GUIA LAB 1

U NI VE R S I DAD NACI ONAL F E DE R I CO VI L L AR R E AL

F ACU L T AD DE CI E NCI AS NAT U R AL E S Y MAT E MAT I CAS

L abor at or io de B ioquímica y B iología Molecular

_______________________________________________________

GU I A DE P R ACT I CAS

BB II OOQQUU ÍÍ MMII CCAA

AU T OR ES :

Mg. Ana Gut ier r ez R omán

Mg. Car los S ant a Cr uz Car pio

B iól.W .I s r ael B ar r ant es B us t inza

L ima, Agost o de 2002 .

Mg. Ana Gutiérrez Román- FCCNM

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Contenido

Temas Páginas

1 Introducción 2

2 Preparación de los Experimentos y registro 3

3 Medidas de Seguridad 4

4 Propiedades físicas de las proteínas 5

5 Espectrofotometría 9

6 Determinación Cuantitativa de Proteínas (Biuret) 12

7 Determinación Cuantitativa de Proteínas (Bradford) 14

8 Secuenciamiento de Péptidos 15 9 Estructura Secundaria, Espacial y Dominios en Proteinas 17

10 Cinética Enzimática 21

11 Cromatografía 27

12 Determinación Cuantitativa de Glucosa 31

13 Transporte de Electrones 33

14 Determinación de Lípidos Totales 35

15 Determinación de Colesterol 37

16 Transaminación 39 17 Electroforesis 41

18 Caracterización de Proteinas 43 19 Bibliografía 45


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1 Introducción

Para la comprensión de la Bioquímica, actividad intelectual abierta con limitaciones que establece el método científico, se requiere una actitud de curiosidad despierta para observar hechos en condiciones experimentales.

La capacidad de obtener información precisa al máximo de exactitud,

registrar, ordenar y presentar los datos en forma comprensibles a los observadores independientes que tengan acceso a ellos es una habilidad que no se logra sino es por la práctica personal del ejercicio.

El costo, espacio y tiempo disponible han hecho imposible el diseño de

prácticas en paralelo con la teoría. Es por ello que la mayoría de las escuelas de Biología de vanguardia en la educación biológica han reducido radicalmente el tiempo dedicado al Laboratorio de Bioquímica. Sin embargo, la experiencia didáctica, nos indica que la práctica de experimentos elementales y sencillos, aplicados a la biología, estimula el interés científico de los estudiantes de Bioquímica.

La presente Guía de Prácticas, tiene la finalidad de cumplir con los siguientes

Objetivos Específicos:

1. Ejercitar a los alumnos en el método científico mediante el manejo de técnicas generales y sencillas, aplicables a múltiples problemas particulares.

2. Desarrollar habilidad para programar experimentos, sistematizar el trabajo de laboratorio, manipular los equipos y realizar mediciones u observaciones rigurosas, así como saber expresar sus resultados.

3. Procurar el desarrollo de iniciativa personal y de razonamiento lógico frente a problemas que se planteen, de tal modo que el alumno pueda realizar innovaciones o variaciones en los métodos de trabajo.

4. Desarrollar el sentido de responsabilidad social para manejar los recursos humanos y materiales que inciden en su propia formación.

5. Exigir en forma intransigente una actitud de honestidad intelectual.

Por la naturaleza de las prácticas y para poder cumplir con sus objetivos es imprescindible una participación activa y personal tanto de alumnos como de docentes.

Mg. Ana I. F. Gutiérrez Román

Mg. Carlos M. Santa Cruz Carpio Biól. W. Israel Barrantes Bustinza

FCCNM – UNFV Abril de 2002


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2 Preparación de experimentos y registro de resultados

El registro de los resultados de los experimentos es una parte esencial de cualquier trabajo científico. Los experimentos de laboratorio son el fundamento de las hipótesis, teorías, conocimientos científico y tecnología, y son inútiles si no se consigna por escrito la descripción de lo que se ha hecho y observado en tal forma que permita a cualquiera, con cierto conocimiento del asunto, que repita, compruebe o corrija el trabajo realizado sin necesidad de guía especial.

Las anotaciones deben ser breves y muy claras; se llevarán en las páginas en blanco de esta guía, así como las gráficas y calibraciones de los experimentos que lo requieran. Se harán inmediatamente después de cada experimento sin confiar a la memoria un momento más de lo necesario.

Para que los experimentos de laboratorio tengan valor formativo, se aprenda a hacer observaciones exactas, se estimule la curiosidad y se desarrolle un sentido crítico basado en los aspectos cuantitativos de la ciencia es necesario que antes de iniciar el trabajo en el laboratorio:

♦se revise en textos, los principios fundamentales implicados ♦se reflexione y relacione con otros principios o hechos previamente conocidos ♦se estudie y comprenda bien las instrucciones del experimento antes de realizarlo

La guía se conservará limpia y ordenada, para permitir la lectura fácil de las anotaciones, que deben ser una descripción completa y honesta de lo que ha visto y echo. No es aceptable hacer anotaciones en borrador para después pasarlo en limpio y conceder al aspecto estético un valor que no merece.

Aunque los experimentos que se harán, producen resultados previsibles por las teorías conocidas que de ellos se derivan originalmente, cualquier resultado imprevisto, raro, o aún absurdo debe anotarse y de ningún modo llenar el protocolo con lo “que debió pasar” pues sería una relación completamente inútil. Los asientos falsos o las omisiones no enseñan nada. Sí en cambio, el análisis concienzudo de los resultados inesperados o contrarios a lo previsto, que pueden ser fuente de mucha información útil para el desempeño futuro en el laboratorio.


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3 Medidas de Seguridad

Todos los accidentes personales por triviales que sean deben comunicarse al profesor encargado de la práctica.

Las sustancias que se utilizan, y las operaciones que se realizan en el

laboratorio son potencialmente tóxicas y peligrosas. Trabaje con cuidado, atento a los eventos que puedan comprometer la seguridad personal o colectiva.

1. Usar mandil, para proteger la ropa y el cuerpo 2. No fumar en el interior del laboratorio 3. No consumir alimentos, ni bebidas en el laboratorio 4. No utilizar la llama del mechero sin cerciorarse antes de que no haya cerca

líquidos inflamables. 5. Dirija la boca del tubo o matraz de reacción, lejos de sí mismo y del vecino, el

contenido puede proyectarse. 6. Con los líquidos corrosivos, ácidos y álcalis concentrados, o venenosos, se debe

tener cuidado de no inhalar sus vapores y el contacto con cualquier parte del cuerpo. Si se tiene contacto accidentalmente, lávese de inmediato con abundante agua del caño y avise al profesor.

7. No mantenga el mechero o cocina encendida sin necesidad. 8. No arroje sólidos (grasa, cerillos, papel de filtro, etc.) al desagüe. 9. Cuídese de no arrojar cerillos encendidos o incompletamente apagados a los

depósitos de basura. 10. No cambie de lugar los reactivos para uso del grupo. Deben estar disponibles para

todos. 11. No confunda los tapones de los frascos de reactivos ni se introduzcan en ellos

pipetas o goteros. De preferencia sirva un poco del que necesita en un tubo de ensayo o matraz muy limpio y de allí sírvase para su experimento.

12. Tenga especial cuidado con los solventes volátiles que pueden llegar a provocar explosiones. Si se vierte accidentalmente sobre la mesa, séquela inmediatamente con un trapo húmedo y enjuáguese éste en el chorro de agua, exprimiéndolo.

13. Conserve limpio su lugar. Lave con mucho cuidado el material de vidrio y enjuáguelo con abundante agua.


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4 Propiedades Físicas de las Proteínas

En la siguiente práctica, se realizarán cuatro experimentos, todos ellos relacionados a las propiedades de las proteínas, los cuales son de mucha utilidad en los métodos de purificación.

Experimento I Objetivo:

a) Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las proteínas plasmáticas. Teoría.-

En las cadenas polipéptidicas de las proteínas los grupos α- amino y α- carboxilo de los aminoácidos, salvo los terminales, se encuentran constituyendo los enlaces peptídicos. De este modo los grupos que pueden cargarse eléctricamente y actuar como ácidos débiles, confiriéndoles a las proteínas la capacidad de actuar como amortiguadores; son:

1. carboxilos libres de los aminoácidos dicarboxilicos, cuyo pKa fluctúa alrededor de 4. 2. épsilon amino de la lisina, guanidino de la arginina, fenol de la tirosina, sulfihidrílo de

la cisteína, cuyos pKa son superiores a 9. 3. imidazol de la histidina cuyo pKa en las proteínas es de 5,6 a 7.

Reactivos:

1. HCl 10 mmol/L 2. Indicador rojo de metilo 3. Muestra biológica: suero sanguíneo

Procedimiento:

1. En un tubo de ensayo, coloque 1,0 ml de suero sanguíneo más 1,0 ml de agua destilada y desproteinice de la siguiente manera: Calentar el tubo con la muestra en un baño de ebullición durante 1 a 2 minutos, luego filtrar o centrifugar. Luego complete el volumen del filtrado a 2 ml con agua destilada.

2. Tomar 1 ml de suero sanguíneo en otro tubo de ensayo y agregaré 1 ml de agua destilada.

3. Agregar a cada tubo 1 o 2 gotas del indicador rojo de metilo y titular con HCl 10 mmol/L. Anote sus resultados y compare.

4. Como referencia considere que, 1 ml de suero sanguíneo de mamífero vira de pH 6,3 a pH 4,2 al agregar aproximadamente 0,03 mEq de ácido.


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Experimento II Objetivo:

a) Estudiar el punto isoeléctrico de una proteína Teoría.-

Los grupos ácidos y básicos libres de las cadenas polipeptídicas se ionizan en función del pH del medio. De su número y de su grado de ionización depende la carga neta de la proteína. Al pH en que el número de cargas eléctricas positivas y negativas es igual, la proteína está eléctricamente neutra y se dice que se encuentra en su punto isoeléctrico. En este punto la solubilidad de las proteínas es mínima. El punto isoeléctrico característico de cada proteína, depende de su estructura y composición de aminoácidos.

Reactivos:

1. CH3COOH 1 N; 0,1 N; 0,01 N 2. NaOH 1 N 3. Solución de caseína al 0,5%, en acetato de sodio 0,1 N: Colocar 0,5 g de caseína pura

en un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 50 ml de agua destilada a 40°C. Agregar 10 ml de NaOH 1N y agitar hasta que la caseína se disuelva, evitando la formación de espuma. Agregue rápidamente 10 ml de ácido acético 1N. Complete el volumen a 100 ml con agua destilada. Es una solución opalescente.

