GENETYKA SĄDOWA

GENETYKA SĄDOWA

Pobieranie materiału do badań DNA

Krew

Nasienie

Ślina

Mocz

Włosy

Zęby

Kości

Tkanki miękkie

Rodzaje śladów krwi

pasywne

(kapane)

nałożone

(smugi)

natryskowe

Testy wstępne - wykrywanie krwi ludzkiej

Testy wstępne - wykrywanie śladów nasienia

Lampa UV

Test na kwaśną fosfatazę

(Phosphatesmo KM)

Test PSA (antygen

specyficzny dla prostaty)

Badanie obecności

plemników pod

mikroskopem

Testy wstępne - wykrywanie śladów śliny

Lampa UV, Crimescope

alfa-amylaza (RSID), test skrobiowy (SALIgAE®)

Materiał porównawczy

krew lub wymaz z jamy ustnej

włosy

rzeczy użytku osobistego, odzież

osobista

materiał szpitalny (preparaty

histologiczne)

znaczki i koperty

Próbka materiału biologicznego

otrzymana z miejsca przestępstwa lub w

do badania spornego ojcostwa

Izolacja DNA Obliczenie ilości DNA i

jego jakości

PCR dla wielu markerów STR

Biologia

Separacja i detekcja produktów

PCR

(Allele STR)

Technologia

Wyznaczenie genotypu DNA

w próbce

Genetyka

Porównanie genotypu a

próbki z rezultatami z innych

próbek

Jeśli istnieje zgodność to

przeprowadza się porównanie

profilu DNA z bazą danych

Generacja raportu z

prawdopodobieństwem

przypadkowej zgodności

Figure 1.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Etapy badań DNA

Perpetrator’s sperm

mixed with victim’s

epithelial cellsOdciągnąć

nadsącz

SDS, EDTA i

proteinaza K

(bufor lizujący)

mieszanina

dowodów

biologicznych

SDS, EDTA i

proteinaza K + DTT

Inkubacja

37 oC

sperma

DTT liza

główki

plemnika

“Frakcja męska” „Frakcja żeńska”sperma

Metoda lizy preferencyjnej

Termocyklery

Automatyczne analizatory DNA - elektroforeza kapilarna

Profil

genetyczny

Identyfikacja genetyczna - w badaniach sądowych, odnosi się

do procesu zmierzającego do pozytywnej odpowiedzi na

pytania:

„Czy dwa otrzymane profile DNA są identyczne?”

„Czy istnieje wystarczający dowód, pozwalający ustalić, że dwa

profile DNA pochodzą z jednego źródła (od jednej osoby)?”

Porównanie wykazało brak

zgodności oznaczonego w

próbce dowodowej profilu

DNA z profilem genetycznym

oznaczonym w nadesłanym

materiale porównawczym.

Należy wykluczyć możliwość

pochodzenia próbki

dowodowej od podejrzanego.

Układ

polimorficzny B Dowód 2

D3S1358 14, 17 14, 15

VWA 15, 17 16, 19

D16S539 11 9, 13

D2S1338 19, 23 17, 20

Amelogenina X, Y X, Y

D8S1179 10, 15 13, 14

D21S11 28, 30 28, 30

D18S51 14, 17 18, 19

D19S433 12, 18.2 14, 15

TH01 6, 8 8, 9.3

FGA 19 22

OPINIA

KATEGORYCZNA

WYKLUCZENIE

Interpretacja wyników analizy genetycznej

Profil DNA oznaczony w

próbce dowodowej jest

zgodny z profilem DNA

charakterystycznym dla

podejrzanego A.

OPINIA

PROBABILISTYCZNA

Układ

polimorficzny A Dowód 1

D3S1358 16, 17 16, 17

VWA 14, 19 14, 19

D16S539 11, 12 11, 12

D2S1338 19, 24 19, 24

Amelogenina X, Y X, Y

D8S1179 14 14

D21S11 28 28

D18S51 14, 15 14, 15

D19S433 12, 13 12, 13

TH01 6, 9.3 6, 9.3

FGA 23, 24 23, 24

BRAK

WYKLUCZENIA

Interpretacja wyników analizy genetycznej

Wykazanie zbieżności profili

genetycznych bez oszacowania

przypadkowej zgodności nie ma

znaczenia dla sądu.

