28.10.2018

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Datum Thema Dozent08.10. DNA-Modifikation, DNA-Restriktion,

Vektoren, DNA-Klonierung, DNA-Sonden, Southern-Blot-AnalyseKoloniehybridisierung, Plaquehybridisierung, Fragenkatalog

Göttfert15.10.22.10.29.10.30.10. (4. DS) Tausch der Stunde mit Prof. Vollmer (05.11.)

PCRDNA-SequenzierungMolekulare Diagnostik, ForensikProteinanalytik (SDS-PAGE, Western)

Dahmann

Entwicklungsgenetik / Modellorganismen/Mutagenese/ES Zellen/ Knock-out/ Knock-in / Gentherapie / Stammzellen / Medizin.Genetik

Brand

Purinbasen

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Pyrimidinbasen

Die Struktur der B-DNA

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Möglichkeiten zur Bildung von Wasserstoffbrücken mit Proteinen

Aufbau des oriC von Escherichia coli

GATC

Die Dam‐Methyltransferase methyliert die Base Adenin in der Sequenz GA*TCDie Dcm‐Methyltransferase methyliert die Base Cytosin in der Sequenz CC*A/TGG

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Phage Bakterienrasen (E. coli-Stamm)

B K C

B 1 4x10-4 1

K 10-4 1 1

C 10-4 4x10-4 1

Wahrscheinlichkeit der Lochbildung eines Partikels des Phagen auf einem bestimmten Bakterienrasen, in

Abhängigkeit von der Wirtszelle, in der er entstanden ist

Typ Aufbau Cofaktoren Schnittstelle (relativ zur Erken-nungssequenz)

I Multifunktionell, bestehend aus 3 Untereinheiten (drei Gene)

Mg2+, ATP, AdoMet = SAM

oft > 1 kb entfernt

II Einfach, getrennte Enzyme für Restriktion und Modifikation (zwei Gene)

Mg2+ An einer bestimmten Stelle innerhalb der symmetrischen Erkennungssequenz

III Bifunktionelles Enzym aus zwei Untereinheiten (Gene mod und res)

Mg2+, ATP, (AdoMet)

Schnitt erfolgt in einer bestimmten Distanz von der asymmetrischen Erkennungs-sequenz.

Mcr/Mrr Mehrere Untereinheiten und Gene, keine Modifikationsenzyme

Mg2+, GTP, (McrBC)

schneidet DNA mit modifizierten C- und A-Resten (nicht jedoch Dcm-methylierte DNA)

Typen von Restriktionsenzymen

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Das Restriktions- und Modifikationssystem (R-M) vom Typ IA

Funktion eines R-M-Systems vom Typ I

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Restriktions-enzym

Typ Erkennungssequenz Bakterium

EcoKI IA*

5'-AAC(N6)GTGC-3'3'-TTG(N6)CACG-5'

*

Escherichia coli

EcoBI IA *5'-TGA(N8)TGCT-3'

E. coli

StySBI IA *5'-GAG(N6)RTAYG-3'

Salmonella typhimurium

StySPI IA *5'-AAC(N6)GTRC

S. typhimurium

StySQI IA *5'-AAC(N6)RTAYG-3'

S. typhimurium

Beispiele von Restriktionsenzymen

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Restriktions-enzym

Typ Erkennungssequenz Bakterium

AvaI II * ° * *5'-C(C/T)CG(A/G)G-3'

Anabaena variabilis

BamHI II ° *°5'-GGATCC-3'

Bacillus amyloliqufaciens H

BglII II °5'-AGATCT-3'

Bacillus globigii

BclI II * 5'-TGATCA-3'

EcoRI II ** *5'-GAATTC-3'

E. coli RY13

HaeIII II *°5-GGCC-3'

Haemophilus aegypticus

DpnI II CH3I

5'-GATC-3'

Streptococcus pneumoniae

DpnII II * °5'-GATC-3'

S. pneumoniae

PstI II * * 5'-CTGCAG-3'

Providencia stuartii

Restriktions-enzym

Typ Erkennungssequenz Bakterium

EcoP15 III *5'-CAGCAG-spacer-CTGCTG-3'

Phage P1

McrBC DNA, die 5-meC, N4-meC und hmC in bestimmten Sequenzkontexten enthält; schneidet Dcm-methylierte DNA nicht

E. coli

Beispiele von Restriktionsenzymen

Basen, deren Modifikation die Restriktion verhindert, sind durch einen Stern markiert. Basen, deren Modifikation die Restriktion nicht unterbindet, sind durch einen Kreis markiert. Zu beachten ist, dass nur ein Strang gezeigt ist (außer bei EcoKI)

