Główne szlaki Główne szlaki transdukcjitransdukcji sygnałusygnału

Dziś tylko fragment....Dziś tylko fragment....

ligand receptorajądrowego

Spotkanie 1:Spotkanie 1:

-- Podstawowe typy receptorówPodstawowe typy receptorów

-- Główne szlaki Główne szlaki transdukcji transdukcji sygnałusygnału

-- Metody badania Metody badania kinaz kinaz i czynników i czynników transkrypcyjnychtranskrypcyjnych

-- Inhibitory Inhibitory transdukcji transdukcji sygnału w medycynie: sygnału w medycynie:

gleevecgleevec

Zewnątrzkomórkowe drogi przenoszące cząsteczkę sygnałową Zewnątrzkomórkowe drogi przenoszące cząsteczkę sygnałową do komórki docelowej:do komórki docelowej:

1. Szlak 1. Szlak endokrynowy endokrynowy -- jeden typ komórek wydziela cząsteczkę sygnałową która aktywuje jeden typ komórek wydziela cząsteczkę sygnałową która aktywuje inne komórki, inne komórki, często odległeczęsto odległe-- cząsteczka sygnałowa często przenoszona jest z krwiącząsteczka sygnałowa często przenoszona jest z krwią

2. Szlak 2. Szlak parakrynowyparakrynowy-- jeden typ komórek w tkance wydziela cząsteczki sygnałowe, którejeden typ komórek w tkance wydziela cząsteczki sygnałowe, które aktywują aktywują natychmiast sąsiadujące komórkinatychmiast sąsiadujące komórki-- cząsteczka sygnałowa zwykle nie jest przekazywana przez układ kcząsteczka sygnałowa zwykle nie jest przekazywana przez układ krążeniarążenia

3. Szlak3. Szlak okołokrynowyokołokrynowy ((jukstakrynowyjukstakrynowy))-- związany z adhezją komórek; pobudzeniu ulega jedna z komórek luzwiązany z adhezją komórek; pobudzeniu ulega jedna z komórek lub obieb obie

4. Szlak 4. Szlak autokrynowyautokrynowy-- komórka odpowiada na swój własny sygnał (wytwarza cząsteczkę komórka odpowiada na swój własny sygnał (wytwarza cząsteczkę sygnałową,wydziela ją i ma na powierzchni odpowiedni receptor)sygnałową,wydziela ją i ma na powierzchni odpowiedni receptor)

Przekaźniki II rzęduPrzekaźniki II rzędu

Cechy charakterystyczne:Cechy charakterystyczne:

-- małe cząsteczkimałe cząsteczki

-- tworzone szybko i w dużych ilościachtworzone szybko i w dużych ilościach

-- aktywne przez krótki czas a następnie szybko inaktywowane przezaktywne przez krótki czas a następnie szybko inaktywowane przez swoiste mechanizmyswoiste mechanizmy

-- wzmacniają sygnał inicjowany przez aktywacje receptorawzmacniają sygnał inicjowany przez aktywacje receptora

Przykłady:Przykłady:

-- cAMP cAMP (cykliczny (cykliczny adenozynomonofosforanadenozynomonofosforan))

-- cGMP cGMP (cykliczny (cykliczny guanozynomonofosforanguanozynomonofosforan))

-- DAG (DAG (diacylgliceroldiacylglicerol))

-- IP3 (1,4,5IP3 (1,4,5--trifosforan inozytolutrifosforan inozytolu))

-- wapńwapń

cAMPcAMP-- produkowany przez produkowany przez cyklazy adenylanowecyklazy adenylanowe (9 (9 cyklaz cyklaz błonowych i 1 błonowych i 1 cytozolowącytozolową))

-- rozkładany przez rozkładany przez fosfodiesterazy cAMPfosfodiesterazy cAMP

-- aktywuje aktywuje kinazykinazy białkowe A (PKA) i kanały jonowe zależne od białkowe A (PKA) i kanały jonowe zależne od cAMPcAMP

Cyklaza adenylanowa synteza synteza cAMPcAMP

Fosfodiesteraza cAMP

Kofeina

hydroliza hydroliza cAMPcAMP

KinazyKinazy białkowe A (PKA):białkowe A (PKA):-- kinazykinazy Ser/Ser/Thr Thr

-- jednostki katalityczne PKA mogą być transportowane do jądra gdzijednostki katalityczne PKA mogą być transportowane do jądra gdzie e fosforylują fosforylują białka CREB białka CREB ((cAMP responsive cAMP responsive element element binding binding protein) utrzymując aktywność genów z CRE w promotorze protein) utrzymując aktywność genów z CRE w promotorze [CREB może być [CREB może być fosforylowany fosforylowany w tym samym miejscu (ser133) przez w tym samym miejscu (ser133) przez kinazę kinazę zależną od zależną od kalmoduliny kalmoduliny w odpowiedzi na wzrost poziomu wapnia]w odpowiedzi na wzrost poziomu wapnia]