Procedimiento:

1.Tomando en cuenta que la caseína está disuelta en acetato de sodio 0,1 N, calcular la cantidad de ácido acético que debe agregarse a volúmenes fijos de la solución proteica, para obtener diferentes pH que difieran entre sí en 0,3 unidades de pH. Use ácido acético 0,1 N o 0,01 N cuando sea necesario

2.Colocar en tubos numerados el ácido acético calculado, completar a volúmenes iguales con agua destilada. Mezcle. Agregue rápidamente la solución de caseína y mezclar.

3.Observe cuidadosamente los resultados inmediatos en cada tubo y anote. Siga sus observaciones por 30 minutos, anote.

Experimento III Objetivo:

a) Estudiar la precipitación de proteínas por sales neutras. Teoría.-

Las sales neutras en altas concentraciones disminuye la solubilidad de las proteínas, lo cual se debe probablemente a una deshidratación de las moléculas proteicas. El solvente, en


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estos casos, se organiza alrededor de los iones de la sal, de modo que éste disminuye alrededor de las moléculas de proteínas, las que se asocian en una fase sólida. La fuerza iónica a la cual precipitan las proteínas es característica para cada una de ellas, a iguales condiciones de pH y temperatura. Esta propiedad permite separar mezclas de proteínas. Reactivos:

1. Solución de caseína o suero sanguíneo. 2. Solución saturada de sulfato de sodio: pesar 23 g de sulfato de sodio anhidro. Disolver

en 70 ml de agua destilada a 50°C. Completar a 100 ml con agua, cuidando que la temperatura no baje de 37°C. Guardar a esa temperatura para evitar su precipitación.

Procedimiento

1. Tome 2 ml de suero sanguíneo o caseína en un beaker. Agregue 30 ml de la solución saturada de sulfato de sodio.

2. Espere 10 – 15 minutos para que la precipitación sea completa. Filtre o centrifugue.

Experimento IV Objetivo

a) Estudiar la precipitación de las proteínas por solventes orgánicos. Teoría.-

El agua tiene una constante dieléctrica relativamente alta (80,36 a 20°C), por lo cual en solución acuosa disminuye la interacción entre las moléculas proteicas (debido a sus grupos cargados), mientras que aumenta la interacción entre las proteínas y el agua. Esto favorece la solubilidad de las proteínas. Los solvente orgánicos tales como el etanol, metanol y acetona tienen constantes dieléctricas bajas (25; 32,4 y 19,6 respectivamente a 20°C), de modo que al agregarlos a una solución acuosa de proteínas, baja la constante dieléctrica del medio y además disminuye la concentración efectiva (actividad) del agua; lo que favorece la interacción de los iones proteicos entre sí y por lo tanto su precipitación. Reactivos:

1. Suero sanguíneo o solución de caseína 2. Acetona 3. Etanol 96°C 4. NaCl 0,15 M

Procedimiento:

1. Tome 2 tubos de prueba y agregar a cada uno 1 ml de suero o solución de caseína. Agregue 3 ml de acetona, dejando un tubo a temperatura ambiente y el otro en refrigeración por 30 minutos. Anote sus observaciones.

2. Diluya 1:4 cada muestra con solución de cloruro de sodio 0,15 M. Tenerlas a temperatura ambiente unos minutos. Anote sus observaciones.

3. Repetir el experimento utilizando como solvente el etanol.


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Cuestionario: 1. ¿ Cuál sería el mínimo de grupos disociables de una cadena polipeptídica lineal? ¿Por

qué?. Explique. 2. Sería correcto hablar de pK de una proteína. Explique. 3. ¿ Qué es desnaturación, precipitación e hidrólisis? 4. El punto isoeléctrico de la protamina es 12,2. ¿Qué significado tiene este valor con

relación a su composición de aminoácidos?. 5. Si se tiene una mezcla de albúmina plasmática y hemoglobina, cuyos puntos isoeléctricos

son 4,7 y 6,7 respectivamente. ¿Cómo podría separarlas adecuadamente? 6. ¿ Cuál es la fuerza iónica de una disolución de SO4(Na)2.H2O al 23% (500 ml) y de una

disolución de SO4(NH4)2.H2O al 50% (500 ml)? 7. Explique las características que presenta el grupo de proteínas denominada caseína.

Luego explique si es posible separar la fracción α caseína, de las otras caseínas, utilizando metales pesados.

8. Explique como se comporta la seroglobulina y seroalbúmina del plasma sanguíneo con relación a su solubilidad en: a) agua pura, b) solución de cloruro de sodio 0,15 M, c) solución saturada de sulfato de amonio y d) solución saturada de sodio.


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5 Espectrofotometria Objetivos:

a. Conocer las partes y funcionamiento del espectrofotómetro y/o fotocolorímetro b. Calibración del Espectrofotómetro y /o Fotocolorímetro. Determinación del

espectro de absorción y determinación de la concentración de una muestra problema.

Teoría.-

La mayoría de los métodos para el análisis de los componentes de la sangre, orina y otros líquidos biológicos se basan en la producción de una solución (coloreada o no) y la comparación de la luz que transmite (o absorbe) la solución problema con la que transmite una solución de concentración conocida. Los métodos son simples, rápidos y sensibles y hacen posible la estimación de pequeñas cantidades de sustancias muy difíciles de medir por otros métodos.

Los espectrofotómetros son instrumentos para medir la luz que llega a una fotocelda, por medio de un potenciómetro al que se adapta una escala convencional graduada en unidades que permiten hacer el cálculo de la concentración del material emisor, absorbente, dispersor, o transformador de longitud de onda (fluorescencia) de la luz.

Se tiene así los fotómetros de flama, que miden la luz emitida por un elemento incandescente y que es proporcional a su concentración si se ajustan las condiciones del experimento. Los fotocolorímetros y espectrofotómetros que miden la absorción de luz de longitudes de onda específicas de materiales como soluciones, cristales, etc. No sólo en el rango visible del espectro electromagnético, sino extensivo al ultravioleta y al infrarrojo. La medición de la luz dispersa por material suspendido en un líquido se conoce con el nombre de nefelometría o turbidimetría. Los fluorocromos son sustancias que emiten luz cuando son excitadas por radiaciones de longitud de onda más corta que la luz emitida; la fluorometría mide la luz emitida por los fluorocromos colocando la fotocelda sensible en ángulo recto con la luz excitadora que llega a la solución problema.

Los fotómetros y espectrofotómetros constan en esencia de las siguientes partes:

1. Una fuente luminosa que es variable según la zona del espectro que desee

utilizarse: lámpara de hidrógeno, de mercurio, de tungsteno, de halógeno, etc. 2. Un dispositivo colimador para alinear los rayos luminosos que se emiten en todas

las direcciones a partir del material incandescente y que puede ser un espejo curvo, una lente o ambos y formar un haz de rayos paralelos.

3. Un selector de longitud de onda para eliminar el haz de luz de la fuente, de las radiaciones de longitudes de onda que no van a utilizarse y obtener luz “monocromática” y que puede ser un filtro, o un prisma, o retícula de difracción para descomponer la luz en su espectro y por medio de una hendidura móvil dejar pasar sólo la que interesa para el experimento.

4. Una “cubeta” que es un recipiente que absorbe una cantidad de luz conocida y constante, en la cual se coloca la solución problema o el “blanco” de reactivos. Las cubetas pueden ser tubos de ensayo seleccionados por su calibre igual, y que


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al ponerse en el aparato dan lecturas iguales, que se ajusta a “cero”. 5. Una fotocelda que transforma (efecto fotoeléctrico) la energía luminosa que

excita su superficie en energía eléctrica. 6. Un potenciómetro para medir la corriente generada en la fotocelda con escala

graduada en unidades de lectura convenientes, sea densidad óptica (D.O.) ó Absorbancia, Transmitancia (T). La aguja indicadora se mueve en todos los casos por la corriente eléctrica y sólo varía la escala que “traduce” la corriente en un dato manejable para el análisis fotométrico.

Las unidades en que se expresa la absorción de luz son:

Transmitancia (T) = I x 100 escala aritmética de 0 a 100 Io

Absorbancia (A) ó = - log T escala logarítmica de 0 a 2 Densidad óptica (D.O)

Material y Reactivos

1. Tubos de Prueba 2. Pipetas de 1ml, 5 ml y 10 ml. 3. Solución stock de permanganato de potasio al 0,5% 4. Agua destilada 5. Espectrofotómetro.

Procedimiento

Disponer de una serie de tubos y montar el siguiente set de trabajo:

Reactivos 1 2 3 4 5 6 Solución de Trabajo 0,05% (ml) 0,00 0,20 0,40 0,80 1,60 2,00 Agua destilada (ml) 5,00 4,80 4,60 4,20 3,40 3,00

♦Mezcle por inversión ♦Recibirán del instructor una o dos soluciones problemas. ♦Tome el tubo denominado como blanco y calibre el equipo a 100 % de T y a 0 de A.

Luego tome uno de los tubos y realice el espectro de absorción, el cual consiste en realizar lecturas a diferente longitud de onda, hasta determinar cual es la longitud de onda en la cual hay mayor Absorbancia. Gráfica en papel milimetrado.

♦Para leer el set de tubos de trabajo, utilizar la longitud de onda en la cual se obtuvo mayor Absorbancia. Haga la gráfica de Absorbancia vs. Concentración y de Transmitancia vs. Concentración. Calcule la concentración de las soluciones problemas.

Cuestionario

1. ¿Qué es un espectro de absorción?. Represente gráficamente el espectro de absorción y la ley de Lambert-Beer de su experimento.

2. ¿ A qué se denomina Blanco de reactivos y en que se diferencia del blanco de


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agua destilada? 3. ¿Qué es un factor de calibración? Calcule el factor de calibración de su

experimento. 4. ¿Cuáles son las aplicaciones y limitaciones del método espectrofotométrico? 5. ¿Qué se entiende por coeficiente de extinción molar?. Determine el coeficiente de

extinción para el azul de metileno? 6. ¿De que color aproximado se ve un cuerpo que absorbe ondas de longitudes

correspondientes al color verde y al azul? 7. ¿Se puede efectuar una determinación fotométrica en un líquido transparente

incoloro? ¿Qué requisitos exigiría a su instrumento? Explique. 8. Si las soluciones coloreadas presentan una absorbancia muy grande que dificulta

la medida en el fotocolorímetro o espectrofotómetro. ¿Puede diluir las soluciones?.


