GUIA BA1 2013

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Carlos Luis Mori Nuez Ing. en Industrias Alimentarias

Profesor del Bioqumica de los Alimentos

Universidad Catlica de Santa Mara

[email protected]

Danissa Paredes Muoz Ing. Qumico

Profesor del Bioqumica de los Alimentos

Universidad Catlica de Santa Mara

[email protected]

Bioqumica de los Alimentos I

Gua de Practicas

Primera Edicin: 2013

Queda prohibida la reproduccin o transmisin total o parcial del contenido de la presente obra por cualquiera de las formas, sean electrnicas o mecnicas, sin el consentimiento previo y por escrito del editor.

Impreso en Per

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PRESENTACIN

Como estudiante de Ingeniera de Industria Alimentaria debes tener en cuenta que la conservacin, transformacin y/o comercializacin de alimentos tanto para nuestro pas como para la exportacin tiene que ser competitiva y sustentable. Es sabido que los cambios que puedan generarse en un alimento tienen su base en la bioqumica de los principales componentes y las modificaciones que en ellas se realizan.

Es importante que usted sepa que el laboratorio es un lugar de trabajo serio y que su atencin y comportamiento sern observados por los docentes encargados del desarrollo de la prctica, quienes estn para guiarlos y responder a sus dudas.

Cuando usted ingresa al laboratorio se entiende que sabe lo que tiene que hacer, para lo cual habr ledo con la suficiente anticipacin el o los experimentos que han de realizarse.

El xito de un experimento est en la observacin acuciosa de los fenmenos que ocurren, en la exactitud de la anotacin de los datos y mediciones, en el orden correcto de los pasos de cada experimento, en la nitidez y habilidad para la manipulacin de los aparatos y/o equipos, en la adquisicin de los buenos hbitos que son la base de la formacin de un cientfico.

En este manuscrito se ha buscado que se enfatice acerca de la importancia de las Ciencias Biolgicas, como es el caso de la bioqumica aplicada al sector Agroindustrial y Pecuario, y lograr con esto no solo que algunos conceptos se refuercen sino adems que se evidencie la necesidad de desarrollar an ms esta rea en particular, para as lograr que los profesionales apliquen con rigor el oficio de las ciencias y desarrollen la habilidad crtica de el porqu, el cmo y el para que en su vida diaria. Con esto se pretende alcanzar un desarrollo ideal de uno de los sectores que tiene mayor relevancia en nuestro pas, como sabemos la alimentacin es uno de los pilares para el desarrollo, pues vivimos en un mundo globalizado y es ah donde debemos incursionar y aprovechar todos los recursos con que se cuenta.

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TABLA DE CONTENIDOS

CARATULA 1

PRESENTACIN 3

TABLA DE CONTENIDOS 4

REGLAMENTOS (Funciones, Sugerencias, Normas en el laboratorio) 5

PRACTICAS DE LABORATORIO 9

Prctica 1. Soluciones valoradas 9

Prctica 2. Actividad enzimtica en tejidos animales y vegetales 15

Prctica 3. Actividad de la tirosinasa en el pardeamiento enzimtico 19

Prctica 4. Inhibicin de la actividad enzimtica de la polifenoloxidasa 25

Prctica 5. Efecto de la temperatura en la actividad enzimtica 31

Prctica 6. Identificacin de carbohidratos 35

Prctica 7. Cuantificacin de carbohidratos Mtodo fenol-sulfrico 41

Prctica 8. Determinacin de la actividad diastsica en harinas 45

Prctica 9. Aislamiento y cuantificacin de glicgeno 49

Prctica 10. Glucolisis 53

Prctica 11. Fermentacin 57

Prctica 12. Identificacin de aminocidos 61

Prctica 13. Hidrolisis de protenas 67

Prctica 14. Determinacin del punto isoelctrico de una protena 73

Prctica 15. Identificacin y solubilidad de lpidos 79

Prctica 16. Identificacin de colesterol en alimentos 83

BIBLIOGRAFIA 87

ANEXOS 89

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REGLAMENTOS

A continuacin les describimos algunas indicaciones para el uso correcto de los ambientes y materiales con que usted desarrollar su experimentacin.

Funciones del Profesor y/o Jefe de Prctica de la asignatura.-

Planificar, coordinar, supervisar, ejecutar y/o controlar la realizacin de las experiencias de laboratorio

Formular el petitorio de materiales de laboratorio con 48 horas hbiles antes de la realizacin de la prctica

Entregar al finalizar la prctica, el material recepcionado para la verificacin de su conformidad

Responsabilizarse de todas las ocurrencias durante el desarrollo de los trabajos prcticos

Funciones del Alumno durante la ejecucin de prctica de laboratorio.-

Presentarse en el laboratorio en la hora fijada con guardapolvo y mandil blanco

Estar enterado de la experiencia (material de laboratorio, mtodos, tcnicas y procedimientos) a realizar.

Mantener en orden y limpieza su rea de trabajo y entregar en buen estado de conservacin los materiales de laboratorio recibidos bajo su responsabilidad.

Mantenerse atento y prevenido en la seguridad personal y la de sus compaeros.

Responsabilizarse del deterioro o ruptura de equipos u otros bienes que utiliza, debiendo reponerlos o abonar su valor a la universidad, como adicional a la quinta tasa educativa.

Funciones del Asistente de laboratorio.-

Prepara y entrega los pedidos de materiales de laboratorio solicitados por los profesores y jefes de prctica

Se responsabiliza de la recepcin de materiales luego de finalizada la practica

Mantiene en buen estado de conservacin los materiales de laboratorio

Presenta al coordinar los adeudos de materiales de laboratorio que hayan generado los alumnos

Informa al profesor o jefe de prctica, con la debida anticipacin, la inexistencia de materiales de laboratorio y otras.

Recibe los equipos, accesorios y mesas de trabajo en buen estado de limpieza, los mantiene y entrega de igual forma.

Sugerencias y normas para el trabajo prctico.-

Evitar movimientos innecesarios como cambios de asiento, lugar. No hacer ruidos y/o bullicio durante el desarrollo de la prctica, el laboratorio es compartido con otros docentes y/o alumnos del mismo u otro Programa Profesional

No colocar sobre la mesa de trabajo carteras, maletines, libros y dems tiles, para ello tiene los anaqueles respectivos

Conservar el lugar limpio y ordenado todo el tiempo.

Revisar cuidadosamente el material que recibe e informar si este se encuentra defectuoso.

Entregar el material de trabajo limpio y ordenado para un rpido control.

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Sugerencias para las materias primas solicitadas.-

Informarse sobre los requerimientos de los materiales que debe traer para la prctica

Procurar adquirir las materias primas e insumos solicitados de lugares confiables, para garantizar el buen desarrollo de la prctica.

Para los casos que es necesario realizar algn tratamiento previo en la materia prima, deber consultar donde, como y cuando va a realizar dicho trabajo.

Norma a seguir para el control y/o anlisis desarrollados en el laboratorio.-

Limpiar la superficie de trabajo al inicio y al final de cada sesin de trabajo.

Anotar el tipo de muestra, procedencia, fecha y hora de extraccin de la misma y hora de llegada al laboratorio y cualquier otra observacin previa al anlisis. En la prueba o el anlisis realizado se debe anotar la tcnica empleada, los reactivos utilizados y los resultados obtenidos.

Identificar las muestras antes de comenzar la prueba o el anlisis; y en general, no desecharlas hasta haber obtenido los resultados.

Manipular la muestra con los instrumentos previamente higienizados y/o esterilizados. No tocar las muestras con las manos.

Colocar las pipetas y los dems materiales de vidrio usados en recipientes destinados para tal fin.

Desechar las envolturas de papel, botellas de plstico y otros en los que se trajera las muestras en los respectivos tachos.

El material a descartar se debe colocar en recipientes especiales, debidamente rotulados para evitar confusin con los materiales servibles. Si se derrama o quiebra un material de vidrio y/o recipiente con material contaminante, no tocar nada. Avisar al responsable del laboratorio.

Una vez terminada la prctica deber colocar todo el material en las bandejas y/o recipientes proporcionados por el tcnico de laboratorio.

Sugerencia para el uso de maquinarias y/o equipos de control.-

Leer cuidadosamente los manuales de funcionamiento.

Informarse del tcnico responsable sobre el estado de funcionamiento de la maquinaria y/o equipo de control.

Higienizar la maquinaria y/o equipos de control antes y despus de haberlo utilizado.

No manipular las maquinarias y/o equipos de control sin la autorizacin del docente o del tcnico responsable del rea.

Avisar si sucede algn problema durante el uso de la maquinaria y/o equipo de control.

Sobre la presentacin de los informes tcnicos de laboratorio.-

Los informes deben presentarse en las fechas establecidas y deben contener lo siguiente:

Portada.- Donde debe indicar lo siguiente: Universidad Catlica de Santa Mara; Facultad de Ciencias e Ingenieras Biolgicas y Qumicas; Programa profesional de Ingeniera de Industria Alimentaria; Numero de prctica desarrollada y Nombre de la prctica desarrollada; Alumnos que presentan el informe de prctica (Cdigo, Apellidos y Nombres); Docente con quien desarrollo la prctica de laboratorio; Fecha de entrega del informe de prctica

ndice.- Se debe enumerar las hojas presentadas e indicar en qu pgina se encuentra cada tem solicitado.

Introduccin.- Es la presentacin del o de los temas desarrollados en la prctica.

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Marco terico.- Debe contener informacin relevante sobre el o los temas tratados en la prctica. Generalmente sirve de soporte para la discusin de los resultados y el desarrollo del cuestionario.

Parte experimental.- Se detalla la forma como se ha desarrollado la experimentacin y se presentan los resultados de la misma.

Discusin y conclusiones.- El informe deber brindar una explicacin de los resultados respecto a informacin presentada en el marco terico, presentando finalmente una conclusin sobre el desarrollo de la prctica.

Resumen.- Redactar el resumen en un solo prrafo, modo impersonal y en tiempo pasado, excepto las conclusiones que llevan el verbo en presente. Cuidar que los datos cualitativos y cuantitativos sean exactos.

Bibliografa.- Proporciona la informacin de los textos, tesis, revistas, revisin de Internet, entre otros utilizados para la elaboracin del informe.

Cuestionario.- Lea las preguntas atentamente, revise libros, revistas y/o investigaciones y responda con claridad.

Anexos.- Se puede incluir fotos, grficos, u otro material que ayude a ilustrar los resultados obtenidos en la prctica.