-- różne różne izoformyizoformy są albo białkami są albo białkami cytozolowymicytozolowymi, albo związanymi z , albo związanymi z cytoszkieletemcytoszkieletem, , organellamiorganellami i i błonamibłonami

1,4,51,4,5--trifosforan inozytolutrifosforan inozytolu (IP3):(IP3):-- produkowany jest przezprodukowany jest przez fosfolipazęfosfolipazę C (PLC) z C (PLC) z fosfatydyloinozytolufosfatydyloinozytolu, , fosfolipidu fosfolipidu błonowegobłonowego

-- PI3 jest hydrofilowy i po powstaniu wędruje do cytoplazmy, gdziPI3 jest hydrofilowy i po powstaniu wędruje do cytoplazmy, gdzie wiąże się do e wiąże się do wewnątrzkomórkowych kanałów wapniowych inicjując ich otwarciewewnątrzkomórkowych kanałów wapniowych inicjując ich otwarcie

-- wzrost poziomu wapnia aktywuje wzrost poziomu wapnia aktywuje kinazękinazę białkową C (PKC)białkową C (PKC)

DAGDAG-- produkowany wraz z PI3 przez PLC z produkowany wraz z PI3 przez PLC z fosfatydyloinozytolufosfatydyloinozytolu

-- wiąże się do PKC i aktywuje jewiąże się do PKC i aktywuje je

KinazyKinazy zależne od IP3 (PI3K) zależne od IP3 (PI3K)

-- kinazykinazy zlokalizowane w błonie komórkowej aktywowana przez receptory o zlokalizowane w błonie komórkowej aktywowana przez receptory o aktywności aktywności kinaz kinaz tyrozynowychtyrozynowych, integryny, receptory związane z białkami G, integryny, receptory związane z białkami G

-- jej aktywacja prowadzi do aktywacji jej aktywacja prowadzi do aktywacji kinazykinazy Akt (PKB) Akt (PKB)

-- Akt Akt fosforyluje mTOR fosforyluje mTOR ((mammalian target of rapamycinmammalian target of rapamycin), ), mediującmediując immunosupresyjne immunosupresyjne działanie działanie rapamycynyrapamycyny

WapńWapń

-- wiąże się ze swoistymi miejscami w wiąże się ze swoistymi miejscami w kinazach kinazach lub z wyspecjalizowanymi białkami (np. zlub z wyspecjalizowanymi białkami (np. zkalmodulinąkalmoduliną))

-- jest aktywatorem wielu ważnych jest aktywatorem wielu ważnych kinazkinaz, , np. np. kinazkinaz białkowych C (PKC) i białkowych C (PKC) i kinaz kinaz zależnych zależnych od od kalmoduliny kalmoduliny ((kinazkinaz CaMCaM))

KinazyKinazy białkowe C (PKC)białkowe C (PKC)

-- kinazykinazy Ser/Ser/ThrThr zależne od wapnia zależne od wapnia

-- do pełnej aktywacji potrzebują jonów Ca2+, DAG i powiązania z do pełnej aktywacji potrzebują jonów Ca2+, DAG i powiązania z fosfolipidami fosfolipidami wewnętrznej wewnętrznej powierzchni błony, zwłaszcza z powierzchni błony, zwłaszcza z fosfatydyloserynąfosfatydyloseryną

-- w stanie nieaktywnym są białkami w stanie nieaktywnym są białkami cytozolowymcytozolowym, po pobudzeniu przechodzą na błonę, po pobudzeniu przechodzą na błonę

-- PKC mogą aktywować PKC mogą aktywować kinazy kinazy MAP, prowadząc np. do MAP, prowadząc np. do fosforylacjifosforylacji jądrowego czynnika jądrowego czynnika transkrypcyjnego Elktranskrypcyjnego Elk--1 indukującego 1 indukującego replikację replikację komórekkomórek

-- PKC inicjują aktywność PKC inicjują aktywność NFNFκκBB

tymocytytymocyty

Kinazy zależna od wapnia Kinazy zależna od wapnia i i kalmoduliny kalmoduliny ((kinazy CaMkinazy CaM))

-- kinazykinazy ser/ser/thrthr

-- mogą być mogą być monomeryczne monomeryczne lub lub oligomeryczneoligomeryczne

-- wapń wiąże się do wapń wiąże się do kalmodulinykalmoduliny zmieniając jej konformację, przez co może ona zmieniając jej konformację, przez co może ona aktywować kilka klas aktywować kilka klas kinazkinaz, między innymi , między innymi kinazę fosforylującąkinazę fosforylującą eF2 (eF2 (elongation factorelongation factor--2, 2, niezbędny przy translacji) i niezbędny przy translacji) i CaMKIICaMKII (jedną z najważniejszych kinaz w neuronach)(jedną z najważniejszych kinaz w neuronach)

