Genome Sequencer Junior

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Genome Sequencer JuniorAplicaciones de Pirosecuenciación Masiva en Biovigilancia de Virus y Microorganismos Emergentes

Roche Diagnostics México, Mayo 2011


Ejemplos de enfermedades re-emergentes

Resistencia de patógenos.

Tipos de virus

• “El agente etiológico de ~50% de los casos de encefalitis no es encontrado.”

• “La infección aguda del tracto respiratorio es la primer causa de mortalidad y morbilidad en niños en US, causa 2 millones de muertes anuales . Es detectado el agente causal solo en el 30-60 % de los casos,

• “...solo en estados unidos , las enfermedades entéricas resultan en la hospitalización del cerca de 500,000 adultos y 160,000 niños anualmente. El 40 % de los casos no se encuentra el agente causal.”

• “... 5,000 muertes anuales de recién nacidos son atribuidas a infecciones sin conocer el agente causal. “

Descubrimiento de agente patogénicos

• Factores Virales :

– Resistencia Viral

– Mutaciones

• Factores del huésped:

– Nutrición

– Factores genéticos

• Factores Ambientales:

– Calidad en el cuidado

– Reporte real (salud)

– Densidad poblacional

• Factores microbianos:

– Co-infecciones

Posibles Causas del incremento de patogenicidad

Pandemia H1N1 2009

Primer caso: Mexico, 4 Abril 2009

Estatus al 27 Septiembre 2009

N= sobre 343,298Muertes= 4,108(Vaillant et al, 2009)


Pirosecuenciación Masiva


Historia.

Origen del nombre.

Muestra inicial y procesamiento:

ADN Genómico, BACs, amplicones, cDNA

Generación de adaptadores A/B.

Flanquean fragmentos de ADN de cadena sencilla.

Formación de microreactores de emulsión:

esferas, fragmentos & reactivos de PCR en agua/aceite.

Amplificación clonal.

Toma lugar en las esferas en los microreactores.

Secuenciación.

Nebulización.

Generación de pequeños fragmentos.

PCR en emulsión

Rompimiento de

emulsión

Secuención

1 esfera

1 lectura

(x 1,000,000)

1 fragmento

Preparación de librería

Extracción de muestra

Pirosecuenciación masiva paralela.

Descripción general.



Un nucleótido complementario a su secuencia blanco genera una señal de luz.PicoTiterPlate Pozos

Fotones son

capturados por la

cámaraFlujo de

reactivos

La imagen de

secuenciación es creada.Secuenciación por

síntesis

Bases (TACG) son fluidas secuencialmente y

siempre en el mismo orden (200 veces) a

través de la PicoTiterPlate durante una corrida

de secuenciación.

La señal de luz es registrada por

la cámara CCD.

La fuerza de la señal es proporcional al

número de nucleótidos incorporados.


Secuenciación por síntesis.


GS Mapa Referencia

GS Ensamble De novo

GS Analizador de Amplicones

Variantes

Captura de

imagen

Procesamiento

de imagen

Procesamiento de señal

T

A

G

C

T

2. Normalización de datos.

3. Transformación de datos

(flujograma).

1. Dirección del flujo de

datos.

Secuencia clave = TCAG señal para calibración.

1-mer

2-mer

3-mer

4-merTACG


Análisis de datos.

1 fragmento

1 lectura

1 pozo1 perla

Preparación de librería PCR en emulsión(Amplificación clonal)

Cargado y deposición de perlas en pozos de la PTP

Corrida de secuenciación Procesamiento de datos (Generación de

flujogramas)


Flujo de trabajo: resumen.


1

10

100

1,000

10,000

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Pltfrm Servicio/Producción

Secuenciador Personal

Avance tecnológico

y mucho más!

GS 2020 MB

GS FLX100 MB

GS FLX Titanium500 MB

GS Junior35 MB

GS FLX Titanium 1k1 GB

GS Junior Atlantis

100 250 350 800

Longitud de lectura promedio

0

1,000,000

Tiempo (año)

Fluidos

PTP

Escala PTP

Opt. flujo

Cámara/PTP/Fluidos

Lecturas / corridaRendimiento (Mb) / corrida

500,000

100,000

Evolución del concepto de secuenciación 454.