Algunos principios generales de Seguridad y Salud en el Laboratorio.-

El Diseo del Laboratorio (distribucin, instalaciones, procedimientos de trabajo, etc.) debe ser el adecuado

para el mantenimiento de un buen nivel preventivo.

Se debe disponer de las instalaciones de emergencia o elementos de actuacin como duchas, lavaojos,

extintores, etc. adems de los equipos de proteccin individual (tambin denominados EPIs).

El laboratorio, incluidas las zonas de paso, salidas, vas de circulacin, equipos e instalaciones deben estar

en perfecto estado de orden y limpieza, estableciendo para ello un mantenimiento peridico de las mismas.

Los desperdicios, manchas y residuos de sustancias peligrosas se eliminarn con rapidez.

Est prohibido realizar trabajos diferentes a los autorizados por los responsables directos, as como utilizar

aparatos e instalaciones sin conocer previamente su funcionamiento.

El personal debe lavarse las manos antes y despus de su entrada en el laboratorio.

La ropa de trabajo debe estar abrochada en todo momento, evitando vestir mangas anchas o colgantes, y

tener los cabellos recogidos.

Debe estar prohibido comer, beber y fumar en el laboratorio.

Cuando se llevan lentes de contacto, ser obligatorio el uso de gafas de seguridad.

El buen estado de los productos y materiales as como su etiquetado debe comprobarse antes de su

utilizacin.

Todos los preparados deben estar etiquetados adecuadamente, estando prohibida la reutilizacin de los

envases vacos sin la retirada de la etiqueta original.

Para el encendido de los mecheros Bunsen se recomienda la utilizacin de encendedores piezoelctricos,

intentando reducir al mximo el uso de llamas vivas una vez encendidos.

Se deber trabajar, siempre que sea posible y operativo, en las vitrinas.

Una vez finalizada la operacin o la tarea en el laboratorio, se debern guardar los materiales y reactivos,

limpiar el lugar de trabajo, y asegurarse la desconexin de aparatos, conductos de agua y gas, etc.

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Algunas sealizaciones de Seguridad en el Laboratorio.-

Seales de advertencia.- Presentan forma triangular, siendo el pictograma negro sobre fondo amarillo (el amarillo deber cubrir el 50% de la superficie) con bordes negros. Excepcin ser el fondo de la seal sobre materias nocivas o irritantes de color naranja.

MATERIAL TOXICO

MATERIAL INFLAMABLE

MATERIAL EXPLOSIVO

MATERIAL IRRITANTE

Seales de prohibicin.- Presentan forma redonda, siendo el pictograma negro sobre fondo blanco, bordes y banda rojos (el rojo deber cubrir el 35%).

PROHIBIDO PASAR

PROHIBIDO FUMAR

PROHIBIDO FUMAR Y

ENCENDER FUEGO

PROHIBIDO TOCAR

Seales de obligacin.- Presentan forma redonda, siendo el pictograma blanco sobre fondo azul (el azul deber cubrir el 50% de la superficie de la seal).

USO OBL.IGATORIO

DEL MANDIL

USO OBLIGATORIO DE LENTES DE SEGURIDAD

USO OBLIGATORIO

DE GUANTES

VIA OBLIGATORIA PARA PEATONES

Seales de lucha contra incendios.- Presentan una forma rectangular o cuadrada, con el pictograma de blanco sobre un fondo rojo (el rojo deber cubrir el 50% de la superficie).

EXTINTOR

MANTA APAGAFUEGOS

TELEFONO PARA USO

EN CASO DE INCENDIO

MANGUERA CONTRA

INCENDIO

Seales de salvamento o socorro.- Presentan una forma rectangular o cuadrada, con el pictograma de color blanco sobre un fondo verde (el verde deber cubrir el 50% de la superficie).

PRIMEROS AUXILIOS

DUCHA DE

EMERGENCIA

LAVADO OJOS DE

EMERGENCIA

SALIDA DE

EMERGENCIA

Seal complementaria de riesgo permanente.- La sealizacin se efectuar mediante franjas alternas amarillas y negras. Las franjas debern tener una inclinacin de 45 y ser de dimensiones similares al modelo:

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Prctica N 01

TEMA SOLUCIONES VALORADAS

OBJETIVO(S) Teorizar y calcular la preparacin de soluciones Preparar soluciones y disoluciones Aplicar distintas tcnicas en la preparacin de soluciones Valorar soluciones por el mtodo de titulacin Diferenciar entre distintos tipos de patrones

MARCO TERICO:

Las soluciones son mezclas de dos o ms componentes, que pueden separarse por mtodos fsicos en sus diversas substancias componentes. En una solucin, aquella substancia que se encuentra en mayor proporcin se conoce como solvente y las dems como solutos. La relacin o proporcin de la mezcla soluto a solvente se conoce como concentracin.

Las soluciones verdaderas difieren de las suspensiones y de los sistemas coloidales, fundamentalmente en el tamao de partcula del soluto o de la fase dispersa y en las propiedades que derivan de dicha diferencia. En general, las soluciones verdaderas en fase lquida, no desprenden soluto por decantacin ni tienen la propiedad de dispersar la luz. En rigor, se dice que una partcula se encuentra en solucin cuando esta se halla dispersa

en otro medio, en un grado de fragmentacin inferior a 0,45 .

Existen varias formas de referirse a la concentracin de una solucin, esto es, a la proporcin de soluto a solvente. Para efectos cualitativos, frecuentemente se habla de soluciones diluidas, concentradas, saturadas o sobresaturadas. Sin embargo, ya que en muchos casos estas descripciones cualitativas no son suficientes, la forma cuantitativa de referirse a la proporcin de soluto a solvente (concentracin) de una solucin, es mediante los conceptos de Molaridad (M), Normalidad (N), el porcentaje peso a peso (PPP), el porcentaje peso a volumen (PPV), las partes por milln (ppm) y las partes por billn (ppb).

Molaridad.- es por excelencia, la forma como se expresa la concentracin de una solucin en trabajos de qumica, fsica, biologa o ingeniera. La molaridad es por definicin, el nmero de moles de soluto que se hallan contenidos en un litro de solucin, tambin es en el laboratorio la mejor forma de prepararla.

Para preparar una solucin 1 molar se tiene:

Normalidad: es el nmero de equivalentes gramo de soluto que se hallan contenidos en 1 litro de solucin.

El valor del equivalente gramo de un cido, base o sal depende de su papel como reactivo en la reaccin de que se trate. Un equivalente gramo del oxidante o del reductor es igual a la masa formula dividida entre la suma de los cambios en el nmero de oxidacin de los tomos que intervienen en la frmula del oxidante o del reductor, esto es:

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Porcentaje peso a peso: es una relacin que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en cada 100 gramos de solucin. Esta forma de expresar la concentracin implica al momento de preparar una solucin, pesar separadamente el soluto y el solvente. Si bien, este procedimiento facilita la comprensin de la proporcin de la mezcla la aplicacin de esta forma de referirse a la concentracin en el trabajo rutinario de laboratorio se dificulta un poco, debido a que obliga a conocer tambin la densidad de la solucin. A esta desventaja se le suma el hecho de que a los lquidos, es ms fcil medirles el volumen que medirles la masa.

La expresin porcentual peso a peso de las soluciones se conserva particularmente, para las soluciones acuosas de los gases, tales como el HCl, el HF, el HBr y el NH3. La mayora de los cidos que se utilizan como reactivos en el laboratorio (clorhdrico, ntrico, sulfrico, actico, fosfrico, entre otros) vienen con sus concentraciones en trminos de porcentaje peso a peso. Para facilitar el manejo de estas soluciones, la concentracin peso a peso de la solucin se acompaa con tablas que registran la densidad de la solucin a diferentes concentraciones.

Porcentaje peso a volumen: es una relacin que expresa los gramos de soluto que se hallan contenidos en cada 100 mililitros de solucin. Esta forma de expresar la concentracin de una solucin facilita enormemente su preparacin y aplicacin; el nico inconveniente radica en que el porcentaje peso a volumen es una unidad muy grande para muchos fines analticos frecuentes. Generalmente, cuando se expresa la concentracin de una solucin en trminos porcentuales, la expresin se refiere al porcentaje peso a volumen.

Partes por milln: La expresin porcentual, molar o normal para referirse a la concentracin de una solucin, se aplica generalmente a las soluciones en las cuales la proporcin de soluto a solvente es relativamente alta, proporcin que generalmente se halla en la escala de las partes por mil. Sin embargo, existen muchas substancias cuya concentracin regular en una solucin es mucho menor que las partes por mil.

Las partes por milln son una relacin que expresa las partes de soluto que se hallan contenidas en un milln de partes de solucin. De esta forma, las partes por milln pueden expresarse como, los gramos de soluto por metro cubico de solucin, los gramos de soluto por tonelada de solucin o los miligramos de soluto por kilogramo de solucin. Ya que esta forma de expresar la concentracin de una solucin se utiliza particularmente para soluciones muy diluidas y como un kilogramo equivale a un litro en trminos de volumen, generalmente las partes por milln se asocian a los miligramos de soluto contenidos en cada litro de solucin.

Preparacin de soluciones: Uno de los problemas que con mayor frecuencia se deben resolver en un laboratorio, lo constituyen el acondicionamiento y concentracin de las soluciones a las necesidades especficas de los diferentes usos; esto, debido a que con frecuencia la concentracin de las soluciones de trabajo dista mucho de la concentracin de los reactivos en su presentacin comercial.

Este es precisamente el caso de los cidos clorhdrico, ntrico, sulfrico, fosfrico y actico, cuyas soluciones de trabajo se preparan normalmente por dilucin de otras ms concentradas: tambin en algunos casos, son las mismas muestras las que deben diluirse con objeto de adecuar la concentracin de alguno de sus constituyentes al rango de medicin de un mtodo especfico de anlisis. Todos los procedimientos de dilucin, implican tcnicas y clculos que son precisos conocer y desarrollar para poder realizar.

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Valoracin: Aunque tericamente la preparacin de soluciones involucra procedimientos de clculo y la forma como se debe preparar, en la prctica existen muchos inconvenientes que obligan, a que una vez que la solucin ha sido preparada en la forma descrita, deba realizarse un proceso de confirmacin de esta concentracin: Dicho proceso de chequeo o certificacin se conoce como valoracin. As, valorar una solucin, es certificar su concentracin por comparacin con la concentracin de una solucin patrn o de referencia.