-- niektóre z kinaz niektóre z kinaz CaMCaM mogą mogą fosforylować fosforylować CREB i CBP (CREBCREB i CBP (CREB--binding binding protein) przez co protein) przez co biorą udział w biorą udział w regulawanej regulawanej przez wapń transkrypcji genówprzez wapń transkrypcji genów

-- niektóre mogą aktywować niektóre mogą aktywować kinazykinazy Akt (PKB)Akt (PKB)

cGMPcGMP

-- produkowany przez produkowany przez cyklazy guanylowecyklazy guanylowe ((cytozolowecytozolowe lub błonowe)lub błonowe)

-- rozkładany przez rozkładany przez fosfodiesterazy cGMPfosfodiesterazy cGMP

-- jego synteza indukowana jest np. przez NO i COjego synteza indukowana jest np. przez NO i CO

-- działa poprzezdziała poprzez-- kanały jonowe regulowane przez kanały jonowe regulowane przez cGMPcGMP-- fosfodiesterazy fosfodiesterazy regulowane przez regulowane przez cGMPcGMP-- kinazykinazy białkowe G (PKG)białkowe G (PKG)-- GTPazyGTPazy

Kinazy Kinazy białkowe G (PKG)białkowe G (PKG)

-- obecne w dużych ilościach w niektórych komórkach (np. mięśniachobecne w dużych ilościach w niektórych komórkach (np. mięśniach gładkich, płytkach gładkich, płytkach krwi); w większości komórek jest ich jednak znacznie mniej niż Pkrwi); w większości komórek jest ich jednak znacznie mniej niż PKAKA

-- zbudowane z jednej jednostkizbudowane z jednej jednostki

-- w zależności od w zależności od izoformy izoformy są albo białkami są albo białkami cytozolowymcytozolowym, albo związanymi z błoną, albo związanymi z błoną

GTPazyGTPazy

1. Małe białka G1. Małe białka G

-- białka białka monomeryczne monomeryczne (znanych jest ich co najmniej 20: np. ras, )(znanych jest ich co najmniej 20: np. ras, )-- występują w cytoplazmiewystępują w cytoplazmie-- występujawystępuja w stanie aktywnym (związane z GTP) lub nieaktywnym (związane z w stanie aktywnym (związane z GTP) lub nieaktywnym (związane z GDP)GDP)

2.2. TrimeryczneTrimeryczne białka Gbiałka G

-- związane z receptorami powierzchniowymizwiązane z receptorami powierzchniowymi-- zbudowane z trzech połączonych zbudowane z trzech połączonych niekowalencyjnieniekowalencyjnie podjednostek: podjednostek: α, β, γα, β, γ-- podjednostka podjednostka αα (ma aktywność (ma aktywność GTPazyGTPazy) występuje w kilku) występuje w kilku izoformach izoformach spełniających spełniających

.. odrębną funkcję wodrębną funkcję w transdukcjitransdukcji sygnałusygnału-- typy podjednostek typy podjednostek GGαα

GGααss –– pobudzapobudza cyklazę adenylanowącyklazę adenylanowąGGααii –– hamujehamuje cyklazę adenylanowącyklazę adenylanowąGGααo o –– pośredniczy w zamykaniu kanałów wapniowychpośredniczy w zamykaniu kanałów wapniowychGGααTT –– pośredniczy w aktywacji pośredniczy w aktywacji fosfodiesteraz fosfodiesteraz w w fotoreceptorachfotoreceptorach

Komunikacja między komórkamiKomunikacja między komórkami

A. Receptory hydrofiloweA. Receptory hydrofilowe-- integralne białka błonoweintegralne białka błonowe-- ligandy ligandy są przeważnie hydrofilowesą przeważnie hydrofilowe

1. Receptory połączone z białkami G1. Receptory połączone z białkami G –– związanie związanie liganduligandu prowadzi do aktywacji swoistegoprowadzi do aktywacji swoistegobiałka G, a w konsekwencji do aktywacji cząsteczek docelowych (białka G, a w konsekwencji do aktywacji cząsteczek docelowych (cyklaz adenylanowychcyklaz adenylanowych,,fosfolipazfosfolipaz, kanałów jonowych i , kanałów jonowych i fosfodiesterazfosfodiesteraz))

2. Receptory będące kanałami jonowymi2. Receptory będące kanałami jonowymi –– ligandligand wiąże się z receptorem (białkiem kanału) iwiąże się z receptorem (białkiem kanału) ipowoduje otwarcie kanału prowadząc do napływu i wypływu odpowiedpowoduje otwarcie kanału prowadząc do napływu i wypływu odpowiednich jonównich jonów

3. Receptory mające domenę 3. Receptory mające domenę kinazykinazy –– związanie związanie ligandu ligandu prowadzi do aktywacji domenyprowadzi do aktywacji domenykinazowej kinazowej a to z kolei prowadzi do a to z kolei prowadzi do fosforylacji fosforylacji substratów cytoplazmatycznychsubstratów cytoplazmatycznych