Cada sistema enfocado a distintos perfiles.

1 1 1 4

No. instrumentos instalados (7)

Secuenciador Personal : GS Junior

Proyectos medianos/pequeños

MÁS CON MENOS TAMAÑO…


Subsistema

Óptico

Subsistema

de Fluidos

Subsistema

Computacional

Genome Sequencer Junior

Componentes del equipo.


Día 3 Análisis de

datos

Día 2Secuenciación

Día 1 Preparación de

muestra

Genome Sequencer Junior

Flujo de trabajo: una solución integral para el análisis de muestras.


Aplicaciones del GS Junior GS Junior en Investigación: Transición hacia Diagnóstico

Viruses

Bacteria

Hongo

Enfermedades Humanas

Susceptibilidad ejemplo.:

Biomercadores de Cáncer:

Pulmón, mama ,

Próstata, Colon

Glioblastoma

Detección de Mutaciones y Genotipo

HIV: Resistencia ,

tropismo,

integración

HBV, HCV

HPV, HSV

Oncologia

EGFR, IgH, p53, BRCA1

Bacteria 16S

Secuenciación

Expresión de genes

Identificación de patógenos

Ebola, Influenza, etc…

Descubrimiento de trancritos

biomarcadores:

Obesidad, Diabetes,

Cáncer

Metagenomica

microRNA biomarcadores

SAGE/CAGE

Genotipicación HLA

Sequence Capture

Chromo-Loci

Diabetes,

Cardiomiopatia familiar

Gene-Loci

PKD, BRCA1, EGFR

CTFR, HLA

Exones asociados a Tumores

Aplicaciones del GS Junior

Secuenciación de Genoma

completo

• Genomas completos de novo:

Genómica comparativa, algunos ejemplos.

La longitud de lectura es importante !


Lecturas alineadasLecturas alineadas

Lecturas alineadas

Lecturas de secuenciación

Secuencia consenso (Contig)Contig

Contig

Ensamble

• Metagenómica:

Organismo 1

Organismo 2

Organismo 3

Lectura larga

Metagenoma X

Lectura corta Cuál organismo?

• Poblaciones y variantes:

Variante 1

Variante 2

Variante 3

Población X

Lectura larga

Lectura corta Cuál variante?

Resistencia

• Recombinación y rearreglos:

Genotipo 1

Genotipo 2

Genotipo 3

Lectura larga

Muestra X

Lectura corta Cuál genotipo?

Patogenicidad


Influenza


El virus de influenza (A/H1N1).

Organización del genoma.

~13.5 Kb

8 Genes:

Genoma AH1N1:

3’UTR5’UTR

PB2 PB1 PA HA NP NA M1/M2

NS1/NS2


El virus de influenza (A/H1N1).

Estructura del virión y proteínas codificantes.

Nucleoproteína

Proteínas estructurales

(Interacción hospedero, regulación replicación y transcripción)

Proteínas accesorias y enzimas virales

HemaglutininaTranscriptasa

NS3NS1

Neuroamidasa

PB2 HA

NS1/NS2

PB1

PA

Transcriptasa: endonucleasa

Transcriptasa: proteasa

NP

NA

Proteína(s) de matriz

reconocimiento de CAP del mARN.

elongación del ARN

receptor (ac. N-acetilneuroaminico) / fusión a

membrana.

importe nuclear de ARN.

liberación del virus.

M1 - interacción con vRNP / exporte nuclear de ARN / gemación viral

M2 - ensamble y desenvoltura del virus.

NS1 - antagonista interferón (IFN)

NS2 - exporte nuclear del ARN M1/M2

PB1, PB2, PA

HA

NP

NAM1M2

NS2

NS1


El virus de influenza porcina (A/N1N1).

Antecedentes.

Métodos de diagnóstico actuales/convencionales:

1778 pb 1413 pb

3’UTR5’UTR


NS1/NS2

1027 pb

regiones parciales (< 200 pb)

0 1 13

Kb

2 3 4 6 7 8 10 11 1295


El virus de influenza porcina (A/H1N1).

