GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS · Microscopio. Cultivos de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella. Placas de Petri con Agar Sabouraud-glucosa. Placas de Petri estériles

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

DOCENTES:

• ALICIA LUQUE

• MARISA BIASOLI

• MARÍA ELENA TOSELLO

• SUSANA AMIGOT

• SILVANA RAMADÁN

• LUCÍA BULACIO

• MAXIMILIANO SORTINO

• CARLOS GÓMEZ

• MIRTA TARTABINI

• HERNÁN DALMASO

• EDUARDO CODINO

• VIRGINIA PODESTÁ

MICOLOGIA


MARISA BIASOLI

MARÍA ELENA TOSELLO

SUSANA AMIGOT

SILVANA RAMADÁN

MAXIMILIANO SORTINO

MIRTA TARTABINI

HERNÁN DALMASO

EDUARDO CODINO

VIRGINIA PODESTÁ

-AÑO 2014-

1


2

TRABAJO PRÁCTICO N° 1

TEMA: ZIGOMICOSIS

Objetivos;

� Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la morfología de los

hongos causantes de Zigomicosis.

� Reconocer la macromorfología de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y

Cunninghamella.

� Reconocer la micromorfología diferencial de los cultivos de Rhizopus, Mucor,

Absidia y Cunninghamella.

Materiales:

� Caja de trabajo.

� Microscopio.

� Cultivos de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella.

� Placas de Petri con Agar Sabouraud-glucosa.

� Placas de Petri estériles.

� Soportes en V.

� Agua destilada estéril.

� Vaspar.

� Cortes histológicos de tejidos de pacientes con Zigomicosis teñidos por las

técnicas de Hematoxilina-Eosina y Groccott.

� Lupa estereoscópica.

Actividades;

� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Rhizopus, Mucor,

Absidia y Cunninghamella.

� Observar las colonias con Lupa estereoscópica.

� Aplicar técnica de microcultivo y observar la micromorfología de las cepas

estudiadas.

� Establecer similitudes y diferencias entre las características morfológicas de

las cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella.

� Estudio de casos clínicos con fichas epidemiológicas

3


TEMA: INFECCIONES POR ESPECIES DE MALASSEZIA

Objetivos:

� Reconocer en examen microscópico directo de escamas la forma parasitaria

del agente etiológico de pitiriasis.

� Conocer la macro y micromorfología de especies de Malassezia spp.

� Conocer los fundamentos e interpretación de pruebas fisiológicas utilizadas

para la identificación de las distintas especies Malassezia.

Materiales:

� Caja de trabajo

� Materiales clínicos: escamas de piel.

� Cultivos en Agar Dixon modificado (ADm) de Malassezia spp.

� Preparados de especies de Malassezia.

� Cultivos en CHROMAgar Malassezia de especies de Malassezia

� Tubos con Agar-Esculina en columna sembrados con especies de

Malassezia.

� Peróxido de hidrógeno 10%- Pipetas Pasteur de vidrio o palillos de madera.

Actividades:

� Realizar exámenes directos con KOH 20 % y Azul de lactofenol de escamas

de piel.

� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Malassezia spp.

� Observar y describir la micromorfología de las diferentes especies de

Malassezia spp.

� Realizar prueba de la Catalasa:

La presencia de catalasa en la cepa en estudio se determina por el agregado de

una gota de peróxido de hidrógeno 10 vol. a una ansada de cultivo sobre un

portaobjeto nuevo y limpio. La aparición de burbujas es considerada una prueba

positiva, sin importar la magnitud de éstas.

� Interpretar los resultados de la prueba de desdoblamiento de la esculina:

Se evalúa la actividad ββββ-glucosidasa usando tubos de agar-esculina. Una ansada

de levaduras jóvenes se inocula por punción en el agar y se incuba 5 días a 32º C.

4

El desdoblamiento de la esculina en esculetina + glucosa se revela por el

oscurecimiento del medio, con liberación de sales de hierro soluble que se

encuentran incorporadas al medio.

� Interpretar los desarrollos obtenidos en placas de CHROMAgar-Malassezia

modificado. Registrar los colores obtenidos, tamaño, producción o no de

precipitado.


5


TEMA: DERMATOFITOSIS: GENEROS MICROSPORUM Y EPIDERMOPHYTON

Objetivos:

� Extraer material de las dermatofítias de las zonas convenientes y en forma

correcta para asegurar la mayor probabilidad de éxito en el examen

micológico.

� Conocer y realizar correctamente el procedimiento para la observación

microscópica del material de las lesiones.