4. Receptory aktywowane przez 4. Receptory aktywowane przez cytozolowe kinazy tyrozynowecytozolowe kinazy tyrozynowe –– kinazy Tyr zwiazane kinazy Tyr zwiazane sąsąniekowalencyjnieniekowalencyjnie z receptorem powierzchniowym i z receptorem powierzchniowym i ulegaja ulegaja aktywacji po związaniu aktywacji po związaniu ligandaligandado receptorado receptora

5. Receptory będące fosfatazami5. Receptory będące fosfatazami –– związanie związanie liganda liganda aktywuje domenę fosfatazyaktywuje domenę fosfatazy

Typy receptorów powierzchniowychTypy receptorów powierzchniowych

With thyrosinekinase domain

Receptory będące kanałami jonowymiReceptory będące kanałami jonowymi

-- białka białka transbłonowetransbłonowe regulujące przejście swoistych jonów do i z komórkiregulujące przejście swoistych jonów do i z komórki

-- wielkość kanałów jest ograniczona a jony przechodzące muszą pozwielkość kanałów jest ograniczona a jony przechodzące muszą pozbyć się wodybyć się wodyhydratacyjnejhydratacyjnej

-- ruch jonów odbywa się zgodnie z gradientem stężeńruch jonów odbywa się zgodnie z gradientem stężeń

Receptory związane z białkami GReceptory związane z białkami G

-- receptory 7TM (siedem domen receptory 7TM (siedem domen transbłonowychtransbłonowych) z końcem aminowym na zewnątrz komórki) z końcem aminowym na zewnątrz komórki

-- znanych jest co najmniej kilkaset tego typu receptorówznanych jest co najmniej kilkaset tego typu receptorów

-- w stanie nieaktywnym są w stanie nieaktywnym są fosforylowanefosforylowane (przez PKA, PKC lub specjalna klasę(przez PKA, PKC lub specjalna klasę kinazkinaz GRK, GGRK, G--proteinprotein coupled coupled receptor receptor kinaseskinases) co zapobiega łączeniu się z białkami G) co zapobiega łączeniu się z białkami G

-- po związaniu po związaniu liganduligandu przekazują sygnał poprzez aktywacjęprzekazują sygnał poprzez aktywację trimerycznychtrimerycznych białek G (jeden białek G (jeden receptor może aktywować kilka białek G)receptor może aktywować kilka białek G)

Działanie Działanie trimerycznychtrimerycznych białek G:białek G:

-- związanie GDP do jednostki związanie GDP do jednostki αα powoduje jej połączenie z powoduje jej połączenie z dimerem dimerem β/γβ/γ i utworzenie i utworzenie nieaktywnego nieaktywnego trimerutrimeru

-- kiedy kiedy ligandligand zwiąże się z receptorem , zwiąże się z receptorem , αα łączy się z GTP, łączy się z GTP, oddysocjowujeoddysocjowuje od od β/γβ/γ i aktywuje i aktywuje cząsteczki cząsteczki efektoroweefektorowe

-- aktywacja podjednostki aktywacja podjednostki αα trwa dopóki GTP nie zostanie zhydrolizowany przez aktywność trwa dopóki GTP nie zostanie zhydrolizowany przez aktywność GTPazyGTPazy. Po hydrolizie GTP podjednostka . Po hydrolizie GTP podjednostka αα ponownie łączy się z ponownie łączy się z dimerem dimerem β/γβ/γ..

-- cząsteczki docelowe białek G to np.cząsteczki docelowe białek G to np. cyklaza adenylanowacyklaza adenylanowa, PLC, PLA2, IP3, PLC, PLA2, IP3

G-protein receptor

Receptory o aktywności Receptory o aktywności kinaz tyrozynowychkinaz tyrozynowych

-- białka o pojedynczej domenie białka o pojedynczej domenie transbłonowejtransbłonowej

-- zawierają domenę zawierają domenę kinazy kinazy w części cytoplazmatycznejw części cytoplazmatycznej

-- ich ich ligandy ligandy to przede wszystkim różne czynniki wzrostu. np. VEGF, EGF, PDGF,to przede wszystkim różne czynniki wzrostu. np. VEGF, EGF, PDGF, NGF, FGFNGF, FGF

-- sygnalizacja rozpoczyna się od związania sygnalizacja rozpoczyna się od związania liganduligandu, co prowadzi do , co prowadzi do dimeryzacji dimeryzacji lub lub oligomeryzacji oligomeryzacji receptorów i ich receptorów i ich autofosforylacjiautofosforylacji lub krzyżowej lub krzyżowej fosforylacji fosforylacji

-- ufosforylowanieufosforylowanie reszt tyrozyny pozwala na przyłączenie białek reszt tyrozyny pozwala na przyłączenie białek adaptorowychadaptorowych z domenami z domenami SH2 które zostają SH2 które zostają ufosforylowane ufosforylowane i przekazują sygnał na kolejne białka. Białka i przekazują sygnał na kolejne białka. Białka adaptorowe adaptorowe to to np. np. GrbGrb--2. 2.