Anlisis volumtrico: en este procedimiento se determina la concentracin de una solucin cuya concentracin se desconoce, midiendo el volumen que se requiere de ella para reaccionar con un volumen fijo de otra solucin cuya concentracin es perfectamente conocida. Esta operacin se le conoce como titulacin, normalizacin o valoracin volumtrica, exige el conocimiento de la reaccin qumica involucrada. Con frecuencia se agrega a la mezcla reaccionante una substancia que tiene por objeto indicar el momento en el cual la valoracin ha alcanzado el punto de equivalencia.

Desde el punto de vista qumico, un indicador es una substancia que reacciona con el agente titulante pero cuya constante de formacin es menor que la correspondiente al producto de la reaccin entre el agente titulante (reactivo que se adiciona desde una bureta) y el agente titulado (Substancia que reacciona con el agente titulante y que se halla presente en la solucin problema). As, el indicador reacciona solamente cuando en el medio ya no exista el agente titulado.

Como ya se dijo antes, en el punto final de una valoracin volumtrica la cantidad de agente titulado debe ser igual a la cantidad del agente titulante o lo que es lo mismo, en el punto final de una valoracin, las concentraciones de los solutos reaccionantes deben ser equivalentes. Por tal razn:

Solucin saturada: Es aquella solucin que no disuelve ms soluto; es decir la solubilidad de soluto llego a su lmite, esta solucin se encuentra en un equilibrio dinmico.

Solucin sobresaturada: Contiene mayor cantidad de soluto que la solucin saturada; este se pudo disolver en la solucin a una temperatura superior a la solucin saturada. La solubilidad de las substancias, depende entre otros factores, de la temperatura, como consecuencia disminuye la solubilidad y la sustancia puede, por ejemplo, separarse por cristalizacin. Debido a este efecto, las soluciones sobresaturadas se preparan de las soluciones saturadas caliente, en las cuales se logr, a una nueva temperatura disolver ms soluto. Se tiene cuidado de no enfriar bruscamente la solucin saturada para que la sustancia en exceso no cristalice.

MATERIA PRIMA, EQUIPOS Y REACTIVOS:

Sacarosa comercial (azcar de caa) Cloruro de sodio (Sal comn) Piceta con agua destilada Balanza analtica ( 0,0001 g) Balanza gramera ( 0,001 g) Probeta Bureta de 25 ml con soporte Fiola 50, 100 ml Erlemeyer 100 ml Beaker 100 ml Pipeta 1, 2, 5, 10, 20 ml Vidrio de reloj Embudo de vidrio Esptula

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Pro pipeta Hidrxido de sodio en escamas cido clorhdrico al 10 % Hidrxido de sodio 1 N (solucin valorada) cido clorhdrico 1 M (solucin valorada) Fenolftalena al 1% en solucin alcohlica al 50 %

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Preparacin de una solucin de sacarosa al 3 % m/v

Calcular la cantidad de sacarosa que debe pesar para preparar 50 ml de solucin.

Seleccionar el vaso de precipitados ms adecuado para pesar el soluto y disolverlo en la menor cantidad posible de solvente.

Pesar la cantidad necesaria de sacarosa en balanza gramera

Agregar agua en la menor cantidad posible que permita la disolucin

Trasvasar cuidadosamente la disolucin a una fiola de 50 ml

Lavar el vaso repetidas veces con pequeas alcuotas de solvente. Tener presente no superar el aforo del matraz.

Llevar el volumen hasta 1 cm del aforo y dejar reposar para que escurra el lquido de las paredes.

Enrasar a volumen con una piceta, tapar e invertir para homogeneizar la mezcla.

Rotular la solucin resultante Preparacin de una solucin 0,1 N de hidrxido de sodio

Calcular la masa de reactivo slido que se necesitan para preparar 100 ml de solucin.

Efectuar la pesada usando una esptula plstica

Disolver las lentejas en un volumen de agua destilada pequeo agitando con varilla de vidrio. Al ser la reaccin exotrmica notar un aumento de temperatura lo que favorecer la disolucin.

Completada la disolucin, transvasar a una fiola lavando 3 o 4 veces para no perder material.

Llevar luego a su volumen final.

Una vez enrasada, invertir el matraz para homogenizacin de la mezcla.

Rotular, guardando la solucin tapada pues se carbonata. Preparacin de una solucin 0,1 N de cido clorhdrico

Partir de una solucin concentrada, en el caso del HCl, densidad 1,19 g/ml, 37% m/m.

Calcular que volumen de cido concentrado ser necesario para preparar 100 ml de cido 0,1N

Utilizando Pro pipeta, tomar el cido concentrado del recipiente que lo contiene. Siempre enrasar a cero la pipeta utilizada y descargar el volumen necesario segn el clculo

Volcar el volumen medido sobre unos 20 o 30 ml de agua destilada contenidos en la fiola del volumen adecuado a la cantidad de solucin que desea realizar.

Agitar suavemente para mezclar, no inclinar el matraz

Llevar al volumen final deseado con agua destilada con la ayuda de piceta o pipeta.

Rotular. Valoracin de una solucin de NaOH utilizando ftalato acido de potasio (FHK) como patrn primario

Para realizar esta experiencia necesita montar el equipo para una valoracin volumtrica. Tenga en cuenta los materiales a utilizar (soporte, bureta, erlemeyer).

Preparar 3 matraces erlenmeyer donde cada uno contenga 10 ml de solucin de FHK y agregar 2 gotas de fenolftalena.

Cargar la bureta con solucin de NaOH preparado

Usando el robinete, agregar NaOH hasta aparicin de la una suave coloracin rosada. Tome nota de ese volumen.

Repita el procedimiento con los dos erlenmeyer restantes a fin de obtener un promedio de medidas.

Calcular la concentracin real de la solucin de NaOH

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Valoracin de una solucin de NaOH utilizando cido clorhdrico valorado (HCl) como patrn secundario

Para realizar esta experiencia necesita montar el equipo para una valoracin volumtrica. Tenga en cuenta los materiales a utilizar (soporte, bureta, erlemeyer).

Preparar 3 matraces erlenmeyer donde cada uno contenga 10 ml de solucin de HCl y agregar 2 gotas de fenolftalena.

Cargar la bureta con solucin de NaOH preparado

Usando el robinete, agregar NaOH hasta aparicin de la una suave coloracin rosada. Tome nota de ese volumen.

Repita el procedimiento con los dos erlenmeyer restantes a fin de obtener un promedio de medidas.

Calcular la concentracin real de la solucin de NaOH Valoracin de una solucin de HCl utilizando NaOH como patrn secundario

Utilizando la solucin de NaOH, previamente valorada por el tcnico de laboratorio, utilizar esta como patrn secundario para valorar la solucin de HCl.

Cargar en la bureta la solucin de HCL y en cada uno de los tres erlenmeyer, 10 ml de solucin de NaOH de concentracin conocida y dos gotas de fenolftalena.

Titular la solucin de NaOH hasta la desaparicin del color rosado en el erlenmeyer

Tomar nota del volumen gastado

Repetir los pasos anteriores en los dos erlenmeyer restantes.

Calcular la concentracin exacta del HCl preparado

CUESTIONARIO:

1. Qu funcin cumple el FHK en la secuencia de titulacin? Por qu? 2. Por qu se considera que NaOH es un patrn secundario? 3. Cul es la funcin de la fenolftalena en las titulaciones realizadas? 4. Considera que este trabajo prctico es de utilidad para su formacin como estudiante de ingeniera en

industria alimentaria? Por qu?

PROBLEMAS A DESARROLLAR EN LA PRCTICA

1. Calcular cunto debo pesar de NaOH solido (en perlas) para preparar una solucin 1 molar (1 M)

2. Calcular cunto debo pipetear de HCl grado qumicamente puro (QP) para preparar una solucin 1 normal (1 N)

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3. Que cantidades debo mezclar de agua destilada y HCl 1 M para preparar 100 ml de una solucin de HCl 0,1 N

4. Calcular cunto de H2SO4 QP debo utilizar para preparar 1 litro de una solucin 0,1 N

5. Que cantidad de H2SO4 con una densidad de 1,84 gr/cm3 debo mezclar con agua para obtener 100 ml un

reactivo de H2SO4 con una densidad de 1,80 gr/cm3

6. Cuanto debo mezclar de HCL al 10 % con agua destilada para preparar 250 ml de HCl 0,25 M

7. Cuanto debo mezclar de HCL al 10 % con agua destilada para preparar 250 ml de HCl 0,25 M

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Prctica N 02

TEMA ACTIVIDAD ENZIMATICA EN TEJIDOS ANIMALES Y VEGETALES

OBJETIVO(S) Estudiar el efecto de una enzima presente en tejidos animales y vegetales.

Comparar la accin de la peroxidasa (catalizador presente en tejidos orgnicos) y del MnO2 (catalizador inorgnico) sobre un mismo sustrato (agua oxigenada)

Estudiar el efecto de la temperatura en la intensidad de la reaccin

Medir la actividad cataltica por medio del desprendimiento de burbujas y la produccin de calor.

MARCO TERICO:

En el mbito de la bioqumica de los alimentos la enzimologa es quizs uno de los campos que se ha desarrollado ms rpidamente en los ltimos aos.

Los amplios estudios realizados en esta rea han puesto en evidencia la importancia de los procesos enzimticos en la elaboracin y conservacin de los alimentos. Fenmenos tan importantes en la tecnologa actual, como las reacciones de pardeamiento enzimtico (frutas), de rancidez (grasas y aceites), de coloracin (vegetales verdes), de textura (salsa de tomate) son ejemplos muy conocidos de la intervencin de enzimas.

Estas sustancias catalizadoras de los procesos vitales pueden presentarse extraordinariamente activas durante el periodo posterior a la cosecha (alimentos vegetales) y los cambios que ellas determinan pueden influir en forma considerable sobre los caracteres organolpticos, textura y presentacin del producto terminado.

As como hay enzimas perjudiciales que deben ser inactivadas en el momento oportuno, hay otras que la tecnologa de los alimentos utiliza para una mejor preparacin del alimento, como lo son las enzimas de filtracin o de clarificacin, las enzimas proteolticas, para ablandar las carnes. La glucosa-oxidasa, que permite eliminar la glucosa de ciertos alimentos, para evitar su pardeamiento posterior.

Tambin ha sido motivo de interesantes estudios la adicin de enzimas de accin aromatizante a los alimentos o bebidas que durante su procesamiento han sufrido en su aroma pero han conservado sus precursores, permitiendo, de este modo, restaurar sus componentes aromticos originales.

Las enzimas son protenas especficas que actan como catalizadores de las reacciones bioqumicas de todos los seres vivos. La actividad enzimtica puede comprobarse experimentalmente mediante la identificacin y cuantificacin de los productos formados de la reaccin que ellas regulan.

