Kolegij Genetiko inenjerstvo

Genska terapija 1. diodoc. dr. sc. Gordana Maravi Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Farmaceutsko-biokemijskog fakultetaGM2005

Genska terapijaPrijenos terapeutskog gena u oboljelo tkivo Vie vrsta:Transplantacija gena (kod delecija) Korekcija gena (ispravljanje mutacije) Poveavanje ekspresije ciljnog gena Ciljano unitenje pojedinih stanica unosom gena ubojice Ciljana inhibicija genske ekspresijeGM2005

Bolesti kod kojih se moe primijeniti genska terapijaBolestTeka kombinirana imunodeficijencija Hemofilija Cistina fibroza Rak Neuroloke bolesti Kardiovaskularne bolesti Autoimune bolesti Infektivne bolesti

DefektAdenozin-deaminaza 4 Faktor VIII, IX Gubitak gena CFTR Vie uzroka Parkinson, Alzheimer Ateroskleroza Dijabetes AIDS, hepatitis B

CIljna stanicaStanice kotane sri, Tlimfociti Jetra, mii, fibroblasti Zrani jastuii - plua Vie tipova stanica Izravno u mozak Endotel krvnih ila MHC, 2-mikroglobulin T-limfociti, makrofagiGM2005

Problemi s genskom terapijomKratkotrajnaVrlo teko je postii dugotrajan uinak bez integracije u genom, a ak i tada

Imuni odgovorReducira uinkovitost, onemoguava opetovanu terapiju

Problemi s virusnim vektorimaToksinost, imuni i upalni odgovor, mogunost povratka sposobnosti za izazivanje bolesti

Viegenske bolestiKombinirani uinak vie gena teko lijeenjeGM2005

Klinika ispitivanja genske terapijeInfektivne bolesti 13 % Ostalo 2% Markiranje gena 7%

Ljudi

Monogenske bolesti 9%

Rak 69%GM2005

Dva tipa genske terapijein vivo ex vivo

GM2005

GT ex vivo

GM2005

GT in vivo vs. ex vivoin vivoGenetiki materijal unosi se izravno u tijelo pacijenta Prilino nasumian proces, mala mogunost kontrole Jedina mogunost za tkiva koja se ne mogu uzgajati in vitro

ex vivoGenetiki materijal unosi se najprije u stanice u kulturi kontroliran proces, selekcija stanica s transgenom Stanice su obino autologne uzimaju se iz pacijenta i modificirane vraaju natrag GM2005

Nain unosa DNA ovisi o namjeni genske terapijeZamjena gena visoko uinkoviti virusni vektoriMonogenske bolesti cistina fibroza, teka kombinirana imunodeficijencija, hemofilija

Kratkotrajna ekspresija izravni unos DNApoticaj imunog odgovora

Prijenos putem liposoma uiniti stanice osjetljivijima za radioterapijuGM2005

Poeljna svojstva vektora za gensku terapijuVisoki titar (>108 estica/ml) Laka i reproducibilna metoda proizvodnje Precizno i stabilno uvoenje transgena Vektor ne bi smio inducirati imuni odgovor po unosu u organizam Kontrolirana ekspresija transgena (on/off sustav) regulatorni elementi unutar transgena Specifinost za pojedine tipove stanica2005 GM

Metode unosa terapeutskih konstrukata DNAUnos gole DNAJednostavnom iglom i pricom tumorsko tkivo Genskim pitoljem epiderma, neprikladno za tumore Unos liposomima dopremanje do ciljnog tkiva intravaskularnim, intratrahealnim, intraperitonealnim, intrakolonskim putem

Unos putem biolokih vektoraGenetiki modificirani virusi - ne mogu se replicirati u domainu Trenutno najuinkovitija metoda prijenosa DNA u genskoj terapijiGM2005

Unos gole DNAIntramuskularno, intravaskularno produena in vivo ekspresija niskog stupnja Jednostavno i jeftino, ali ne i univerzalno DNA vakcineInfektivne bolesti tradicionalne vakcine jo uvijek uinkovitije RakPoveanje postojeeg imuno-odgovora Poticaj imuno odgovora prema neprepoznatom ili slabo antigenom tumoru