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6 Determinación de Proteínas Objetivo:

a) Cuantificar la concentración de proteínas que pueda estar presente en algunas muestras biológicas, según el método de Biuret.

b) Uso del factor de calibración y de un estándar de proteínas. Teoría.-

El reactivo de Biuret es el sulfato cúprico diluido en solución alcalina. Los compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos tales como el Biuret (NH2CONHCONH2) y proteínas, forman complejos organometálicos con los iones cúpricos para dar un color púrpura característica. Esta reacción llamada “reacción de Biuret”, es muy general, ya que todos los compuestos con dos grupos carbamilos o enlaces peptídicos unidos directamente o por medio de un átomo de carbono o nitrógeno dan reacción positiva. Los dipéptidos y los aminoácidos con excepción de la histidina, serina y treonina, dan reacción negativa. En los materiales biológicos prácticamente no hay sustancias fuera de las proteínas que den la reacción de Biuret. A pH bajos los iones cobre se combinan también con los grupos carboxilos y a pH altos reaccionan con los grupos amino de las proteínas. La reacción no debe efectuarse en presencia de iones amonio, debido a que forma compuestos coloreados con los iones de cobre.

Este método para la determinación de proteínas no es muy sensible, ya que se requiere grandes cantidades de proteínas, en un rango de 1 a 20 mg Materiales y Reactivos

1. Reactivo de Biuret: Disuelva 1,5 g de sulfato de cobre pentahidratado y 6 g de tartrato de sodio y potasio en 500 ml de agua destilada. Adicione con agitación constante 300 ml de NaOH al 10 % (w/v). Diluir el reactivo a 1 litro y agregar 1 g de yoduro de potasio para proteger la oxidación del cobre.

2. Solución estándar de proteínas.- Albúmina bovina sérica (BSA) 10 mg/ml. 3. Muestra biológica

Procedimiento:

Reactivos Blanco Est. 1 Est. 2 Est. 3 Est. 4 Est. 5 Muestra BSA (ml) --- --- Muestra (ml) --- --- --- --- --- --- X Agua destilada (ml) 1,00 --- --- --- --- --- --- Reactivo de Biuret (ml) 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00

•Mezcle bien cada tubo y déjelos reposar por 30 minutos. •Lea frente a sus blancos apropiados a 570 nm.


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Cuestionario

1. Gráficar sus resultados y determine la concentración de su muestra problema en su gráfica y según la siguiente formula:

Proteínas Totales (g/dl) = A m x C est. (g/dl)

A est.

2. Halle el factor de calibración y determine la concentración de su muestra. 3. Si tuviera muestras biológicas con proteínas y alto contenido de grasas. ¿Cómo

trataría a su muestra para la determinación de proteínas? Explique con detalle. 4. ¿Qué otras técnicas se pueden utilizar para la determinación de proteínas? 5. ¿Cuáles son las principales proteínas que encontraremos en la sangre y cuáles

son los valores normales? 6. ¿Qué es el fibrinógeno? 7. Especifique algunas de las funciones que cumple la albúmina. 8. Mencione los tipos de globulinas que conoce y explique cuales son sus

funciones.


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7 Determinación de proteínas: Método de Bradford

Objetivos.-

a) Conocer un método más sensible para determinar proteínas.

Teoría.-

El método de Bradford, cuantifica las proteínas utilizando al colorante azul brillante de Coomassie, el cual se une a las proteínas y desplaza su punto de máxima absorción de 465 – 595 nm.

Materiales y Reactivos.-

1. Reactivo concentrado de Bradford: disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G en 100 ml de ácido o-fosfórico y 100 ml de metanol absoluto. Mezclar, filtrar a través de Whatman N°1 y conservar a 4°C, en frasco oscuro.

2. Reactivo de Trabajo: Diluya 1/5 el reactivo concentrado de Bradford. 3. Solución estándar de Proteína: Disuelva 0,5 mg de BSA (albúmina bovina de suero),

en 1 ml de agua destilada. 4. Muestra: muestras biológicas que tengan escasas proteínas.

Procedimiento.- •Procesar junto con la muestra una curva estándar que tenga por lo menos 6 puntos:

Reactivos 1 2 3 4 5 6 M B Estándar proteínas (µl) 5 10 15 20 60 100 --- --- Muestra (µl) --- --- --- --- --- --- 20 --- Reactivo de Trabajo(µl) 250 250 250 250 250 250 250 250 Agua destilada (ml) 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25

•Agitar cada tubo sin formar espuma y dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente. •Lea la Absorbancia de cada solución a 595 nm. Utilice cubetas de vidrio y enjuagarlas entre

una y otra lectura con alcohol. •Grafique en papel milimetrado la curva estándar. Cuestionario:

1. Hallar el factor de calibración 2. Calcular la concentración de proteínas de su muestra en la curva de calibración y con

el factor de calibración. 3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de este método? 4. ¿Cuál es la sensibilidad del método? 5. Detalle el procedimiento al que fue sometida su muestra.


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8 Secuenciamiento de Péptidos Objetivos:

a) Conocer y describir los métodos de caracterización a nivel de estructura primaria. b) Aplicar el método de reconstrucción por digestiones con endopeptidasas.

Teoría:

Las propiedades biológicas de las Proteinas son derivadas de su composición de aminoácidos y del orden en el cual estos residuos se encuentran en la estructura primaria, de la que luego continuan los plegamientos superiores secundarios y en el espacio. Por lo tanto, la determinación de la secuencia, o secuenciamiento, es una estrategia de elevada resolución que nos permite inferir acerca de la estructura, función y relaciones evolutivas de las proteinas. Para tales fines, se cuenta con una variedad de tecnologías, como la cromatografía en geles de sílica, separaciones digestivas automatizadas (métodos de Sanger y de Edman) acopladas a cromatógrafos de gases, espectrometría de masas de ionización electrospray (ESI), etc. En esta práctica se empleará la Estrategia de Determinación de la Secuencia de Campbell (1997), mediante la cual tras una serie de pasos que cubren diferentes metodologías, se pueden reunir los datos obtenidos para producir un órden de aminoácidos único. Procedimiento:

1. Se obtiene la composición total de residuos del péptido en un analizador de aminoácidos tras la hidrólisis ácida completa (HCl 6M, 110C al vacío por 24 horas).

2. Verificar el análisis N-terminal y C-terminal de los fragmentos peptídicos (producidos por digestión química con Cloruro de Dansilo, o enzimática mediante Carboxipeptidasa, respectivamente).

3. Observar la fragmentación de la proteina en péptidos más pequeños que posean secuencias traslapadas luego de diferentes tratamientos:

En algunos casos, las digestiones con CNBr o ácida leve no distinguen los aminoácidos azufrados, para tales casos se coloca la denominación HSL (homo-Ser-Lactona) que equivale a Met.

4. Finalmente, tener en cuenta el secuenciamiento directo de los fragmentos con un instrumento automatizado que utilice los métodos de Edman o de Sanger

Reactivo o Enzima Sitio(s) de Digestión (*) Bromuro de Cianógeno Met – X T r ips ina Lis – X ó Arg – X Yodosobenceno T rp – X Hidroxilamina Asn – Gli Quimotr ips ina T ir – X ó Fen – X Hidrólis is Ácida Leve Asp – Pro Proteasa V8 Glu – X (excepto Glu – Lis ) Proteasa Acida Asp – X ó Glu - X


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Cuestionario

1. Cuál de los métodos existentes actualmente es más apropiado para llevar a cabo el secuenciamiento de aminoácidos? Justifique su respuesta.

2. Porqué la Tripsina digiere cualquier enlace peptídico que sigue a los residuos de Arginina y Lisina, excepto cuando están unidas a Prolina?

3. Sólo 17 aminoácidos sobreviven intactos a la hidrólisis ácida, cuando se necesita saber la composición de residuos de un péptido. Cuáles son los tres aminoácidos que desaparecen y porqué?

4. Mencione las ventajas y desventajas comparativas entre los métodos para determinar la secuencia de Sanger, Edman y el uso de la Carboxipeptidasa.

5. En qué consiste la espectrometría de masas de ionización por electrospray, y cuál es su importancia en la determinación de la secuencia de aminoácidos?


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9 Estructura Secundaria, Espacial y Dominios

A pesar del gran avance en la Bioquímica, existe aún la necesidad de describir y

comprender la función de muchas proteinas en mas detalle del que se ha conseguido hasta ahora. Aunque la función de las proteinas es determinada con mayor precisión experimentalmente a través de diferentes aproximaciones, puede muchas veces ser obtenida mediante predicción computacional, lo cual se consigue principalmente por (1) similaridad en composición y orden de los aminoácidos que los componen (secuencias); (2) composición y orden de elementos super- secundarios (motivos y dominios); y (3) similaridad en plegamiento estructural en el espacio. Estas tres aproximaciones consiguen, con diferentes grados de precisión, describir la función y relaciones de una proteina dada, lo que empleando las metodologías convencionales ocuparía grandes recursos, equipamiento y mucho más tiempo requerido. Experimento I Objetivos:

a) Analizar las composiciones y propensidades en la estructura secundaria. b) Aplicar las metodologías empleadas para determinar la estructura secundaria de

una proteina. Teoría:

La estructura secundaria es la organización espacial local del esqueleto polipeptídico sin considerar sus conformaciones de cadenas laterales. Consiste de regularidades de plegamientos locales mantenidos por puentes de hidrógeno, y se subdivide tradicionalmente en tres clases: hélices alfa, hojas beta, y giros que representan a todo el resto. En las hélices alfa, la “columna vertebral” de puentes de hidrógeno une el primer y el quinto residuo repetitivamente, mientras que en las hojas beta los mismos enlaces unen dos segmentos de secuencia, ya sea paralela- o antiparalelamente. La estructura secundaria puede ser sensible a cambios de un solo aminoácido y depende tanto de interacciones locales, como de interacciones de amplio rango. En el método de Chou y Fasman, se asigna a cada residuo de aminoácido una propensidad de formar helices alfa u hojas beta, las cuales luego son analizadas junto a sus vecinos mediante una serie de reglas empíricas, basadas en estadísticas obtenidas a partir de estructuras espaciales previamente observadas in vitro. Procedimiento

1. Para una secuencia de aminoácidos dada de un polipéptido, se asigna cada residuo a una propensidad dada, según la tabla siguiente:

P- alfa P- beta P- giro Clase Glu Q 1.51 0.37 0.74 Ha, Bb Met M 1.45 1.05 0.60 Ha Ala A 1.42 0.83 0.66 Ha Leu L 1.21 1.30 0.59 Ha


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Lis K 1.16 0.74 1.01 ha Fen F 1.13 1.38 0.60 hb Gln E 1.11 1.10 0.98 ha Trp W 1.08 1.37 0.96 hb Ile I 1.08 1.60 0.47 Hb Val V 1.06 1.70 0.50 Hb Asp D 1.01 0.54 1.46 Bb His H 1.00 0.87 0.95 Arg R 0.98 0.93 0.95 Tre T 0.83 1.19 0.96 hb Ser S 0.77 0.75 1.43 Cis C 0.70 1.19 1.19 hb Tir Y 0.69 1.47 1.14 Hb

Asn N 0.67 0.89 1.56 Pro P 0.57 0.55 1.52 Ba, Bb Gli G 0.57 0.75 1.56 Ba

2. Se identifican los sitios de nucleación de helices alfa (Ha) o de hojas beta (Hb). 3. Se extienden las regiones de nucleación en ambas direcciones hasta encontrar un

tetrapeptido con una propensidad de al menos 1.00 (uno) para alfa o beta, según las sumatorias de la tabla de propensidades

4. Una región será asignada como hélice alfa si su propensidad de alfa es mayor que de beta, tiene una longitud de al menos seis aminoacidos, y no contiene prolinas.

