Genetikai polimorfizmusok szerepe a

bronchopulmonális dysplasia és a perinatális

tüdőkárosodás kialakulásában

Doktori értekezés

Dr. Bokodi Géza Miklós

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Vásárhelyi Barna, tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Hivatalos bírálók: Dr. Hídvégi Edit, Ph.D.

Dr. Klausz Gergely, Ph.D Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szalai Csaba, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Hermann Róbert, tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Dr. Pós Zoltán, tudományos munkatárs, Ph.D.

Budapest 2007.

2

1. Tartalomjegyzék

1. Tartalomjegyzék 2

2. Rövidítések jegyzéke 5

3. Bevezetés 8

3.1. A bronchopulmonális dysplasia 8

3.2. A bronchopulmonális dysplasia definíciója 8

3.3. A bronchopulmonális dysplasia története, incidenciája, mortalitása 10

3.4. A bronchopulmonális dysplasia klinikai tünetei 11

3.5. A bronchopulmonális dysplasia radiológiai tünetei 11

3.6. A bronchopulmonális dysplasia szövettani jellemzői 14

3.7 A bronchopulmonális dysplasia típusai 16

3.8. A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői és

patomechanizmusa 17

3.8.1. Oxigénterápia és gépi lélegeztetés 19

3.8.2. A tüdőfejlődés és szabályozó tényezői. 21

3.8.3. A perinatális gyulladás 22

3.8.3.1. A gyulladás sejtes elemei 23

3.8.3.2. A gyulladás és az oxidatív stressz 23

3.8.3.3. A gyulladás szerepe a koraszülésben 23

3.8.3.4. A chorioamnionitis 24

3.8.3.5. A gyulladás szerepe a perinatális adaptáció

zavaraiban 25

3.8.3.6. A perinatális gyulladásos reakció fázisai 25

3.8.4. A gyulladással kapcsolatos vizsgálataink 26

3.8.4.1. Az immunrendszer részei 26

3.8.4.2. Az újszülött immunrendszere 27

3.8.4,3. A neutrophil granulocyták, makrofágok és

természetes ölősejtek 27

3.8.4.4. A citokinek általános jellemzői 29

3.8.4.5. Az általunk vizsgált citokinek 30

3

3.8.4.6. A renin angiotenzin aldosteron rendszer szerepe

a gyulladásban 33

3.8.5. Táplálási ápolási tényezők 33

3.8.6. Örökletes, genetikai tényezők 34

3.8.6.1. Általános genetikai jellemzők 34

3.8.6.2. A genetikai polimorfizmusok 35

3.8.6.3. A bronchopulmonális dysplasia és a lélegeztetés

iránti igény genetikai háttere közötti kapcsolat 36

3.8.6.4. A koraszülés és a chorioamnionitis genetikai

háttere 38

3.8.6.5. A tüdőfejlődés genetikai háttere 41

3.8.6.6. A perinatális gyulladásos reakció genetikai

háttere 44

3.8.6.7. Az általunk vizsgált gén polimorfizmusok 49

4. Célkitűzések 52

5. Betegek és módszerek 54

5.1 Betegek 54

5.2 Módszerek 57

5.2.1 DNS izolálás szűrőpapíros mintából 57

5.2.2 Molekuláris biológiai vizsgálatok 58

5.2.3. Statisztikai elemzés 67

6. Eredmények 72

6.1 A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés 72

6.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés 73

6.3. Az ACE I/D és AT1R és lélegeztetés 76

7. Megbeszélés 78

7.1. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés 78

7.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés 79

7.3. Az ACE I/D és AT1R génpolimorfizmusok és lélegeztetés 82

7.4. Az általunk feltárt új összefüggések a perinatális lélegeztetési igény

és a BPD genetikájában 82

8. Tézisek 85

4

9. Összefoglalás 86

10. Summary 87

11. Táblázatok és ábrák jegyzéke 88

12. Irodalomjegyzék 89

13. Saját publikációk jegyzéke 104

14. Köszönetnyilvánítás 106

15. Saját publikációk különlenyomata 108

5

2. Rövidítések jegyzéke

ACE angiotenzin konvertáló enzim

APC antigén prezentáló sejt

ARF akut veseelégtelenség

AT angiotenzin

AT1R 1-es típusú angiotenzin receptor

bp bázispár

BPD bronchopulmonális dysplasia

BMP-4 bone morphogenetic protein-4

CD klaszter differentációs antigén

CF keringési elégtelenség

CI konfidencia intervallum

CLD krónikus tüdőbetegség

COX ciklooxigenáz

CO2 széndioxid

CPAP folyamatos pozitív légúti nyomás

CRP C-reaktív protein

CRT kapilláris újratelődési idő

DNS dezoxiribonukleinsav

dNTP dezoxi nukleotid-trifoszfát

ER ösztrogénreceptor

FGF fibroblast növekedésifaktor

FIRS magzati gyulladásos válaszreakció szindróma

FRC funkcionális reziduális kapacitás

GATA-6 transzkripciós faktor (GATA szekvenciához kötődik)

HLA humán leukocyta antigén

HSP hősokkfehérje

HW Hardy-Weinberg

I/D inzerció/deléció

IFN interferon

IFNγ interferon gamma

6

IL interleukin

IL-1β interleukin-1-béta

Il-1ra interleukin-1 receptor agonista

IL-4RA interleukin-4 receptor alfa lánc

IL-6 interleukin-6

IL-10 interleukin-10

IL-12 interleukin-12

iNOS indukálható nitrogénmonoxid szintáz

IRDS idiopathiás respirációs distressz-szidróma

IUGR intrauterin növekedési retardáció

IVH kamrai vérzés

JAK Janus kináz

kB kilobázis

kD kilodalton

LAK limfokin aktivált ölősejt

LBW kis születési súlyú

LPS lipopoliszacharid

LT limfotoxin

M mol/dm3

MAP artériás középnyomás

MAS mekónium-aspirációs szindróma

MBL mannózkötő lektin

MHC fő hisztokompatibilitási komplex

MMP mátrix metalloproteináz

mRNS messenger RNS

mtsai. munkatársai

NCPAP nazális CPAP

NEC nekrotizáló enterocolitis

NF-κB nukleáris faktor-kappa-B

NICU újszülött intenzív osztály

NK természetes ölősejt

NO nitrogén monoxid

7

NOD nukleáris oligomerizációs domén

NOS nitrogénmonoxid szintáz

OR esélyhányados

PCR polimeráz láncreakció

PDA nyitott Botallo-vezeték

PE praeeclampsia

PPHN újszülöttek perzisztáló pulmonáris hipertóniája

PPV pozitív nyomású lélegeztetés

RAAS renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer

RFLP restrikciós fragment hossz polimorfizmus

RDS respirációs distressz-szindróma

rpm fordulat másodpercenként

RSV respiratory syncytial vírus

SNP egy nukleotidot érintő polimorfizmus

SPA surfactant protein A

SPB surfactant protein B

SPC surfactant protein C

SPD surfactant protein D

TGFβ transzformáló növekedésifaktor-béta

Th T helper lymphocyta

TLC teljes tüdőkapacitás

TLR toll-like receptor

TNFα tumor nekrózis faktor-alfa

TV légzéstérfogat

U egység

UTR nem átíródó régió

UV ultraibolya

VEGF vaszkuláris endotheliális növekedési faktor

VEGFR vaszkuláris endotheliális növekedési faktor receptor

VLBW igen kis születési súlyú

v/v% térfogatszázalék

8

3. Bevezetés

3.1. A bronchopulmonális dysplasia

A Bronchopulmonális dysplasia (BPD), a koraszülöttek krónikus tüdőbetegsége (CLD)

jelentősen hozzájárul a koraszülött populáció morbiditásához és mortalitásához (1,2). A

neonatológiai terápiás eljárások fejlődésével egyre éretlenebb újszülöttek maradnak

életben, ezzel párhuzamosan emelkedett a BPD előfordulása a nagyon éretlen

koraszülött populációban (1-4). A BPD krónikus betegség, egész életük során

végigkíséri az érintett koraszülötteket. A csökkent légzésfunkció, perzisztáló légúti

tünetek, gyakori és súlyos légúti infekciók miatt jelentősen romlik a betegek

életminősége. A gyakran szükségessé váló kórházi kezelések illetve az egész életet

végigkísérő gyógyszerfogyasztás súlyos terhet jelent az egészségügyi rendszer számára

(1,5,6). Ezért nagy jelentőségű a betegség megelőzése, a BPD kialakulása

szempontjából fokozott kockázatú betegek kiszűrése és célzott kezelése. Bár számos

tényezőről igazolták, hogy hozzájárul a BPD kialakulásához, a veszélyeztetett betegek

azonosítása egyelőre nem megoldott. Egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak az

örökletes hajlamnak a betegség kialakulásában (4-10). Bár a BPD kockázatát fokozó

genetikai polimorfizmusoknak önmagukban csekély a prediktív értékük, kombinált

alkalmazásuk, pl. DNS chip technika segítségével, lehetőséget teremthet a

veszélyeztetett betegek azonosítására és személyre szabott kezelésére.