Distribución global: casos confirmados y muertes reportadas.

http://www.broadinstitute.org/annotation/viral/Dengue/

¿Tipos y variantes en México?

¿Resistencia?


Esquema de trabajo.

Preparación de la muestra: Estrategia 1.

Amplificación segmentos específicos (PCR):

F R

Oligos específicos

MID

AB

Purificación, mezcla y dilución de amplicones

Proceso de secuenciación

(emPCR y secuenciación de amplicones)

Necesario el diseño de oligos y estandarización de PCRs

3’UTR5’UTR


NS1/NS2

0 1 13

Kb

2 3 4 6 7 8 10 11 1295

Chan et al., (2006). Journal of Virological Methods. 136: 38-43.


Esquema de trabajo.





F R

Oligos específicos

BOligos universalesMID

A



3’UTR5’UTR


NS1/NS2

0 1 13

Kb

2 3 4 6 7 8 10 11 1295



Esquema de trabajo.

Preparación de la muestra: Estrategia 3 (genomas completos).

Amplificación de genomas completos: Nota: Es importante considerar proporción de material genético humano.

uniRT-F uniRT-R

3’UTR5’UTR

PB2 PB1 PA HA NP NA

NS1/NS2

0 1 13

Kb

2 3 4 6 7 8 10 11 1295

M1/M2

cADN (sstDNA)


18 cepas de virus de influenza A (subtipos H1N1 y H3N2) colectadas entre 1996-2004 (período de 9 años).


Esquema de trabajo.


Amplificación de genomas completos:

Nebulización

(longitud compatible c/GS Junior)


(Preparación de librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)

Ligación de adaptadores MID

(caseros ó provenientes del Kit)

Nota: Es importante considerar proporción de material genético humano.

uniRT-F

uniRT-R

3’UTR5’UTR

PB2 PB1 PA HA NP NA

NS1/NS2

M1/M2

cADN (dstDNA)


M PB2 PB1 PA HA NP NA MP NS -

300020003500

1000

500

pb

M


Influenza/Resistencia

Hasta 10 %Hasta 1.0 %


GS Junior

Ventajas de plataforma masiva

Detección y sensibilidad

PyroMark – Pirosecuenciación NO Masiva


VIH


El virus de la Immunodeficiencia Humana (VIH).

Estructura del genoma.

9.719 Kb

Genoma del VIH-1:

9 Genes:

Proteínas estructurales comunes (genes gag, pol y env)

Proteínas reguladoras (genes tat y rev)

Proteínas accesorias (genes vpu, vpr, vif y nef)

gag pol env

vif vpr rev vpu tat nef

revtat5’-LTR 3’-LTR




9 Genes:

gag pol env



2000 pb 2900 pb 1800 pb

p53 p160 gp160

gp120 gp41p17 p24 p7/9 p6

3 Precursores:

10 Proteínas:

enzimas virales

extracelular

Proteínas estructurales (núcleo)

intracelular

Proteínas estructurales (cubierta)

p31/32p66/55 p15p10


El virus de Immunodeficiencia Humana (VIH).

Antecedentes.

Métodos de diagnóstico actuales/convencionales:

2000 pb 2900 pb 1800 pb

gag pol env



0 1 2 3 4 6 7 8 9.795



Distribución geográfica.


Esquema de trabajo.



R F

Oligos específicos

MID

A BMID


(emPCR y secuenciación de amplicones)HIV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.


gag pol env



Kb

0 1 2 3 4 6 7 8 9.795



Esquema de trabajo.





R F

Oligos específicos

BMID

Oligos universalesMID

A

HIV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.


gag pol env



Kb

0 1 2 3 4 6 7 8 9.795



Esquema de trabajo.


Síntesis de ds-cADN (RT-PCR):

Nebulización



(Prep. librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)




gag pol env



~9.7 Kb

msf12b nefyn05 UNINEF7’

Nadai et al., 2008. PLoS One. 3(1): e1420Bruselles et al., 2009. AIDS Res Hum Retro. 25(9): 937.


157 454 1232Proteasa Transcriptasa Reversa

cADNs

amplicones

coverage profile

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300

position

# re

ads

§ Futuro: Dependiendo del patrón de resistencia , los fármacos prescritos pueden modificarse.