-- Grb2 przyłącza białko GEF (zwane też SOS) i taki kompleks pobudGrb2 przyłącza białko GEF (zwane też SOS) i taki kompleks pobudza za GTPazęGTPazę Ras Ras (prowadząc do wymiany GDP na GTP)(prowadząc do wymiany GDP na GTP)

-- Aktywowany Ras aktywuje szlak Aktywowany Ras aktywuje szlak kinaz kinaz MAPMAP

Kinazy MAPKinazy MAP-- występują we wszystkich komórkachwystępują we wszystkich komórkach

-- aktywowane są poprzez aktywowane są poprzez fosforylację fosforylację reszt reszt serynowychserynowych, , treoninowych treoninowych i i tyrozynowychtyrozynowych

-- są są kinazami kinazami cytoplazmatycznymi, ale po aktywacji mogą przechodzić do jądra gcytoplazmatycznymi, ale po aktywacji mogą przechodzić do jądra gdzie dzie fosforylują fosforylują liczne czynniki liczne czynniki transkrypcyjne transkrypcyjne (np. c(np. c--junjun, ATF, ATF--2,2, elkelk--1, CHOP)1, CHOP)

-- główne grupy główne grupy kinaz kinaz MAP to:MAP to:>> ERK1/2ERK1/2 (p42/p44) (p42/p44) –– extracellular signalextracellular signal--regulated regulated protein protein kinasekinase>> JNKJNK (c(c--Jun Jun NH2NH2--terminal terminal kinasekinase))>> p38p38

-- aktywacja p38 może reguluje stabilność aktywacja p38 może reguluje stabilność mRNAmRNA zawierającego regiony bogate w regiony AUzawierającego regiony bogate w regiony AU

Etc.

Komunikacja między komórkamiKomunikacja między komórkami

B. Receptory B. Receptory lipofilowelipofilowe

-- ligandyligandy obejmują np.obejmują np.-- steroidysteroidy-- hormony tarczycyhormony tarczycy-- witamina D3witamina D3-- retinoidyretinoidy-- prostaglandyny prostaglandyny serii D i Jserii D i J

-- ligandy ligandy są zwykle są zwykle lipofilowelipofilowe i przechodzą przez błonę do cytoplazmy (najczęściej są i przechodzą przez błonę do cytoplazmy (najczęściej są transportowane przez białka nośnikowe)transportowane przez białka nośnikowe)

-- pusty receptor jest zwykle w pusty receptor jest zwykle w cytozolucytozolu, związany z innymi białkami, związany z innymi białkami

-- gdy gdy ligand ligand zwiąże się z receptorem, kompleks przenoszony jest do jądra gdzizwiąże się z receptorem, kompleks przenoszony jest do jądra gdzie wiąże się do e wiąże się do swoistych sekwencji DNA działając jako czynnik swoistych sekwencji DNA działając jako czynnik transkrypcyjnytranskrypcyjny

-- niektóre puste receptory zlokalizowane są w jądrze gdzie przyłąniektóre puste receptory zlokalizowane są w jądrze gdzie przyłączone są do promotora genu czone są do promotora genu docelowego hamując jego transkrypcję (czyli zachowują się jak docelowego hamując jego transkrypcję (czyli zachowują się jak represoryrepresory). Związanie ). Związanie liganduligandu prowadzi do przebudowy prowadzi do przebudowy allosterycznej allosterycznej receptora i aktywacji transkrypcji genureceptora i aktywacji transkrypcji genu

Komórki Komórki transfekowane transfekowane plazmidem plazmidem reporterowymreporterowym HREHRE--lucluc

*

*

lum

ines

cenc

elu

min

esce

nce [

[ RLU

]R

LU] wild-type HRE

0

100

200

300

control 15d-PGJ2 control 15d-PGJ2normoxia hypoxia

lum

ines

cenc

elu

min

esce

nce [

[ RLU

]R

LU] mutated HRE

0

200

400

600

control 15d-PGJ2 control 15d-PGJ2normoxia hypoxia

NS

NS

HRE

EMSA EMSA –– descriptiondescription-- The gel shift or electrophoretic mobility shift assay providesThe gel shift or electrophoretic mobility shift assay provides aa simple and rapid methodsimple and rapid methodforfor detectingdetecting DNADNA--binding proteinsbinding proteins..

-- This method is widely usedThis method is widely used toto study sequencestudy sequence--specificspecific DNADNA--binding proteins suchbinding proteins such asastranscription factorstranscription factors. .

-- The assay is basedThe assay is based onon the observation that complexes ofthe observation that complexes of proteinprotein andand DNADNA migrate migrate throughthrough aa nondenaturing polyacrylamide gel more slowly than freenondenaturing polyacrylamide gel more slowly than free DNADNA fragments or fragments or doubledouble--stranded oligonucleotidesstranded oligonucleotides. .