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Hypothetische Evolution der Bakterien-Phagen-Interaktion

Hypothetische Evolution der Bakterien-Phagen-Interaktion

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Verknüpfung von DNA-Enden mitT4-DNA-Ligase

pBR322 ist einer der ersten Klonierungsvektoren

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Durchführung einer Klonierung in pBR322

Durchführung einer Klonierung in pBR322

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Der Vektor pBluescript

ATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC

M * V S S L I R H P R L Y T L C F

CGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAA

R L V C C V E L * A D N N F T Q E

ACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGG

T A M T M I T P S A Q L T L T K G

AACAAAAGCTGgagctccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggat

N K S W S S T A V A A A L E L V D

cccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcg

P P G C R N S I S S L S I P S T S

lacZ‘‐Gen des Vektors pBluescript

>beta-D-galactosidase[Escherichia colistr. K-12 substr. W3110] MTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWF.... 1024 aa

Promotor (‐35, ‐10

Operator

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agggggggcccggtaccCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGC

R G G P V P N S P Y S E S Y Y A R

TCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACC

S L A V V L Q R R D W E N P G V T

CAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGC

Q L N R L A A H P P F A S W R N S

GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGC

E E A R T D R P S Q Q L R S L N G

GAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTT

E W K L *

>beta-D-galactosidase[Escherichia colistr. K-12 substr. W3110] MTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWF.... 1024 aa

-Galactosidase codiert durch lacZM151 11 43 MTMITDSLAVV--ARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGY

Nachweis von ß-Galactosidase

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Der Genotyp des E. coli-Stammes DH10B

(teilweise)

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 rpsL

(„vollständig“)F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ-

http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes

Auftrennung von geschnittener und ungeschnittener DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

M1 M1M2

M2T1-U

T1-G

K1-U

K1-G

K2-U

K2-G

M1, M2:Größenstandard

T1:Genomische DNA

K1, K2:Plasmide

U, G:ungeschnitten,geschnitten mit EcoRI

Ethidiumbromid

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Ligation stumpfer Enden

Ligation von DNA mit überhängenden Enden (sticky ends)

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Passfähigkeit unterschiedlich geschnittener DNA

Aktivitäten der DNA-Polymerase I

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Aktivitäten des Klenow-Fragments

In Anwesenheit von dNTPs kommt beim Klenow-Fragment die Polymerase-Funktionzur Geltung. Beim Fehlen von Nucleotiden wirkt das Klenow-Fragment als 3‘-5‘-Exonuclease.Die Auffüllreaktion kann auch zum Markieren der DNA verwendet werden (Einsatz markierterNucleotide).

Mit einem Oligonucleotid-Linker lassen sich Enden anpassen

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Mit einem Oligonucleotid-Adapter lassen sich Enden anpassen

Bei einer Ligation werden viele Moleküle eingesetzt und es sind sehr viele verschiedene Produkte möglich

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Durch Dephosphorylierung der 5‘-Enden kann die (Re)ligation verhindert werden

Klonierung in einen Vektor mit dephosphorylierten Enden

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The probability P that a given DNA fragment has been cloned is given by the equationP = 1-(1-f)N

where f is the fraction of DNA that a certain clone contains, and N is the number of clones you need. If the genome consists of 5000 kb and the insert size is 1 kb then f = 1/5000.

One may also calculate the number of clones one needs to achieve a certain probability that a given piece of DNA has been cloned. N = ln(1-P) / ln(1-f)

Genome coverage P (%)1 63,23 95,05 99,37 99,91

10 99,995

Notwendige Größe einer Klonbank

Der Lebenszyklus des Bakteriophagen

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cos site

Die cos-Stelle ist etwa 200 bp lang. Die Stelle, an der die DNA zur Verpackung geschnitten wird, wird cosN genannt; beim Schnitt entstehen kohäsive Enden.