VIH – Detección efectiva de mutaciones de baja frecuencia que confieren resistencia a drogas al nivel del 1.0%.Estrategia. Wang et al., (2008). Genome Research. 17(8): 1195-1201.

Secuencia referencia

Cob

ertu

ra

Frec

uenc

iade

no-

pare

ados

A C G T CoberturaRuptura

Mutación Frecuencia Tipo

C984A 2.70% D177ET990G 5.80% no Δ C993A 2.30% no Δ C993T 2.20% no Δ A995G 1.00% Y181CT996C 0.90% no Δ

C1002T 0.50% no Δ T1012C 0.40% no Δ

D177E: polimorfismo comun(20% del clado de viruses B)

VIH – Detección efectiva de mutaciones de baja frecuencia que confieren resistencia a drogas al nivel del 1.0%.Resultados.

www.roche-applied-science.comWang et al., (2008). Genome Research. 17(8): 1195-1201.


HPV


El virus de Papiloma Humano (VPH).

Organización del genoma.

7.908 / 7.857 Kb

8 Genes:

Genoma VPH tipo 16/18:

E6

E1

E2

L2

L1 LCR

E7

E5

E4




Subunidad menor

Subunidad mayor

Proteínas estructurales (cápside)

E6

E1

E2

E7

E5

E4

L2

L1

Transformación e

inmortalización celular

Regulación replicación y

transcripción

Helicasa/ATPasa

vATPasa - EGFR

p53 - CBP/p300

pRB

Proteínas accesorias y enzimas virales

Proteínas de cápside (L1/L2)

Histonas

ADN genómico

Ensamble y liberación de viriones



Antecedentes.

Métodos actuales/convencionales:

E6

E1

E2

L2

L1 URR

E4

E5

MY09/11

GP5+/6+

SPF1/2

450 pb

150 pb

65 pb

Genotipo (Variabilidad

Genética)Diagnóstico

El criterio de clasificación de los HPV se basa en la secuencia nucleotídica del gen viral L1

que codifica para la proteína principal de la cápside4 y es una región altamente

conservada; así, se establece un nuevo tipo viral cuando éste difiere en más de un 10%

con la L1 de los tipos conocidos; un subtipo si esta divergencia oscila entre 2 y 10% y

una variante intratípica cuando la divergencia es menor al 2%.

E7

0 1 2 3 4 5 6 7 7.9

Kb



Antecedentes.

Listado de ensayos/métodos moleculares utilizados para la genotipificación de VPH:

Método Código Blanco

Cuantitativo

In-house real-time PCR IHRT E6, E7, E6E7, L1

Cualitativo

HPV Amplicor (Roche molecular diagnostics, USA) AM L1

Clinical arrays papillomavirus human (Genomica, ES) CA L1

GP5þ/6þPCR (detection by enzyme immunoassay [EIA], Luminex, or Reverse Line Probe) GP L1

Hybrid Capture Version 2 (Digene Corporation, USA) HC Genoma completo

Other in-house qualitative PCR IHQ E7, L1

Linear array HPV genotyping test (Roche molecular diagnostics, USA) LA L1

MY09-MY11 PCR southern/dot blot MY L1

PGMY09-PGMY11 PCR (detection by EIA or dot blot) PGMY L1

SPF10 PCR-reverse line probe SPF L1


Esquema de trabajo.



F R

Oligos específicos

MID

AB





HPV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.

E6

E1

E2

L2

L1 LCR

MY09/11

560 pb

E4

E5

E7

L1

0 1 2 3 4 5 6 7 7.9

Kb


Esquema de trabajo.





F R

Oligos específicos

BOligos universalesMID

A

HPV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.



E6

E1

E2

L2

L1 LCR

MY09/11

560 pb

E4

E5

E7

L1

0 1 2 3 4 5 6 7 7.9

Kb


Esquema de trabajo.



Nebulización



(Prep. de librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)




Stewart et al., 1995. Genome Res. 5: 79.

MY11 MY09

Genoma VPH

Sitio de restricción (HindIII para CP141)

450 pb


Esquema de trabajo.