-- The gel shift assay is performedThe gel shift assay is performed byby incubatingincubating aa purifiedpurified protein,protein, oror aa complex mixture complex mixture of proteinsof proteins ((suchsuch asas nuclear or cell extract preparationsnuclear or cell extract preparations),), withwith a a 3232PP endend--labeledlabeled DNA DNA fragmentfragment containing the putativecontaining the putative proteinprotein binding sitebinding site. .

-- The reaction products are then analyzedThe reaction products are then analyzed on aon a nondenaturing polyacrylamide gelnondenaturing polyacrylamide gel. .

-- The specificity of theThe specificity of the DNADNA--bindingbinding protein forprotein for the putative binding site is establishedthe putative binding site is established bybycompetition experiments using unlabeledcompetition experiments using unlabeled DNADNA fragments or oligonucleotides containingfragments or oligonucleotides containingaa binding sitebinding site forfor thethe proteinprotein of interest or other unrelatedof interest or other unrelated DNADNA sequencessequences..

EMSA EMSA –– typical resultstypical results

Supershift assays canSupershift assays can bebeusedused toto assess the specificity assess the specificity of the retardedof the retarded band.band.

Cell extracts were processedCell extracts were processedfor NFfor NF--kB gel shift analysiskB gel shift analysis. .

Antibodies raised against Antibodies raised against eithereither p50 (p50 (laneslanes 55 andand 6)6) ororp65 (p65 (laneslanes 77 andand 8)8) were were addedadded toto the cell extract the cell extract before adding the probebefore adding the probe. .

Supershift indicates that this Supershift indicates that this proteic complex is composed proteic complex is composed of theof the bonabona fidefide p50p50--p65p65heterodimerheterodimer. .

Gel shift competition assayGel shift competition assay,, usingusing aa wildwild--type probe andtype probe and aa mutated probemutated probe, on, on thethe DNADNA--binding of NFkBbinding of NFkB.. The radioactive probeThe radioactive probe waswas first mixed with an increasing excessfirst mixed with an increasing excess (0, 1, (0, 1, 55 andand 20 x)20 x) of the cold probe containing either the wildof the cold probe containing either the wild--typetype ((laneslanes 11--44 andand 99--12)12) or the or the mutatedmutated ((laneslanes 44--88 andand 1313--16)16) NFkBNFkB--bindingbinding consensusconsensus sequencesequence. EMSA was. EMSA was then then performed withperformed with 25 25 µµg proteing protein of cell extracts coming from unstimulatedof cell extracts coming from unstimulated ((laneslanes 11--8)8) ofofILIL--11--stimulated cellsstimulated cells ((laneslanes 99--16). 16).

TransAm AssayTransAm Assay

0

20

40

60

80

100

120

control 15d-PGJ2 control 15d-PGJ2

normoxia hypoxia

HIF

-1 a

ctiv

ity[%

ofc

ontro

l]

*

*

0

20

40

60

80

100

120

control

#

*

#

NS

NS

HIF

-1 a

ctiv

ity[%

ofc

ontro

l]

controlWT-HIF1

controlmut-HIF1

15d-PGJ2 15d-PGJ2WT-HIF1

15d-PGJ2mut-HIF1

TransAM AssayTransAM Assay

Badanie aktywności HIFBadanie aktywności HIF--11

Kontrola specyficznościKontrola specyficzności

Badanie translokacji Badanie translokacji NFNFκκBB

((przciwciała przciwciała antyanty--p65 znakowane p65 znakowane FITCemFITCem, analiza przy pomocy mikroskopu konfokalnego), analiza przy pomocy mikroskopu konfokalnego)

control TNFα15d-PGJ2

komórki HMECkomórki HMEC--11

Subcellular localization of NFkB analysedSubcellular localization of NFkB analysed byby immunofluorescence and confocal microscopy immunofluorescence and confocal microscopy inin human fibroblasts stimulated orhuman fibroblasts stimulated or not for 20 minnot for 20 min withwith 5 5 µµg/mlg/ml ofof ILIL--1.1. NFkBNFkB antianti--p65p65antibodyantibody was was labeled with labeled with FITC (FITC (greengreen)). . NucleiNuclei ((blueblue)) were conterstained with topowere conterstained with topo 33..