La accin de los compuestos proteicos en una reaccin, se afecta por la variacin de factores fsicos y qumicos tales como la temperatura, la concentracin de la enzima y del sustrato, del pH, etc.

En esta prctica se disean experimentos utilizando un catalizador inorgnico (MnO2) y otro orgnico (peroxidasa); esta ltima, se encuentra tanto en tejidos animales como vegetales y acta sobre el perxido de hidrogeno o agua oxigenada (H2O2). El perxido es un producto de la actividad celular y el acumularse en exceso intoxica la clula por lo cual debe ser degradado por una enzima especfica.

La reaccin en la cual interviene la peroxidasa se presenta de la siguiente manera:

Peroxidasa

2 H2O2 2 H2O + O2

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Esta reaccin puede visualizarse por la formacin de burbujas, las cuales se producen debido al desprendimiento de oxgeno. La cantidad de burbujas en una medida cualitativa proporcional a la intensidad de reaccin y puede utilizarse para evaluar la dinmica de la reaccin.

Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisan mayor temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad peculiar de la regeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo parcial, con prdida de su estructura terciaria, cuando el calor se aplica en un tiempo muy corto, se produce luego una reversin de la protena a su estado normal por recombinacin de sus grupos hidrgenos o sulfhidrlicos.

Este efecto del calor sobre la actividad peroxidsica es muy, importante en la industria de alimentos y la regeneracin enzimtica de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres organolpticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimtica puede detenerse totalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneracin es muy dbil generalmente.


Hgado de res

Papa blanca

Agua destilada

Agua oxigenada de 30 volmenes

Dixido de manganeso

Balanza analtica ( 0,0001 g)

Pipetas de 2 cc

Tubos de ensayo

Gradilla

Licuadora

Tabla de picar y cuchillo

Placas petri

Esptula

Bao de agua caliente

Balanza analtica

Cronometro

Soporte universal

Termmetro

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: se realizara los siguientes procedimientos:

Nota: conserve en una gradilla todos los tubos que utilice en esta prctica para efectuar comparaciones posteriores.

Accin de un catalizador inorgnico sobre el H2O2: Marque cuatro tubos de ensayo con los nmeros 1, 2, 3, 4 agregue a cada tubo lo que pueda tomar con la punta de una esptula dixido de manganeso (procure que las cantidades sean constantes para todos los tubos) y proceda de la siguiente manera:

Tome el tubo 1, agrguele 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reaccin para que compare con los siguientes tubos; analizar qu papel desempea el MnO2 y el H2O2 en la reaccin; verificar si hubo desprendimiento de calor.

~ 17 ~

Utilizando pinzas coloque el tubo 2 en bao de agua mara durante 10 minutos. Retrelo, deje enfriar y agrguele 2 ml de agua oxigenada. Compare la reaccin con la anterior, se present con mayor o menor intensidad. Analizar si la temperatura afecto al catalizador.

Coloque el tubo 3 en un recipiente con hielo durante 10 minutos, retrelo e inmediatamente agrguele 2 ml de agua oxigenada, compare la reaccin con las anteriores. Compare como afecto la disminucin de la temperatura y cul es la accin del MnO2.

Tome el tubo 4, agrguele 4 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reaccin para que compare con la reaccin con el tubo 1. Analizar si la cantidad de agua oxigenada influye en la reaccin.

Accin de un catalizador de origen animal sobre el H2O2: Marque cuatro tubos de ensayo con los nmeros 1, 2, 3, 4 agregue a los tubos 1, 2,3 un pedazo de hgado (procure que las cantidades sean constantes para todos los tubos); Para el tubo 4, realice un licuado del hgado y agregue al tubo una cantidad similar al de los tubos anteriores, luego proceda de la siguiente manera:

Tome el tubo 1, agrguele 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reaccin para que compare con los siguientes tubos; analizar qu papel desempea el hgado en la reaccin; Explique cul es la naturaleza qumica de la sustancia que cataliza esta reaccin; verificar si hubo desprendimiento de calor.

Utilizando pinzas coloque el tubo 2 en bao de agua mara durante 10 minutos. Retrelo, deje enfriar y agrguele 2 ml de agua oxigenada. Se presenta reaccin?; Como explica este resultado.

Coloque el tubo 3 en un recipiente con hielo durante 10 minutos, retrelo e inmediatamente agrguele 2 ml de agua oxigenada. Ocurre reaccin?. Como es su intensidad en relacin con las reacciones anteriores. Que efecto tiene la disminucin de la temperatura sobre el catalizador?. Cree usted que si se agrega el agua oxigenada se agrega despus que el hgado vuelva a la temperatura ambiente, la intensidad de la reaccin seria como la del tubo 1. Explique.

Tome el tubo 4, agrguele 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reaccin para que compare con la reaccin con el tubo 1. Analizar si la reaccin es en mayor o menor intensidad a la del hgado sin homogenizar. Porque?.

Accin de un catalizador de origen vegetal sobre el H2O2: Marque cuatro tubos de ensayo con los nmeros 1, 2, 3, 4 agregue a los tubos 1, 2,3 un pedazo de papa (procure que las cantidades sean constantes para todos los tubos); Para el tubo 4, realice un licuado de papa y agregue al tubo una cantidad similar al de los tubos anteriores, luego proceda de la siguiente manera:

Tome el tubo 1, agrguele 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reaccin para que compare con los siguientes tubos; analizar qu papel desempea la papa en la reaccin; Explique cul es la naturaleza qumica de la sustancia que cataliza esta reaccin; verificar si hubo desprendimiento de calor.

Utilizando pinzas coloque el tubo 2 en bao de agua mara durante 10 minutos. Retrelo, deje enfriar y agrguele 2 ml de agua oxigenada. Se presenta reaccin?. Como explica este resultado.

Coloque el tubo 3 en un recipiente con hielo durante 10 minutos, retrelo e inmediatamente agrguele 2 ml de agua oxigenada. Ocurre reaccin?. Como es su intensidad en relacin con las reacciones anteriores. Que efecto tiene la disminucin de la temperatura sobre el catalizador?.

Deje el tubo en reposo por unos 5 minutos y observe de nuevo la reaccin. Que ha ocurrido?. Que explicacin tiene este hecho.

Tome el tubo 4, agrguele 2 ml de agua oxigenada. Observe la intensidad de la reaccin para que compare con la reaccin con el tubo 1. Analizar si la reaccin es en mayor o menor intensidad a la da la papa sin homogenizar. Porque?

Medicin de la accin de una enzima en trminos de la produccin de calor: Haga el montaje de tal manera que pueda proceder como se indica a continuacin: Coloque un tubo de ensayo en una gradilla y adicione una cantidad constante de muestra homogenizada (papa e hgado, un tubo para cada muestra), inserte en

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cada tubo un termmetro con la escala de tal forma que pueda leer los valores (el termmetro debe dejarse descansar libremente). Tome la temperatura inicial. Posteriormente proceda de la siguiente manera:

En el tubo con el homogenizado de papa adicione 2 ml de agua oxigenada y empiece a observar los valores de temperatura cada 30 segundos. Las variaciones de temperatura que tengan lugar deben quedar registradas por pequeas que estas sean. Anote los datos en la tabla y realice una grfica con los datos obtenidos. Tiempo (seg); Temperatura (C)

Seg 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270

C

En el tubo con el homogenizado de hgado adicione 2 ml de agua oxigenada y empiece a observar los valores de temperatura cada 30 segundos. Las variaciones de temperatura que tengan lugar deben quedar registradas por pequeas que estas sean. Anote los datos en la tabla y realice una grfica con los datos obtenidos.

Seg 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270

C

Grafique los resultados obtenidos

CUESTIONARIO:

1. Cmo varia la accin enzimtica sobre la naturaleza fsica de la muestra, comparar resultados del hgado y la para homogenizadas y sin homogenizar?

2. Cul es la funcin de un catalizador sobre la velocidad de reaccin?

3. Diagrame el mecanismo de accin enzima-sustrato soportado sobre las nuevas teoras existentes?

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Prctica N 03

TEMA ACTIVIDAD DE LA TIROSINASA EN EL PARDEAMIENTO ENZIMATICO

OBJETIVO(S) Experimentar la extraccin de la enzima tirosinasa a partir de la manzana

Evaluar el efecto de la concentracin de la enzima en la medicin de la actividad del pardeamiento enzimtico

Evaluar el efecto de la concentracin del sustrato en la medicin de la actividad del pardeamiento enzimtico

Determinar los parmetros cinticos para la actividad de la tirosinasa presente en la manzana

MARCO TERICO:

ltimamente, la produccin de frutas y hortalizas mnimamente procesadas (FyHMP) ha crecido notoriamente tanto en cantidad como en variedad, debido a que proporcionan al consumidor un producto similar al fresco con una vida til relativamente prolongada y, al mismo tiempo, garantizan su inocuidad, calidad nutritiva y sensorial.

La apariencia, determinada principalmente por el color, es uno de los atributos ms utilizados por los consumidores para evaluar la calidad de FyHMP. El color, se debe a los pigmentos naturales, como las clorofilas, los carotenoides y las antocianinas, o a los pigmentos que resultan de las reacciones de pardeamiento enzimtico. Este proceso, relacionado con la actividad de la enzima polifenoloxidasa (PPO), no ocurre en clulas de la planta intacta debido a que los sustratos (compuestos fenlicos) estn contenidos en vacuolas celulares citoplasmticas, separadas de la enzima. Una vez que el tejido celular es daado, ya sea por la propia manipulacin o por el corte de la fruta, se pierde la compartimentalizacin celular, se pone en contacto la enzima y el sustrato, y se desencadenan las reacciones de pardeamiento.

Las polifenoloxidasas, tambin conocidas como tirosinasas, fenoloxidasasas, monofenoloxidasas o cresolasas, catalizan la hidroxilacin de monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrn, rojo o negro, dependiendo de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales.

Para que el fenmeno de pardeamiento enzimtico tenga lugar se requiere de la presencia de cuatro diferentes compuestos: el oxgeno molecular, substratos apropiados, la polifenoloxidasa y la presencia de cobre en el centro activo de la enzima. Estos factores determinan la velocidad de pardeamiento, que puede tener lugar muy rpidamente, incluso en 30 min. Esta velocidad depender de factores tales como la concentracin y actividad de la enzima, la cantidad y naturaleza de los compuestos fenlicos, pH, temperatura, actividad del agua y de la cantidad de oxgeno disponible en el entorno del tejido vegetal. Otros factores intrnsecos que influyen en la intensidad del pardeamiento son: la especie, la variedad y el estado fisiolgico de los frutos.