� Reconocer las formas parasitarias en material de piel y faneras,

diferenciándolas de las formas saprofíticas, sobre material queratinoso.

� Ser capaz de sembrar el material proveniente correctamente en los medios de

cultivos adecuados, conociendo la composición y razón de uso de cada uno

de ellos.

� Conocer las características macromorfológicas típicas (aspecto, color,

superficie, etc.) y las posibles variaciones (pleomorfísmo) de las colonias de

dermatofitos (géneros Microsporum y Epidermophyton) más comúnmente

aisladas de las lesiones humanas en nuestro medio.

Materiales:

� Caja de trabajo: ansa, espátula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos,

papel de filtro, gasa, colorante Gueguén, líquido de montar, KOH 20% P/V,

Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, espátula de Drigalsky.

� Microscopios.

� Colonias en Sabouraud-glucosa de; Microsporum canis, Microsporum

gypseum y Epidermophyton floccosum.

� Preparados provenientes de cultivos de adhesión de: Microsporum canis,

Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum.

� Escamas de piel y faneras con elementos fúngicos provenientes de

dermatofitias.

Actividades;

� Observar y describir macromorfológicamente las colonias de Microsporum

canis, Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum.

6

� Observar y describir micromorfológicamente cepas de Microsporum canis,

Microsporum gypseum y Epidermophyton floccosum.

� Observar exámenes directos de escamas de piel, pelos y uñas parasitados.


7


TEMA: DERMATOFITOSIS: GÉNERO TRICHOPHYTON

Objetivos:

� Extraer material de las dermatofitias de las zonas convenientes y en forma

correcta para asegurar la mayor probabilidad de éxito en el examen

micológico.

� Conocer y realizar correctamente el procedimiento para la observación

microscópica del material de las lesiones.

� Reconocer las formas parasitarias en material de piel y faneras,

diferenciándolas de las formas saprofíticas sobre material queratinoso.

� Ser capaz de sembrar el material proveniente correctamente en los medios

de cultivos adecuados, conociendo la composición y razón de uso de cada

uno de ellos. Conocer las características macromorfológicas típicas

(aspecto, color, superficie, etc.) y las posibles variaciones (pleomorfísmo) de

las colonias de dermatofitos (género Trichophyton) más comúnmente

aisladas de las lesiones humanas en nuestro medio.

� Reconocer por observación microscópica los elementos estudiados del

micelio vegetativo y de reproducción asexuada del género Trichophyton.

� Conocer el fundamento y ser capaces de realizar las siguientes técnicas

para: formación de órganos perforadores sobre pelos estériles in vitro,

comprobación de la capacidad de síntesis de la ureasa determinación de

requerimientos nutricionales utilizando los medios:"Trichophyton agar" y

utilización del medio de agar púrpura de Bromo-cresol, glucosa leche.

� Aplicar los resultados obtenidos del estudio morfológico y fisiológico a

claves taxonómicas con el objeto de ubicar un dermatofito dado en el

género y especie correspondiente,

� Saber aplicar los recursos con que cuenta el laboratorio micológico en el

diagnóstico de casos de cronicidad y de portador sano.

� Conocer los criterios a tener en cuenta en los diagnósticos diferenciales.

Materiales:


� Microscopios.

8

� Colonias en Sabouraud-glucosa de: T. rubrum, T. interdigitale y T.

tonsurans.

� Preparados provenientes de cultivos de adhesión de: T. rubrum, T.

interdigitale y T. tonsurans.

� Escamas de piel y faneras con elementos fúngicos provenientes de

dermatofitias.

� Medio de agar púrpura de Bromo-cresol, glucosa, leche.

� Medio de Christensen.

� Medio diferencial "Trichophyton agar":

• -N° 1: Caseína agar

• -N° 2: Caseína + Inositol agar

• -N° 3 : Caseína + Inositol + Tiamina agar

• -N° 4 - Caseína + Tiamina agar

• -N° 5.- Caseína + ácido nicotínico agar

• -N° 6: Nitrato de amonio agar

• -N° 7: Nitrato de amonio + Histidina agar

Actividades;

� Observar y describir macromorfológicamente las colonias de T. rubrum, T.


� Observar y describir micromorfológicamente cepas de T. rubrum, T.


� Realizar exámenes directos de materiales parasitados: escamas de piel,

pelos y uñas.

� Realizar la siembra de T. rubrum, T. interdigitale en medio de Christensen.

Incubar durante 4 días a 28 °C.

� Sembrar las cepas de T. rubrum, T. interdigitale por la técnica del anzuelo

queratinoso. Incubar durante 4 semanas a 28 °C.