Nebulización



(Prep. de librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)




Stewart et al., 1995. Genome Res. 5: 79.

~8 Kb

LPCR A LPCR B

MY11 MY09


Detección de microorganismo

Emergentes

• La metagenómica es el estudio del contenido genómico de una muestra de organismos obtenida de un hábitat específico.

• Es un novedoso y prometedor enfoque que permite analizar los genomas de todos los microorganismos de un nicho ecológico, incluidos

los que no pueden cultivarse, que son la gran mayoría.

¿Qué es la Metagenómica?

• La metagenómica humana esta formada por un compuesto entre genes de Homo sapiens y genes que se encuentran presentes en el

genoma de trillones de microbios que colonizan nuestro cuerpo.

• Se piensa que el número total de genes microbianos en nuestro cuerpo excede el de genes humanos en una proporción de 1000 a 1. Esto

significa, que el genoma dentro de nuestro intestino -EL MICROBIOMA – puede albergar 1000 veces más genes que nuestro propio

genoma, y dotarnos con características que afortunadamente, no hemos tenido que desarrollar nosotros mismos

¿Qué es la Metagenómica Humana?

• El microbioma humano es el conjunto de los genomas de todos los microorganismos presentes en el cuerpo humano.

• Este microbioma está casi inexplorado. Es esencial que los científicos entiendan cómo los microorganismos interactúan con el cuerpo

humano al promover la salud o al provocar enfermedades.

• Este nuevo concepto tiene el potencial de transformar los enfoques con los que se entiende la salud humana, así como la prevención,

diagnóstico y tratamiento de una amplia gama de enfermedades.

¿Qué es la Microbioma Humano?


Proyecto del Microbioma Humano.

Identificación de la diversidad microbiana asociada al paisaje metabólico y genético humano.Iniciativa del Instituto Nacional de Salud (NIH) para llegar a las entrañas de la epidemiología de muchas enfermedades humanas…

Infección y Cáncer

Uno de cada 5 tipos de cáncer pueden ser atribuidos a algún agente

infeccioso. Las neoplasias relacionadas a infecciones son:

•Cáncer de Estomago Helicobacter pylori,

•Cáncer Hígado Virus de hepatitis B y C

•Cáncer de Cervix, Virus del Papiloma Virus

•Carcinoma nasofaríngeo Epstein-Barr

•Tipos de linfomas, herpes humano virus-8

La carga de la infección relacionada con el cáncer sigue siendo

subestimado en todo el mundo, además la asociación con agentes de

nuevas infecciones aun no ha sido explorado.

Proyecto del Microbioma Humano.

Infección y Cáncer


Comparación con bases de datos disponibles públicamente:

Base de datos ‘semilla‘: http://www.theseed.or g/wiki/Main_Page

(BLASTX, E-value<0.001) http://metagenomi cs.nmpdr.org/

NCBI non-redundant Clusters of Orthologs (COG).

- Identificación de grupos ortologos no-redundantes

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

- Determinación de rutas de senalización

Bases de datos públicas 16 S

- Filtrado de secuencias 16 S

Aislamiento de ADN

Fragmentos de escopetazo ‘shotgun’Protocolo estándar de nebul ización

Amplicones 16 S rARNProtocolo oligos 16 S

Metagenómica y diversidad microbiana.

Esquema de trabajo.

400

100

75

ROCHE 454 GS

FLX Titanium

GS JuniorPlataformas de secuenciación de

segunda generación

100 bp 200 bp 300 bp 400 bp0 bp

Longitud de lectura

Otras plataformas

Plataformas de secuenciación de segunda generación.

La longitud de lectura es importante!

Región repetida > 1,000 pb

Región repetida > 600 pb, < 1,000 pb

Región repetida > 400 pb, < 600 pb

Región repetida > 50 pb, < 400 pb

Secuenciación capilar

Secuenciación 454 (Lecturas largas)

Competencia (Lecturas cortas)

Blanco

Rep

etid

osEn

sam

ble

Con

tigs


El problema con la longitud de lectura.

Ensamble de novo: resolución de regiones repetidas.


Análisis de metagenomas.

La longitud de lectura es importante !