Badanie translokacji kinaz:Badanie translokacji kinaz:

--transfekcja transfekcja komórek plazmidem kodującym komórek plazmidem kodującym białko białko fuzyjne PKCfuzyjne PKCγγ/GFP/GFP

--obserwacje przyżyciowe lokalizacji obserwacje przyżyciowe lokalizacji świecącego białka (mikroskop konfokalny)świecącego białka (mikroskop konfokalny)

kontrolakontrola 10 min po stymulacji IL10 min po stymulacji IL--11ββ

Typy białaczekTypy białaczek

A.A.-- LimfoidalnaLimfoidalna

-- MieloidalnaMieloidalna

B.B.-- ostraostra(wynika z transformacji stosunkowo niezróżnicowanych komórek (wynika z transformacji stosunkowo niezróżnicowanych komórek progenitorowychprogenitorowych, z jedynie niewielkimi możliwościami dalszego różnicowania , z jedynie niewielkimi możliwościami dalszego różnicowania się)się)

-- przewlekłaprzewlekła(wynika z transformacji bardziej dojrzałych komórek, które mają (wynika z transformacji bardziej dojrzałych komórek, które mają zdolność zdolność dalszego różnicowania się)dalszego różnicowania się)

Chroniczna białaczka Chroniczna białaczka mieloidalnamieloidalna-- chroniczna białaczkachroniczna białaczka mieloidalnamieloidalna stanowi około 3% nowotworów u ludzi (15stanowi około 3% nowotworów u ludzi (15--20% 20% wszystkich białaczek u dorosłych) wszystkich białaczek u dorosłych) –– około 1około 1--2 przypadki na 100 000 osób2 przypadki na 100 000 osób

-- średnia wieku osób zdiagnozowanych to 53 lata (30% pacjentów maśrednia wieku osób zdiagnozowanych to 53 lata (30% pacjentów ma ponad 60 lat, mniej ponad 60 lat, mniej niż 10% niż 10% -- poniżej 20 lat)poniżej 20 lat)

-- nieco częściej występuje u mężczyznnieco częściej występuje u mężczyzn

-- u około połowy pacjentów przebiega bezobjawowo i zostaje wykrytu około połowy pacjentów przebiega bezobjawowo i zostaje wykryta w trakcie a w trakcie rutynowych badań krwirutynowych badań krwi

-- nieleczonanieleczona prowadzi do śmierciprowadzi do śmierci

-- w terapii stosuje się przeszczep szpiku (dostępny dla mniej niżw terapii stosuje się przeszczep szpiku (dostępny dla mniej niż 20% nowo 20% nowo zdiagnozowanych pacjentów) oraz terapie interferonemzdiagnozowanych pacjentów) oraz terapie interferonem--αα

-- w zaawansowanym stadium choroba jest praktycznie nieuleczalna mw zaawansowanym stadium choroba jest praktycznie nieuleczalna mimo stosowania imo stosowania chemioterapiichemioterapii

-- ostatnio lekiem pozwalającym leczyć chroniczną białaczkę szpikoostatnio lekiem pozwalającym leczyć chroniczną białaczkę szpikową jest wą jest gleevecgleevec

Chroniczna białaczka Chroniczna białaczka mieloidalnamieloidalna

-- pierwszy nowotwór dla którego wykryto przyczynę genetyczną (1960pierwszy nowotwór dla którego wykryto przyczynę genetyczną (1960 rok, rok, PhiladelphiaPhiladelphia))

-- chromosom chromosom Philadelphia Philadelphia powstaje na skutek translokacji fragmentu długiego ramienia powstaje na skutek translokacji fragmentu długiego ramienia chromosomu 9 na długie ramię chromosom 22chromosomu 9 na długie ramię chromosom 22

-- aberracja ta obecna jest u 95% pacjentów z chroniczną białaczkaaberracja ta obecna jest u 95% pacjentów z chroniczną białaczka szpikową; szpikową; wystepuje wystepuje tez u pacjentów z innymi typami białaczek (np. u 15tez u pacjentów z innymi typami białaczek (np. u 15--30% chorych na ostrą 30% chorych na ostrą białaczke białaczke limfoidalną)limfoidalną)

-- translokacja genu kinazy translokacja genu kinazy abl abl w pobliże regionu w pobliże regionu bcr bcr prowadzi do powstania prowadzi do powstania hybrydowego genu i hybrydowego genu i fuzyjnegofuzyjnego białka o konstytutywnej aktywności kinazybiałka o konstytutywnej aktywności kinazy

-- w w zalezności zalezności od miejsca translokacji białko od miejsca translokacji białko fuzyjne moze fuzyjne moze być różnej wielkościbyć różnej wielkości

Diagnostyka przewlekłej białaczki Diagnostyka przewlekłej białaczki mieloidalnejmieloidalnej

-- u zdecydowanej większości pacjentów u zdecydowanej większości pacjentów chromosom chromosom Philadelphia Philadelphia może być wykryty może być wykryty standardowymi metodami cytogenetycznymistandardowymi metodami cytogenetycznymi

-- można tez stosować FISH lub RTmożna tez stosować FISH lub RT--PCRPCR

Normalna Normalna kinaza tyrozynowa Ablkinaza tyrozynowa Abl w leukocytach w leukocytach zwiazana zwiazana jest z regulacją proliferacji jest z regulacją proliferacji komórek i ich różnicowania siękomórek i ich różnicowania się