� Realizar la siembra de T. rubrum, T. interdigitale en medio de agar púrpura

de Bromo-cresol, glucosa, leche. Incubar durante 7 días a 28 °C.

� Utilizar el test de Trichophyton agar": Nº1 y Nº4 (Incubado durante 15 días

a 28 °C) para diferenciar: T. rubrum, T. interdigitale y T. tonsurans.


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TRABAJOS PRÁCTICOS N° 5

TEMA: CANDIDIASIS

Objetivos:

� Reconocer la presencia de levaduras, pseudomicelio y/o filamentos

en materiales biológicos por exámenes directos o coloración.

� Conocer la macro y micromorfología de los agentes productores de

Candidiasis.

� Utilizar medios cromogénicos para la detección de mezcla de

levaduras.

� Utilizar técnicas rápidas para la identificación de Candida albicans y

Candida dubliniensis.

� Utilizar otros métodos de identificación para especies de levaduras no

Candida albicans.

� Interpretar los resultados del laboratorio para los distintos materiales

clínicos y relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una

ficha de anamnesis.

Materiales:

� Caja de trabajo

� Materiales clínicos; secreción vaginal, orina, escamas de piel o uñas,

hisopados de mucosa, hemocultivos.

� Extendidos de materiales clínicos teñidos con GN, MGG y ZN.

� Cultivos en Sabouraud glucosa de C albicans, C. dubliniensis, C

glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis.

� Cultivos en CHROMagar Candida de C albicans, C. krusei, C.

tropicalis.

� Kit de identificación API 20 C Aux e ID32.

� Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM).

� Tubos de hemólisis con 0,5 ml de suero.

� Microscopio-

� Placas de CHROMagar Candida

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Actividades:

� Análisis micológico de materiales clínicos y realización de las pruebas

bioquímicas para la identificación de las levaduras aisladas.

� Observar y describir los extendidos de materiales profundos teñidos con

GN, MGG y ZN.

� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Candida.

Efectuar un preparado directo de estas colonias con Líquido de montar y

Gueguén. Describir la micromorfología.

� Observar los diferentes colores de las colonias de Candida en medio

CHROMagar Candida.

� Sembrar las diferentes especies de Candida en suero. Incubar

durante 2 hs 30 ' a 37 °C y observar la formación de tubos

germinativos,

� Observar y describir la micromorfología de las colonias de Candida

en AHM.

� Leer los resultados obtenidos para una levadura incógnita en un blister de

ID 32 C. Realizar la identificación de las levaduras utilizando el soporte

informático correspondiente.

� Observar los cultivos correspondientes a diferentes materiales clínicos con

desarrollo de colonias de levaduras e interpretar los resultados.

� En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes,

los materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de

una Candidiasis.


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TEMA: TRICHOSPORONOSIS - GEOTRICOSIS

Objetivos:

� Conocer la macro y micromorfología de Trichosporon sp. y Geotrichum

sp. agentes productores de Trichosporinosis y Geotricosis.

� Reconocer la micromorfología de Trichosporon sp., Geotrichum sp. por

observación del desarrollo en agar harina de maíz, preparados directos

de las colonias y cultivos de adhesión.

Materiales:

� Caja de trabajo

� Cultivos en Sabouraud glucosa de Trichosporon sp. y Geotrichum sp.

� Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM) sembrado con

Trichosporon sp y Geotrichum sp.

� Cultivos en CHROMagar Trichosporon sp. y Geotrichum sp.

Actividades:

� Observar y describir la macromorfología de las colonias de

Trichosporon sp. y Geotrichum sp.

� Observar y describir la micromorfología de Trichosporon sp. y

Geotrichum sp. en AHM.

� Observar los diferentes colores de las colonias en medio CHROmagar

Candida.


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TEMA: CRIPTOCOCOSIS

Objetivos:

� Reconocer en examen microscópico directo de LCR, con tinta china y

Gueguén, la forma parasitaria del agente etiológico de la Criptococosis.

� Conocer y describir la macro y micromorfología de Cryptococcus

neoformans en medio Sabouraud glucosa.

� Conocer y describir la micromorfología de Cryptococcus neoformans en

medio agar chocolate y AHM.

� Desarrollar habilidad para identificar en forma presuntiva y definitiva las

levaduras de este género.

Materiales:

� Caja de trabajo

� Materiales clínicos: LCR.

� Cultivos en Sabouraud glucosa de Cryptococcus neoformans.

� Placas de Petri con Agar Harina de Maíz (AHM) sembrado con

Cryptococcus neoformans.

� Placas de Petri con Agar chocolate sembrado con Cryptococcus

neoformans.