3.2. A bronchopulmonális dysplasia definíciója

A BPD definíciója többször változott az elmúlt években. Kezdetben a diagnózis a

posztmenstruációs kor és az oxigénfüggőség mellett a betegségre jellemző klinikai és

radiológiai jeleken alapult (1-4,12). Utóbbiak azonban a betegség karakterisztikájának a

változásával együtt változtak, objektív meghatározásuk körülményes. A BPD jelenlegi

definíciója több konszenzus-konferencia, illetve klinikai vizsgálat eredményén alapul. A

koraszülötteket két csoportra osztják gesztációs kor szerint és ezekben más-más

kritériumok alapján döntik el azt, hogy fennáll-e BPD (1. táblázat) (1-3).

A 32. gesztációs hét előtt született gyermekek esetén BPD-ről akkor beszélünk, ha a 36.

posztmenstruációs héten, vagy a gyermek otthonába bocsátásakor (attól függően, hogy

9

melyik következik be előbb) még mindig oxigéntámogatásra szorul a gyermek. A 32.

vagy nagyobb gesztációs hétre születettek esetén akkor beszélünk BPD-ről, ha a

gyermek az 56. életnapon, vagy otthonába bocsátásakor, (attól függően, hogy melyik

következik be előbb) még mindig oxigén adására szorul. Mindkét csoportban a betegség

megállapításának feltétele a legalább 28 napig tartó, 21 %-nál magasabb

oxigénkoncentrációval történő kezelés. (A BPD feltétele a parenchymás tüdőkárosodás,

illetve az emiatt fokozott légzéstámogatás iránti igény. Akut légzési elégtelenség miatt,

vagy más okból (pl.centrális apnoe, diafragma paralízis) kialakuló légzéstámogatási

igény a definícióban szereplő időpontban nem jelent BPD-t.)

Az oxigénfüggés mértéke alapján a betegséget 3 súlyossági csoportra osztják:

Enyhe BPD esetén a definícióban meghatározott időpontban a beteg

21% oxigéntartalmú levegőt igényel.

Középsúlyos BPD esetén a levegőben a szükséges oxigéntartalom 22-

29%.

Súlyos BPD esetén a beteg szaturációja csak akkor kielégítő, ha az

oxigénkoncentráció ≥30% vagy a megfelelő oxigenizáció biztosításához

pozitív nyomás (pozitív nyomású lélegeztetés (PPV) vagy nazális

folyamatos pozitív légúti nyomás (NCPAP)) szükséges.

(Az, hogy mi tekinthető megfelelő oxigénszaturációnak, jelenleg még

vita tárgyát képezi.).

Bár a definíció nem tartalmazza a betegségre jellemző klinikai, illetve radiológiai

jeleket, ezek segítik a BPD diagnózisának biztos felállítását (1-3,16).

10

1. táblázat: a bronchopulmonális dysplasia definíciója (1)

A BPD definíciója

Legalább 28 napig tartó 21%-nál magasabb oxigénkoncentrációval történő kezelés

krónikus tüdőkárosodás

Gesztációs kor születéskor <32 hét ≥32 hét

36. posztmenstruációs hét 56. életnap

BPD meghatározás ideje

vagy otthonába bocsátás

Enyhe BPD 21% oxigén koncentráció

Középsúlyos BPD 22-29% oxigén koncentráció

Súlyos BPD ≥30% oxigén koncentráció vagy PPV/NCPAP

3.3. A bronchopulmonális dysplasia története, incidenciája, mortalitása

A bronchopulmonális dysplasiát először Northway és munkatársai írták le 1967-ben

(11). A betegséget olyan koraszülöttekben figyelték meg, akiket valamilyen tüdőt érintő

betegség, legtöbbször idiopátiás respirációs distressz-szindróma (IRDS) miatt hosszú

ideig lélegeztettek géppel, vagy kezeltek oxigénnel, és akikben emiatt krónikus

tüdőkárosodás alakult ki (1-3). A neonatológiai terápiás eljárások korszerűsödése: az

antenatális szteroidprofilaxis bevezetése, a surfactant kezelés, az új, kíméletesebb

lélegeztetési stratégiák, a nyitott Botallo-vezeték (PDA) korai és hatékony kezelése, a

korszerű táplálás és egyéb terápiás eljárások megjelenése miatt az IRDS-ben szenvedő

újszülöttek életminősége és esélyei jelentősen javultak az elmúlt 40 évben (1).

Ugyanakkor a BPD incidenciája nem változott (1). Ennek magyarázata az lehet, hogy

bár a neonatológia fejlődésével a hagyományosan a BPD hátterében álló, tüdőt érintő

perinatális betegségek prevalenciája csökkent, ugyanakkor egyre kisebb súlyú, egyre

11

éretlenebb újszülöttek tarthatók életben, akik között egy „új-típusú” BPD jelent meg,

amit nem előz meg más tüdőbetegség (1-4). A betegséget kísérő szövettani elváltozások

sokkal enyhébbek, illetve a kialakulásában a tüdőfejlődési zavar dominál. Ezért a BPD

továbbra is az igen kis születési súlyú (VLBW) koraszülött populáció jelentős hányadát

– 20-30%-át – fenyegeti. Mortalitása is magas, a BPD súlyosságától és a gesztációs

kortól függ, súlyos BPD-ben 20-40% (1,2).

3.4. A bronchopulmonális dysplasia klinikai tünetei

A BPD-t klinikailag az elhúzódó légzéstámogatási igény, elsősorban oxigén

dependencia jellemzi. Az állapot súlyossága széles határok között mozoghat, a

látszólagosan tünetmentes betegektől a tartós gépi lélegeztetést igénylőkig. A krónikus

hypoxia miatt a fejlődés elmarad, perifériás cianózis, dobverőujj alakulhat ki. A

növekedés és fejlődés elmaradásához hozzájárul a fokozott légzési munka miatt

megnövekedett energiaigény is. „Mivel minden energiáját légzésre fordítja a gyermek,

másra nem marad ereje.” (5,6) Ezzel magyarázható a táplálási nehezítettség is, ami

tovább súlyosbítja a retardációt. A szomatikus elmaradások mellett idővel mentális

visszamaradás is kialakul. Ebben nagy szerepe van a gyakori, elhúzódó

hospitalizációnak is. A betegek a legyengült szervezet és a károsodott tüdő miatt

fokozottan érzékenyek a fertőzésekre, hajlamosak a tüdőgyulladásra. A légzészavart a

fertőzések és a szervezetet érő egyéb stresszhatások jelentősen fokozhatják. Ilyenkor

még a látszólag panaszmentes gyermekek is rövid időn belül légzéstámogatásra,

gyakran gépi lélegeztetésre szorulhatnak. Ezáltal egy önrontó kör alakulhat ki. Az

állandó gyulladás tovább roncsolja a tüdőállományt, a beteg ezért egyre rosszabb

állapotba kerül, miközben egyre fogékonyabb lesz a fertőzésekre. A betegek halálát is

legtöbbször egy pneumoniás epizód okozza. A betegség előrehaladtával a

tüdőkárosodás kihat a szívre is, pulmonális hipertónia alakul ki, ami végül akár jobb

szívfél elégtelenségig (cor pulmonale) is fokozódhat (1-3).

3.5. A bronchopulmonális dysplasia radiológiai tünetei

A mellkasröntgenen a BPD nagyon változatos eltérések formájában jelenhet meg. A

BPD radiológiai diagnózisa nehéz, a klinikum ismerete nélkül nem is lehetséges, mivel

12

a BPD számos más betegség radiológiai tüneteit képes utánozni. Mégis a

mellkasröntgen az egyetlen, BPD kimutatására alkalmas, széles körben elterjedt

vizsgálati módszer (1-3). A tüdőgyógyászatban alkalmazott egyéb vizsgálatok, például a

légzésfunkciós tesztek, csecsemőkorban nem kivitelezhetőek a beteg rossz kooperációja

miatt. Radiológiailag a legtöbb betegséghez hasonlóan, a BPD-nek is négy stádiumát

lehet elkülöníteni.

A betegség kezdeti stádiumában csak diffúz mikroatelectasiák láthatók. A kép nagyon

hasonlít az IRDS-re.

A második stádiumban a lélegeztetési trauma miatt károsodnak az alveolusok, a

növekvő atelectasiás területek mellett megjelennek a túllélegeztetett régiók, illetve a

levegőszökési szindrómák jelei. Gyakoriak a pulmonális intersticiális emphysemák

(PIE).

A harmadik stádiumban tovább súlyosbodik a helyzet. Egyszerre találunk atelectasiás

területeket és nagy cysticus emphysemás régiókat. Az elpusztult tüdőállomány helyén

megjelennek a fibrotikus kötegek is.

A negyedik stádiumban a tüdő jelentős része elpusztul. A roncstüdőre jellemző

szabálytalan képet látunk volumenveszteséget okozó fibrotikus kötegekkel. A maradék

tüdő túlfeszített, emphysemás jellegű. A hegesedések miatt nagy légtelen területek is

láthatók. Ebben a stádiumban már az állandósult pulmonális hypertonia miatt a szív is

károsodik, cardiomegalia alakul ki (1-3).