Ocena statystyczna dowodu !

Częściowy profil genetyczny,

który oznaczono w próbce

dowodowej nie pozwala na

przeprowadzenie

wnioskowania odnośnie

zgodności profili DNA.

Układ

polimorficzny B Dowód 3

D3S1358 14, 17 14

VWA 15, 17

D16S539 11

D2S1338 19, 23

Amelogenina X, Y X, Y

D8S1179 10, 15 10

D21S11 28, 30

D18S51 14, 17

D19S433 12, 18.2 12

TH01 6, 8

FGA 19

OPINIA

NIEROZSTRZYGAJĄCA

BRAK

ROZSTRZYGNIĘCIA

Interpretacja wyników analizy genetycznej

Trudności w profilowaniu i brak

pozytywnych wyników w analizie

kontaminacja obcym materiałem

mała ilość DNA/degradacja DNA

działanie inhibitorów

fizyczne i chemiczne czynniki degradujące

monozygotyczne bliźniaki

chimeryzm/heteroplazmia

materiał biologiczny z tkanek nowotworowych

(LOH-onkogeny/MSI-geny naprawcze)

bloczki histologiczne

złe przechowywanie próbek

błąd człowieka/zawodność aparatury

pochodzeniu odzwierzęcym badanego materiału biologicznego

stwierdzenie, czy wynik jest „dobry” czy „zły” zależy od wiedzy i doświadczenia eksperta

zasadniczym elementem oceny jest morfologia „pików”

Problemy z determinacją płcibłędna interpretacja wyników genotypowania

delecja genu amelogeniny

przemieszczenie odcinka z genem SRY z

chromosomu Y do X (niepłodni mężczyźni XX z

genem SRY i kobiety XY – Y bez genu SRY)

chimeryzm zupełny po przeszczepie (biorca kobieta

a dawca mężczyzna)

aberracje chromosomowe (XXY, XXX, XYY, X0,

CAIS – fenotypowo kobieta XY)

inaktywacja 5-alfa-reduktazy (XY- kobieta)

Wymagania i standardy współczesnej

opinii genetycznej

Atestacje dotyczące testów biegłości w badaniach genetycznych w zakresie śladów biologicznych i ustalania ojcostwa, zgodne z aktualnymi zaleceniami Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Sądowej (ISFG), Komisji Genetyki Sądowej PTMSiK* oraz Europejskiej Sieci Instytutów Kryminalistycznych (ENFSI)

Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie badań śladów biologicznych, muszą być przeprowadzane w zakresie minimum 10 loci oraz markera płci*

Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie ustalania pokrewieństwa, w tym ojcostwa, muszą być przeprowadzane w zakresie minimum 13 loci oraz markera płci systemu CODIS*

Wartość szansy ojcostwa (PI) wymagana, aby wyniki atestacji zostały uznane za prawidłowe, w przypadku potwierdzenia ojcostwa musi wynosić co najmniej 1 000 000, a wykluczenie ojcostwa musi być wykazane co najmniej w 4 loci genowych*

Akredytacja laboratoriów wg normy PN-EN ISO/IEC 17025

Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych

Rozpoznanie zwłok opiera się na:

dowodach pozamedycznych

(daktyloskopia, odzież, przedmioty)

dowodach medycznych

oględziny zewnętrzne

oględziny wewnętrzne

badania genetyczne

Identyfikacją zajmują się medycy sądowi i antropolodzy

Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych

Oględziny zewnętrzne

Oględziny zewnętrzne zwłok, w zależności od stanu zwłok

pozwalają na ustalenie:

- wieku, płci, wzrostu, wagi ciała, rozmiaru „obuwia”