� Placas con Agar Semilla de girasol

Actividades:

� Realizar exámenes directos con tinta china y Gueguén de LCR.

� Observar y describir la macromorfología de las colonias de Cryptococcus

neoformans.

� Observar y describir la micromorfología de Cryptococcus neoformans en

Sabouraud, agar chocolate y AHM.

� Realizar pruebas bioquímicas mínimas para identificación presuntiva

� Prueba de ureasa

� Siembra en medio semilla de girasol

� Siembra en medio CGB, (diferencial de C neoformans y C gatti)


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Técnicas: Pruebas bioquímicas necesarias para la identificación del género

Cryptococcus

� Siembra de levaduras en el medio diferencial Agar semillas de girasol.

La técnica se basa en la detección de la actividad de la enzima fenoloxidasa

presente en estas levaduras, dando un compuesto de color marrón.

� Determinación de la producción de ureasa en medio de Christensen (medio

empleado en pruebas bioquímicas bacteriológicas). Incubar por 4 días a 28º C

� Prueba rápida para la detección de actividad ureasa en levaduras.

Reactivos:

Solución A: (guardar en frasco color caramelo) REACTIVO 1 WIENER

Fenol 50g

Nitropursiato de sodio 0.25 gr

Agua destilada csp 1000ml

Solución B: (no usar luego de 3 meses) REACTIVO 2 WIENER

NaOH 25gr

Hipoclorito de Na 80g/00 26.5 ml

Agua destilada csp 1000ml

Solución de urea 0.6 g% en agua destilada (preparar en el momento)

Técnica:

Se parte de un cultivo de 24-48 hs, en Sb-G.

1. Suspender colonia en 0.5 ml de solución de urea 0.6%,

2. Incubar 10’ a 37ºC

3. Agregar 0.5 ml Rvo A REACTIVO 1 WIENER

4. Agregar 0.5 ml Rvo B REACTIVO 2 WIENER

5. Incubar 5’

6. Usar controles positivo C neoformans, negativo C albicans

Interpretación de los resultados:

POSITIVO: Azul intenso

NEGATIVO. Celeste o verde pálido

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� Prueba para diferenciar C neoformans de C gatti

Medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB)

El evaluar la capacidad de asimilar la L-canavanina y la glicina, nos permite realizar

la determinación de la variedad del Cryptococcus en estudio. Datos todos estos,

importantes en lo referente, al estudio epidemiológico de la criptococosis

Reactivos:

Solución A: glicina 10 g;

fosfato de potasio monobásico KH2PO4 1 g;

sulfato de magnesio MgSO4 1 g;

tiamina-HCl 1 mg;

sulfato de L-canavanina 30 mg;

agua destilada 100 ml;

pH 5,6.

Se esteriliza por filtración (0,45 m).

Solución B:

azul de bromotimol 0,4%;

agua destilada 100 ml.

Para 100 ml del medio:

• solución B 2 ml; agua destilada 88 ml; agar 2 g;

• solución A 10 ml.

Se mezcla la solución B con el agua destilada y el agar. Se esteriliza en autoclave y,

al entibiar, se agrega la solución A. Se distribuye a razón de 4 ml por tubo, dejando

solidificar con taco y bisel.

A partir de un cultivo de 48 horas de crecimiento a 35°C en medio de SbGl, se

procedió a realizar la siembra en la superficie del bisel. Se dejaron a temperatura

ambiente y se observaron diariamente hasta un máximo de 5 días.

Interpretación de los resultados:

• Color amarillo o amarillo-verdoso = C. neoformans;

• Color azul de cobalto = C. gattii.

15

TRABAJO PRÁCTICO N° 8:

TEMA: NEUMOCISTOSIS

Objetivos:

� Realizar una observación / mostración de coloraciones de materiales

respiratorios, (BAL, esputo), provenientes de pacientes con esta micosis, para

adquirir conocimiento sobre las formas parasitarias de la misma.

Materiales:

� Extendidos de materiales profundos teñidos con Azul de toluidina.

� Microscopios.

Actividades;

� Observación microscópica con aumento 100 x

Técnica: Búsqueda de Pneumocystis en Materiales Biológicos

Técnica de Tinción Azul de Toluidina

Preparación de reactivos

� Reactivo de Sulfatación

• Acido Acético Glacial 45 ml

• Acido Sulfúrico 15 ml

� Reactivo Azul de Toluidina

• Azul de Toluidina 0.16 gr.