I: Fátyolozott tüdő, diffúz retikulogranuláris rajzolat, elkülöníthetetlen

az IRDS-től

II: Fokozódó tejszerű fátyolozottság, elmosódott szívkontúr,

atelectasias területek jelennek meg, interstitialis folyadékakkumuláció,

levegő bronchogram, PIE

III: Cysticus tüdőkép atelectasiákkal és emphysemás területekkel

IV: súlyos tüdőfibrosis, kiterjedt emphysema, szálagos atelectasiás

területek, inhomogén tüdő, durva kötegek, cardiomegalia

13

1. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia röntgen képe

Az ábrán a BPD radiológiai stádiumait szemlélteti. Az első képen egy 30 napos

gyermek kezdődő BPD-je látszik diffúz fátyolozottsággal. A második képen egy, két

hónapos BPD-s gyermek röntgenképén már durvább dystelectasia látható. A harmadik

képen egy négy hónapos BPD-s csecsemő mellkasröntgen felvétele látható, kifejezett

emphysemas területekkel. A negyedik képen egy fél éves BPD-s gyermek mellkas

röntgen felvételén durva fibrotikus kötegek, cardiomegália látható.

14

3.6. A bronchopulmonális dysplasia szövettani jellemzői

A BPD szövettani tünetei sem specifikusak. Kezdetben intersticiális és alveoláris

ödéma, hialinmembrán képződés, atelectasia, nyálkahártya nekrózis figyelhető meg. Ezt

követően a szubakut stádiumban kialakul a diffúz gyulladásos infiltráció. Ebben a

polymorphonuclearis sejtek mellett a makrofágoknak van fontos szerepe. A gyulladásos

sejtek által termelt szövetkárosító anyagok hatására az alveolusok destrukciója

következik be. Krónikus stádiumban az elpusztult alveolusok helyén megindul a

regeneráció. Ez fibroblast és simaizom proliferációval jár, az alveolusok helyén

kötőszövetes rostokat találunk. A bronchusok, bronchiolusok hámja metaplasiás,

hyperplasiás. Jellemző a fokozott váladékképződés. Végstádiumban a kapillárisok és

arteriolák száma csökken, az erek médiája hypertrophizál (1-3).

15

2. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia szövettani képe

A képeken BPD-s tüdő szövettani képe látható hematoxilin-eosin festéssel, 100x illetve

300x-os nagyítással. Az alsó képen gyulladásos infiltráció és az RDS-re jellemző

hyalinmembrán is látható.

Alveolus

Bronchiolus

Hyalinmembrán

16

3.7 A bronchopulmonális dysplasia típusai

A korszerű neonatológia eljárások megjelenése előtt a BPD olyan újszülöttekben alakult

ki, akiket valamilyen tüdőt érintő betegség, adaptációs zavar miatt hosszú ideig kellett

géppel lélegeztetni, illetve oxigénnel kezelni. A lélegeztetési igény hátterében

leggyakrabban IRDS állt, de ide sorolható a mekónium aspirációs szindróma (MAS),

kongenitális diafragma hernia, tüdő hipoplázia, nyitott Botallo-vezeték is (4). A

tüdőkárosodás hátterében több vizsgálat is igazolta a magas oxigénkoncentrációk és a

gépi lélegeztetés fiziológiástól eltérő nyomásparamétereinek vezető szerepét (3,4,12-

15). Manapság ez a klasszikus, régi-típusú BPD ritkább, a BPD-s esetek kb. 30%-át

teszi ki.

A BPD-s betegek többsége az új típusú BPD-ben szenved. Ez olyan koraszülöttekre

jellemző, akik 1000 gramm alatti súllyal születtek és nincs más tüdőbetegségük. A

betegség klinikai tünetei sokkal enyhébbek, alacsonyabb oxigénkoncentrációk és

nyomásértékek elegendőek a megfelelő oxigenizáció biztosításához. Idővel ez az

oxigénigény tovább csökken. A röntgenképen inkább diffúz fátyolozottság látható

nagyobb ciszták illetve atelectasiás területek helyett. A szövettani képen sokkal

enyhébbek a gyulladásos jelek illetve kevésbé meghatározó az epitheliális metaplasia,

simaizom hypertrophia és a fibrózis. Az alveolusok száma és komplexitása illetve a

kapilláris hálózat sűrűsége elmarad a normálistól (2. táblázat) (1-4).

Ez alapján az új típusú BPD inkább tekinthető tüdőfejlődési rendellenességnek, míg a

régi típusú BPD kialakulásában a külső hatások által kiváltott szövetkárosodás illetve

regeneráció dominált.

17

2. táblázat: A régi és új típusú bronchopulmonális dysplasia összehasonlítása (1)

3.8. A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői és patomechanizmusa

A BPD a perinatális morbiditás és mortalitás szempontjából meghatározó jelentőségű

kórkép. Pontos patomechanizmusának feltárása érdekében az elmúlt 40 évben számos

vizsgálatot végeztek. Jelenleg a BPD-t multifaktoriális kórképnek tartják, ahol együtt

játszanak szerepet a betegség kialakulásában a külső környezet tüdőkárosító tényezői és

az egyén genetikai hajlama. (3. táblázat)

A régi és új típusú BPD összehasonlítása

Régi típusú BPD Új típusú BPD

Alternáló atelectasia és hyperinfláció Kevesebb regionális különbség a

tüdőben

Súlyos légúti epitheliális léziók

(hyperplasia, metaplasia) Ritka légúti epitheliális léziók

Légúti simaizom hyperplasia Enyhe légúti simaizom hyperplasia

Súlyos, diffúz fibroproliferatio Kevés fibrózis

Pulmonális artériák hypertoniás

remodellációja Kevesebb, diszmorf artéria

Csökkent alveolarizáció és légzőfelület Kevesebb, nagyobb alveolus,

egyszerűbb szerkezet

18

3. táblázat: A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői

Vastag betűvel emeltem ki a citokin génpolimorfizmusokat, amiknek a BPD

kockázatára gyakorolt hatását a disszertációban vizsgáltam.

A BPD kockázati tényezői

Általános,

genetikai

tényezők Éretlenség

Lélegeztetés káros

hatásai

Elhúzódó lélegeztetés-

sel járó betegségek

Gyulladás,

infekció

Táplálási, ápolási

tényezők

Férfi nem Koraszülés Barotrauma IRDS Anyai infekció

Energia és esszenciális

tápanyaghiány

Kaukázusi rassz

Intrauterin retardáció

Volutrauma MAS Chorio-amnionitis

Immun-globulin hiány

HLA-A2 Alacsony születési

súly Túlfeszítés PPHN Magzati

infekció

Antioxidáns hiány (Cu, Zn, Se, vit-A, vit-

E)

Atopiás, asthmás családi

anamnézis

Alacsony gesztációs

kor

Oxigén-toxicitás

Diaphragma hernia

Újszülöttkori nosocomialis

fertőzés

Folyadék túlterhelés

Citokin gén polimor-

fizmusok?

Éretlen tüdő (IRDS)

Elhúzódó lélegeztetés

Cardio-pulmonalis betegségek

Pneumonia (Ureaplasma urealyticum)

Ápolási faktor

Szteroid

profilaxis

hiánya

(Pneumonia) Túlélést javító kezelések

19

3.8.1. Oxigénterápia és gépi lélegeztetés

Első leírásakor a BPD-t az afiziológiás lélegeztetés, magas nyomások, illetve magas

oxigénkoncentrációk következtében kialakuló tüdőkárosodásnak tartották. A magas

oxigénkoncentrációról illetve a magas lélegeztetési nyomásról több vizsgálat is

kimutatta, hogy közvetlenül, (gyulladásos mechanizmussal) károsítják a tüdőt, illetve

megzavarják a tüdőfejlődést.

Magas oxigénkoncentráció jelenlétében fokozódik a citotoxikus szabad gyökök

képződése, ami meghaladhatja a koraszülött szervezet csökkent antioxidáns védelme

által közönbösíthető mennyiséget, így közvetlenül tüdőkárosodás alakulhat ki. Az

oxigén önmagában képes a szakkuláris fázisban lévő tüdő szeptációjának leállítására

(3). Azokban a betegekben, akiknél magasabb oxigénszaturáció elérésére törekedtek,

ezért magasabb oxigénkoncentrációt alkalmaztak súlyosabb tüdőkárosodás alakult ki.

Magas oxigénkoncentráció jelenlétében csökkent az alveolusok száma, illetve az

alveolusok körüli kapilláris hálózat sűrűsége (3,17).

Az oxigénkoncentráció mellett erős korrelációt találtak a BPD kockázata és a

lélegeztetésre jellemző nyomásértékek között, illetve fordított arányosságot figyeltek

meg a BPD kialakulásának kockázata és a lélegeztetés intenzitására jellemző

vérgázértékek között (1,4). A gépi lélegeztetés térfogat- és nyomásterheléssel járhat. Ez

közvetlenül károsítja az alveolusokat, illetve a szövetkárosodást kísérő gyulladásos

reakció révén közvetve is hozzájárul a tüdőkárosodáshoz (4,18).