En la industria alimentaria es comn que en las operaciones unitarias de reduccin de tamao de productos como la papa, manzana, pltanos u otras frutas adquieran un color marrn; esto se debe a la conversin del aminocido tirosina en el pigmento melanina de acuerdo con la secuencia de reacciones que se describen a continuacin:

~ 20 ~

El mismo proceso ocurre en la piel por exposicin a la radiacin ultravioleta. Las reacciones enzimticas son catalizadas por la tirosinasa (monofenol dihidroxifenilalanina: oxigeno oxidoreductasa); la enzima se encuentra en el interior del tejido vegetal, y dado que la reaccin requiere O2, esta no ocurre hasta que los productos en su parte interior estn expuesta al aire.


Manzana

Agua destilada

Agua destilada

Buffer 1. Fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,2 Mantenido en refrigeracin ( 2C )

Buffer 2. Fosfato de sodio 0,1 M a pH 6,0

D.L-dihidroxifenilalanina 20 mM (DOPA)


Mortero

Bao de hielo


Tubos de ensayo

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Gradilla

Balanza gramera

Pipeta de 20, 5, 2, 1, 0,1 ml

Embudo Buchner con sistema de vaco

Papel Whatman N 42

Centrfuga a 3500 RPM

Espectrofotmetro a 420 nm


Nota: conserve en una gradilla todos los tubos que utilice en esta prctica para efectuar comparaciones posteriores.

Extraccin de la enzima tirosinasa

Lavar cuidadosamente la manzana para evitar que se dae la cascara y se produzca el pardeamiento enzimtico rpidamente; una alternativa es que la manzana este previamente refrigerada a 2 C para retardar el pardeamiento.

Colocar 40 gramos de manzana en un mortero pre-enfriado con hielo (adems puede mantenerse previamente en refrigeracin a 2 C) y extraer el zumo de la manzana.

Filtrar al vaco en un embudo buchner conectado a un sistema de vaco (empapar el papel filtro con el Buffer 1 para que se pegue perfectamente en el embudo)

Centrifugar a 3500 rpm durante 5 minutos a 4 C

Recuperar el sobrenadante y dividirlo en las porciones que sean necesarias. Las muestras deben ser colocadas en bao de hielo, este extracto presenta un color marrn oscuro caracterstico, el cual se vuelve ms oscuro con el paso del tiempo.

Medicin de la actividad enzimtica en funcin a la concentracin de la enzima.

La actividad de la tirosinasa puede ser fcilmente determinada colorimtricamente midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm debido a la conversin de la DOPA en DOPA-cromo (color rojo)

Pipetear en una celda para espectrofotmetro 0,2 ml del extracto y 3,8 ml del Buffer 2.

La reaccin inicia con la adicin de 1 ml de DOPA (mezclar varias veces por inversin y colocar la celda en el espectrofotmetro previa calibracin del instrumento)

Llevar a cero la absorbancia y comenzar a cronometrar rpidamente, medir la absorbancia a 420 nm cada minuto hasta el minuto 10, sin retirar la celda del espectrofotmetro. (Prueba P1)

Repetir el experimento pero pipeteando las siguientes cantidades en la celda de medicin: 0,4 ml del extracto, 3,6 ml del Buffer 2 y 1 ml de DOPA. (Prueba P2)

Para obtener los datos de calibracin de la absorbancia de la reaccin enzimtica debe pipetear 2 ml del extracto en un tubo de ensayo, calentarlo en bao mara a ebullicin durante 10 minutos; enfriar y realizar la prueba de actividad enzimtica con 0,4 ml del extracto, 3,6 ml del Buffer 2 y 1 ml de DOPA medida espectrofotomtricamente a 420 nm durante 10 minutos, con intervalos de lectura de 1 minuto, como se realiz en los anteriores experimentos. (Prueba de calibracin PC) Nota: las celdas de medicin deben estar perfectamente limpias y secas por fuera antes de medir, de otro modo las medidas de absorbancia pueden ser afectadas por errores de lectura.

Completar la siguiente tabla con los valores de absorbancia a 420 nm.

Min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

P1

P2

PC

~ 22 ~

Encontrar la velocidad V0 para cada muestra

Muestra

Velocidad (V0)

Dibujar una grfica donde se muestre la relacin entre absorbancia y el tiempo.

Medicin de la actividad enzimtica en funcin a la concentracin del sustrato.

Se repetir el experimento anterior utilizando 0,4 ml del extracto enzimtico y variando la concentracin de L-DOPA (preferiblemente 5 concentraciones distintas) se medir la absorbancia cada minuto durante 6 minutos.

Enzima Buffer Sustrato 0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 6 min

A 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

B 0,4 ml 3,1 ml 1,5 ml

C 0,4 ml 2,6 ml 2,0 ml

D 0,4 ml 2,1 ml 2,5 ml

E 0,4 ml 1,6 ml 3,0 ml

Nota 1: Para el experimento con 1 ml de DOPA se puede utilizar los datos obtenidos anteriormente

Nota 2: Enzima: Polifenoloxidasa

Buffer: Fosfato de sodio 0,1 M a pH 6,0

Sustrato: D.L-dihidroxifenilalanina 20 mM (L-DOPA)

~ 23 ~

Graficar absorbancia en funcin del tiempo para las diferentes concentraciones de sustrato estudiadas.

Calcular la V0 para las 5 concentraciones de sustrato estudiadas, se puede calcular as: V0 = Abs / t

Una forma ms cientfica es determinando la regresin lineal de los puntos que puedan tener una correlacin 0,98

Completar la siguiente tabla

[ ] ( ) (

)

(

)

[ ] ( )

A

B

C

D

E

~ 24 ~

Representar los datos obtenidos en una grfica doble recproca o de Lineweaver-Burk y hallar grficamente los valores de Km y Vmax.

Calcular matemticamente los valores de y mediante la siguiente expresin

(

[ ])

CUESTIONARIO:

1. Qu enzima se est estudiando? De qu tipo de enzima se trata 2. Cules son los sustratos y los productos in- vivo e in-vitro? 3. Cmo se podr medir la formacin de productos?

~ 25 ~

Prctica N 04

TEMA INHIBICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA POLIFENOLOXIDASA

OBJETIVO(S) Experimentar la extraccin de la enzima polifenoloxidasa de los championes

Evaluar el efecto de inhibidores en la medicin de la actividad enzimtica de la polifenoloxidasa extrada de los championes

Evaluar el efecto de la concentracin de un inhibidor qumico en la medicin de la actividad del pardeamiento enzimtico de la polifenoloxidasa.

Determinar los parmetros cinticos de la actividad de la polifenoloxidasa presente en la presente en los championes tratados con inhibidores qumicos.

MARCO TERICO:

La polifenoloxidasa conocida como tirosinasa, fenolasa, catecol oxidasa, o-difenoloxidasa, monofenol oxidasa cresolasa, fue descubierta y aislada inicialmente de championes; ella acta sobre dos tipos de sustratos: monohidroxifenoles como por ejemplo el p-cresol hidroxilandolos en posicin orto con respecto al grupo hidroxilo original, EC 1.14.18.1, y sobre o-dihidroxifenoles tales como el catecol, oxidndolos a benzoquinonas por remocin de hidrgenos del grupo hidroxilo.

La caracterstica estructural ms importante de la polifenoloxidasa (PPO) es la presencia, en su centro activo, de dos tomos de cobre unidos a histidina. Alrededor de ellos, se sitan aminocidos hidrofbicos con anillos aromticos, importantes para su unin a los sustratos. La primera metodologa utilizada para controlar el pardeamiento enzimtico, consisti en la adicin de sulfitos que actan como agentes reductores transformando las o-quinonas en difenoles menos reactivos para prevenir el desarrollo de melaninas. Si bien de esta forma se previene el pardeamiento enzimtico, su utilizacin ha sido restringida en vegetales y frutas debido a que el uso de esta sustancia present casos de reacciones alrgicas en individuos, especialmente asmticos, que consumieron alimentos que contenan este agente reductor. Las reacciones de pardeamiento enzimtico pueden, tambin controlarse mediante mtodos fsicos que incluyen la reduccin de temperatura y/o de la disponibilidad del oxgeno molecular, el uso de atmsferas modificadas o recubrimientos comestibles y tratamientos con irradiacin gamma o altas presiones hidrostticas. Por otro lado, puede utilizarse mtodos qumicos basados en la utilizacin de compuestos que inhiben la enzima, reducen la disponibilidad del sustrato y/o de los productos de la catlisis enzimtica que evitan la formacin de productos coloreados.

Su aplicacin en los alimentos est restringida debido a consideraciones relevantes tales como la toxicidad, la salubridad y el efecto que puede causar sobre el sabor, la textura o eventualmente por el costo. Entre los agentes reductores utilizados en la actualidad, se encuentra el cido ascrbico que reduce las o-benzoquinonas a o-difenoles. Dado que durante la reaccin este compuesto se consume por oxidacin, la proteccin que confiere es slo temporal y tambin pueden aplicarse los cidos orgnicos para controlar el pardeamiento enzimtico que logran disminuir el pH y garantizar la inocuidad microbiolgica. Adems, algunos de ellos, pueden actuar como fungicidas/fungistticos y como inhibidores del crecimiento de gran parte de la flora de deterioro.

Los acidulantes se utilizan frecuentemente en combinacin con otros agentes de antipardeamiento, debido a que es muy difcil lograr una inhibicin completa del oscurecimiento nicamente por el control del pH. El ms

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utilizado es el cido ctrico que reduce el pardeamiento capturando o quelando el cobre del sitio activo de la PPO, y potencia el efecto de compuestos tales como el cido ascrbico. Otro compuesto de inters es el cido etilendiamino tetraactico (EDTA) que inactiva a la enzima y forma complejos con iones de metales pesados tales como el cobre de la PPO.

Entre las sales propuestas para controlar el pardeamiento la ms usada es el coluro de sodio (NaCl), cuya accin impide la actividad de la polifenoloxidasa frente al cido clorognico. Una inmersin en solucin acuosa diluida de NaCl (0,3%) se usa mucho cuando se quiere evitar por corto tiempo el oscurecimiento de frutas peladas, como rodajas de manzanas, antes de ser sometidas al procesamiento.