5. Una región será una hoja beta si tiene al menos cinco aminoácidos de longitud y su propensidad de beta es mayor que de alfa.

6. Se establecen regiones de giros a todas aquellas que no fueron asignadas como helices alfa u hojas beta.

Experimento II Objetivos:

c) Estudiar las características estructurales super - secundarias. d) Aplicar las metodologías para describir la funcionalidad de una proteina.

Teoría:

Es clasicamente aceptado de que existe un nivel de organización en las proteinas que sobrepone las categorías clásicas de terciaria y cuaternaria, es decir residuos secuencialmente consecutivos de las cadenas polipeptídicas tienden a plegarse en módulos más o menos compactos llamados dominios. Al respecto, un dominio puede definirse como parte de una proteina que puede plegarse independientemente de las secuencias vecinas, y que además cumple una función independiente. A su vez, los dominios presentan composiciones características llamadas motivos, o secuencias firma, que los distinguen de manera única. De esta manera, al conocer la secuencia de aminoácidos de una proteina, se puede observar la presencia de uno o más motivos, y por lo tanto encontrar los diferentes dominios que componen a la proteina analizada. Esto es de vital interés en la Bioquímica, pues es


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universalmente aceptado que cada dominio cumple una función diferente, y el conjunto de dominios otorga la función completa a la proteina. Procedimiento

1. Ubicarse en el URL del programa Panal (http://mgd.ahc.umn.edu/panal) 2. Colocar la secuencia a estudiar en el formulario, y enviarlo pulsando el botón

apropiado 3. Guardar el documento HTML generado, con especial énfasis en la imagen que

contiene una representación grafica de los dominios (archivo PNG) 4. Observar los dominios encontrados, y en base a ellos, describir la función de la

proteina completa. (Crédito extra: identifique la proteina). Experimento III Objetivos:

e) Estudiar las propiedades del plegamiento espacial de las macromoléculas. f) Aplicar las metodologías empleadas para formular la estructura espacial.

Teoría:

A causa de las dificultades técnicas en la dilucidación de la estructura espacial mediante cristalografía de rayos X o por resonancia magnética nuclear (NMR), son pocas las estructuras conocidas y depositadas en los registros internacionales. Por lo tanto no es de sorprender que exista un gran interés en las aproximaciones teóricas y predictivas para la determinación de estructuras. Hasta la fecha, solo el modelamiento comparativo, una forma de extrapolación estructural, ha probado ser valioso y confiable como para producir modelos útiles. Estos programas cuentan además con la ventaja de estar disponibles libremente via la Internet, desde donde pueden ser utilizados y consultados. Procedimiento

1. Ubicarse en la web de Swiss Model (URL:http://www.expasy.ch/swissmod/) 2. Escoger el modo First Approach para modelar la estructura por primera vez 3. Ingrese su nombre, e-mail a donde se enviará el resultado del modelamiento, y un

nombre para el modelo enviado 4. Ingrese la secuencia en formato simple en Provide a sequence... 5. En Results options..., escoger el modo breve (Short mode); luego en Swiss Model

server can forward..., escoger “ Do not forward” para ambos casos 6. Click en “ Send request” para iniciar el modelamiento. La estructura espacial

resultante llegará al e-mail que se indicó, y podrá visualizarse con el programa RasMol.

Cuestionario

1. ¿Cuáles son los principales tipos de plegamientos super- secundarios?. 2. ¿Qué tipo de estructura secundaria predomina en los dominios integrales de

membrana?. 3. ¿Cuáles dominios están presentes en la enzima Hexoquinasa, y cuál es la relación


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de ellos con la función de la proteina completa ? 4. ¿Cuáles otras definiciones de motivos y dominios existen? Explique. 5. Explique con un ejemplo de aplicación porqué dos proteinas con igual composición

y secuencia pero con diferente plegamiento espacial, cumplan diferentes funciones. Bibliografía

1. Doolittle, R.F. 1995. The multiplicity of domains in proteins. Ann Rev Biochem 64:287

2. Silverstein, K.A.T. 2000. PANAL: an integrated resource for protein sequence analysis. Bioinformatics 16(12):1157

3. Chou, P.Y., y G.D. Fasman. 1978. Empirical conformations of protein conformation. Ann Rev Biochem 47:251

4. Sayle, R.A., y E.J. Milner-White. 1995. RASMOL: biomolecular graphics for all. Trends Biochem Sci 20:374

5. Richardson, D.C., y J.S. Richardson. 2002. Teaching molecular 3D literacy. Biochem Mol Biol Educ 30(1):21

6. Salter, H. 1998. Teaching bioinformatics. Biochem Educ 26:3 7. Kaspar, R.L. 2002. Integrating internet assignments into a Biochemistry /

Molecular Biology laboratory course. Biochem Mol Biol Educ 30(1):36 8. Guex, N., et al. 1999. Protein modelling for all. Trends Biochem Sci 24:364


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10 Cinética Enzimática Experimento I: Velocidad inicial Objetivos:

a)Extracción parcial de la enzima Fosfatasa Alcalina del intestino de ratón. b)Definir las condiciones del sistema enzimático y medir la actividad enzimática

(velocidad inicial). Teoría.- La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparición del substrato o aparición del producto de la reacción. Para ello la enzima es incubada con el substrato bajo condiciones cuidadosamente controladas y se sacan alícuotas a intervalos de tiempo para ser analizadas. Debe considerarse además controles para corregir los errores que se presentan debido a reacciones químicas espontáneas no específicas ni catalizadas por la enzima.

La Fosfatasa Alcalina (EC. 3.1.3.1) es una enzima que se encuentra en hueso, riñón, hígado e intestino, cuyo pH óptimo esta entre 9 y 10. Esta enzima actúa sobre los ésteres fosfóricos liberando fosfato inorgánico. Para su determinación se usa como substrato el p-nitrofenolfostato (p-NFF), siendo el producto liberado el p-nitrofenol (p-NF), el cual en solución alcalina puede ser cuantificado entre 390 - 420 nm.

El estudio "in vitro" implica, sin embargo, aislar y purificar aunque sea parcialmente la enzima y posteriormente analizar individualmente las variables que influyen en su actividad. Para todo este proceso es indispensable fijar inicialmente en forma tentativa las condiciones experimentales en que se realizará el ensayo enzimático, tomando en consideración todos los conocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la enzima en estudio. De este modo se debe elegir un pH, una temperatura y un tiempo de incubación compatibles con la naturaleza proteica de la enzima, condiciones que deben ser en lo posible lo más semejantes a las del medio en el cual la enzima actúa "in vivo". Además se debe procurar que las concentraciones de la solución amortiguadora del pH que se use en el medio de incubación, garanticen la estabilidad del pH elegido durante el lapso de observación y que la concentración del substrato sea lo suficientemente alta para mantener la saturación de la enzima, mientras dure el experimento. Materiales y Reactivos

1. Amortiguador glicil-glicina 0.1 mmol/L, con 1 mmol de Mg++ (pH 10.5) 2. Solución de substrato (p-nitrofenilfosfato de sodio) de 0.01M 3. Estándar: solución de p-nitrofenol 0.5 mmol/ 4. Solución de hidróxido de sodio 20 mmol/L 5. Solución de sucrosa 0.25 M. 6. Muestra biológica


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7. Homogenizadores con embolo de Teflón 8. Tubos de prueba y pipetas 9. Centrífuga clínica 10. Espectrofotómetro o fotocolorímetro 11. Baño de maría a 37 °C

Extracción de la Enzima 1. Sacrifique por decapitación 6 ratones y extraer 10 cm. del intestino delgado. 2. Lavar con agua corriente, sin maltratar la mucosa. 3. Coloque el tejido sobre una placa de vidrio fría y cuidadosamente extraer la mucosa

intestinal. 4. Poner la muestra extraída en un erlenmeyer frío y agregar la solución de sucrosa 0.25 M,

hasta obtener una dilución de tejido del 10 % (w/v). 5. Centrifugue a 2000 g. por 15 min. a 4°C y separar el sobrenadante (guarda una alícuota

en frío). 6. Luego centrifugue el sobrenadante a 7000 g. por 15 min. a 4°C. Separar el sobrenadante y

guardarlo en frío. 7. Resuspender el precipitado obtenido (pelet) con el amortiguador de trabajo en 10 ml;

conserve en frío. Procedimiento

Reactivos Blanco Muestra Buffer glicina (ml) 5,00 5,00 Agua Destilada (ml) 7,50 7,50 Substrato (ml) 5,00 5,00 Incubar a 37 °C Enzima (ml) --- 2,50

♦Inmediatamente mezcle y saque una alícuota de 3.5 ml del tubo muestra y 3.00 ml del tubo blanco. Agregue a cada tubo 5 ml de NaOH 20 mmol/L.

♦Coloque 0.50 ml de enzima al tubo blanco y leer en el espectrofotómetro (390 - 420 nm). Este punto corresponde al tiempo cero (t=0).

♦Proceda de igual forma al minuto (t = 2), a los dos minutos (t= 4 min.), a los cuatro minutos (t= 6 min.) y a los ocho minutos (t= 8 min.).

Curva estándar de p-nitrofenol Reactivos Bl. 1 2 3 4 5 6 p-NFF 0.5 mmol/L (ml) 0,00 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 NaOH 0.1 N (ml) 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 nmol p-NF


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Experimento II.- Concentración de Substrato

Objetivo:

a) Conocer como la concentración de substrato puede modificar la velocidad de reacción y calcular la constante de Michaelis de una enzima.