GGGCGGCGACCTCGCnnn-phage genome-nnnACGGCGnnn-phage genome-nnnTGCCCCGCCGCTGGA

Die Verpackung der Bakteriophagen -DNA

Aufbau eines Cosmid-Vektors

ca. 6 kbp

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Herstellung einer Cosmid-Bank

nach Ligation von geschnittenem Vektor und Insert entstehen unterschiedliche Produkte

ca. 6 kbp

ca. 48 kbp

Insertfragment BamHIBamHI

Insertfragment BamHIBamHI

Mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese können sehr große DNA-Fragmente getrennt werden

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Auftrennung von geschnittener und ungeschnittener DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

M1 M1M2

M2T1-U

T1-G

K1-U

K1-G

K2-U

K2-G

M1, M2:Größenstandard

T1:Genomische DNA

K1, K2:Plasmide

U, G:ungeschnitten,geschnitten mit EcoRI

Ethidiumbromid

A random genome analysis of Edwardsiella tarda ETSJ54: annotation of putative virulence- related genes

Verjan-García et al. (2013) Orinoquia vol.17 no.1 ; ISSN 0121-3709

Flowchart of Edwardsiella tarda ETSJ54 cosmid DNA library construction. Genomic DNA of E. tardaETSJ54 was isolated and digested with Sau3AI restriction enzyme for 30s, 60s, 90s, 2’, 3’, 5’, 7’, 10’ and 15’ and analyzed in 1% agarose by pulsed field gel electrophoresis (Lanes 2-9). Lane 1: undigested genomic DNA. PFG-M: PFG DNA ladder marker. M: HindIII digested lambda DNA marker. B. Digested genomic DNA was dephosphorylated and ligated into the BamHI of Super Cos I vector. C. E. coli XL-1BlueMR cells were infected with lambda phage particles carrying the recombinant cosmid molecules.

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Präparation der Insert-DNA durch partiellen Verdau

Herstellung einer Klonbank

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Aufbau eines BAC-Vektors (Bacterial Artificial Chromosome)

For example: http://ampliconexpress.com/bac-libraries/

Aufteilung von Plasmiden mit niedriger Kopienzahl auf Tochterzellen

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Herstellung einer YAC-Bank(Yeast Artificial Chromosome)

Der DNA-Doppelstrang kann durch Temperaturerhöhung oder durch NaOH (reversibel) in seine Einzelstränge getrennt werden: der G+C-Gehalt

beeinflusst die Schmelztemperatur

5‘3‘

3‘5‘

5‘

3‘

3‘

5‘

Wasserstoffbrückenbindungen

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Bei der Southern-Blot-Hybridisierung wird eine Einzelstrang-DNA auf eine Membran gebracht. Mittels einer Sonde wird die Anwesenheit einer

bestimmten Nucleotidsequenz überprüft

Häufig eingesetzte radioaktiv markierte Nucleotide

αβ

32P Halbwertszeit ca. 14 Tage33P Halbwertszeit ca. 25 Tage35S Halbwertszeit ca. 87 Tage

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Die Grundlage des DIG-Detektionssystems beruht auf dem exklusiv in Pflanzen der Gattung Digitalis vorkommenden Hapten Steroid Digoxigenin (DIG, Abbildung 1). Dieses Antigen wird für den Nachweis von Nukleinsäuren genutzt, indem Digoxigenin Moleküle chemisch an (deoxy)UridinNukleotide gekoppelt werden und DIG-(d)UTP in Nukleinsäure Sonden eingebaut wird. Da DIG ausschließlich in Digitalis Pflanzen vorkommt, konnten für dieses Antigen hochspezifische Antikörper generiert werden, die nicht unspezifisch mit anderen biologischen Materialien reagieren. Der Einsatz dieser Sonden und Antikörper ermöglicht in Hybridisierungsreaktionen so einen Nachweis spezifischer Nukleinsäuren. Die eigentliche Detektion findet indirekt statt indem ein Anti-DIG Antikörper eingesetzt wird, der an ein Reporterenzym oder einen Farbstoff gekoppelt ist. Man unterscheidet die Detektion von Nukleinsäuren in ganzen Zellen (in situ) oder auf Filtermembranen nach vorhergehender Nukleinsäure Isolierung (Filter Hybridisierung).

DIG Application Manual for Filter Hybridization (2000), Roche Applied Science

(Eine Alternative zum DIG-System ist die Verwendung eines Biotin-markierten Nucleotids)

Nachweis einer Sonde

CSPD ([3-(1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate)

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Vorbereitung eines Southern-Blots

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Durchführung eines Southern-Blots (Beispiel)

Durchführung einer Southern-Blot-Hybridisierung (Beispiel)

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Denaturation Solution - 1.5 M NaCl- 0.5 M NaOH

[HCl (2.5 N)]

Neutralization Buffer - 0.5 M Tris-CI (pH 7.2)- 1 M NaCl

20x SSC- 3.0 M NaCl- 0.3 M sodium acetate- pH 7.0

Prehybridization/Hybridization Solution (for Hybridization in Aqueous Buffer)