El efecto inhibitorio de la POO mediante radiaciones de microondas ha sido objeto de varias investigaciones. En el control del pardeamiento de rodajas de pltano, el tratamiento de inactivacin a 650 W durante 2 minutos mostr grandes variaciones de eficiencia segn la madurez del producto tratado. Con un tratamiento a 475 W durante 60 segundos se obtuvo una inactivacin del 70% de la PPO en purs de kiwi y fresa. La disminucin de la actividad polifenoloxidasa en ambos productos fue casi lineal a la potencia utilizada en el tratamiento. No obstante, el color de los productos tratados trmicamente con microondas se modific como consecuencia de la alteracin que la radiacin provoc sobre las clorofilas en kiwi y sobre los antocianos en fresa. En el caso de champin, se ha propuesto un tratamiento combinado con microondas y bao de agua caliente para conseguir satisfactoriamente la completa inactivacin a tiempos cortos de la PPO.

El modo ms satisfactorio de inhibir el pardeamiento enzimtico es eliminando por completo el oxgeno. Esto puede obtenerse por desoxigenacin a vaco, borboteo de nitrgeno o apelando a la accin combinada de la glucosa oxidasa y la catalasa. Sin embargo, es importante considerar que el oxgeno es un requisito de los tejidos vivos. En el caso de slidos, como las porciones de frutas y hortalizas, la eliminacin del oxgeno ms sencilla es por inmersin en soluciones como jarabe, salmueras o agua para retardar la difusin del oxgeno. Sin embargo, el tejido pardear cuando entre en contacto nuevamente con el aire. Adems, durante el tiempo el cual en el que el tejido est inmerso, el equilibrio osmtico puede producir una prdida de solutos y la imbibicin de la solucin de inmersin, en algunas ocasiones no deseada. Otra alternativa seria el envasado del producto en atmsfera inerte. Pero el desarrollo de metabolismo anaerobio alterara las propiedades organolpticas de las frutas hace este tratamiento inaplicable. Frecuentemente se usan atmsferas modificadas para la comercializacin de frutas y hortalizas Mnimamente Procesadas.


Championes

Agua destilada




Inhibidor 1. Solucin de 2,0 % cido ascrbico + 1,0 % de cido ctrico + 0,5 % EDTA

Inhibidor 2. Solucin de 1,0 % cido ascrbico + 0,5 % de cido ctrico + 0,25 % EDTA

Inhibidor 3. Solucin isotnica de sacarosa 15 Brix + 0,75 % cido ascrbico + 0,25 % de cido ctrico

Inhibidor 4. Solucin isotnica de sacarosa 40 Brix + 0,25 % cido ascrbico + 0,75 % de cido ctrico


Mortero

Bao de hielo


Tubos de ensayo

Gradilla

Balanza gramera

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Pipeta de 20 ml

Pipeta de 5 ml

Pipeta de 2 ml

Pipeta de 1 ml

Pipeta de 0,1 ml


Embudo de vidrio

Beaker de 100 ml

Erlemeyer de 100 ml

Probeta graduada

Papel Whatman N 42




NOTA: Limpiar cuidadosamente los championes para evitar que se daen y se produzca el pardeamiento enzimtico rpidamente; una alternativa es que los championes estn previamente refrigerados a 2 C para retardar el pardeamiento.

Inactivacin de la enzima polifenoloxidasa

Colocar en un Beaker (previamente refrigerado entre 2 a 4 C) 100 ml de la solucin inhibidora

Pesar aproximadamente 20 gramos de championes

Cortar en lminas de 1 a 2 mm de espesor e introducirlos inmediatamente en la solucin inhibidora

Mantener los championes en la solucin inhibidora durante 5 minutos (de ser posible utilice bao de agua helada para mantener la temperatura entre 2 a 4 C)

Sacar los championes y escurrirlos en un papel filtro (mximo 1 minuto)

Continuar inmediatamente con la extraccin de la enzima polifenoloxidasa.

Extraccin de la enzima polifenoloxidasa

Colocar los championes en un mortero pre-enfriado con hielo (tambin puede mantenerse previamente en refrigeracin a 2 C) y agregar 40 ml del Buffer 1; procurar extraer mediante presin la mayor parte de polifenoloxidasa de la muestra.




Medicin de la actividad enzimtica.

La actividad de la polifenoloxidasa puede ser fcilmente determinada colorimtricamente midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm debido a la conversin de la DOPA en DOPA-cromo (color rojo)

Pipetear en cada celda para espectrofotmetro PC= Muestra de calibracin = 0,4 ml E+I; 3,6 ml de Buffer 2 y 1,0 ml de sustrato A= Muestra con 4 mM de L-DOPA = 0,4 ml E+I; 3,6 ml de Buffer 2 y 1,0 ml de sustrato B= Muestra con 6 mM de L-DOPA = 0,4 ml E+I; 3,1 ml de Buffer 2 y 1,5 ml de sustrato C= Muestra con 8 mM de L-DOPA = 0,4 ml E+I; 2,6 ml de Buffer 2 y 2,0 ml de sustrato

Llevar a cero la absorbancia y comenzar a cronometrar rpidamente, medir la absorbancia a 420 nm cada minuto hasta el minuto 6, sin retirar la celda del espectrofotmetro.

~ 28 ~

Repetir el experimento con cada una de los tratamientos a los que ha sido sometido los championes

Completar la siguiente tabla con los valores de absorbancia a 420 nm. I0. Sin inhibidor

I0 E+I Buffer Sustrato 0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 6 min

PC 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

A 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

B 0,4 ml 3,1 ml 1,5 ml

C 0,4 ml 2,6 ml 2,0 ml

I1. Solucin de 2,0 % cido ascrbico + 1,0 % de cido ctrico + 0,5 % EDTA


PC 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

A 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

B 0,4 ml 3,1 ml 1,5 ml

C 0,4 ml 2,6 ml 2,0 ml

I2. Solucin de 1,0 % cido ascrbico + 0,5 % de cido ctrico + 0,25 % EDTA


PC 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

A 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

B 0,4 ml 3,1 ml 1,5 ml

C 0,4 ml 2,6 ml 2,0 ml

I3. Solucin isotnica de sacarosa 15 Brix + 0,75 % cido ascrbico + 0,25 % de cido ctrico


PC 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

A 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

B 0,4 ml 3,1 ml 1,5 ml

C 0,4 ml 2,6 ml 2,0 ml

I4. Solucin isotnica de sacarosa 40 Brix + 0,25 % cido ascrbico + 0,75 % de cido ctrico


PC 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

A 0,4 ml 3,6 ml 1,0 ml

B 0,4 ml 3,1 ml 1,5 ml

C 0,4 ml 2,6 ml 2,0 ml

~ 29 ~

Graficar la Absorbancia vs el tiempo de cada una de las muestras estudiadas

Calcular la V0 para las de sustrato estudiadas, se puede calcular as: V0 = (Abs) / t

Tratamiento I0 Tratamiento I1 Tratamiento I2 Tratamiento I3 Tratamiento I4

A= [ ] 4 mM

A= [ ] 6 mM

A= [ ] 8 mM

Calcular matemticamente los valores de para cada tratamiento, la y el valor de mediante las siguientes expresiones:

(

[ ])

[ ]

~ 30 ~

Graficar para cada tratamiento en estudio [ ] (eje x) vs (eje y); grfica doble recproca o de

Lineweaver-Burk. Hallar grficamente los valores de Km y Vmax.

CUESTIONARIO:

1. Cmo actan los inhibidores en la cintica enzimtica? 2. Esquematice la bioqumica de la actividad de los inhibidores estudiados?

~ 31 ~

Prctica N 05

TEMA EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVO(S) Experimentar la extraccin de la enzima polifenoloxidasa de la uva

Determinar los parmetros cinticos de la actividad enzimtica de la polifenoloxidasa extrada de la uva

Evaluar el efecto de la temperatura en la actividad enzimtica de la polifenoloxidasa extrada de la uva

MARCO TERICO:

El vino es el producto de la fermentacin del mosto de uvas por clulas de levaduras, su caracterstica o calidad organolptica est ntimamente relacionada al buen manejo de la cosecha y cuidado del mosto desde su obtencin, pasando por las diversas etapas de vinificacin y almacenamiento antes de su comercializacin.

Uno de los principales problemas en la elaboracin del vino blanco es el contacto del mosto y del vino con el oxgeno del aire en las diversas secciones de elaboracin. Resulta difcil evitar este contacto durante las etapas de procesamiento, conservacin y almacenamiento. El oxgeno desnaturaliza el aroma, destruye el afrutado y oscurece el color.

Durante la vinificacin, las oxidaciones son ms graves porque el mosto es ms sensible que el vino y ms difcil de proteger, debido a que los sistemas enzimticos siguen intactos, mientras que en el vino la oxidacin se da por oxidacin no enzimtica. La oxidacin de la vendimia estrujada y de las diferentes fracciones del mosto es mucho ms acentuada por la presencia de oxidasas. Las uvas presentan alta actividad de polifenoloxidasas y el oscurecimiento enzimtico ocurre rpidamente en la baya daada o durante la trituracin de uvas frescas para jugos y vinos. La indeseable reaccin de oscurecimiento est asociada a la enzima polifenoloxidasa (PPO) (monofenol, dihidroxi-L-fenilalanina) cuyo nmero cdigo es (E.C. 1.14.18.1). La enzima cataliza dos distintos tipos de reacciones que involucran al oxgeno molecular, llamadas: a) La o-hidroxilacin de monofenoles a o-difenoles o actividad de la cresolasa y b) la subsecuente oxidacin de o-difenoles a o-quinonas o actividad de la catecolasa. El oxgeno para la hidroxilacin de monofenoles para dar o-difenoles viene directamente a partir del O2 no a partir de agua. Un tomo de oxgeno es incorporado dentro del fenol, y el otro dentro del agua formada. As, la polifenoloxidasa acta como una monooxigenasa en esta reaccin. El mecanismo de oxidacin de o-difenoles por la polifenoloxidasa no es conocido con certeza, sin embargo, en este mecanismo existen evidencias de que no son formados intermediarios radicales. Investigaciones sobre la interaccin del O2 y el o-difenol para la enzima indica que el O2 reacciona primero. Este mecanismo es realizado sobre mecanismo Bi. Las polifenoloxidasas que actan sobre las sustancias fenlicas provocando modificaciones intensas, en casos extremos, llegan a producir la quiebra oxidsica, la formacin de sustancias acres y amargas. Las sustancias responsables del aroma del mosto son tambin oxidadas.