- owłosienie głowy

- koloru tęczówek

- cech twarzy, rąk, stóp, budowy ciała, co powinno być

zarejestrowane na zdjęciach lub filmie

- znaki szczególne (znamiona, blizny, zniekształcenia)

- uzębienie (w Polsce bardzo rzadko ludzie leczą się u

jednego stomatologa i posiadają kartę stomatologiczną)

- superprojekcja i metoda Gerasimowa - do odtworzenia

wyglądu twarzy

Najlepszy materiał sekcyjny do badań DNA

krew (zwłoki bez widocznego rozkładu gnilnego)

nienaruszone stomatologicznie zęby

trzon kości piszczelowej lub udowej

guzowatość kości potylicznej

chrząstka żebrowa

wątroba lub śledziona (w wyjątkowych przypadkach)

Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych

Oględziny wewnętrzne

Oględziny wewnętrzne czyli sekcja zwłok pozwala na ustalenie

stanu zdrowia tj. schorzeń narządów wewnętrznych, przebytych

operacji, zmian pourazowych, np. wygojonych złamań kości.

Należy odpowiedzieć na pytania:

jak długo od śmierci i w jakich warunkach

pozostawały poszczególne fragmenty ciała

czy poszczególne fragmenty należą do tego samego

osobnika (dopasowanie anatomiczne, zgodność

serologiczna lub testy DNA)

czy poszczególne części ciała należą do osobnika tej

samej płci

jaki wzrost i wagę ciała miała ofiara

Identyfikacja zwłok rozkawałkowanych

Metody identyfikacji zwłok*

porównanie profilu genetycznego DNA

porównanie odcisków palców

badanie uzębienia i innych danych odontologicznych

badania radiologiczne

porównanie danych medycznych (przebyte zabiegi lecznicze i

chirurgiczne)

porównanie znaków szczególnych (blizny, tatuaże)

porównanie danych rysopisowych

identyfikacja rzeczy osobistych

identyfikacja na podstawie dokumentów ujawnionych przy

zwłokach lub szczątkach

rozpoznanie przez świadków, członków rodziny lub znajomych

*opracowane podczas V Konferencji Komisji Interpolu do spraw Identyfikacji Ofiar Katastrof Masowych i Klęsk Żywiołowych, która odbyła się w Lyonie w 1993r

Profil DNA ofiary

z katastrofy

Profil DNA z

dowodowego materiału(szczoteczka do zębów

należąca do ofiary)

Bezpośrednie porównanie

Analiza pokrewieństwa

D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D

?

syn

żona

ofiara D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D

10,10 9,109,138,98,1411,13 syn

żona10,12 8,108,98,128,1211,13

10,10 9,1211,139,911,1412,13

?,10 9,??,139,??,1411,? or

?,13

ofiara

(ojciec)

uzyskany

profil

domniemany

profil ofiary

profil ofiary z

katastrofy

Figure 24.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Barkoding DNA – narzędzie do opisu bioróżnorodności

1. Opis i ewidencja bioróżnorodności

2. Analizy ekologiczne i fitogeograficzne

3. Analizy kryminalistyczne

4. Ustalanie składu żywności oraz leków

5. Kontrola „bezpieczeństwa biologicznego”

6. Zapobieganie i identyfikacja nielegalnego handlu zwierzętami lub roślinami będącymi pod ochroną

7. Klasyfikacja i opisywanie nowych gatunków

Sprawy kryminalne

Proces analizy mitochondrialnego DNA

oczyszczenie i pobranie materiału do badania

izolacja mtDNA

amplifikacja regionu HV1/HV2 metodą PCR

sekwencjonowanie amplikonów regionu

HV1/HV2

porównanie sekwencji badanych

porównanie sekwencji badanych z referencyjną

sekwencją Andersona

sprawdzenie z bazą danych częstości

haplotypowej danej sekwencji

Interpretacja wyników sekwencjonowania mtDNA

wykluczenie – różnica dwóch lub

więcej nukleotydów pomiędzy

badanymi próbkami

brak rozstrzygnięcia – różnica w

jednym nukleotydzie pomiędzy

badanymi próbkami

brak wykluczenia – brak różnicy w

sekwencji nukleotydów pomiędzy

badanymi próbkami

Analiza klasycznych cech grupowych w

badaniach o ustalenie ojcostwa

układ AB0

antygeny erytrocytarne: MNSs, Rh, Kell, Jk(a,b), Fy(a,b)