Dreyfuss és Saumon összefoglalták a rendelkezésre álló adatokat, és kimutatták, hogy a

tüdőt károsítja, ha a teljes tüdőkapacitást (TLC)-t meghaladó térfogatokra fújják fel

(14). A regionális vagy egyenletes túlfúvás a leukociták tüdőbe vándorlását, fokozott

permeabilitást, illetve intersticiális és alveoláris ödémát eredményez. A funkcionális

reziduális kapacitás (FRC) és tidal volume (TV) különböző kombinációi szintén

károsak, ha összegük meghaladja a TLC-t. Ha a mellkas tágulását korlátozzuk

kötözéssel vagy öntvénnyel, akkor a nagy nyomások sem eredményeznek

tüdőkárosodást (14).

A tüdő túlfeszítése strukturális elemeket tehet tönkre a tüdőszövetben, illetve többféle

mediátor felszabadulását válthatja ki, amik beindítják a gyulladásos kaszkádot. Ezeket,

a faktorokat kezdetben valószínűleg nem a perifériás leukociták termelik, mivel az

20

izolált és perfundált tüdőben is TNFα, IL-1β és IL-6 szabadul fel, illetve két órán belül

megemelkedik ezen a citokinek mRNS-ének szintje is.

Ugyanezeket a citokineket/kemokineket azonosították a fokozott BPD kockázatú

gyermekek amnionfolyadékában. A légúti minták nagy mennyiségben tartalmaznak más

faktorokat is, amik elősegíthetik a fehérvérsejtek kivándorlását a tüdőbe, illetve más

tüdőkárosító anyagok felszabadulását (laminin, fibronectin, elasztáz, komplement). A

gyulladás ellenes citokinek, mint az IL-10, szintje alacsony, ugyanakkor a

proinflammatorikus citokinek szintje magas. Az effektor molekula keverék egyes

komponenseinek szerepe a folyamatban még nem ismert. A túlfúvott tüdőben

extracelluláris mátrix elemek és növekedési faktorok is szintetizálódnak. A tüdő által

termelt citokinek és kemokinek felerősítik a közvetlen károsodásra adott választ, azáltal,

hogy odavonzzák a perifériás leukocitákat a tüdőbe (14).

Egy érett tüdőn végzett vizsgálat azt is kimutatta, hogy a tüdő normális FRC alatti

lélegeztetése szintén a tüdő károsodását eredményezi, a tüdőegységek ciklikus nyitásán

és zárásán keresztül. A mosással surfactant hiányossá tett tüdők alacsony tüdőtérfogat

melletti lélegeztetése in vivo és izolált perfundált tüdőben citokinek felszabadulását

eredményezte. A túlfúváshoz hasonlóan, az alacsony tüdőtérfogatok melletti

lélegeztetés is elősegíti a perifériás leukociták felhalmozódását és aktivációját a

tüdőben. Az optimális FRC és TLC közé eső lélegeztetési térfogatok, amik VLBW

gyermekekben valószínűleg 7-10 ml/kg közé esnek, nagyon kevés manőverezési helyet

hagynak a klinikusoknak, hogy elkerüljék az alacsony és magas térfogatú

tüdőkárosodási zónákban végzett lélegeztetést. Nincsenek elérhető technikák, amikkel

rutinszerűen mérhetnénk az FRC-t és TLC-t lélegeztetett koraszülöttekben. Ezért a

súlyos IRDS-ben szenvedő VLBW gyermekekben elkerülhetetlen lehet az éretlen tüdő

sérülési zónákban történő lélegeztetése, ami gyulladásos citokinek felszabadulásához és

tüdőkárosodáshoz vezet (4).

Kraybill és munkatársai 10 neonatológiai egység 1000g alatti újszülötteiben elemezték a

BPD-vel összefüggő klinikai paramétereket, és azt találták, hogy a géppel lélegeztetett

újszülöttekben 48 és 96 órás korban a BPD gyakorisága fordítottan arányos a PCO2

szintekkel (13). Ez az eredmény megkérdőjelezhető, mivel a kevésbé súlyos

tüdőbetegségekben szenvedő újszülötteknél általában alacsonyabbak a PCO2 értékek. A

legalacsonyabb PCO2 értékeket azoknál a neonatológiai egységeknél találták, ahol

21

legnagyobb arányú volt a BPD előfordulása. A PCO2 hatékonyabban jelezte előre a

BPD kialakulását, mint a kezdeti tüdőbetegség súlyossága. Ezek az eredmények arra

utalnak, hogy a hyperventilatio hozzájárulhat a BPD kialakulásához. A BPD és a

lélegeztetés kapcsolatának hosszú történetét ismerve nem kétséges, hogy az oxigén

káros hatásai és az afiziológiás, túlzott gépi lélegeztetés hozzájárulnak a BPD

kialakulásához. Az alacsony PCO2 értékek pedig a túlzott lélegeztetés indikátorai (4).

3.8.2. A tüdőfejlődés és szabályozó tényezői

Az új típusú BPD inkább tüdőfejlődési zavarnak tekinthető, mint közvetlen

tüdőkárosodásnak. A tüdőfejlődés alveoláris szakasza emberben a 24. gesztációs hét és

a 18. születés utáni hónap közé esik. Az alveolarizáció legnagyobb része 5-6 hónapos

korban következik be, ezért a születés utáni infekciók, gyulladásos reakciók is

tüdőkárosodáshoz vezethetnek (3). A tüdőfejlődés két szakaszból áll, ami nem különül

el élesen egymástól: az elsődleges szeptációval sacculusok képződnek, amit a

másodlagos szeptáció követ. Ennek kapcsán alakulnak ki az alveolusok és a kapilláris

hálózat (17,19). A kapilláris hálózat fejlődése az alveolarizáció után is intenzív marad.

A tüdőfejlődés során a serkentő és gátló tényezők közötti finom egyensúly szükséges az

egyes részfolyamatok megfelelő, térben és időben összehangolt lezajlásához.

A tüdőfejlődés legfontosabb mediátorai a TGFβ illetve a glükokortikoidok (3). A

glükokortikoidok gyorsítják a parenchyma érését, fokozzák a surfactant termelést és a

compliancet, csökkentik az erek permeabilitását és fokozzák tüdőfolyadék clearance-ét.

Összességében tehát javítják a tüdőfunkciót (3,19).

A TGFβ ezzel szemben gátolja a tüdőfejlődést. A korai embrionális életben izoformáit

és receptorát a tüdő fibroblastok és epitél sejtjei termelik. Gátolja a fejlődő

hörgőrendszerben az elágazódások képződését és a II-es típusú pneumocyták surfactant

termelését. Azoknál, akikben később BPD alakult ki, megemelkedett TGFβ szinteket

találtak a tüdőaspirátumban, ami valószínűsíti, hogy a TGFβ szerepet játszik a

tüdőkárosodás kialakulásában (3,17).

Feltételezhető, hogy azok a VLBW koraszülöttek, akikben később BPD alakul ki, még

túl éretlenek ahhoz, hogy a külső stresszhatásokra elegendő kortizolt termeljenek, így

22

náluk az éretlen neuroendokrin rendszeren keresztül a legtöbb környezeti stressz-faktor

is hozzájárulhat a BPD kialakulásához (3).

A tüdőfejlődés fontos része az érfejlődés, az alveolusok körüli kapilláris hálózat

kialakulása, ami a másodlagos szeptáció során következik be (3,17). Ebben a

folyamatban jelentős szerepe van a megfelelő angiogenetikus faktorok pontosan

szabályozott térbeli és időbeli megjelenésének. Legfőképpen a vascularis endotheliális

növekedési faktor (VEGF) szerepét vizsgálták a tüdőfejlődésben. A BPD

állatmodelljeiben alacsony VEGF és VEGF-receptor-1 (VEGF-R1) szinteket mutattak

ki (12,17). Ugyancsak alacsonyabbnak találták az endotheliális és az indukálható

nitrogénoxid szintáz (NOS) aktivitást ezekben az állatokban. Ez valószínűsíti, hogy a

nitrogénoxid (NO) rendszer, ami szintén szerepet játszik az érképződésben, fontos lehet

a BPD kialakulásában is (17).

A tüdőfejlődés egyik legjellemzőbb markere az elasztin, ami elengedhetetlen a tüdő és

az erek falának rugalmassága, compliance-e szempontjából. BPD-ben elhunytak

boncolási anyagaiban és állatkísérletekben az alveolusok és kapillárisok fejlődészavara

mellett károsodott szerkezetű elasztin felhalmozódását figyelték meg (12).

A tüdőfejlődés és a gyulladásos reakció szabályzásáért felelős mediátorok egy része –

például növekedési faktorok és arachidonsav származékok – a két folyamatban

megegyezik. Ezért a fejlődési folyamat megzavarásában az intrauterin életben és

születés utáni időszakban központi szerepet tulajdonítanak a gyulladásnak, illetve a

gyulladásos reakció során felszabaduló mediátoroknak (4). Különösen igaz ez az egyre

éretlenebb koraszülöttekre, akiknél a tüdő még fejletlenebb állapotban található,

ugyanakkor az éretlen immunrendszer miatt a gyulladásos reakciók inadekvát módon,

kontrollálatlanul zajlanak (20-23).