El oscurecimiento del color durante las etapas de produccin del vino resulta esencialmente a partir de reacciones qumicas que envuelven compuestos fenlicos, particularmente derivados del flavan 3-ol (catequinas).

Los cambios ms significativos, producidos por la oxidacin de mostos y vinos, son la polimerizacin de fenoles y la generacin de acetaldehdo, este hecho repercute bsicamente en el aspecto fsico del producto ya que causa un cambio radical en el color y en el aroma del mosto, lo que implica la disminucin de la calidad del producto final.

Hasta ahora, el oscurecimiento ha sido considerado principalmente debido al empobrecimiento de las caractersticas sensoriales y a la reduccin de la vida del vino, sin embargo, los aspectos nutricionales del

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oscurecimiento deben tambin tenerse presentes. La oxidacin de los fenoles, conduce a la reduccin de la habilidad de oxidacin del vino y a una reduccin de la disponibilidad de aminocidos esenciales importantes como: lisina, triptfano, histidina, cistena y metionina, por la formacin de compuestos que combinan fenoles y protenas oxidadas en el tracto duodenal del aparato digestivo.

Algunos mtodos utilizados para prevenir el contacto del oxgeno con el vino son: antioxidantes y qumicos, tratamientos trmicos y remocin de polifenoles que han sido propuestos para prevenir el oscurecimiento de los vinos blancos.

La polifenoloxidasa es una enzima resistente a temperaturas menores de 60 C por periodos cortos de tiempo, mientras que a temperaturas mayores de 80 C se muestra una reduccin brusca de la actividad enzimtica. El valor de reduccin decimal a 80 C es de 3,18 minutos, mientras que para 60 C es de 20,31 minutos

La temperatura ptima determinada para la enzima PFO aislada de tallos de clavel de la variedad tolerante fue 45 C. La enzima tuvo su mayor actividad en un intervalo de temperatura entre 37 y 45 C declinando tal actividad a temperaturas superiores a 60C y menores de 37 C. Este intervalo de temperatura concuerda con reportes de PFO de nspero 35 C, Hevea brasilensis 45 C, morera 45 C, ferula 30 C, menta 30 C y manzana 40 C, , entre otros. La notoria disminucin de actividad a temperaturas superiores a 50 C confirman la labilidad de la enzima, al igual que por largos periodos de almacenamiento y manipulacin, condiciones en las cuales la enzima pierde su actividad.


Uva negra

Uva blanca

Agua destilada





Mortero

Bao de hielo


Tubos de ensayo y gradilla

Termmetros

Balanza gramera

Pipeta de 20, 5, 2, 1, 0,1 ml


Papel Whatman N 42




NOTA: conserve en una gradilla todos los tubos que utilice en esta prctica para efectuar comparaciones posteriores.

Extraccin de la enzima polifenoloxidasa

Colocar 60 gr uvas en un mortero pre-enfriado con hielo (tambin puede mantenerse previamente en refrigeracin a 2 C) y agregar 30 ml del Buffer 1; procurar extraer mediante presin la mayor parte de polifenoloxidasa de la muestra.

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Medicin de la actividad enzimtica.

La actividad de la polifenoloxidasa puede ser fcilmente determinada colorimtricamente midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm debido a la conversin de la DOPA en DOPA-cromo (color rojo)

Pipetear en cada celda para espectrofotmetro Muestra = 0,4 ml de Enzima; 3,6 ml de Buffer 2 y 1,0 ml de sustrato Se debe considerar la muestra de correccin de lectura de absorbancia

Controlar la temperatura de trabajo para la cintica enzimtica a desarrollar

Llevar a cero la absorbancia y comenzar a cronometrar rpidamente, medir la absorbancia a 420 nm cada minuto hasta el minuto 9, sin retirar la celda del espectrofotmetro.

Completar las siguientes tablas con mediciones de absorbancia a 420 nm

T1 0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 6 min 7 min 8 min 9 min

PC

5 C

20 C

35 C

50 C

65 C

80 C

Graficar la Absorbancia vs el tiempo de cada una de las muestras estudiadas

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Calcular la V0 para las de sustrato estudiadas, se puede calcular as: V0 = (Abs) / t

5 C 20 C 35 C 50 C 65 C 80 C

V0

Graficar y calcular matemticamente los valores de y mediante las siguientes expresiones:

( ) ( )

(

)

CUESTIONARIO:

1. Qu significa Energa de activacin y que funcin cumple en la cintica enzimtica? 2. Qu significa tiempo de reduccin decimal y como se relaciona con la cintica enzimtica?

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Prctica N 06

TEMA IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO(S) Reconocer cualitativamente los carbohidratos Diferenciar monosacridos, disacridos o polisacridos Diferenciar Hexosas de pentosas Diferenciar e identificar almidones y disacrido Diferenciar e identificar azucares reductores y no reductores Diferenciar aldosas de cetosas. Distinguir la forma de los cristales en mono y disacridos

MARCO TERICO:

El trmino "carbohidratos", o "hidratos de carbono" procede de la antigua forma de escribir la frmula emprica de algunos de los ms importantes, como Cn(H2O)n.. Uno de los carbohidratos, la celulosa, es la sustancia orgnica ms abundante en el conjunto de los seres vivos terrestres. Qumicamente se definen como polihidroxialdehdos o polihidroxiacetonas cclicas o sustancias que luego de hidrolizarse dan origen a los mismos.

Segn el resultado de su hidrlisis, los carbohidratos se pueden clasificar "polisacridos", formados por muchas unidades separables por hidrlisis, "oligosacridos", formados por unas cuantas unidades, y "monosacridos", que son las unidades elementales que no producen, por hidrlisis, unidades de tamao menor. A diferencia de lo que sucede en el caso de las protenas, en el que no existe un corte ntido entre un polipptido grande y una protena pequea, entre oligosacridos y polisacridos naturales existe una divisin clara. Los oligosacridos tienen menos de 20 unidades, mientras que los polisacridos comienzan en los centenares.

Monosacridos.- Podemos definir los monosacridos como polihidroxialdehdos y polihidroxiacetonas.. Los monosacridos se dividen en aldosas y cetosas, segn tengan un grupo aldehdo o un grupo cetona. Aunque existen muchas decenas de monosacridos, solamente dos, glucosa y fructosa, son realmente importantes, como tales, en el mundo de los alimentos.

Aunque se pueden representar en forma abierta, con los grupos aldehdo o cetona evidentes, los monosacridos de cinco o ms carbonos se encuentran fundamentalmente en forma cerrada, es decir, con el grupo carboxilo formando parte de un anillo hemiacetlico, que puede tener 5 o 6 tomos. Si tiene 5 tomos, la forma se llama furanosa, por analoga con la estructura del heterociclo furano, y si tiene 6 tomos, la forma se llama piranosa, por analoga con la estructura del pirano.

Todos los monosacridos son reductores, es decir, su grupo carbonilo es capaz de reaccionar como tal. Esto es importante en la industria alimentaria, porque el poder reductor est relacionado directamente con la capacidad de formar colores y aromas de tostado por reaccin con las protenas.

Disacrido.- Los disacridos o azcares dobles son un tipo de hidratos de carbono, o carbohidratos, formados por la unin de dos monosacridos iguales o distintos mediante enlace O-glucosdico, mono o dicarbonlico, que adems puede ser o en funcin del -OH hemiacetal. Los disacridos ms comunes son: sacarosa (formada por la unin de una glucosa y una fructosa. A la sacarosa se le llama tambin azcar comn), lactosa (formada por la unin de una glucosa y una galactosa. Es el azcar de la leche), maltosa, isomaltosa, trehalosa, celobiosa (formadas todas por la unin de dos glucosas, son diferentes dependiendo de la unin entre las glucosas). La frmula emprica de los disacridos es C12H22O11. El enlace covalente entre dos monosacridos

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provoca la eliminacin de un tomo de hidrgeno de uno de los monosacridos y de un grupo hidroxilo del otro monosacrido. En la mucosa del tubo digestivo del hombre existen unas enzimas llamadas disacaridasas, que hidrolizan el enlace glucosdico que une a los dos monosacridos, para su absorcin intestinal.

Oligosacrido.- Los oligosacridos son polmeros de monosacridos con un nmero de unidades monomricas entre 2 y 10. Los oligosacridos ms presentes en la naturaleza son la inulina, la oligofructosa (fructooligosacridos) y los galactooligosacridos. La inulina y oligofructosa estn formados por cadenas de fructosa que pueden terminar en glucosa o fructosa. Estn presentes en muchos vegetales: achicoria, cebolla, puerro, ajo, pltano, alcachofa, etc. Los galactooligosacridos estn formados por cadenas de galactosa y estn presentes en la leche y en algunas plantas. Los oligosacridos forman parte de los glucolpidos y glucoprotenas que se encuentran en la superficie externa de la membrana plasmtica y por lo tanto tienen una gran importancia en las funciones de reconocimiento celular.

Polisacrido.- Los polisacridos son polmeros, cuyos monmeros constituyentes son monosacridos, los cuales se unen repetitivamente mediante enlaces glucosdicos. Los polisacridos pueden descomponerse, por hidrlisis de los enlaces glucosdicos entre residuos, en polisacridos ms pequeos, as como en disacridos o monosacridos. Su digestin dentro de las clulas, o en las cavidades digestivas, consiste en una hidrlisis catalizada por enzimas digestivas (hidrolasas) llamadas genricamente glucosidasas, que son especficas para determinados polisacridos y, sobre todo, para determinados tipos de enlace glucosdico

Principales Polisacridos : Almidn (qumicamente es una mezcla de dos polisacridos muy similares, la amilosa y la amilopectina), glucgeno (su estructura puede parecerse a la de amilopectina del almidn, aunque mucho ms ramificada que sta), celulosa (se forma por la unin de molculas de -glucosa mediante enlaces -1,4-O-glucosdico. Es una hexosa que por hidrlisis da glucosa. La celulosa es una larga cadena polimrica de peso molecular variable, con frmula emprica (C6H1005)n, con un valor mnimo de n= 200)

Fundamentos qumicos de las pruebas cualitativas.-

Prueba de Molish .- Este ensayo es un ensayo para reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacridos y disacridos se hidrolizan con cido sulfrico concentrado hasta monosacridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales reaccionan con -naftol formando un color prpura violeta.

Prueba de Barfoed.- Es una reaccin para identificar monosacridos, aunque algunos disacridos (los reductores) dan positiva la reaccin, pero con ms tiempo de calentamiento, ya que as se hidroliza el disacrido. El fundamento radica en la reduccin del acetato cprico a oxido cuproso.