Kinaza BcrKinaza Bcr--AblAbl, aktywna konstytutywnie powoduje:, aktywna konstytutywnie powoduje:-- zwiększenie proliferacjizwiększenie proliferacji-- zahamowanie zahamowanie apoptozyapoptozy-- zmniejszenie ekspresji zmniejszenie ekspresji adhezyn adhezyn (osłabienie adhezji i (osłabienie adhezji i ogranicznie ogranicznie możliwości możliwości odbierania sygnałów z odbierania sygnałów z mikrośrodowiska mikrośrodowiska szpiku)szpiku)

Gleevec Gleevec ((imatinibimatinib))

-- pierwszy komercyjnie dostępnypierwszy komercyjnie dostępnyinhibitor inhibitor kinazy tyrozynowej kinazy tyrozynowej przeznaczony do terapii klinicznejprzeznaczony do terapii klinicznej

-- hamuje specyficznie kinazy hamuje specyficznie kinazy BcrBcr--Abl Abl (jej aktywacja powoduje przewlekłą (jej aktywacja powoduje przewlekłą białaczkę białaczkę mieloidalnąmieloidalną) oraz kinaz c) oraz kinaz c--Kit (CD117) i PDGFKit (CD117) i PDGF--R R –– blokuje blokuje proliferację i indukuje proliferację i indukuje apoptozę apoptozę komórek mających te kinazykomórek mających te kinazy

-- powoduje stosunkowo niewielkie efekty ubocznepowoduje stosunkowo niewielkie efekty uboczne

-- istotne cofnięcie objawów choroby obserwuje się u 49% pacjentówistotne cofnięcie objawów choroby obserwuje się u 49% pacjentów w w chronicznej fazie choroby, którzy nie odpowiedzieli na leczenie chronicznej fazie choroby, którzy nie odpowiedzieli na leczenie IFNIFNα

2

gleevec

--phenylaminopyrimidine derivativephenylaminopyrimidine derivative2

α

Kinazy hamowane przez Kinazy hamowane przez gleevecgleevec

GIST GIST can can bebe divided into fourdivided into four majormajor groupsgroups::

-- Differentiation towards smooth muscle cellsDifferentiation towards smooth muscle cells..-- Differentiation towards neural elementsDifferentiation towards neural elements..-- Dual differentiationDual differentiation ((neural and smooth muscleneural and smooth muscle).).-- Lacking differentiation of either cell typeLacking differentiation of either cell type..

ImmunohistochemistryImmunohistochemistry::

-- CD34CD34-- cc--kitkit gene productgene product (CD117) (CD117) -- VimentinVimentin

GIST GIST –– ((Gastrointestinal Gastrointestinal stromal stromal tumorstumors))-- Common in adults aged 50Common in adults aged 50--60 years.60 years.-- Present as a primary Present as a primary tumtumoor or r or metastaticmetastatic massmass-- 25% of 25% of GISTsGISTs are malignant.are malignant.

LocalizationLocalization::

-- EsophagusEsophagus:: 5%5%-- StomachStomach:: 5050--70%70%-- Small intestineSmall intestine:: 2525--40%40%-- ColorectalColorectal:: Less than 10%Less than 10%

TherapyTherapy::

-- SurgerySurgery-- GleevecGleevec

GIST GIST –– ((Gastrointestinal Gastrointestinal stromal stromal tumorstumors))

MMesenchymal tumoursesenchymal tumours arising in arising in the GI tractthe GI tract aandnd sometimes within sometimes within thethe aabdomenbdomen withoutwithoutgastrogastrointestinal intestinal coconnectionnnection..

Single or multiple Single or multiple tumourstumours..

Size vary between 1 to more than 20 Size vary between 1 to more than 20 cm. cm.

SubmucosalSubmucosal oror intramuscularintramuscular mass.mass.

UsuallyUsually well circumscribed but lack well circumscribed but lack a true capsule.a true capsule.

Cut surface gray to pink in Cut surface gray to pink in colourcolour ..

Areas of cystic degeneration, Areas of cystic degeneration, infarction andinfarction and hhemorrhageemorrhageandand necrosis .necrosis .

Prone to surface ulceration and Prone to surface ulceration and bleeding.bleeding.

DziekujęDziekuję i zapraszam za tydzień.i zapraszam za tydzień.

Co warto zapamiętać:Co warto zapamiętać:

-- podstawowe podstawowe kinazy kinazy i wtórne przekaźnikii wtórne przekaźniki

-- typy receptorówtypy receptorów

-- na czym polega EMSA i na czym polega EMSA i transfekcja transfekcja plazmidami plazmidami reporterowymireporterowymi

-- jak działa jak działa gleevecgleevec

Slajdy będą dostępne w bibliotece i na stronie FanSlajdy będą dostępne w bibliotece i na stronie Fan--clubu hemoksygenazyclubu hemoksygenazy::

wwwwww.mol..mol.ujuj..eduedu..plpl/~/~jdulak jdulak