Ambiente

§ Miles de diferentes especies

Aislamiento de AD

N del am

biente y

secuenciación tipo ‘shotgun’

Lecturas Largas Microlecturas

Blast:

Mapa único

Blast:

Complementa con todo

Difícil identificación

Herramientas de análisis.

GS Reference Mapper Software.


Reference Sequence

Herramientas de análisis.

GS DeNovo Assembler Software.


Metagenomica

Detección de patógenos no conocidos

• Conocer el perfil de DNA circulante en individuos sanos

• Infección oculta por HBV se puede detectar en un solo

individuo.

Perfil de DNA circulante en individuos sanosBeck et al. Clinical Chem January, 2009

“Secuenciación masiva de ácidos nucleicos de suero puede ser una herramienta muy poderosa para detectar agentes

infecciosos en adultos…, y en recién nacidos.”


> Curso clínico

Donador: Individuo de sexo masculino de 57 anos de edad que murió de un desangrado talámico 10 días después de haber pasado 3 meses en la región rural de Yugoslavia.

#ID Edad (anos)

Diagnóstico Órgano Fecha de transplante Curso clínico

1 64 hepatitis C cirrosis hígado 12/4/2006 fiebre, encefalopatíamuerte (día 30)

2 63 enfermedad poliquística rinón 12/4/2006 fiebre, CNS, rechazo de injertomuerte (día 36)

3 44 enfermedad poliquística rinón 12/4/2006 fiebre, CNS, rechazo de injertomuerte (día 29)

Arenavirus – Detección de nuevo virus en un grupo de enfermedades fatales asociadas a transplante.Introducción. Palacios et al., (2008). New England Journal of Medicine. 358: 991-998.


ESQUEMA DE TRABAJO: aislamiento de ARN - RT & DOP-PCR - secuenciación de cADN.

• La comparación de secuencia con LCMV, identifica al virus como un nvo. arenavirus:

– El alineamiento de secuencia es muy pobre; el segmento pareado continuo más largo es de tan solo 14 nt.– El alineamiento de la secuencia traducida (proteína) es casi completo: arenavirus y LCMV se encuentran

filogenéticamente relacionados.

traducción

Query:LMCV:Query:LMCV:

Query:LMCV:

→ La longitud de lectura es crucial para proveer suficiente información para la correctaidentificación del arenavirus como una nueva especie viral.

Arenavirus – Detección de nuevo virus en un grupo de enfermedades fatales asociadas a transplante.Estrategia y resultados.


Metagenómica y diversidad microbiana.

Microbioma de intestino con incrementada capacidad para cosechar energía asociado a obesidad.

Secuenciación tipo escopetazo (‘shotgun’) de microbiomas delintestino distal.

§ Ratones y voluntarios humanos: obesos vs. delgados.

Análisis taxonómico de microbiomas.§ Alineamiento (BLAST) genomas microbianos no-redundantes y

secuencias 16S.§ Firmas genéticas ambientales, se definen como lecturas

asignadas a:- grupos ortologos no-redundantes (COG)- rutas de senalización implicadas (KEGG).

Cambios de microflora§ Mayor abundancia relativa bacterias Firmicutas vs. Bacterioides§ Incrementada capacidad para cosechar energía de la dieta.

La obesidad es trasmisible§ La colonización de ratones delgados libres de gérmenes con la

microbiota procedente de ratones obesos provoca un mayorincremento de la grasa corporal total.

§La microbiota del intestino es un factor adicional que puedecontribuir a la obesidad.

Turnbaugh et al., (2006). Nature. 444: 1027-1031.

• Identificación de diversidad y abundancia microbiana, analiza la expresión de genes en comunidades microbianas no cultivables.

• Analiza de forma rápida y precisa brotes virales por secuenciación de fragmentos amplificados a partir de preparaciones de RNA viral de individuos infectados.

• Detección de genomas minoritarios en infecciones vírales e identificación de cuasiespecies.

• Caracteriza mutaciones que pueden estar implicadas en resistencia a fármacos antivirales y en la evasión a la respuesta inmune del huésped.

Identificación de diversidad y abundancia microbiana

Innovación para tu salud

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