Teoría.-

Si se analiza la influencia de la concentración del substrato, manteniendo la concentración de la enzima constante, y se dibuja una gráfica con los resultados, se obtiene una hipérbola rectangular. Esta curva está expresada matemáticamente por la ecuación de Michaelis:

Vmax Vmax S v = -------------- ó v = -------------

1 + Km. / S S + Km. donde v es la velocidad de la reacción, Vmax es la velocidad máxima, S es la concentración molar de substrato y Km. es una constante equivalente a la concentración de substrato con la que se obtiene la mitad de velocidad máxima. Suele usarse la expresión de Lineweaver-Burk, que es la reciproca de la ecuación de Michaelis y da una línea recta. 1 Km. 1 1 --- = -------. ---- + ---- v Vmax S V Procedimiento:

♦Se montará el siguiente set de trabajo, donde se prepararan junto con los tubos muestra que está en la tabla, tubos semejantes que serán los blancos, a los que no se les adiciona la enzima, hasta detener la reacción con el NaOH 20 mmol/L.

Reactivos 1 2 3 4 5 6 Buffer glicina (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Agua destilada (ml) 1,90 1,80 1,60 1,20 0,80 0,40 Substrato p-NFF (ml) 0,10 0,20 0,40 0,80 1,20 1,60 Preparar tubos Blancos para cada uno. Incubar 5 minutos a 37 °C

Enzima (ml) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

♦Mezcle e incubar 2 minutos. ♦Luego adicione a cada tubo (muestras y blancos) 5 ml de NaOH 20 mmol/L ♦Finalmente agregue a cada tubo blanco 0.50 ml de la enzima. Lea entre 390 - 420 nm.


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Experimento III.- Concentración de la Enzima Objetivo:

a)Conocer como la concentración de la enzima puede modificar la velocidad de reacción.

Procedimiento:


Reactivos 1 2 3 4 5 6 Buffer glicina (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Agua destilada (ml) 1,40 1,30 1,00 0,70 0,50 0,00 Substrato p-NFF (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Hacer Blancos para cada tubo Incubar a 37°C

Enzima (ml) 0,10 0,20 0,50 0,80 1,00 1,50

♦Mezclar e incubar 2 minutos. ♦Luego adicione a cada tubo (muestras y blancos) 5 ml de NaOH 20 mmol/L. ♦Finalmente agregue a cada tubo blanco 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1.0 y 1.5 ml de la enzima.

Leer entre 390 - 420 nm. Experimento IV.- Efecto del pH Objetivo: a) Conocer como la variación de pH puede modificar la velocidad de reacción. Teoría.-

El efecto de pH en la cinética enzimática es debido a cambios en el estado de ionización de los componentes del sistema enzimático (enzima libre, complejo enzima - substrato, substrato). Es posible que la enzima reaccione con una sólo especie iónica de un substrato ionizable o tenga diferente afinidad con las diferentes especies iónicas del substrato.

Por su carácter de proteína posee numerosos grupos ionizables. Si se varia la ionización de estos grupos en el nivel del sitio activo o en algún punto lejano, para que de alguna manera altere el sitio activo, se afecta el tipo de unión y la estabilidad del complejo enzima - substrato o la actividad catalítica misma.

Los efectos del pH sobre la actividad enzimática implican modificación del Km o de la velocidad máxima de la reacción o de ambos.


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Procedimiento:


Reactivos 1 2 3 4 5 6 Buffer glicina (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 pH 5,0 7,5 8,5 9,5 10,5 12 Agua destilada (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Substrato (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Preparar tubos Blancos, para cada tubo Incubar a 37°C

Enzima (ml) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

♦Mezclar e incubar 2 minutos. ♦Luego adicione a cada tubo (muestras y blancos) 5 ml de NaOH 20 mmol/L ♦Finalmente agregue a cada tubo blanco 0.5 de la enzima. Leer entre 390 - 420 nm.

Experimento V.- Efecto de la Temperatura Objetivo: a) Conocer como la variación de temperatura puede modificar la velocidad de

reacción. Procedimiento:


Reactivos 1 2 3 4 Buffer glicina (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 Agua destilada (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 Substrato (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00 Preparar tubos blancos para cada tubo Incubar a

9°C 20°C 37°C 60°C

Enzima (ml) 0,50 0,50 0,50 0,50

♦Mezclar e incubar 2 minutos. ♦Luego adicione a cada tubo (muestras y blancos) 5 ml de NaOH 20 mmol/L ♦Finalmente agregue a cada tubo blanco 0.5 de la enzima. Leer entre 390 - 420 nm.


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Cuestionario

1. Realice sus anotaciones y haga sus respectivos cálculos. 2. Para cada experimento ejecute su respectiva gráfica. 3. Comente sus resultados. 4. Grafique las absorbancias vs. las concentraciones de p-NF. 5. Grafique la velocidad (concentración de producto) vs. tiempo. 6. Identifique a que clase de enzimas pertenecen las fosfatasas. ¿ cuántas tipos de

fosfatasas se conocen y en que se diferencian. 7. En la leche fresca Ud. encuentra fosfatasas, ¿de qué tipo es y cuál es su función en la

leche? 8. En los tubérculos, ¿cuál tipo de fosfatasa esta presente, en que parte se localiza y

cual sería su función?


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11 Cromatografía Objetivo: a) Conocer las diferentes técnicas de cromatografías y determinar su uso práctica

dentro del campo de la biología. Teoría.-

La separación de la moléculas en la cromatografia, se basa en: Tenemos dos fases denominadas fase estacionaria y fase móvil. En este sistema las moléculas se separan unas de otras según su afinidad a estas dos fases. Por ejemplo si la molécula tiene alta afinidad por la fase estacionaria, esta se quedará más tiempo detenida que otra molécula que no interactúa de ninguna forma con el soporte. Estos tipos de interacciones pueden ser: electrostáticos, hidrofóbicos, de difusión y de afinidad.

Cromatografía en Capa Fina

Esta técnica se usa generalmente en la separación e identificación de pequeñas cantidades de muestras biológicas.

En una placa de vidrio se cubre con una delgada capa uniforme del adsorbente (soporte), los cuales necesitan un agente ligando como el sulfato de calcio para facilitar la adherencia a la placa de vidrio. El espesor normal que se espera obtener es de unos 0.25 mm. cuando se utilizan las placas para hacer análisis cualitativos. Si se trata de trabajos preparativos se debe usar láminas con un espesor de 0,5 mm.

Las placas de Silica se utilizan para la separación y caracterización de aminoácidos, alcaloides, azúcares, ácidos grasos, aceites esenciales, terpenoides y esteroides. Material y Reactivos

1. Silica Gel. 2. Láminas de vidrio 3. Láminas porta objetos. 4. Envase con tapa (Cámara cromatográfica) 5. Muestra: Flores y frutos de color púrpura. 6. HCl metanólico 1%

Eluyentes:

1. n-butanol: ácido acético glacial: agua (60:15:25) 2. HCl 1 N 3. Acido acético glacial: HCl : Agua (60:6:20)


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Procedimiento

1. Preparación de la Placa

a. Se mezcla el adsorbente con agua, hasta que la suspensión sea homogénea y este libre de grumos y aire.

b. La mezcla que se usa como adsorbente se coloca sobre una lámina de vidrio de ha sido previamente lavada con mezcla sulfocrómica.

c. Se deja secar durante 15 minutos en una estufa a 100°C ó a 120oC. La temperatura elimina la humedad del adsobente y lo activa de esta forma.

d. Las láminas portaobjetos cuidadosamente lavadas se embadurnan con la suspensión sumergiéndolas en una cubeta que las contiene.

2. Preparación y Aplicación de la muestra

a. La muestra (1 gr. de pétalos) se coloca en un tubo pequeño y se agrega 5 ml de HCl metanólico (1%). Se muele hasta que el líquido quede fuertemente coloreado. Utilice el sobrenadante para la Cromatografía.

b. Coloque la muestra en la superficie del silicagel, forme un diámetro de 1 a 5 mm. con una micropipeta (colocar 10 - 100 ul de muestra).

c. Las manchas deben tener un diámetro de unos 3 mm y estar separadas por una distancia de 1 ó 2 centímetros

3. Desarrollo del Cromatograma

a. Las placas de vidrio se colocan en la cuba cromatográfica cuidando que le origen

no sea tocado por el solvente. b. Para evitar que el solvente que ésta saturando la cámara se evapore es necesario

cerrar las tapas herméticamente, si es posible embadurnándolas con Silica o grasa. c. Después del desarrollo de la cromatografía se remueven las placas, se marca el

frente de corrida y se secan en la estufa a 110°C.

Cromatografía en Columna

Fundamento.- La cromatografia en columna es una técnica muy en boga que se usa para separar o identificar compuestos de interés biológico de una mezcla. Se emplea un medio a través del cual fluye un líquido provocando una migración diferencial de los compuestos que se aplican. Los solutos se distribuyen entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Cromatografía de Adsorción

Fundamento.- Clásicamente un adsorbente se define como un sólido que tiene la capacidad de mantener moléculas en su superficie sobre todo cuando son porosos y está finamente dividido, la atracción de moléculas no implica fuerzas electrostáticas. La adsorción puede ser bastante específica de modo que un soluto puede ser adsorbido selectivamente de una mezcla. La separación de componentes por éste método depende de las diferencias en el


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grado de adsorción y de la solubilidad. Naturalmente, estas características son dependientes de la estructura molecular del compuesto.

La separación de compuestos de una mezcla se realiza en un tubo de vidrio previamente empacado con el medio de soporte y a través del cual se eluye el solvente adecuado. Las sustancias con coeficientes de distribución efectivas más altas se mueven mucho más rápido, por lo tanto, eluyen primero respecto a las de menor coeficiente de distribución efectiva. En la mayoría de los casos los compuestos a separarse no son coloreados por lo tanto es necesario colectar fracciones a partir de la base de la columna.

Un factor importante se refiere al buen empaque de la columna. Existen varios tipos de adsorbentes: ácido sílico, oxido de aluminio, carbonato de calcio, oxido de magnesio. etc. Es necesario saber que tipo de compuestos se va ha cromatografiar ya que de esto depende el tipo de adsorbente y eluyente que se utilice. Algunos adsorbentes pueden captar agua atmosférica durante su almacenamiento lo que puede alterar sus condiciones de adsorción, por ello es necesario calentar el adsorbente 110°C para activarlo. Materiales y Reactivos

1. Sephadex G-25 2. Tubo de vidrio ( 1 x 45 cm) 3. Buffer Fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2 4. Reservorio de Buffer con mangueras 5. Muestra: Azul de dextrano 10mg/ml y rojo de fenol 0.5%

Procedimiento

1. Se prepara una suspención de Sephadex G-25 en buffer fosfato de potasio 50 mM, pH 7.2; se vierte una vez equilibrada en el tubo (1 x 45 cm) dejando una capa de buffer de elución.