Prueba de Bial o de Orcinol-HCl.- Es una prueba especfica para pentosas, el reactivo de Bial contiene orcinol en cido clorhdrico, el cual forma complejos de coloracin slo con las pentosas.. La positividad se reconoce por la formacin de una coloracin verde botella brillante.

Prueba de Seliwanoff.- Este ensayo es especfico para cetosas y se basa en la conversin de la cetosa en 5-hidro-metil-furfural y su posterior condensacin con resorcinol formando as complejos coloreados, se usa casi exclusivamente para identificar fructosa.

Prueba de Lugol.- Es una prueba que se usa para identificar polisacridos. Particularmente el almidn por la formacin de una coloracin azul violeta intensa (El color azul, se debe, posiblemente a la formacin de un complejo: Ioduro de almidn)y el glicgeno y las dextrinas por formacin de coloracin roja .

Prueba de Benedict.- El ensayo de Benedict permite el reconocimiento de carbohidratos reductores (con grupos carboxilos libres), al igual que el reactivo de Fehling, el de Benedict contiene ion cprico en medio alcalino que se reduce hasta xido cuproso en presencia de azcares con el hidroxilo hemiacetlico libre.

Prueba Fenilhidrazina.- Una particularidad importante de los monosacridos consiste en su capacidad de entrar en reaccin con la fenilhidrazina y formar fenilhidrazonas y osazonas. La reaccin de formacin de osazonas transcurre en tres etapas. Al reaccionar los monosacridos con la fenilhidrazina, en la primera etapa se forman fenilhidrazonas solubles en agua (reaccin de sustitucin). En la segunda etapa, con la fenilhidrazonas solubles en agua (reaccin de sustitucin). En la segunda etapa, con la fenilhidrazona formada reacciona otra molcula de fenilhidrazina y, oxidndola, transforma el grupo hidroxilo en grupo carbonilo. La

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tercera molcula de fenilhidrazina entra en reaccin de sustitucin con el grupo carbonilo recin formado, lo que conduce a la formacin de compuestos poco solubles en agua: osazonas, que producen cristales de color amarillo, de forma caracterstica. La forma de los cristales de osazonas es variable y depende de la estructura de los monosacridos, de los cuales se forman las osazonas.

Las osazonas de diferentes monosacridos se distinguen por la forma de los cristales, punto de fusin, solubilidad y actividad ptica. Por eso, estas propiedades se utilizan para aislar los monosacridos de la disolucin, como tambin para distinguir unos azcares de otros. En conclusin es una prueba para distinguir osas (y oligosacridos). Los carbohidratos que solo se diferencian en sus tomos de carbono 1 y/o 2 darn la misma osazona, como es el caso de la glucosa y la fructosa, que son ismeros de funcin.

Glucosa

Galactosa

Arabinosa

Lactosa

Maltosa

Xilosa


Sacarosa comercial (azcar de caa) Huevo entero Yogurt natural

Xilosa 0,1 M

Ribosa al 0,1 M

Arabinosa al 0,1 M

Glucosa al 0,1 M

Fructosa al 0,1 M

Lactosa al 2 %

Maltosa al 2 %

Sacarosa al 2 %

Almidn al 1 %

Casena al 1 %

H2SO4 concentrado

Solucin de Lugol

Reactivo de Benedict

Reactivo de Molish

Reactivo de Barfoed

Reactivo de Bial

Reactivo de Seliwanof

Reactivo de Fenilhidrazina Piceta con agua destilada Balanza analtica ( 0,0001 g) Balanza gramera ( 0,001 g) Microscopio electrnico Porta y cubre objetos Probeta de 10 ml Fiola de 25 ml

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Bureta de 25 ml con soporte Erlemeyer 100 ml Beaker 100 ml Pipeta 1, 2, 5, 10 ml Pipeta Pasteur Tubos de ensayo Gradilla para tubos de ensayo Pinzas para tubo de ensayo Mechero bunsen Cocina elctrica Bao de agua hirviente Esptula Pro pipeta


Identificacin de carbohidratos en sustancias puras

Prueba de Molish.- Colocar en el tubo de ensayo 0,5 ml de la sustancia problema, agregar 4 gotas del reactivo de Molish, mezclar bien y posteriormente dejar caer lentamente y por las paredes del tubo de ensayo 0,5 ml H2SO4 concentrado. La aparicin de un anillo violeta rojizo en el sitio de contacto de los dos lquidos, indica que la muestra contiene carbohidratos.

Sustancias Problema: Ver cuadro de muestras a analizar

Prueba de Barfoed.- Colocar en el tubo de ensayo 1 ml de la sustancia problema, agregar 2,5 ml del reactivo de Barfoed, mezclar bien y calentar en bao de agua hirviente, contando los minutos y sacar del bao cada tubo inmediatamente despus que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato. La aparicin de un precipitado rojo, antes de los 6 minutos, indica la presencia de un monosacrido, entre 9 y 12 minutos indica la presencia de disacrido (lactosa o maltosa) o un polisacrido.


Prueba de Bial.- Colocar en el tubo de ensayo 1 ml de la sustancia problema, agregar 1,5 ml del reactivo de Bial, mezclar bien y llevar a bao de agua hirviente durante 3 minutos. La aparicin de un color verde botella, brillante y totalmente transparente, indica la presencia de una pentosa. Algunos azcares dan una coloracin verde, pero esta es opaca.


Prueba de Lugol.- Colocar en el tubo de ensayo 2 ml de la sustancia problema, agregar 1 gota del reactivo de lugol, mezclar bien y observar. La aparicin de una coloracin azul indica la presencia de almidn y una coloracin roja, indica el glicgeno o eritrodextrina. Si el color no cambia el carbohidrato es un monosacrido o un disacrido.


Prueba de Seliwanof.- Colocar en el tubo de ensayo 1 ml de la sustancia problema, agregar 2 ml del reactivo de Seliwanof, mezclar bien llevar a bao mara hirviente durante 10 minutos. La formacin de un color rojo cereza, indica la presencia de fructosa.


Prueba de Benedict.-Colocar en el tubo de ensayo 0,5 ml de la sustancia problema, agregar 2 ml del reactivo de Benedict, mezclar bien llevar a bao mara hirviente durante 5 minutos. La aparicin de un precipitado verde, amarillo o rojo indica la presencia de un azcar reductor


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Prueba de Fenilhidrazina.- Colocar en el tubo de ensayo 2 ml de la sustancia problema, agregar 0,5 ml del reactivo de Fenilhidrazina, mezclar bien y coloque los tubos en bao de agua hirviendo durante 10 minutos. Al final del periodo de calentamiento, enfre los tubos en chorro de agua. Dejar en reposo durante 5 minutos y posteriormente examine al microscopio la caracterstica de los cristales de osazona, colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto, cubrir con la lmina cubreobjetos, evitando daar a los cristales con movimientos bruscos o excesos de muestra.

Sustancias Problema: Ver cuadro de muestras a analizar Identificacin de carbohidratos en muestras desconocidas

Preparacin de muestra.- Pese 5 gramos de muestra (alimento) y diluya en 95 cc de agua destilada, homogenizar la muestra durante 5 minutos, posteriormente proceder a filtrar con papel whatman N 42, tome del filtrado la muestra y proceda a identificar. Nota: La muestra problema debe ser incolora y sin turbidez, en caso de que esto ocurra procure volver a filtrar o utilizar algunas sustancia decolorante.

Realice la identificacin de carbohidratos siguiendo las tcnicas descritas anteriormente y guindose del siguiente flujo:

Cuadro de muestras a analizar

Prueba Agu

a d

esti

lad

a

Alm

id

n a

l 1

%

Mal

tosa

al 2

%

Lact

osa

al 2

%

Saca

rosa

al 2

%

Glu

cosa

0,1

M

Fru

cto

sa 0

,1 M

Rib

osa

0,1

M

Ara

bin

osa

0,1

M

Xilo

sa 0

,1 M

Cas

en

a al

1 %

Mu

estr

a 1

Mu

estr

a 2

Molish

Barfoed

Bial

Lugol

Seliwanof

Benedict

Fenilhidrazina

CUESTIONARIO:

1. Explique por qu existe variacin en el tiempo de precipitacin (color rojo ladrillo) en los diversos carbohidratos experimentados mediante la prueba de Barfoed

2. Porque la prueba de lugol da positivo con colores diferenciados en el glucgeno y en el almidn

3. Presente las ecuaciones que fundamentan cada prueba cualitativa

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CUADRO RESUMEN:

SUSTANCIA DESCONOCIDA

Prueba de Bial

(-) Otro colorHexosa

(+) Verde Pentosa

Prueba de Lugol

(+) Rojo Amarillo Oscuro

Glucgeno(-) AmarilloDisacarido

(+) AzulAlmidn

Prueba de Barfoed

Precipitado rojo< 6 minutos

Monosacarido

Precipitado rojoentre 9 a 12 minutos

Disacrido o Polisacrido

Prueba de Molish

(-) IncoloraNo es Carbohidrato

(+) Anillo rojo o violeta Carbohidrato

Prueba de Benedict

(+) Precipitado RojoReductor

(-) No cambiaNo es reductor

Sacarosa

Prueba de Seliwanoff

(-) Incoloro o con leve coloracin

Glucosa/Galactosa

(+) Rojo

Fructosa

Prueba de Fenilhidrazina

(+) Cristales en

forma de Palma(Glucosazona)

Glucosa

(+) Cristales en

forma de Estrella(Galactosazona)

Glucosa

(+) Cristales en

forma de Flor(Maltosazona)

Glucosa

(+) Cristales en

forma de Nido(Lactosazona)

Glucosa

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Prctica N 07

TEMA CUANTIFICACION DE CARBOHIDRATOS - Mtodo fenol-sulfrico

OBJETIVO(S) Establecer la curva patrn para la determinacin de glucosa Evaluar la inversin de azcar (sacarosa) por mtodo espectrofotomtrico

MARCO TERICO:

El trmino "carbohidratos", o "hidratos de carbono" procede de la antigua forma de escribir la frmula emprica de algunos de los ms importantes, como Cn(H2O)n.. Uno de los carbohidratos, la celulosa, es la sustancia orgnica ms abundante en el conjunto de los seres vivos terrestres. Qumicamente se definen como polihidroxialdehdos o polihidroxiacetonas cclicas o sustancias que luego de hidrolizarse dan origen a los mismos.

Este mtodo propuesto por Dubois et al en 1956 se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensible a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simple, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con hetero ciclos con el nitrgeno como hetero tomo. La condensacin m

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GUIA BA1 2013