Miina distrofija biolistika Cistina fibroza - liposomi

GM2005

DNA vakcina za malariju dananji pokuajiT-limfociti prepoznaju stanicu s parazitom malarije Proizvodnja INF- i stimulacija prezentacije antigena

GM2005

DNA vakcina za malariju imunoloki vane komponente patogenaNekoliko peptidnih epitopa koje prepoznaju Tlimfociti itavi protein TRAP (thrombospondin related adhesion protein)DNA vakcina koja kodira za imuno-prepoznatljiv produkt: poticaj imunolokog odgovora prikladnom prezentacijom antigenaGM2005

Biolistika primjenjiva i na stanicama sisavacaGenski pitolj plazmidna DNA se taloi na estice zlata ili volframa promjera 1-3 m Okidanje pod tlakom helija ili pod visokim naponom Snimka pod svjetlosnim elektronskim mikroskopom: estice zlata obavijene s DNA nakon upucavanja u kou

GM2005

Duchennova miina distrofijaX-vezana recesivna bolest, 1/3500 muke djece Odsutnost distrofina, membranskog proteina koji ini oko 0.01% proteina skeletnog miia Oslabljeni miii, gubitak miine mase Najprije zahvaeni miii udova i trupa invalidska kolica do 12. godine ivota Srana aritmija ili otkazivanje srca u 10% sluajeva Smrt u dobi od 10. do 20. godine ivota zbog plunih problemaGM2005

Normalni i MD mii

Detekcija distrofina monoklonskim protutijelima: miofibrili su obavijeni tamno obojenim distrofinom

Distrofina nema; Poveano vezivno tkivo; povean promjer miofibrilaGM2005

DistrofinPovezuje unutarstanini citoskelet i aktinske filamente s vanstaninim matriksom itavi kompleks stabilizira membranu Laminin 22 kongenitalna MD (k.6) Sarkoglikani 4 tipa MD Distrofin Duchennova i Beckerova MDGM2005

Duchennova miina distrofija: intramuskularni unos DNA biolistikomProblem gen za distrofin i mRNA su preveliki za unos putem vektoraNativni gen 2.4 Mb mRNA 14 kb

IDEJA: distrofin zadrava dio funkcije i kada mu nedostaje velik dio gena (Beckerov fenotip puno blai od potpune DMD)GM2005

Delecijske varijante distrofina za GT

ABD= actin-binding domains

Vei dio ponavljajuih sljedova nalik spektrinu moe se izostaviti da bi distrofin jo uvijek bio funkcionalan.Scott Harper et al., 2002.GM2005

GT s minigenom za distrofin u mievima s DMD fenotipomDMD mievi s preuranjenim stop kodonom u eksonu 23: nema distrofina!

tretirani GT

netretirani

GM2005

Rezultati 1. faze klinike studije genske terapije MD5. lipnja 2003. Francuska udruga miinih distrofiara i Transgene objavili su rezultate 1. faze klinikih ispitivanja genske terapije Duchennove i Beckerove miine distrofije 9 pacijenata u 3 skupine:Jedna injekcija 200 g plazmida s genom za distrofin Jedna injekcija 600 g plazmida s genom za distrofin 2 injekcije 2x600 g plazmida s genom za distrofin

Ispitani uzorci miia pokazuju:Ekspresija distrofina prisutna u 1-10% miinih vlakana za skupinu 1 i 2; potpuna ekspresija u skupini 3! Nema imune reakcije niti popratnih uinaka!!