• Agua Destilada 60 ml

• Acido Clorhídrico 2 ml

� Alcohol Etílico Absoluto 140 ml

Preparación de la muestra a procesar:

� Lavado broncoalveolar: centrifugar a 2.500 rpm 5 min. Y realizar con el

sedimento al menos tres frotis

� Esputo ó secreción bronquial: Agregar perlas de vidrio y dos o tres gotas de

hidróxido de sodio al 10 %. Realizar al menos 6 frotis.

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Técnica de coloración

1. Reactivo de Sulfatación 10 minutos

2. Agua corriente bajo la canilla (lado opuesto al preparado) 1 minuto

3. Reactivo azul de toluidina 5 minutos o 10 minutos o mas según la antigüedad del

reactivo

4. Alcohol etílico al 95 % 10 segundos

5. Alcohol etílico puro 10 segundos

6. Alcohol etílico puro 10 segundos

7. Xilol (no es indispensable) 10 segundos

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TEMA: SENSIBILIDAD A ANTIFÚNGICOS

Objetivos:

� Conocer las distintas metodologías utilizadas para la determinación de

sensibilidad antifúngica para hongos filamentosos y levaduriformes.

� Utilizar le método de Difusión en Disco para la determinación de actividad

antifúngica de levaduras del género Candida.

� Interpretar los resultados de las distintas metodologías y evaluar su

importancia en el tratamiento del paciente.

Materiales:


� Microscopio.

� Cultivos de cepas de Candida

� Placas de Petri con Agar Muëller Hinton modificado.

� Discos conteniendo Anfifúngicos comerciales

� Escala de Mac Farland

Actividades:

� Aplicar la técnica de Difusión en Disco para levaduras del género Candida.

� Interpretar los resultados obtenidos de determinaciones realizadas por el

método de Difusión en Disco, de Microdilución en Caldo y E-test.

� Evaluar ventajas y desventajas de las distintas metodologías.

Problemas

Problema 1

Se determinó la sensibilidad antifúngica, por el método de difusión en agar, de

dos cepas de Candida causantes de Candidiasis orofaríngea aisladas de pacientes

HIV positivo.

a) Se determinaron los diámetros de los halos de inhibición para los distintos

microorganismos frente a los antifúngicos estudiados. Complete el cuadro con la

interpretación de esos hallazgos.

18

Anfotericina Fluconazol Itraconazol

Halo Interpret. Halo Interpret. Halo Interpret.

Cepa 1 22 mm 20 mm 18 mm



C. parapsilosis ATCC 22019 22 mm 22 mm 20 mm

C. krusei ATCC 6258 20 mm 20 mm

b) ¿De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede

afirmar que el método fue realizado de forma correcta?

c) ¿Qué puede concluir sobre la susceptibilidad antifúngica de las cepas aisladas?

d) En pacientes infectados con HIV la infección oral causada por C. albicans es un

cuadro recidivante que suele precisar tratamientos con azoles de larga duración

o de numerosos ciclos para conseguir su remisión. El crecimiento de la

población con SIDA multitratada con azoles ha dado lugar a un aumento notable

de las descripciones de casos de candidosis oral o esofágica que no responden

al tratamiento con fluconazol. ¿Qué importancia tiene la determinación de

susceptibilidad antifúngica en estos casos?

Problema 2

Se determinó la susceptibilidad antifúngica de dos cepas de C. albicans provenientes

de flujo vaginal a través del método de microdilución en caldo.

El diseño de las microplacas se encuentra debajo.

- Filas A y B: C. albicans. Cepa 1

- Filas C y D: C. albicans. Cepa 2

- Filas E y F: C. parapsilosis ATCC 22019

- Filas G y H: C. krusei ATCC 6258

a) ¿Cuáles fueron las CIMs para las distintas cepas estudiadas frente a Fluconazol

e Itraconazol?

b) De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede

afirmar que el método fue realizado de forma correcta?

c) ¿Qué puede concluir sobre la susceptibilidad antifúngica de las cepas aisladas?

19

Fluconazol Itraconazol

Fluconazol Itraconazol

CIM Interpretación CIM Interpretación

Cepa 1 16 0,125

Cepa 2 1 0,06

Candida parapsilosis ATCC 22019 1 0,25

Candida krusei ATCC 6258 32 1

d) Algunos autores consideran que se está produciendo un cambio en los agentes

etiológicos de Candidiasis vaginales siendo cada vez es más frecuente la

implicación de especies menos sensibles a los azoles o que desarrollan

fácilmente resistencia. Se piensa que puede existir una relación entre

resistencia secundaria a los azoles en las cepas de C. albicans procedentes de

mujeres inmunocompetentes, tratadas con fluconazol y la recidivas de las

vaginitis fúngicas. ¿Qué importancia tiene la determinación de la susceptibilidad

antifúngica en estos casos? ¿A qué puede atribuir los resultados obtenidos para

la cepa 2? ¿Qué antifúngico utilizaría en cada caso?