3.8.3. A perinatális gyulladás

A gyulladásos folyamat elkezdődhet már a születés előtt az intrauterin életben, hiszen

például a koraszülés egyik legfontosabb okának a chorioamnionitist, és a

magzatfüggelékek gyulladását tartják (23,24). A gyulladás, születés után is kialakulhat

infekciók, illetve szövetkárosodást okozó ártalmak hatására. A gyulladásos reakcióról

23

kiváltó októl függetlenül több szinten is kimutatták, hogy hatással lehet a BPD illetve a

tüdőkárosodás kialakulására (21-23).

3.8.3.1. A gyulladás sejtes elemei

A koraszülöttek tüdejében közvetlenül születés után nagyon alacsony az érett neutrofil

granulocyták és makrofágok száma. Ugyanakkor állatkísérletek alapján számuk gyorsan

emelkedik a gépi lélegeztetés megkezdése után (20-21). A tüdőmosó folyadékban lévő

granulocyták száma szoros összefüggést mutat a tüdőödémával és a tüdőkárosodással

(21). A gyulladásos reakció kezdetét a vérben lévő neutrofil granulocyták és

makrofágok kivándorlása jelzi a szövetkárosodás helyére. Ezzel magyarázzák azt a

megfigyelést, hogy azoknál a koraszülötteknél, akiknél egy órás korban a keringő

neutrofil szám jelentősen csökkent, gyakrabban alakult ki BPD (21). Az aktivált

neutrofil granulocyták által termelt proteolitikus enzimek később aztán további

szövetkárosodáshoz vezetnek (21). Állatkísérletekben a BPD kialakulását a hízósejtek,

eozinofilek és neuroendokrin sejtek felhalmozódása is kísérte a tüdőben (3).

3.8.3.2. A gyulladás és az oxidatív stressz

A gyulladásos folyamat az oxidatív stresszel szemben is érzékenyebbé teszi a tüdőt. A

gyulladásos reakció következtében a légutakba kerülő szabad vas elősegíti a

szabadgyökképződést, ami TGFβ képződésén keresztül fibrózishoz vezet (3,25). Az

általános alultápláltság és elégtelen protein bevitel miatt a koraszülöttekben alacsony a

glutation szint, ami tovább fokozhatja a koraszülöttek érzékenységét a szabadgyökök

által okozott tüdőkárosodással szemben (3,25). Állatkísérletekben az antioxidánsok

hatékonyan megelőzték a BPD kialakulását (1,2,12). Emberben csupán az A-vitamin

mutatott valamelyes védő hatást a tüdőkárosodással szemben (2,12).

3.8.3.3. A gyulladás szerepe a koraszülésben

A BPD legfontosabb kockázati tényezője a koraszülöttség (1-3). A koraszülések 70-

80%-a ismeretlen okból bekövetkező úgynevezett idiopathiás koraszülés. Az esetek 20-

24

30%-ában valamilyen ismert anyai eltérés (méh- és/vagy placenta-rendellenesség) áll a

hátterében (19,20,24). Az idiopathiás koraszülések pathomechanizmusa vitatott, a

legáltalánosabban elfogadott elmélet szerint hátterüken többnyire chorioamnionitis áll.

A 30. gesztációs hét előtt spontán koraszülő nők között a chorioamnion tenyészetekben

közel 75%-os fertőzöttségett írtak le (26,27).

3.8.3.4. A chorioamnionitis

A chorioamnionitis (CA) hátterében legtöbbször Ureaplasma urealyticum-mal történt

fertőződés áll. A kórokozó többnyire látens infekciót okoz enyhe, sokszor

észrevehetetlen tünetekkel. Ugyanakkor a háttérben folyamatos immunreakció zajlik. A

szervezet nem képes a kórokozó eliminálására, a gyulladás a hüvelyből felfele terjedve

eléri a méhet és a magzatfüggelékeket is (4,19,20). A CA-re jellemző intrauterin

proinflammatorikus citokin emelkedésnek számos anyai és magzati következménye van

(28-31). A magzati szervezetben aktiválódnak a fagociták, amik különböző szervekben,

így a tüdőben is, szövetkárosdást okozhatnak (32). A CA-ben jellemző magas citokin

szintek (elsősorban IL-1β és IL-6) megzavarhatják a magzat normális fejlődését és

meghatározhatják az újszülöttkori morbiditást (28,30). Terminusra bekövetkező

szülésnél az amnion folyadékban és a placentában megemelkedett citokin (IL-1β, IL-6,

IL-8) szinteket figyeltek meg (33,34). Azokban a nőkben, akiknél koraszülés

következett be ezek a citokinszintek még tovább emelkedtek, az aktuális fertőzöttségi

állapottól függetlenül (35). Ez alátámasztja azt az elméletet, miszerint a gyulladásos

mediátorok meghatározó szerepet játszanak mind a szülés mind a koraszülés

beindításában (36). A méhnyak érésében és felpuhulásában például, a cervicalis

stromában felhalmozódó fehérvérsejtek játszanak központi szerepet (37). Továbbá az

IL-1β és TNFα szintek erősen korrelálnak a prosztaglandinok termelődésével, amik a

méhösszehúzódásokért felelősek (38). Egy antiinflammatorikus citokinről, az IL-1β

receptor antagonistáról kimutatták, hogy képes az IL-1β szüléstelősegítő hatásait

ellensúlyozni (39). A magzati oldalon termelődött citokinek szintén hozzájárulhatnak a

koraszülés beindulásához (40).

25

3.8.3.5. A gyulladás szerepe a perinatális adaptáció zavaraiban

A koraszülötteknél a perinatális adaptáció során fokozott a légzési elégtelenség

kockázata. Különösen érzékenyek azok a koraszülöttek, akiknél a tüdőfejlődés már az

intrauterin élet során zavar szenvedett, és ezért még kevésbé képesek a környezeti

változások kompenzálására (17). A légzési elégtelenség kezeléséhez gyakran magas

oxigénkoncentrációk alkalmazására és gépi lélegeztetésre van szükség. A lokális iritáció

gyulladásos reakciót, közvetlen és közvetett tüdőkárosodást okozhat (3,17).

Az adaptációs zavar során más perinatális szövődmények is kialakulhatnak (41-43). A

legtöbb perinatális szövődmény patomechanizmusában szerepe van a gyulladásos

reakciónak (42,43). A posztnatális korban jelentkező gyulladás lehet szisztémás

(szepszis), illetve szervrendszerre lokalizálódó (nekrotizáló enterocolitis (NEC)). A

kontrollálatlan gyulladásos reakció során felszabaduló mediátorok közvetlenül

károsítják a tüdőt, illetve a gyakran kialakuló légzési elégtelenség kezelése szintén

tüdőkárosodást okozhat. A perinatális infekciók gyakran járnak generalizált szepszis

kialakulásával. Az újszülöttkori szepszis illetve a magzati gyulladásos reakció (FIRS)

patomechanizmusával számos vizsgálat foglalkozott (43-47).

3.8.3.6. A perinatális gyulladásos reakció fázisai

A bakteriális kórokozók eliminálásáért újszülöttkorban döntően a veleszületett

immunitás a felelős, az immunreakció szabályozásában azonban a lymphocyták is

szerepet játszanak (42). A gyulladásos reakció első lépése, a kórokozó felismerése, a

bakteriális mintázat felismerő receptorok (TLR, CD14, MBL) segítségével történik. A

sejtek aktivációja intracelluláris kinázokon illetve a nukleotidkötő oligomerizációs

domén (NOD) család fehérjéin keresztül történik, ami végül az NF-κB sejtmagba

történő transzlokációjához vezet (47-49). Az így aktivált makrofágok és neutrophil

granulocyták gyulladásos citokinek szekrécióján keresztül auto- és parakrin módon

kommunikálnak egymással és a gyulladásos reakciót szabályzó limfocitákkal, ezáltal

további aktivációs lépéseken mennek keresztül. A kemotaktikus faktorok és adhéziós

molekulák expressziója fokozódik, lehetővé téve a fagocita sejtek kitapadását és

extravazációját. Az extravazációban szerepe van az endothel állapotának is. Ennek

26

jelzője lehet az endotheliális faktoroknak (mint az ACE) expressziója (49,50). A

folyamat utolsó lépése a kórokozók elpusztítása fagocitózissal, reaktív oxidatív

szabadgyökökkel és proteolítikus enzimekkel (18,21,22). A szepszis

generalizálódásában fontos szerepet játszik a gyulladásos és a véralvadási rendszer

kölcsönhatása is (47).

3.8.4. A gyulladással kapcsolatos vizsgálataink

A BPD összetett patomechanizmusú kórkép, kialakulásában azonban a gyulladásnak

központi szerepe van. Az elhúzódó gépi lélegeztetésre és oxigénterápiára hajlamosító

kórképek többségében szintén meghatározó szerepe van a gyulladásnak. A magas

oxigénkoncentrációk illetve a gépi lélegeztés által okozott barotrauma, volutrauma és

túlfeszítettség szövetkárosító hatása szintén gyulladásos mechanizmussal valósul meg.