- 6x SSC (or 6x SSPE)- 5x Denhardt’s reagent - 0,5 % (w/v) SDS- 1 µg/ml poly(A)- 100 µg /ml salmon sperm DNA

50x Denhardt's reagent contains in H2O- l % (w/v) Ficoll 400- 1 % (w/v) polyvinylpyrrolidone- 1 % (w/v) bovine serum albumin

Beispielhafte Zusammensetzung von Lösungen, die für eineSouthern-Blot-Hybridisierung benötigt werden

1. Die DNA wird isoliert und in verschiedenen Ansätzen mit je einem Restriktionsenzym geschnitten

2. Die Restriktionsansätze werden mit 4 μl Farbstofflösung gemischt und in die Geltaschen eines Agarosegels geladen. Zur Bestimmung der Fragmentgrößen wird auch ein DNA-Größenstandard aufgetragen.

2. Das Gel wird zur Färbung der DNA z. B. in eine Ethidiumbromid-Lösung gelegt.

3. Das Gel wird kurz in Wasser gewaschen. Die DNA-Fragmente werden durch UV-Bestrahlung sichtbar gemacht und mit einem Foto dokumentiert. Ein seitlich angelegtes Lineal mit der 0-cm-Marke an der DNA-Auftragsstelle dient der Zuordnung der Fragmentgrößen nach der DNA-Hybridisierung.

4. Das Gel wird während 30 min in einer Lösung (1 M NaCl; 0,5 M NaOH) geschwenkt (Denaturierung).

5. Das Gel wird kurz mit H2O gewaschen und für weitere 30 min in einer Lösung (1 M NH4-Acetat; 0,02 M NaOH) geschwenkt (Neutralisierung).

6. Eine Nylonmembran wird entsprechend der Gelgröße zugeschnitten. Drei 3MM-Filterpapiere werden ca. 1 cm größer als die Membran zugeschnitten. Ein Stapel Haushaltspapier und eine 2x SSC-Lösung wird bereitgestellt.

7. Die DNA wird auf die Nylonmembran übertragen (Southern Blot) und dort fixiert.

8. Durch Prähybridisierung werden unspezifische Bindungsstellen auf der Membran blockiert.

9. Die DNA-Sonde wird bei Bedarf denaturiert und zur Hybridisierungslösung gegeben.

10. Die Hybridisierung erfolgt mehrere Stunden (über Nacht). Nach einem Waschschritt wird die Sonde detektiert.

Schritte zur Durchführung einer Southern-Blot-Hybridisierung

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nwsAB-specific interspecies hybridization to BamHI-digested DNA of different strains of Azorhizobium, Bradyrhizobium and Rhizobium. The lanes contain similar amounts of DNA. The hybridization to B. japonicum 110spc4 DNA (lane 8) revealed more bands than expected for the nws region. The 1.3 kb and the 8.0 kb bands correspond to the nws region, whereas the 6.2 kb band matches with the nodVWregion. Numbers in the right margin are size markers (in kb). Total genomic DNA was from the following sources: lane 1, Rhizobium sp. strain NGR234; lane 2, R. fredii USDA 191; lane 3, A. caulinodans ORS571; lane 4, R. leguminosarum bv phaseoli 8002; lane 5, R. meliloti AK631; lane 6, R. leguminosarum bv viciae; lane 7, R. leguminosarum bv trifoii ATCC 14480; lane 8, B. japonicum 110spc4; lane 9, B. japonicum 61A76; lane 10, B. japonicum USDA123; lane 11, Bradyrhizobium sp. strain 32HI; lane 12, Bradyrhizobium sp. strain ANU289; lane 13, Bradyrhizobium sp. strain ATCC 10319.

Nachweis von nwsAB-ähnlichen Sequenzen in unterschiedlichenBakterien mittels Southern-Hybridisierung

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Golden Rice is part of the solution

Biofortified rice as a contribution to the alleviation of life-threatening micronutrient deficiencies in developing countries

A good start is a food start!

Structures of the T-DNA region of pB19hpc used in single transformations, and ofpZPsC and pZLcyH used in co-transformations. Representative Southern blots of independenttransgenic T0-plants are given below the respective Agrobacterium vectors. LB, leftborder; RB, right border; !, polyadenylation signals; p, promoters; psy, phytoenesynthase;crtI, bacterial phytoene desaturase; lcy, lycopene b-cyclase; tp, transit peptide; Gt1p, rice glutelin promoter

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Schema einer Kolonie-Hybridisierung

Schema einer Kolonie-Hybridisierung

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Herstellung einer Sonde ausgehend von einer Aminosäuresequenz