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03

Control de crecimiento Control de esterilidad

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12


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TEMA: HISTOPLASMOSIS

Objetivos:

� Reconocer la macro y micromorfología de Histoplasma capsulatum.

� Reconocer la forma parasitaria de Histoplasma capsulatum.

Materiales:

� Colonias de Histoplasma capsulatum en Sabouraud-glucosa cultivadas a

28°C.

� Colonias de Histoplasma capsulatum en Sabouraud-glucosa cultivadas a

37°C.

� Preparados directos de las colonias del hongo a 28° y 37°C.

� Coloraciones con la técnica de Giemsa y May Grunwald Giemsa de

materiales obtenidos de pacientes.

� Caja de trabajo

� Microscopio

Actividades

� Observar y describir la forma parasitaria a partir de materiales clínicos.

� Observar y describir la macromorfología de este hongo a 28° y 37°C.

� Observar y describir la micromorfología en los preparados directos de las

colonias a 28° y 37°C.


21


TEMA: INMUNODIAGNOSTICO

Objetivos:

� Conocer los métodos de preparación de los antígenos usados en reacciones

serológicas para el estudio de las micosis

� Aprender a realizar la técnica de inmunodifusión de Outcherlony

� Conocer la técnica inmunológica de aglutinación de partículas de látex para el

diagnóstico de Criptococosis

� Interpretar los resultados obtenidos en el estudio del estado inmunológico de

pacientes afectados con las micosis sistémicas.

Materiales:

� Portaobjetos con capa delgada de agar precipitinas. Tubos con agar

precipitinas

� Antígenos y antisueros fúngicos. Sueros de pacientes.

� Plantilla y sacabocado, Agua destilada, cajas de Petri.


� Kit comercial de aglutinación de partículas de látex para diagnóstico de

Criptococosis

Actividades

� Armado de los portaobjetos con la placa delgada de agar precipitinas.

� Preparación de agar precipitinas y realizar con la plantilla las perforaciones

correspondientes.

� Observar e interpretar resultados de reacciones inmunológicas practicadas

según técnica de Inmunodifusión de Outcherlony.

� Conocer y desarrollar técnicas auxiliares de diagnóstico: “producción de

exoantígenos.

Técnica: INMUNODIFUSION DE OUTCHERLONY

Preparación de los portaobjetos:

Se diluye 1 ml de agar para inmunodifusión en 7 ml de agua destilada y se coloca en

baño de agua a 70 ºC; se cubre los portaobjetos perfectamente limpios y

22

desengrasados con alcohol; con una película de esta preparación, se desparrama

con el dedo para que quede rugoso y se deja secar en la estufa de 37 ºC hasta que

se forme una capa seca y opaca. Luego se agregan entre 2.5 y 2.8 ml de agar para

inmunodifusión sin diluir por portaobjetos. Una vez solidificados se los colocan en

cámara húmeda y se conservan en heladera hasta el momento de su uso. Pueden

guardarse hasta una semana en estas condiciones.

Realización de la prueba:

Con un sacabocados de 4 mm, se cortan el agar de acuerdo con un esquema de 6

hoyos periféricos y uno central. Previo El cortador se usa en posición vertical.

Los cilindros de agar se retiran con aguja o espátula. En el orificio central se coloca

el antígeno correspondiente y en los periféricos los sueros problema y un suero

control positivo. Todas las cavidades se llenan hasta el borde

La incubación se hace a temperatura ambiente durante 72 horas, pero es

conveniente observar diariamente la reacción.

Finalizada la incubación, los portaobjetos se cubren con una solución de citrato de

sodio pH 8.2 durante 2 horas con el objeto de hacer desaparecer los halos formados

por los sueros que dificultan la observación de las bandas de precipitación y para

eliminar las bandas producidas por una proteína llamada sustancia C. Luego de ese

lapso se vuelca el tampón y se procede a ver la existencia de bandas de

precipitación que indican presencia de anticuerpos precipitantes en el suero

estudiado. Es necesario colocar una fuente de iluminación debajo de la placa para la

mejor visualización de los resultados. En casos de pruebas positivas se debe realizar

una titulación, efectuando diluciones seriadas al doble y repitiendo la prueba.

Siempre se debe realizar una coloración final, sobre todo en casos de pruebas

negativas (para confirmarlas), y en casos de titulaciones; se observa que bandas

muy débiles se observan luego de esta maniobra.