A gyulladásos reakcióban központi szabályozó szerepe van a gyulladásos citokineknek.

A citokinek szabályozzák a fehérvérsejtek gyulladás helyére történő vándorlását, a

szövetkárosító proteolítikus enzimek és reaktív oxidatív ágensek felszabadulását. A

gyulladásos reakciót szabályzó anyagok és a tüdőfejlődés mediátorai között számos

átfedés van, ezért a gyulladásos citokinek megzavarhatják a normális tüdőfejlődést,

ezzel is hozzájárulva a BPD kialakulásához (17).

Mivel a gyulladás központi szerepet játszik a BPD kialakulásában, vizsgálataink során

elsősorban a gyulladásos reakcióval foglalkoztunk. A koraszülöttek immunrendszere

éretlen, eltér a felnőttekétől, azonban ezt részleteiben még kevesen vizsgálták. A

gyulladásos folyamatok szabályozásában azonban koraszülöttek esetén is a citokinek a

legfontosabb mediátorok, ezért genetikai vizsgálatainkban a citokin gének

polimorfizmusai és a BPD kockázata közötti kapcsolatot vizsgáltuk.

3.8.4.1. Az immunrendszer részei

Az immunrendszeren belül elkülönítik a veleszületett immunitást, ami az összes

kórokozóval szembeni aspecifikus, gyors, elsődleges védelmi vonalat jelenti, és a

szerzett immunitást, ami a T és B sejteken keresztül specifikusan bár, de lassabban

reagál az ismert antigénekre. A két rendszer átfedi egymást, szoros együttműködés van

27

közöttük. Minden antigénhatásra először a veleszületett immunitás reagál, majd ezután

aktiválja a szerzett immunitás effektor mechanizmusait. A szerzett immunitás esetén is a

kórokozók végső eliminálását a veleszületett immunitás sejtes elemei biztosítják (51).

3.8.4.2. Az újszülött immunrendszere

Születéskor az immunrendszer még éretlen, különösen igaz ez a szerzett immunitásra,

ahol a hatékony működéshez az antigénekkel történő találkozás szükséges. Ezért az

újszülöttek immunvédekezésében az anyától kapott immunglobulinok mellett a

veleszületett immunitásnak van meghatározó szerepe. A veleszületett immunitás több

szinten működik, részt vesznek benne a határfelületek barrierjei, antibakteriális

enzimek, pl. lizozim, akut fázis fehérjék, komplement rendszer. Legfontosabb részei

azonban a fagocita sejtek, amelyek a kórokozók eliminálását végzik. Különösen

fontosak a makrofágok, amelyek az ősi, testidegen anyagokra jellemző molekuláris

mintázatokat felismerő receptorokkal rendelkeznek.

A veleszületett immunitás sejtes elemei két citokin, az IL-12 és az IFNγ, szabályozása

alatt állnak (3. ábra) (52-55). A koraszülöttek éretlen immunrendszerérere jellemző a

nem megfelelő citokinválasz, a többi citokinhez hasonlóan az IFNγ és IL-12 termelése

is csökkent mértékű koraszülöttekben (52.)

3.8.4.3. A neutrophil granulocyták, makrofágok és természetes ölő sejtek

Vizsgálataink során elsősorban a veleszületett immunitás sejtes elemeit vizsgáltuk. A

veleszületett immunitáshoz a klasszikus fagocita sejtek tartoznak, a neutrophil

granulocyták, a makrofágok és a természetes ölősejtek (NK). Ezekre a sejtekre.az

jellemző, hogy kórokozó felismerésük kevésbé specifikus, mint az adaptív immunitás

sejtjeinek, a limfocitáknak, antigén felismerése. Általános, ősi, baktériumokra jellemző

konzervatív motívumokat ismernek fel, mint például a lipopoliszacharid, CpG

szekvenciák. A felismerésben az úgynevezett mintázatfelismerő receptoroknak van

szerepe, az egyik legismertebb a toll-like receptor család. Az adaptív immunitás B és T

limfocitái peptidkötő-receptoraikkal sokkal specifikusabb antigének felismerésére

képesek, a HLA rendszer révén képesek a szervezet saját fehérjéit elkülöníteni a

28

testidegen fehérjéktől. A limfociták hátránya, hogy csak peptid típusú antigének

felismerésére képesek (kivétel a CD1 T sejtek), míg a veleszületett immunitás sejtjei

lipid és cukor természetű antigéneket is felismernek. A kisebb specificitás és a

konzervált motívumok felismerése a veleszületett immunitás sejtjei számára nagyon

gyors reakciót tesznek lehetővé. Ezek a sejtek jelentik a szervezet első védelmi vonalát,

ezek találkoznak előszőr a kórokozókkal és kezdik meg azok eliminálását, fagocitózisát.

Bár ez a folyamat gyors, kevésbé hatékony, mint az adaptív immunreakció. A

veleszületett immunitás sejtjei a kórokozókkal való találkozás után a belőlük

felszabaduló citokineken, mediátorokon keresztül aktiválják az adaptív immunitás

sejtjeit is, illetve az adaptív immunreakció során is szabadulnak fel olyan anyagok,

amelyek viszont a veleszületett immunitás sejtjeit aktiválják, például, fokozzák a

makrofágokban az oxidatív szabadgyökök termelését. A kétféle immunrendszer tehát

nagyon szorosan összefügg, nem választható el egymástól. Sokszor az adaptív

immunfolyamatoknál is a végső eliminációs lépést a veleszületett immunitás sejtjei

végzik (51).

3. ábra: Az IFNγ és IL-12 hatása egymás termelődésére

Aktivált makrofág NK sejt

Az NK és T sejtek által termelt IFNγ aktiválja a makrofágokat, fokozza az adhéziós molekulák expresszióját, a fagocitózist, az oxidatív gyökök és az IL-12 termelését. Az aktivált makrofágok által termelt IL-12 NK sejt aktivációt, fokozott IFNγ termelést okoz.

29

3.8.4.4. A citokinek általános jellemzői

Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció citokineken keresztül valósul meg.

Valamennyi immunsejt képes citokinek termelésére, illetve rendelkezik a citokinek

érzékeléséhez szükséges specifikus receptorokkal. Az immunsejteken kívül azonban a

gyulladásos és immunfolyamatokban szerepet játszó más szervrendszerek, így

elsősorban a haemopoeitikus és neuroendokrin rendszer, sejtjei is képesek citokinek

termelésére és érzékelésére. A citokinek kis molekulatömegű (10-40kD)

fehérjemolekulák, elhelyezkedhetnek a sejtfelszínen, vagy szolubilis formában a

plazmában. A citokinek nómenklatúrája változatos, a legkorábban felfedezett citokinek

a feltételezett funkcióról kapták a nevüket, pl. tumor nekrózis faktor (TNF). Később a

citokint termelő sejtek alapján elkülönítettek monokineket, illetve limfokineket. A

fehérvérsejtek közötti kommunikációban résztvevő citokineket szokás interleukineknek

(IL) nevezni.

A citokinek változatos szerkezetű polipeptidek. Közös jellemzőjük, hogy rendszerint

valamilyen külső stimulus hatására termelődnek. Általában nem raktároz a sejt előre

szintetizált citokineket, a stimulus hatására a sejt aktiválódik, és ez transzkripción

keresztül vezet a citokinek szintéziséhez. A szintézis után, a citokinek azonnal

kiválasztódnak a sejtből, ezáltal biztosítva a gyors hatás kialakulását.

A citokinek hatása pleiotróp és redundáns, azaz a legtöbb citokin többféle sejtre is képes

hatást gyakorolni, ugyanakkor többféle citokin is kiválthat azonos hatást a célsejteken.

A citokinek hatásukat rendszerint kaszkádok formájában, felerősítve fejtik ki, egyes

citokinek további citokinek termelését indukálják. A citokinek hatása lehet autokrin,

parakrin, sőt a nagy mennyiségben a keringésbe jutó citokineknek endokrin hatásuk is

lehet.

A citokinek hatásukat specifikus nagy affinitású receptorokon keresztül fejtik ki, ezért

nagyon alacsony 10-10-10-12M koncentrációban is hatásosak. Citokinek hatására

rendszerint receptoraik expressziója is változik, tovább erősítve vagy gyengítve a

citokinek hatását.

Funkciójuk alapján megkülönböztethetők a veleszületett immunitás citokinjei, az

adaptív immunitás citokinjei és a haemopoietikus citokinek (51).

30

3.8.4.5. Az általunk vizsgált citokinek

Vizsgálataink során, mi elsősorban a klasszikus gyulladásos citokineket és a

veleszületett immunitás citokinjeit vizsgáltuk.

TNFα

A TNFα az akut gyulladásos válasz központi mediátora. Elsősorban az aktivált

mononukleáris fagocita sejtek termelik, de a T, NK és hízósejtek is képesek termelésére.

