk dari Fermentas Co (USA). Tripsin adalah produkdari Promega (Madison, WI, USA). Asetonitril (ACN) dipasok oleh JT BakerProduk Kimia Trading (Shanghai) Co, Ltd (Cina). Bahan kimia lainnya tidakdilambangkan disediakan oleh Sigma Co (St. Louis, MO, USA). Semua reagen yang digunakan dalameksperimen ini dibuat seperti yang dijelaskan [5] sebelumnya.Keterbatasan penelitianKarena keterbatasan sumber layak kit dan pemasok terkait yang berhubungan dengan

Model embrio ayam, pekerjaan penelitian kami telah pasti sangat sulit danterbatas. Selain itu, ekspresi gen dan protein sinyal redamanberurutan dan cepat dengan cara dosis-dan tergantung usia (yang bisa diharapkan),kita akan kehilangan banyak informasi berharga, kami kira.Dengan demikian, selain downregulation dari CPT1 dan peningkatan regulasi ACCseperti dilaporkan sebelumnya [8], kami menyimpulkan bahwa VPA cenderung downregulate PEBP1dan BHMT (p, 0,05) dan upregulate MYL1, ALB dan FLNC (p, 0,05) pada awaltahap embrio tanpa mempengaruhi PKM2, melibatkan penghambatan langsung padafolat-independen remetilasi jalur. Gen ini terkait erat denganmiopati metabolik, myogenesis, ekspresi gen albumin, dan hemolitikanemia. Selain itu, VPA langsung menghambat folat-independen (atau betainedependent yang)remetilasi jalur, yang mendasari mekanisme aksi VPA untukmenginduksi hemoragik myoliposis. RV dan vit E yang efektif untuk pengentasan sepertidampak buruk.informasi pendukungS1 Tabel. LC / MS / MS identifikasi protein diekspresikan dalam ayam servikssampel otot. Data dikonfirmasi oleh setidaknya enam penentuan (untuk ditinjausaja).doi: 10.1371 / journal.pone.0116534.s001 (DOCX)Asam valproik Apakah Dicegah dengan Resveratrol dan-TokoferolPLOS ONE | DOI: 10.1371 / journal.pone.0116534 31 Desember 2014 17/20Ucapan Terima KasihKami ingin mengakui bantuan teknis ahli Dr. J.-W. Liaw diAnimal Disease Center, Rumah Sakit Veteran dari Chung-Hsing University(Kota Taichung, Taiwan) untuk pemeriksaan patologis dari NTD dan otakjaringan.Penulis KontribusiDisusun dan dirancang percobaan: PKC YC PMK. Melakukanpercobaan: PKC PXL. Menganalisis data: CLH PKC YC PMK. Kontribusireagen / bahan / alat analisis: CLH YC PMK. Menulis kertas: PMK.