23

TRABAJO PRÁCTICO Nº 12

TEMA: PARACOCCIDIOIDOMICOSIS

Objetivos:

� Reconocer la macro y micromorfología de Paracoccidioides brasiliensis.

� Reconocer las formas parasitarias de Paracoccidioides brasiliensis.

Materiales:

� Caja de trabajo

� Microscopios

� Colonias de P. brasiliensis en Sabouraud glucosa cultivadas a 28°C y en

SABHI (Sabouraud glucosa: agar cerebro corazón) cultivadas a 37°C.

� Preparados directos de las colonias de P. brasiliensis a 28 y 37°C.

� Corte histológico teñido con Gomori-Groccott de testículo de cobayo infectado

con P. brasiliensis.

� Preparados de lesiones clínicas de pacientes teñidos con la técnica de May

Grunwald-Giemsa y Gomori-Groccott.

Actividades:

� Observar y describir la macromorfología de P. brasiliensis a 28 y 37°C.

� Observar y describir la micromorfología en los preparados directos de las

colonias correspondientes.

� Observar y describir las formas parasitarias de este hongo.


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24


TEMA: COCCIDIOIDOMICOSIS

Objetivos:

� Reconocer la macro y micromorfología de colonias de Coccidioides sp. en

medio de Sabouraud-glucosa.

� Reconocer las formas parasitarias de Coccidioides sp.

Materiales:

� Colonias en Sabouraud-glucosa de Coccidioides sp.

� Cultivos de adhesión de Coccidioides sp.

� Preparados de esférulas de Coccidioides sp. en de cortes histológicos

realizados con material de testículo de cobayo con PAS, y de biopsia con

Giemsa.

� Preparados con KOH de Coccidioides sp. de biopsia

� Caja de trabajo

� Microscopio

Actividades

� Observar y describir la macromorfología del desarrollo de Coccidioides sp. En

Sabouraud-glucosa a 28°C.

� Observar y describir la micromorfología del desarrollo de Coccidioides sp. En

Sabouraud-glucosa a 28°C.

� Observar y describir las formas parasitarias de Coccidioides spp en cortes de

tejido en fresco y con coloraciones permanentes.

� En una ficha de anamnesis, señalar las posibles causas predisponentes, los

materiales a extraer y qué resultados se esperan obtener en caso de una

posible Coccidiodomicosis.


25


TEMA: ASPERGILOSIS

Objetivos:

� Reconocer la presencia de filamentos en materiales biológicos por exámenes

directos o coloración.


Aspergilosis.

� Interpretar los resultados del laboratorio para los distintos materiales clínicos y

relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una ficha de

anamnesis.

� Analizar la importancia de los estudios serológicos en pacientes

inmunocompetentes e inmunocomprometidos.

� Identificar taxonómicamente las especies frecuentemente involucradas en las

diferentes patologías en el hombre.

Materiales:


� Extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN.

� Cultivos en Czapek y APD de Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger y A.

terreus.

� Preparados de cultivos de adhesión de Asperillas fumigatus, A. flavus, A.

niger y A. terreus

� Microscopios.

Actividades;

� Observar y describir los extendidos de materiales profundos teñidos con GN,

MGG y ZN y Groccot.

� Observar y describir la macromorfología de las colonias de las especies de

Aspergillus.

� Observar y describir la micromorfología de las colonias de Aspergillus.

� Discutir resultados de pruebas micoserológicas.



posible Aspergillosís. Señalar la importancia del diagnóstico serológico.

26

� Identificar taxonómicamente una cepa del género Aspergillus aislada de

material clínico.


27


TEMA: HIALOHIFOMICOSIS

Objetivos:

� Reconocer la presencia de filamentos en materiales biológicos por exámenes

directos o coloración.


Hialohifomicosis: Penicillium sp, Fusarium sp, Scopulariopsis sp. y

Acremonium sp.

� Interpretar el valor de los resultados del laboratorio en los distintos materiales

clínicos y relacionarlos con las posibles causas predisponentes en una ficha

de anamnesis.

� Identificar taxonómicamente las especies frecuentemente involucradas en las

diferentes patologías en el hombre.

Materiales:

� Caja de trabajo:

� Extendidos de materiales profundos teñidos con GN, MGG y ZN.

� Cultivos en Czapek, APD, MEA y SNA de Penicillium sp., Fusarium sp.,

� Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.

� Preparados de cultivos de adhesión de Penicillium sp., Fusarium sp.,

Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.

� Microscopios.

Actividades;

� Observar y describir los extendidos de materiales profundos.

� Observar y describir la macromorfologia de las colonias de las especies de

Penicillium sp., Fusarium sp., Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.