2. Conectar el reservorio que tiene el mismo buffer (de elución) y se deja equilibrar la columna.

3. Se destapa el tubo y se aplica la muestra en la parte superior del Sephadex G-25, lavando con el buffer para eliminar las trazas de muestra que aún queden en las paredes de la columna.

4. Se agrega un exceso de buffer y se conecta al reservorio. 5. Se colectan fracciones de 1,00 ml por tubo. El tubo con mayor intensidad de color

representa el volumen de exclusión de la columna (Vo o volumen muerto). Se determina con más exactitud leyendo las fracciones en un espectrofotometro a 620 o 260 nm.

6. La posición del pico correspondiente a la elución del rojo de fenol también se realiza visualmente.

Cuestionario:

1. ¿Qué es el Rf y el Rg? ¿Cuándo se utiliza cada uno? 2. ¿Cuál es el Rf de los pigmentos vegetales que ha logrado caracterizar? 3. ¿Cuál es Volumen de elución del rojo de fenol? 4. ¿Cuál es Volumen muerto de la columna?


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5. Si se utiliza otra batería de solventes ¿se obtendrá el mismo Rf? Explique. 6. Si quisiera concentrar su muestra porque esta muy diluida, ¿podría utilizar la

Cromatografía para concentrarla? Explique. 7. Utilizando la Cromatografía puede cuantificar la concentración de sus muestras.

Explique 8. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la Cromatografía en papel?


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12 Determinación de Glucosa Objetivo:

a)Obtención de las muestras y procesamiento para cuantificar la concentración de glucosa en sangre y en algunas muestras biológicas.

b)Manejo del Método de Somogyi y Nelson Teoría.- La concentración de glucosa en la sangre fluctúa entre 80 y 120 mg/dl en el hombre normal en ayunas. Para la obtención de la muestra se recomienda usar como anticoagulante al fluoruro de sodio que, además de impedir la coagulación por precipitación del ion calcio, impide la glucólisis por inhibición de la enolasa. Es necesario eliminar previamente las proteínas para evitar que interfieran en la determinación. Debido a la gran difusibilidad de la glucosa, no hay diferencia significativa entre las mediciones efectuadas en sangre total y en plasma.

Los métodos usuales para la determinación de glucosa se basan en su mayoría, en la capacidad de la glucosa de reducir ciertos iones metálicos en soluciones alcalinas calientes. En el método de Somogyi y Nelson, la muestra que contiene glucosa actúa sobre el ion cúprico, reduciéndolo a cuproso. El ion cuproso se trata inmediatamente con el reactivo arseno – molibdíco, que al reducirse a subóxido de molibdeno, da color azul proporcional a la cantidad de glucosa presente, de acuerdo con la Ley de Beer. Con este método se puede medir desde 0.01 a 0.20 mg aproximadamente de glucosa o de otro azúcar de equivalente poder reductor. Material y Reactivos:

1. Reactivo de Somogyi 2. Reactivo de Nelson 3. Hidróxido de bario [Ba(OH)2.8H2O) solución al 4.5% (0.3N). 4. Sulfato de Zinc (ZnSO4.7H2O) solución al 5%. 5. Estándar de Glucosa: Solución 2.0 g/l. 6. Tubos y pipetas 7. Espectrofotómetro

Procedimiento: 1. Desproteinización de las Muestras:

Como habitualmente se emplea el método de Somogyi - Nelson para determinar azúcares en líquidos orgánicos que contienen proteínas y éstas interfieren en el procedimiento analítico, es necesario desproteinizar las muestras.

Para efectuar la desproteinización se usa el hidróxido de bario y sulfato de Zinc que tienen la ventaja de dar un filtrado libre de otras sustancias reductoras no glucosídicos. En la sangre normal, por ejemplo, estas sustancias están constituidas esencialmente por glutatión y


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ácido glucorónico, los cuales se encuentran principalmente en los eritrocitos.

H2O destilada 7 ml. Muestra 1 ml. Mezclar Hidróxido de Bario 1 ml. Sulfato de Zinc 1 ml.

Mezclar, esperar 5 minutos y filtrar o centrifugar. El filtrado corresponde a una dilución al 1:10 de la muestra.

2. Determinación de la Concentración de Glucosa en la Muestra:

Reactivos Blanco Estándar Muestra Muestra desproteinizada (ml) --- --- 1.00 Estándar diluido 1/10 (ml) --- 1.00 --- Agua destilada (ml) 1.00 --- --- Reactivo de Somogyi (ml) 1.00 1.00 1.00 Hervir por 10 minutos. Enfríe en chorro de agua fría Reactivo de Nelson (ml) 1.00 1.00 1.00 Mezclar Agua destilada (ml) 1.00 1.00 1.00

♦Mezclar. Reposar por 10 minutos. ♦Leer a 540 nm. frente a sus blancos apropiados. ♦Si las condiciones lo permiten realice una curva de calibración para glucosa.

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué otros métodos conoce para determinar glucosa sanguínea? Mencione el fundamento de una.

2. ¿ Cuáles son las ventajas y desventajas de este método? 3. Mencione otras formas de desproteinizar la sangre. ¿Qué otros anticoagulantes se

usan para determinar glucosa? 4. Anote sus resultados, realice sus cálculos, grafique. 5. Si realizó la curva, diferencie sus resultados encontrados entre la gráfica y los

cálculos efectuados con su estándar. 6. Si la concentración de azúcar en su muestra es muy alta. Indique los pasos a seguir

para poder aplicar este método. 7. ¿Existen métodos enzimáticos para cuantificar azúcares cómo: lactosa, sacarosa,

maltosa? Mencione el fundamento de por lo menos dos. 8. Indique un protocolo del tratamiento que se debe realizar en una muestra de

alimento, para cuantificarle la concentración de azúcares, por este método.


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13 Transporte de Electrones Objetivos:

a)Usar el azul de metileno como indicador del proceso de oxidación, es decir como aceptor final de hidrógenos.

b)Determinar la actividad Enzimática de la Succínico Deshidrogenasa, en un extracto de hígado, riñón o corazón.

c)Estudiar algunos factores que afectan el transporte de electrones, siguiendo esta vía.

Teoría.- La Succínico Deshidrogenasa cataliza la oxidación del ácido Succínico a ácido Fumárico.

HOOC - CH2 - CH2 - COOH <===> HOOC - CH = CH - COOH + 2H+

La Succínico Deshidrogenasa es una flavoproteína que no requiere coenzima

nicotinamida y que se encuentra en las mitocondrias. Además de formar parte del ciclo de Krebs es capaz de reducir directamente a la coenzima Q de la cadena respiratoria. Es altamente específica para el ácido succínico y es inhibida competitivamente por numerosos ácidos dicarboxílicos, en especial, málico y oxaloacético. Es una típica "enzima -SH"; inhibida no competitivamente por arsenicales trivalentes, monoyodoacetato, metales pesados y aún por el oxígeno. Estos inhibidores oxidan los grupos sulfihidrilos o forman compuestos coovalentes con ellos (Asmercapturos, derivados S-alquilos, sales de metales pesados).

Fundamento.- El azul de metileno es un pigmento de color azul que se decolora al reducirse. El NADH2 puede reducirlo debido a la presencia en el extracto de tejido de una diaforasa, que es una flavoproteína capaz de catalizar esa reacción y corresponde al Lipoato Deshidrogenasa; el potencial redox del azul de metileno es + 0.011 voltios.

La reacción deben hacerse en anaerobiosis, pues el azul de metileno reducido es autooxidable, es decir, puede ser oxidado espontáneamente por medio del oxígeno molecular. Para conseguir la anaerobiosis se utilizan los tubos de Thumberg, en los cuales se puede hacer fácilmente el vacío y reemplazar el aire por un gas inerte (nitrógeno). Una anaerobiosis relativa se puede conseguir mediante una capa de vaselina líquida, que aísla el medio de incubación del aire. Materiales y Reactivos:

1. Fosfato de sodio 0.15 M a pH 7.0 2. Succinato de sodio 0.10 M 3. Malonato de sodio 0.10 M 4. Azul de metileno 0.02 % 5. Cianuro de potasio 0.08 M 6. Cloruro de mercurio 0.10 M 7. Vaselina líquida 8. Arena 9. Tubos y pipetas


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Procedimiento: 1. Preparación de la enzima

a. Se usarán hígados, riñones o corazones de ratas, órganos que se guardarán congelados. Cortar los órganos en pequeños trozos y colocarlos en un mortero.

b. Agregar aproximadamente un gramo de arena y 5 ml de fosfato de sodio pH 7,0. c. Moler hasta obtener una pasta fina y agregar otros 5 ml. de fosfato. Dejar esta mezcla

a la temperatura ambiente por unos 15 minutos, revolviendo de vez en cuando para destruir substratos endógenos.

d. Vaciar el contenido a un tubo de centrifuga y centrifugar a baja velocidad durante unos 5 minutos para sedimentar la arena, núcleos y células enteras que haya quedado sin destruir. Conservar en hielo el sobrenadante.

2. Ensayo de la Succínico Deshidrogenasa.- Determinar la actividad de la Succínico

Deshidrogenasa, usando los controles adecuados para un sistema completo: Succinato de sodio 0.020 M; azul de metileno 0.004%; 1 ml de preparación enzimática para un volumen final de la mezcla de 5 ml. Es recomendable colocar los componentes en el orden indicado. Inmediatamente después de colocar el sistema, mezclar y agregar aproximadamente 2 ml de vaselina líquida al tubo, no usar pipeta.

La actividad enzimática se reconocer por la decoloración del azul de metileno. Cada grupo de trabajo diseñará sus propios experimentos, que permitan responderlas preguntas que se han formulado con respecto a los blancos necesarios y a los factores que puedan influir en la reacción.

Cuestionario

1. Escriba la ecuación del azul de metileno 2. Use la magnitud de decoloración del azul de metileno como índice de la actividad

enzimática. Evalúe semi - cuantitativamente el efecto de los diversos factores estudiados.

3. ¿Qué significado energético para la fosforilación oxidativa tiene el hecho de que la Deshidrogenasa Succínico no requiere NAD?