GM2005

LiposomiNastaju spontanom agregacijom lipidnih molekula u vodenom okruju Kationski liposomi veu negativno nabijenu DNA Tako omotana DNA zatiena je od razgradnje Lipofektin, lipofektamin slue i za transfekciju stanica u kulturi Pozitivno nabijene lipidne glave

GM2005

Modificirani liposomiNedostatak jednostavnih liposoma - vrlo se brzo uklanjaju iz cirkulacije putem makrofaga iz jetre Dodatak povrinskih liganada smanjuje degradaciju liposoma:Monosijalogangliozidi Polioksietileni Kolesterol Glukuronska kiselina

Produljeni polu-ivot liposoma zbog reducirane opsonizacije (omatanja) proteinima iz plazmeGM2005

Kokleati vieslojni liposomiDugotrajna i jednostavna pohrana barem godinu dana kao liofilizirani prah na sobnoj temperaturi Trajne vezikule preivljavaju viestruke fuzije s membranom Preivljavanje u gastrointestinalnom traktu prikladni za oralnu primjenuliposom

kokleat

GM2005

ImunoliposomiZa aktivno usmjeravanje DNA Na povrini nose specifina protutijela Protutijela na unutarstanini miozin usmjeravaju imunoliposome na podruja sranog miia zahvaena infarktom Protutijela na molekule specifine za tumore usmjeravaju imunoliposome na stanice tumora

GM2005

Liposomi mogu posluiti kao tumor-specifine vezikule ak i bez posebnog usmjeravanjaLiposomi lake ulaze u krvne ile s oteenim endotelom tumorska tkiva

GM2005

Liposomi u genskoj terapijiNEDOSTACI PREDNOSTI potrebno 100Jeftiniji od virusnih 1000 puta vie vektora DNA da bi se Ne izazivaju imuni postigla ista odgovor uikovitost kao Iznimno prikladni kod virusnih za dopremu DNA u vektora plua putem nisu prikladni za aerosola cistina tretman mnogih fibroza bolesti

GM2005

Cistina fibrozaVrlo esta bolest u bijelaca (1 na 2000 roenih) Defekt u genu CFTRCystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

Nepravilno provoenje natrijevih i kloridnih iona u epitelnim stanicama mnogih organaZnojne lijezde previe slanog ekskreta Probavni sustav opstipacija Oteenje pankreasa dovodi do dijabetesa Gusti mukozni sekret u pluima osjetljivost na infekcije, konstantni kaalj, glavni uzrok smrtnostiGM2005

Plua u cistinoj fibrozi

Normalne alveole

CF proirene kripte ispunjene mukusom i bakterijama

CF plua ne kolabiraju nakon smrti CF plua GM2005

CF plua su osjetljiva na infekcijePseudomonas aeruginosa lako kolonizira mukus konstantna aktivacija neutrofila

Mukus titi bakterije i promovira hipermutacije

Neutrofili ne mogu eliminirati bakterije konstantna upala i oteenje plunog tkiva GM2005

Guteraa u cistinoj fibrozi

Normalna guteraa

CF guteraa proirene kripte ispunjene mukusom

Enzimi guterae ne mogu napustiti lijezdu to dovodi do oteenja Proizvodi se manje inzulina dijabetes Meu bolesnicima koji doive 25 godina 1/3 s poremeenom tolerancijom na glukozu i 1/3 s dijabetesomGM2005

Lijeenje cistine fibrozeUestala uporaba antibiotika za suzbijanje bakterijskih infekcija

Staphylococcus aureus, Haemophilius influenzae, Aspergillus fumigatus

- ista slika ...

GM2005

CFTR gen - kromosom 7: 27 eksona; protein od 1480 a.k.

ATP binding domain

GM2005

CFTR produktDelecija F508 50% pacijenata homozigoti 30% heterozigoti (normalna verzija/delecija) Nastaje nepotpuno smotani oblik osjetljiv na razgradnju proteazama Rapidna degradacija prije ulaska u Golgijev aparat

GM2005

Genska terapija cistine fibrozeSijeanj 1995. tretman liposomima intranazalni sprej 12 pacijenata privremeno olakanje u 20% pacijenata Maksimum 3. dan, prestanak 7. dan Nema imunoloke reakcije 2000. g. - mjesene aplikacije takoer uzrokuju poboljanjeGM2005

Viestruke doze prijenosa genaPrijenos gena detektiran nakon svake doze: Doza 1 56% (5/9) Doza 2 66% (6/9) Doza 3 66% (6/9) DNA mRNA protein funkcija 60% 44% 28% 22%

Prijenos gena CFTR putem kationskog lipidnog nosaa znaajno utjee na kliniku sliku bolestiGM2005