specyficzne białka surowicy krwi: układ GM,

haptoglobiny (HP)

izoenzymy zawarte w krwinkach czerwonych: APC

(kwaśna fosfataza krwinkowa), PGM

(fosfoglukomutaza), ESD (esteraza D), GLO

(glioksolaza), GPT (aminotransferaza), PGP (fosfataza

fosfoglikolanowa)

antygeny układu zgodności tkankowej HLA

Badanie ojcostwa testami genetycznymi DNA

?Pobranie krwi lub wymazu z jamy

ustnej do badania

Izolacja DNA

Amplifikacja 15 polimorficznych

markerów genetycznych techniką

PCR (Identifiler)

Rozdział produktów amplifikacji techniką

zautomatyzowanej elektroforezy – sekwenator ABI

Prism 377

Interpretacja 5-kolorowego cyfrowego obrazu

elektroforezy

• w teście tym tylko 1 mężczyzna nie będący ojcem, na milion nie będących ojcami pozostanie

niewykluczony

• wykluczenie ojcostwa stwierdzane jest średnio w 9 spośród 15 układów

• brak wykluczenia ojcostwa jest praktycznie równoznaczny z jego udowodnieniem

• prawdopodobieństwo napotkania innego mężczyzny, którego ojcostwo nie zostałoby wykluczone w

teście wynosi średnio 1 na 9 miliardów

Dziecko

Matka

Mężczyzna będący

ojcem

biologicznym

?

Zasady dziedziczenia

1) dziecko ma dwa allele dla każdego markera

autosomalnego (jeden od matki i jeden od

biologicznego ojca)

2) dziecko dziedziczy mitochondrialny haplotyp

DNA po matce (wyłączając mutacje)

3) dziecko płci męskiej dziedziczy haplotyp

chromosomu Y po ojcu (wyłączając mutacje)

Mężczyzna nie

będący ojcem

biologicznym

Zaginione

dziecko

Domniemana

matka

Domniemany

ojciec

?

Test na ojcostwo

Odwrotny test na ojcostwo(identyfikacja zaginionego dziecka)

?

Parametry biostatystyczne

Prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa (PE)

definiuje się jako prawdopodobieństwo, z jakim zastosowany zestaw markerów genetycznych pozwala na wykluczenie niesłusznie pozwanego mężczyzny; czyli określa procent mężczyzn w populacji, którzy nie mogą być biologicznymi ojcami dziecka ze względu na brak wspólnego allela

Szansa ojcostwa (PI)

interpretując wyniki badań genetycznych rozważamy dwie hipotezy - jedną potwierdzającą ojcostwo, a drugą zaprzeczającą ojcostwu badanego mężczyzny. Wielkość współczynnika PI informuje nas o tym, dla której hipotezy otrzymane wyniki badań genetycznych są bardziej prawdopodobne. Przykładowo, wartość PI = 1 000 000 oznacza, że otrzymany wynik badań genetycznych jest 1 000 000 razy bardziej prawdopodobny przy założeniu, że badany mężczyzna jest biologicznym ojcem, niż przy założeniu, że ojcem dziecka jest inny mężczyzna

Prawdopodobieństwo ojcostwa (P)

obliczane na podstawie szansy ojcostwa (PI) oraz tzw. prawdopodobieństwa a priori, którego wartość przyjmuje się najczęściej jako 0.5. Gdy wartość P przekracza 99.999999%, szansa ojcostwa (PI) wynosi przynajmniej 1 000 000

Katedra i Zakład Medycyny Sądowej UJCM