A TNFα termelés leghatékonyabb stimulusa a lipopoliszacharid (LPS). Az NK sejtek

által termelt IFNγ fokozza a makrofágok TNFα termelését.

A TNFα monoglikozilált II-es típusú membránproteinként szintetizálódik, kis

intracelluláris aminoterminussal és nagy extracelluláris karboxil terminussal

rendelkezik. A membránban homotrimer formában helyezkedik el, és a II-es típusú

TNFα receptorokat képes aktiválni. A szolúbilis TNFα egy membrán metalloproteináz

által történt hasítás után keletkezik. Három 17 kD-os polipeptid lánc alkotja az 51 kD-os

szolúbilis TNFα molekulát. A szolúbilis TNFα hatását az I-es és II-es típusú TNF

receptoron keresztül fejti ki. A receptorok TNFα kötése után intracelluláris jelátviteli

kaszkád aktiválódik, majd végül az NF-κB transzkripciós faktoron keresztül alakul ki a

TNFα hatása.

A TNFα fő funkciója a neutrophil granulocyták és monocyták toborzása a fertőzés

helyére. Hatására az endothel sejtek felszínén fokozódik az adhéziós molekulák

expressziója, fokozódik a kemokinek szekréciója is. Bizonyos sejtekben a TNFα

apoptózist indukál. A gyulladásos válaszreakció során nagymennyiségű TNFα kerül a

keringésbe, aminek szisztémás hatásai is lehetnek. A TNFα a hypothalamusban

hozzájárul a láz kialakulásához, csökkenti az éhségérzetet, a májban hatására fokozódik

az akut fázis fehérjék szintézise, az anyagcserét katabolikus irányba tolja, nagy

mennyiségben myocardium depresszor hatással rendelkezik, az endothelre kifejtett

hatásai miatt intravasculáris koagulációt is képes okozni. Ezáltal a TNFα a szeptikus

sokk és a következményes több szervi elégtelenség kialakulásának központi mediátora

(51).

31

IL-1β

Az IL-1 a TNFα-hoz hasonlóan a gyulladásos válaszreakció központi mediátora. Az IL-

1 is elsősorban aktivált makrofágokban termelődik LPS és TNFα hatására, azonban más

sejtek, így a neutrophil granulocyták, endothel és epithel sejtek is képesek a termelésére.

Az IL-1-nek két izoformája ismert az IL-1α és az IL-1β. Mindkét izoforma azonos

sejtfelszíni receptorokhoz kötődik, és azonos hatásokkal rendelkezik. Mindkét izoforma

33 kD-os prekurzorként szintetizálódik, amiből enzimatikus hasítás után alakul ki a 17

kD-os szekretált forma. Az IL-1α mindkét formában aktív, míg IL-1β esetén csak a 17

kD-os hasított formának van biológiai aktivitása. A keringésben inkább az IL-1β

izoforma található. AZ IL-1-nek két receptora ismert mindkettő az Ig superfamily-be

tartozik. Az I-es típusú receptor majdnem minden sejten megtalálható, a II-es típusú

receptor főleg B-lymphocytákon fordul elő. Az IL-1 a receptorkötés után IRAK kinázon

keresztül végül az NF-κB transzkripciós faktor segítségével fejti ki hatásait.

Az IL-1β hatásai a TNFα-éhez hasonlók. Kis mennyiségben az endothel sejtek

aktivációját, a sejtfelszíní adhéziós molekulák expressziójának fokozódását okozza.

Nagyobb mennyiségben a szisztémás keringésbe kerülve hozzájárul a láz

kialakulásához, és az akut fázis fehérjék szintéziséhez. Bár az IL-1β és a TNFα hatásai

hasonlóak az IL-1β nem okoz apoptózist, és önmagában szeptikus sokk kiváltására is

képtelen.

Az IL-1-nek létezik egy funkció nélküli szerkezeti homológja az IL-1 receptor

antagonista. Ez a citokin valószínűleg az IL-1 hatásainak endogén szabályozásában

játszik szerepet (51).

IL-6

Az IL-6 mind a természetes, mind az adaptív immunitásban szerepet játszó citokin. Pro-

és antiinflammatorikus hatásokkal is rendelkezik. Mononukleáris fagocytákban

endothelsejtekben, fibroblastokban és más sejtekben termelődik elsősorban IL-1β és

TNFα hatására. Homodimer formában hatásos, mindkét alegység négy globuláris

láncból épül fel. Hatásait I-es típúsú citokinreceptoron illetve JAK/STAT kinázokon

keresztül fejti ki.

32

Az IL-6 fokozza az akut fázis fehérjék szintézisét, illetve a csontvelőben a neutrophil

granulocyták képződését. Az adaptív immunitásban elősegíti a B-sejtek érését és az

antitestek termelődését (51).

IL-10

Az IL-10 gátló hatású citokin, ami hatással van a természetes és az adaptív immunitás

sejtjeire is. Elsősorban aktivált makrofágok termelik, de a T-sejtek és a keratinocyták is

képesek termelésére. Négy alfa-hélix szerkezetű globuláris doménből épül fel. Hatásait

II-es típusú citokinreceptoron keresztül fejti ki.

Az IL-10 feladata az immunreakció kioltása a fertőzés eliminálását követően. Hatásait

elsősorban az aktivált makrofágok gátlásán keresztül fejti ki. Az IL-10 gátolja az

aktivált makrofágok és dendritikus sejtek IL-12 termelését, illetve gátolja a makrofágok

és dendritikus sejtek MHC II expresszióját, ezáltal gátolva a T-sejt választ és az adaptív

immunreakciót (51).

IL-12

Az IL-12 teremti meg a kapcsolatot a veleszületett és az adaptív immunitás között. A

veleszületett immunitás alapvető mediátora, aktiválja a sejt közvetített szerzett

immunitást. Az antigénprezentáló sejtek (APC), azaz a makrofágok és dendritikus sejtek

termelik bakteriális endotoxin (LPS), intracelluláris kórokozók, és antigénnel stimulált

T sejtek hatására. Az IL-12 egyedi szerkezetű citokin, 70 kD tömegű heterodimerek

alkotják, melyek egy 35kD és egy 40 kD tömegű alegységből épülnek fel. A p35

alegység 4 α-globulin láncból áll, a 3p12-q13.2 locusban kódolódik. A legtöbb sejtben

termelődik. A p40 alegység I-es típusú citokinreceptor szerű, de Ig-like domént is

tartalmaz, az 5q31-32 locusban kódolódik, csak az APC sejtek képesek szintetizálni, így

csak ezekben alakul ki aktív IL-12 heterodimer. (létezik solubilis p40 is). Hatását I-es

típusú wsxws szekvenciát tartalmazó citokinreceptoron keresztül fejti ki. JAK és

STAT4 kinázokat aktivál.

Az IL-12 fokozza az NK és T sejtek IFNγ termelését, ami makrofág aktivációhoz vezet.

Hatására a CD4 pozitív T sejtek Th1 sejtekké differenciálódnak, (T sejt növekedési

faktor). A Th1 sejtek az adaptív immunitás fagocitáit aktiválják. Az NK sejtek IL-12

33

hatására limfokin aktivált ölő (LAK) sejtekké alakulnak, aktiválódnak a CD8 pozitív

cytotoxikus limfociták is (51,56).

IFNγ

Az IFNγ (II típusú interferon) a legfontosabb makrofág aktiváló citokin. Az IL-12-vel

stimulált NK és T sejtek termelik. Homodimer formában fordul elő. Hatását II-es típusú

citokinreceptoron keresztül STAT1 kinázon keresztül fejti ki. Génje a 12q14 locusban

található. Az aktivált makrofágok kórokozó elimináló képességét fokozza azáltal, hogy

fokozódik a szöveti faktor, a fagocyta oxidáz, az iNOS, a növekedési faktorok, a

citokinek (pl. IL-12) és a mikrobicid enzimek szintézise és expressziója. Ugyancsak

fokozódik az MHC I és II expressziója az APC sejteken. Az IFNγ az adaptív immunitást

Th1 irányba tolja, fokozza a Th1 és gátolja a Th2 sejtek képződését. Az IFNγ hatással

van a B-sejtek immunglobulin termelésére is, gátolja az IL-4 függő immunglobulinok

képződését. Az IFNγ a neutrofil és NK sejteket is aktiválja (51,57,58).

3.8.4.6. A renin angiotenzin aldosteron rendszer szerepe a gyulladásban

Jól ismert az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) és termékének az angiotenzin II-nek

(AII) a vérnyomás-szabályozásban betöltött szerepe. Újabb vizsgálatok szerint azonban

a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer (RAAS) szerepet játszik a gyulladásos

folyamatban is. Az AII-ről kimutatták, hogy fokozza a proinflammatorikus citokinek

(TNFα, IL-6) termelését (59), míg az ACE gátlás a sejtes gyulladásos válasz

csökkenését eredményezte (60).