4. ¿Qué diferencias existen entre actividad succínico deshidrogenasa y succínico oxidasa?

5. ¿Cuál es el fundamento del método manométrico de Warburg? ¿Cómo se podría medir la respiración de un tejido mediante el método de Warburg?

6. Mencione tres enzimas flavínicas, indicando las reacciones que catalizan. 7. ¿Cuál es la característica espectrofotométrica que permite distinguir al NAD reducido

del oxidado? 8. ¿Qué efecto tiene el KCN sobre la succinico deshidrogenasa? ¿Cómo lo demostraría?


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14 Determinación de Lípidos Totales Objetivo:

a)Familiarizar al alumno con esta técnica y ver su posible adaptación en otro tipo de muestras biológicas.

Teoría.-

Los lípidos en el torrente sanguíneo pueden encontrarse ya sea libre o ligado a las proteínas que los transportan. En general se encuentran triacilgliceroles, fosfolípidos, colesterol y ácidos grasos no esterificados.

El método de la vainillina, se fundamenta en que el suero sanguíneo es calentado con ácido sulfúrico concentrado y enseguida tratado con reactivo ácido fosfórico - vainillina. En la reacción sulfo-fosfo-vainillina se produce una coloración rosa que puede ser medida en el espectrofotómetro a 530 nm. La intensidad de esta coloración es directamente proporcional a la concentración de lípidos presentes en la muestra, siguiendo la ley de Beer. Materiales y Reactivos

1. Tubos de prueba 2. Pipetas de 0.1, 2.0, 5.0 ml 3. Acido sulfúrico concentrado 4. Vainillina Purísima al 0.6% en solución acuosa 5. Solución de vainillina al 10% en ácido ortofosfórico al 85% 6. Estándar de lípidos 10 g/L 7. Muestra biológica: suero, plasma o tejido 8. Tubos y pipetas 9. Espectrofotómetro 10. Baño de maría a 37°C 11. Baño de agua hirviente a 100°C

Procedimiento

Reactivos Estándar Muestra Estándar (µl) 20 --- Muestra (µl) --- 20 Acido sulfúrico (ml) 1,00 1,00

♦Agitar para homogeneizar. Coloque en baño maría hirviente durante 10 minutos. Enfríe.

♦Luego en tres tubos de prueba colocar las siguientes cantidades de la mezcla anterior.

Reactivos Blanco Estándar Muestra Acido Sulfúrico (µl) 100 --- --- Mezcla de estándar (µl) --- 100 --- Mezcla de Muestra (µl) --- --- 100 Reactivo Vainillin-fosfórico (ml) 2,50 2,50 2,50


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♦Mezclar y dejar en reposo durante 10 minutos. ♦Leer en espectrofotómetro a 530 nm (500 - 550 nm)

Cálculos: Lípidos Totales (g/L) = Am / A st. x 0.6 Si la muestra tiene alto contenido de lípidos utilizar 0.05 ml de la muestra. Valores Normales: Lípidos totales en suero 4 a 8 g/L Cuestionario

1. ¿Podría usted adaptar esta técnica, para determinar la cantidad de lípidos en una muestra de tejido de cerebro? Fundamente su respuesta.

2. Si su muestra es muy pobre en lípidos, podría usted utilizar esta técnica. Fundamente su respuesta.

3. ¿Qué otros métodos existen para determinar lípidos totales?. Mencione sus fundamentos.

4. Realice sus cálculos respectivos. 5. ¿Cuáles son los componentes de los lípidos totales?. En los tejidos ¿cuál de sus

componentes se encuentra en mayor proporción? 6. ¿Cuál es la importancia en el diagnóstico clínico del perfil lipídico? 7. ¿Cuál es la diferencia entre las grasas animales y vegetales? 8. En general los mamíferos lactantes no deben consumir grasas. ¿Cuál sería el

impedimento desde el punto del metabolismo?


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15 Determinación de Colesterol Objetivo

a) Dosificar del colesterol en el suero sanguíneo u otra muestra biológica, según el método de Pearson.

Teoría.-

Los esteroides se encuentran ampliamente distribuidos en los animales superiores donde ejecutan gran cantidad de funciones. Por ejemplo, el colesterol que es el más abundante de los esteroles se encuentra en muchas membranas celulares de los animales, y sirve además como precursor importante de muchas hormonas esteroideas, sales biliares.

El anhídrido acético, el ácido sulfúrico y el ácido p-toluensulfónico reacciona con el colesterol en solución clorofórmica para producir un color característico azul-verdoso. La naturaleza exacta del cromóforo es desconocida pero la reacción probablemente incluye la esterificación del grupo hidroxilo en posición 3, junto con otros arreglos de la molécula. La intensidad del cromóforo desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de colesterol en la muestra. Material y Reactivos

1. Tubos de prueba y pipetas 2. Acido sulfúrico concentrado 3. Estándar de colesterol: Pesar 200 mg de colesterol y diluir hasta 100 ml con ácido

acético glacial. Guardar en refrigeración. 4. Acido acético glacial 5. Anhídrido acético 6. Solución al 12 % de ácido p-toluensulfónico en ácido acético. 7. Espectrofotómetro 8. Baño de maría 9. Muestra biológica

Procedimiento Usar suero, plasma sanguíneo u otra muestra biológica tratada adecuadamente y preparar el siguiente set de trabajo:

Reactivos Estándar Muestra Blanco Muestra (ml) --- 0.1 --- Estándar (ml) 0.1 --- --- Agua destilada (ml) --- --- 0.1 Acido acético (ml) 0.1 0.1 0.1 p-Toluensulfónico 12% (ml) 0.5 0.5 0.5 Anhídrido Acético (ml) 1.5 1.5 1.5 Mezcla. Reposar 10 minutos en oscuridad Acido Sulfúrico (ml) 0.2 0.2 0.2


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♦Mezclar. Reposar por 15 minutos en oscuridad. Valores Normales en suero tenemos 150 a 200 mg/dl . Aumentando con la edad a partir de los 40 años de 5 a 10 mg cada 5 años y se estabiliza después de los 60 años. Cuestionario

1. ¿Cuál es la importancia de la determinación del colesterol en el hombre? 2. ¿Qué otros métodos conoce ? Mencione el fundamento de alguno. 3. Si encuentra valores elevados de colesterol en sangre, explique las posibles causas. 4. ¿Qué le sugiere el encontrar altas concentraciones de colesterol libre en el tejido

hepático? 5. Se justificaría que la leche materna tenga valores elevados de colesterol. Explique. 6. Explique el transporte de colesterol del tejido adiposo al hígado. 7. ¿Cuál es la importancia del colesterol en las plantas? 8. ¿Qué moléculas pueden derivarse a partir del colesterol?


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16 Transaminación Objetivos:

c) Estudio de la Transaminación en homogeneizado de hígado. d)Aplicación de la técnica en cromatografía en papel.

Teoría.-

La mayor parte de los aminoácidos son substratos para la Transaminación. Las excepciones incluyen a la lisina, treonina y a los aminoácidos cíclicos prolina e hidroxiprolina. La Transaminación no esta restringida a los grupos α-amino; el grupo δ-amino de la ornitina es por ejemplo fácilmente transaminado formando γ-semialdehído de glutamato.

La Transaminación consiste en la transferencia reversible del grupo amino desde un aminoácido hasta un cetoácido, sin que el amoníaco quede libre del medio. El aminoácido que pierde el grupo amino se convierte en un cetoácido y el cetoácido que gana el grupo amino se convierte en el aminoácido respectivo.

Las reacciones de Transaminación tienen como coenzima al piridoxal fosfato. Se encuentran en la mayoría de los tejidos animales. En especial todas las enzimas son específicas para un determinado aminoácido (cetoácido) y el α-cetoglutarato (glutamato). Material y Reactivos

1. α-cetoglutarato de sodio 0.2 M, pH 7.4 2. Piruvato de sodio 0.2 M, pH 7.4 3. Alanina 0.2 M, pH 7.4 4. Glutamato de sodio 0.2 M, pH 7.4 5. Arsenito de sodio 0.1M, pH 7.4 6. Amortiguador de fosfato de sodio 0.05 M, pH 7.4 7. Ninhidrina al 0.2% en alcohol etílico 8. 2,4-dinitrofenilhidrazina semisaturada en HCl 9. Alcohol etílico 95% 10. N-propanol 11. N-butanol 12. Hidróxido de amonio 0.5 M 13. Etanol absoluto 14. Papel Whatman N°1 o placas d silica G 15. Cámaras de cromatografía 16. Baño de maría a 37°C 17. Atomizador 18. Horno a 100°C

Procedimiento

Diseñar un experimento para demostrar la reacción de Transaminación en homogeneizado de hígado. Hacer algunas variaciones que permitan conocer algunas


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características del sistema. Preparación del homogeneizado de hígado

a. Se decapita el animal (rata, ratón), se desangra y extrae rápidamente el hígado, que se coloca sobre hielo molido.

b. Se corta rápidamente la mitad del hígado (unos 3 g) en trocitos y se homogeneiza con 10 ml de solución amortiguadora de fosfato.

c. Centrifugar el homogeneizado a la velocidad máxima de la centrífuga clínica para eliminar células no destruidas, núcleos, y parte de las mitocondrias

d. Vaciar el líquido sobrenadante en un matraz o vaso de precipitado que debe mantenerse en hielo. Esta es la preparación enzimática.

Reacción de Transaminación.- El sistema completo está compuesto por un aminoácido, un cetoácido, la preparación enzimática, Arsenito de sodio y un amortiguador. Esquema de un experimento tipo: α-cetoglutarato de sodio: 0.3 ml; Alanina: 0.3 ml; Arsenito: 0.4 ml; Preparación enzimática: 1.0 ml y amortiguador de fosfato: 1.0 ml. Después de incubar la mezcla durante un cierto tiempo (por ejemplo, 30 minutos a 37°C), detener la reacción agregando 6 ml de alcohol etílico. Centrifugar y vaciar el sobrenadante a un tubo de ensayo. Identificación de los productos de la reacción.- Los productos de la reacción se identificarán por cromatografía en papel. El procedimiento del revelado es diferente según se trate de aminoácidos o cetoácidos. Una vez colocada la muestra de cetoácido en el papel filtro agregar encima de la mancha aproximadamente 0.05 ml de la solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina, siguiendo el mismo procedimiento que se utiliza para colocar las muestras problemas. Al reaccionar la dinitrofenilhidrazina con el cetoácido se produce una hidrazona de color amarillo. Los diferentes cetoácidos dan hidrazonas que migran con un Rf característico. Por lo tanto, los cetoácidos no requieren ningún procedimiento especial para revelarlos después de desarrollado el cromatograma. Los aminoácidos se revelan después de desarrollar el cromatograma, pulverizando el papel con el reactivo de Ninhidrina y calentándolo con aire caliente.