� Observar y describir la micromorfología de las colonias de Penicillium sp.,

Fusarium sp. Scopulariopsis sp. y Acremonium sp.



posible Hialohifomicosis.


28


TEMA: MICETOMA.

Objetivos:

� Reconocer las formas parasitarias de actinomicetales y eumicetes

productores de micetomas.

� Aplicar los conocimientos de los pasos del análisis micológico a un examen

correcto de un presunto micetoma.

� Reconocer la macromorfología y micromorfología de Madurella mycetomatis,

M. grisea, Pseudoalescheria boydii (Scedosporium apiospermum)

� Usar e interpretar guías que permiten diferenciar a los agentes productores de

micetomas eumicóticos.

Materiales;


� Microscopios.

� Colonias desarrolladas en Sabouraud glucosa, Agar harina de maíz y Agar

papa dextrosa de las cepas mencionadas.

� Preparados de cultivo de adhesión de M. mycetomatis, M. grisea y

Pseudoalescheria boydii (Scedosporium apiospermum).

� Frotis y cortes histológicos con elementos parasitarios actinomicetales y

eumicetes productores de micetomas.

� Gránulos de muestras de micetomas.

Actividades;

� Observar y describir macroscópicamente las colonias de las cepas

mencionadas.

� Diferenciar las formas parasitarias de actinomicetales y eumicetes

productores de micetomas.

� Observar microscópicamente los preparados provenientes de cultivos de

adhesión de M. mycetomatis, M. grisea y Pseudoalescheria boydii (S.

apiospermum).


29


TEMA: CROMOBLASTOMICOSIS

Objetivos:

� Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la forma parasitaria de

los agentes de Cromoblastomicosis.

� Reconocer la macromorfología de estos hongos dematiáceos.

� Reconocer microscópicamente los distintos tipos de reproducción de estos

hongos: Cladosporium, Phialophora y Rhinocladiella.

Materiales:


� Microscopio.

� Cultivos de cepas de Phialophora verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Rhinocladiella

aquaspersa, Cladophialophora carionii.

� Cortes histológicos de pata de ratón inoculado, teñidos por las técnicas de

Groccott.

� Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión de Phialophora

verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Rhinocladiella aquaspersa, Cladophialophora

carionii.

Actividades;

� Observar la forma parasitaria de los agentes de Cromoblastomicosis.

� Observar y describir la macromorfología y la micromorfología de estas

especies.


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TEMA: FEOHIFOMICOSIS

Objetivos:

� Reconocer en cortes histológicos de materiales clínicos la forma parasitaria

de los agentes de Feohifomicosis.

� Reconocer la macromorfología de estos hongos dematiáceos.

� Reconocer microscópicamente los distintos tipos de reproducción de estos

hongos: anelides, fíalides, etc.

Materiales:


� Microscopios.

� Cultivos de cepas de Curvularia Iunata, Alternaría sp., Wangiella dermatitidis.

� Cortes histológicos de pata de ratón, teñidos por las técnicas de Gomori-

Groccott.

� Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión de Curvularia

Iunata, Alternaría sp., Wangiella dermatitidis.

Actividades:

� Observar la forma parasitaria de los agentes de Feohifomicosis.

� Observar y describir la macromorfología de estas especies.

� Observar y describir la micromorfología de estas especies obtenidas por cultivo

de adhesión.


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TEMA: ESPOROTRICOSIS

� Objetivos:

�

� Reconocer microscópicamente las formas parasitarias de Sporothrix schenkii.

� Reconocer macro y micromorfológicamente las colonias de Sporothrix

schenkii.

� Relacionar las características morfológicas observadas con el dimorfismo de

Sporothrix schenkii

� Relacionar el cuadro clínico de la enfermedad con los factores predisponentes

y vías de infección del hongo.

Materiales:


� Microscopio.

� Cortes histológicos de cola y pata de rata teñidos por las técnicas de PAS y

Groccott.

� Cultivos de Sporothrix schenkii en Sabouraud-glucosa a 28 °C.

� Preparados obtenidos por la técnica de cultivo de adhesión a 28 °C en

Sabouraud-glucosa y Agar-harina de maíz.

Actividades:

� Observar la forma parasitaria de Sporothrix schenkii en cortes histológicos y

coloraciones.

� Observar y describir macro y micromorfológicamente las colonias de

Sporothrix schenkii.

� Observar cola de rata inoculados en forma experimental.


Documents

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS · Microscopio. Cultivos de cepas de Rhizopus, Mucor, Absidia y Cunninghamella. Placas de Petri con Agar Sabouraud-glucosa. Placas de Petri estériles