Cuestionario

1. Escriba la ecuación de reacción para las transaminasas 2. Indicar en cada caso los productos que se han identificado de acuerdo a los valores

de Rf encontrados. 3. ¿Qué función cumple el Arsenito de sodio? 4. ¿Porqué se agrega el alcohol después de la incubación? 5. Si en el experimento de Transaminación que usted realiza colocará ácido pirúvico

uniformemente marcado con C14 ¿Qué aminoácidos espera encontrar marcados preferentemente? Fundamente su respuesta.

6. ¿Cómo se interpreta el aumento de actividad de algunas transaminasas del suero sanguíneo que ocurre en algunas afecciones del miocardio y hepáticas?

7. Podría usted cuantificar los productos formados o los reactantes. Explique 8. ¿Todas las células realizan transaminaciones? Explique


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17 Electroforesis Objetivos:

g) Conocimiento de la técnica y sus aplicaciones h) Separar y caracterizar algunas biomoléculas.

Teoría:

La Electroforesis junto con la Cromatografía son los métodos de separación y caracterización de biomoléculas más frecuentemente usado en la investigación bioquímica.

La mayor parte de biomoléculas (proteínas, ácidos nucleicos) son anfolitos que están constituidos por varios grupos ionizables con diferentes pKi, que en conjunto determinan el pI de una proteína, es decir el valor de pH en el cual la suma de las cargas positivas y negativas es igual a cero (no tiene carga eléctrica). Si en condiciones en las que la proteína tiene carga, aplicamos un campo eléctrico sobre ella actuará una fuerza igual a Eq (E = Energía el campo, q = carga de la molécula) que en el vacío provocaría un movimiento acelerado (A):

amqE ⋅=⋅ entonces: m

qEa

⋅=

Donde m = masa de la molécula.

La electroforesis se realiza en un medio determinado (papel, geles de agarosa, poliacrilamida, etc.), éste se opone a una fuerza de rozamiento al movimiento acelerado que llega a neutralizarlo de tal forma que la molécula se mueve en el campo eléctrico con una velocidad constante V .

Esta velocidad constante, en un sistema de electroforesis determinado es específico para cada tipo de molécula y depende principalmente del tamaño y la carga de la molécula (cada molécula estará caracterizada por una V diferente). Así, la electroforesis se asemeja a una carrera de autos que parten al mismo tiempo pero con diferentes velocidades y siguen su ruta sin acelerar: los autos irán alejándose unos de otros. Lo mismo cuando colocamos una muestra en la electroforesis, las moléculas que componen la muestra se irán separando unas de otras durante la corrida. Electroforesis en Agarosa

Se ha convertido en una de las técnicas de rutina más empleada en electroforesis, por ser una matriz económica, de fácil manejo, fácil aplicación de la muestra, rápida separación, buena resolución. El polímero de agarosa, derivado del agar agar, forma una red que sirve de soporte para la migración de las macromoléculas, en cuya ausencia no ocurriría electroforesis.

Materiales y Reactivos

1. Matriz: Gel de agarosa. Voltaje : 60 voltios (5 volts/cm) 2. Buffer Tris – Acetato – EDTA (Tris-Acetato 400 mM, EDTA 20 mM), pH 8.0.-


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Preparar un volumen suficiente de la solución de trabajo, como para el gel y la cámara electroforética, a partir del stock que está diez veces concentrado (10X). La solución stock se prepara de la siguiente manera: Para 500 mL, pesar 24.2 gramos de Tris base; adicionar 5.71 mL de ácido acético glacial para ajustar el pH a 7.4, mas 10 mL de EDTA 0.5M, disolverlos hasta 500 mL con agua destilada. Marcador de corrida: Azul de bromofenol, xylene cyanol

3. Muestra.- 15 ul de colorantes orgánicos Procedimiento

7. Colocar la base del gel sobre la camara electroforetica, y delimitar con cinta masking tape los limites del gel, y luego el peine que marcara los pozos. Vertir la agarosa cuando este lista, y dejar solidificar. Una vez solido, se agrega un poco de Buffer de Corrida TAE 1X, y se retira el peine. Lo siguiente sera colocar los electrodos, ayudandose de cinta masking para sujetarlos.

8. Las muestras se siembran en uno de los pozos del gel. 9. Se conectan los electrodos a la Fuente de Poder, y se deja correr a 60 – 80

voltios durante 1½ - 3 horas, o hasta que el azul de bromofenol haya migrado 2/3 de la longitud del gel.

10. Enjuagar primero con agua corriente y despues con agua destilada. (Sharp et al., 1973). El gel se coloca sobre el TransIluminador visible y se registran manualmente sobre transparencias o tomando fotografías en blanco y negro.

Cuestionario

6. ¿Por qué es necesario realizar la electroforesis en soluciones buffer?. 7. ¿Cuáles son los aminoácidos que confieren carga a las proteínas?. 8. ¿Hacia donde migrará una proteína que tiene un pI de 7.8 en un buffer A de pH

4.0, y en un buffer B de pH 10.0? 9. ¿Qué pH utilizaría para que pueda moverse en la electroforesis el aminoácido

lisina? 10. ¿Qué otros tipos de electroforésis existen y en que casos son utilizadas? 11. ¿Con este método puedo identificar y cuantificar las proteínas?. Explique 12. ¿Cómo se revela una electroforésis? Explique 13. ¿Qué es una inmunoelectroforésis?


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18 Caracterización de Proteinas Objetivos:

i) Describir y comparar las estrategias de purificación y caracterización de proteinas j) Aplicar las metodologías empleadas para caracterizar una proteina.

Teoría:

Con el fin de obtener la descripción completa de las propiedades de una proteina se requiere de su purificación total o parcial, y de una serie de determinaciones de características como son el peso molecular, el número de subunidades, ubicación subcelular y en tejidos, solubilidad, carga neta, y cantidad de la proteina purificada. Para este fin se han desarrollado numerosas tecnologías, de las cuáles ya se han revisado varias de ellas como la espectrofotometría, métodos cromatográficos y electroforéticos, sin embargo, debido a que las propiedades físico- químicas en las cuales descansan estas tecnologías, cada proteina en particular exige una aproximación diferente para su aislamiento y caracterización. En esta práctica se conocerán estrategias y flujos de trabajo a partir de los cuales se puede discernir una aproximación única para la proteina que se quiere purificar. Procedimiento:

1. Identificar el orígen de la proteina a purificar: Especie, tejido(s) u órgano(s), tipo de célula, localización subcelular. Además calcular aproximadamente la cantidad inicial del material inicial a utilizar, para que la proteina purificada sea obtenida en una cantidad suficiente como para realizar los siguientes procedimientos.

2. Establecer el procedimiento de extracción parcial, y luego con un grado elevado de pureza, en base al orígen y la solubilidad de la proteina.

3. La proteina purificada total- o parcialmente deberá ser cuantificada, la elección del método de cuantificación seguirá las recomendaciones de Scopes (1998)


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4. Determinar el peso molecular y el número de subunidades de la proteina, usualmente mediante aproximaciones electroforéticas y cromatográficas

5. Obtener la secuencia de aminoácidos, ya sea mediante métodos automatizados o manuales (Práctica No.9), y la estructura espacial de la proteina (mediante resonancia magnética nuclear, difracción de rayos X, etc).

Cuestionario:

1. ¿Qué estrategia emplearía para purificar una proteina integral de membrana?. 2. ¿Qué solución se puede dar cuando la fuente original de la proteina es de dificil

obtención, con el propósito de purificar la máxima cantidad posible?. 3. ¿En qué casos es preferible emplear electroforesis en lugar de cromatografía para

las purificaciones? 4. Compare la sensibilidad y especificidad de los métodos para separar las proteinas

basados en las propiedades bioquímicas (afinidad) 5. Diseñe un experimento de purificación y caracterización de las siguientes

proteinas: i. Colágeno

ii. Citocromo C de ratón iii. Hemoglobina humana iv. Glucosa oxidasa

Bibliografía :

Scopes, R.K. 1998. Analysis of Proteins. En: Current Protocols in Molecular Biology, 3ra Ed. Ausubel, F.M. et al. (Eds.) 10.0.1 – 10.0.20. Wiley, New York.


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19 Bibliografía Teoría 1. ARMSTRONG F. B. (1989): Biochemistry. Thrid Edition. Oxford University Press. 2. BOHINSKI C. R. (1978): Bioquímica. Fondo educativo Interamericano, S.A. 3. BOHINSKI C. R. (1991): Bioquímica. 5ta. Ed. Addison-Wesly Iberoamericana. 4. LEHNINGER A. L. (1982): Principles of Biochemistry. Worth Publishers, INC. U.S.A. 5. LEHNINGER A.L.; NELSON D. Y COX M. (1995): Principios de Bioquímica. 2da. Ed.

Editorial Omega S.A. 6. MATHEWS C. K. y van Holde K. E. (1990): Biochemistry. The Benjamin/Cumming

Publishing Company, U.S.A. 7. STRYER L. (1976): Bioquímica. Editorial Reverté S.A. Encarnación, 86, Barcelona -

España. 8. VOET D. Y VOET J. (1990): Bioquímica. Ed. Omega S.A.

Prácticas

1. ARIAS M. F., ARROYO B. A., GARCÍA DE GÓMEZ M. E. y VILLALOBOS M. R. (1985): Curso de Bioquímica. Univ. Nacional Autónoma, México.

2. FALEN B. J. M. (1982): Manual de Práctica de Bioquímica. UNFV. Lima - Perú. 3. FRAIS F. (1972): Practical Biochemistry an Introductory course. Butterworths London,

University Park Press Baltimore. 4. GORNALL A.G., BARDAWILL C. y DAVID M.M. (1949): Determination of serum

proteins by means of the Biuret reaction. J. Biol. Chem. 177: 751 - 766. 5. NELSON N. (1944): A photometric adaptation of de Somogy Method for the

determination of glucosa. J.Biol.Chem. 153: 375 - 380. 6. PLUMMER T. D. (1981): Introducción a la Bioquímica Práctica. Ed. Mc Graw-Hill

Latinoamerica S.A. 7. BRYAN L.W. y WILSON K. (1981): Principios y Técnicas de Bioquímica Experimental.

Ed. Omega, S.A. Barcelona 36, España.

Documents

GUIA LAB 1