3.8.5. Táplálási ápolási tényezők

Bár a BPD átlagos prevalenciája 20% körül mozog igen kis születési súlyú

koraszülöttekben, jelentős különbségeket figyeltek meg az egyes neonatológiai

centrumok között. Ennek hátterében állhat az egyes centrumok által alkalmazott eltérő

BPD definíció, illetve az eltérő terápiás irányelvek. Különbözik a centrumok technikai

felszereltsége is, a korszerűbb lélegeztetési stratégiák pedig bizonyítottan csökkentik a

BPD kialakulásának kockázatát (1). Adatok utalnak arra is, hogy az alacsonyabb

34

oxigéntenzióra, 90% alatti oxigénszaturációra való törekvés, illetve a permisszív

hypercapnia csökkentette a BPD incidenciáját. Hasonló megfigyeléseket tettek a

folyamatos pozitív légúti nyomás (CPAP) szélesebb körű alkalmazásával is (1).

A koraszülöttekre jellemző az esszenciális tápanyag és energiahiány, az

immunglobulinok és antioxidánsok alacsony szintje. Ennek ellenére eddig nem sikerült

randomizált kontrollált vizsgálattal igazolni a korszerű táplálás és az antioxidáns pótlás

hatásosságát a BPD megelőzésében (1,52,53).

3.8.6. Örökletes, genetikai tényezők

A BPD kialakulásában az egyén genetikai fogékonysága is fontos szerepet játszik. Erre

utal, hogy bár a BPD kialakulása szempontjából az újszülött érettsége döntő fontosságú,

egy adott kohorszban ugyanolyan terápia mellett is csak a betegek egy részénél

jelentkezik ez a szövődmény (5-8). Ugyancsak a genetikai tényezők szerepét támasztják

alá az ikervizsgálatok, ahol a BPD fokozott konkordanciáját figyelték meg egypetéjű

ikrekben, illetve a BPD kialakulásában a genetikai tényezők szerepét 63,6%-osnak

találták (9).

A genetikai tényezők nem csak közvetlenül a BPD kialakulási kockázatát

befolyásolhatják, hanem a BPD-re hajlamosító egyéb tényezők iránti fogékonyságot is

befolyásolhatják.

Számos gén illetve génváltozatot próbáltak kapcsolatba hozni a BPD-vel, illetve a BPD-

re hajlamosító perinatális szövődményekkel.

3.8.6.1. Általános genetikai jellemzők

Vannak olyan fenotípusos tulajdonságok, amelyek genetikai háttere vagy nincs

pontosan feltárva, vagy több gén által meghatározott úgynevezet poligénes öröklődésű.

A klasszikus genetika hőskorában a teljes genom megismerése előtt, csak a fenotípusos

jegyek kapcsolódását, együttes előfordulását tudták megfigyelni, és ez alapján próbáltak

az öröklődésre következtetni.

35

A BPD esetén is ismertek olyan fenotípusos jegyek, melyek jelenlétében a betegség

gyakrabban fordul elő, ezek pontos oka azonban egyelőre még nem ismert,

feltárásukhoz további vizsgálatok szükségesek.

A férfi nemről, a kaukázusi rasszról, a HLA-A2 antigén hordozásról, valamint az

atópiás, asztmás családi anamnézisről bebizonyították, hogy fokozza a BPD kialakulási

kockázatát (4).

3.8.6.2. A genetikai polimorfizmusok

Az emberi genom kb. 5 milliárd bázispárból épül fel. Az emberi DNS-t felépítő

nukleotidok sorrendje egyénenként kisebb-nagyobb eltéréseket mutat. Az eddigi

megfigyelések szerint kb. 1250 bázispáronként fordulnak elő 1 nukleotidot érintő

egyéni variációk. Ezeket single nucleotide polymorphism-nak, röviden SNP-nek,

nevezik (régebbi néven pontmutációk). Az 1%-nál gyakoribb SNP-k száma

mintegy 11 millióra, a 10%-ál gyakoribbaké mintegy 5 millióra tehető. Jelenleg kb.

9 millió SNP-t ismerünk. Emellett vannak olyan, több nukleotidból álló DNS-

szakaszok is, melyek egyéni variációt mutatnak az egyes emberek között. Ezeknek

több változata ismert, mi egy inzerciós/deléciós polimorfizmust is vizsgáltunk az

SNP-k mellett, ahol az inzerciós génváltozat néhány bázispár beépülésével

hosszabb lesz a deléciós változatnál. Az egy nukleotidnyi eltérések és az egyéb

polimorfizmusok döntő hányada olyan DNS-szakaszokban található, amelyek nem

vesznek részt a sejtműködés szabályozásában. Kis részük, 2-3 százalékuk, azonban

fehérjéket kódoló géneket, vagy ezek működését szabályozó DNS-szakaszokat

érint, és ezek egy része a fenotípusban is megjelenik. Megegyezés szerint a

gyakrabban előforduló génvariáns a „vad”, a ritkábban előforduló a „mutáns”. A

polimorfizmusok jelentős részét a Humán Genom Projekt keretében azonosították.

Az adatok nyilvános adatbázisokban elérhetők (Human SNP Database, HGBASE).

36

3.8.6.3. A bronchopulmonális dysplasia és a lélegeztetés iránti igény genetikai

háttere közötti kapcsolat

A BPD-re hajlamosító genetikai tényezők közül elsősorban olyan SNP-k szerepét

vizsgálták, melyek a patomechanizmusban szerepet játszó tényezőkkel kapcsolatba

hozhatók. Így hagyományosan az RDS talaján kialakuló BPD-nél a surfactant fehérje

(SP) gének SNP-i, később pedig az új típusú BPD megjelenéséval a gyulladásos

folyamat és az antioxidáns rendszer SNP-i és a BPD illetve lélegeztetési igény között

kerestek kapcsolatot.

A surfactant fehérje polimorfizmusok közül Weber és mtsai. az SPA1 6A6 allél

hordozást gyakoribbnak találták BPD-s koraszülöttekben (61). Makri és mtsai. az SPB

intron-4 mutáns allél hordozókban figyelték meg a BPD magasabb incidenciáját (62).

Rova és mtsai. szintén az SPB intron-4 deléciós variánsáról mutatta meg, hogy a BPD

kockázati tényezője (63). A többi SP polimorfizmus és a BPD között nem sikerült

kapcsolatot kimutatni (61,64).

Az aktivált fehérvérsejtek nagy mennyiségű citokint termelnek az éretlen tüdőben. A

gyulladásos citokinek központi szerepet játszanak a BPD kialakulásában (20-24,65). A

citokinek hozzájárulnak a fehérvérsejtek inváziójához, a proteolítikus enzimek és

reaktív oxigén intermedierek felszabadulásához. Ezen kívül a citokinek megzavarhatják

a tüdőfejlődés jelátviteli útjait is.

A citokinek termelését meghatározza az egyén genetikai háttere, csakúgy, mint a

fejlettségi állapota és a perinatális körülmények. A legfontosabb citokinek SNP-i és a

BPD közötti kapcsolatot már többen vizsgálták.

A TNFα G-308A SNP szerepét BPD-ben három csoport is vizsgálta. Az A-allél

hordozásáról kimutatták, hogy fokozott TNFα termeléssel jár. A BPD és az SNP

hordozás közötti kapcsolatot bemutató eremények azonban ellentmondásosak. Míg

Kazzi és mtsai. az A-allél védő szerepét mutatták ki BPD-vel szemben (66), addig

Adcock és mtsai. (67) nem találtak kapcsolatot ezen SNP és a BPD kockázata között.

A tüdőkárosodásban szintén fontos szerepet játszó monocyta kemoattraktáns protein-1-

nek (MCP-1) funkcionális SNP-je és a BPD kockázat között sem tudtak kapcsolatot

kimutatni (67).

37

A szelektinek lektin kötő fehérjék, amelyek a fehérvérsejtek endothel sejtekhez történő

kitapadásában játszanak szerepet. Ez annak az adhéziós kaszkádnak az első lépése, ami

a fehérvérsejtek gyulladás, fertőzés vagy szövetkárosodás helyére történő

kivándorlásához vezet.

A közelmúltban munkacsoportunk kimutatta, hogy az L-szelektin gén mutáns alléljének

(Ser213) hordozása a BPD kialakulásának valószínűségét 2,45-szörösére emelheti (68),

míg az E- és P-szelektin gének SNP-i (E-szelektin Ser128Arg, P-szelektin Thr715Pro)

nem befolyásolták a BPD kialakulásának kockázatát. Úgy gondoljuk, hogy ennek a

jelenségnek a magyarázata az SNP jelenlétében megváltozott L-szelektin expresszió

lehet (68).

Az endothel faktorok közül a közelmúltban az ACE inzerciós/deléciós (I/D)

polimorfizmus lehetséges szerepét vizsgálták a neonatális tüdő patológiában (50). Kazzi

és mtsai. igen kis születésisúlyú koraszülöttekben kimutatták, hogy a D allél (ami magas

ACE aktivitással, és ezért magas AII szintekkel jár) prevalenciája magasabb a BPD-s

populációban (50). Yanamandra és mtsai. illetve nem tudták ezt az összefüggést

igazolni (70).

Léteznek a perinatalis tüdőkárosodás ellen védő veleszületett mechanizmusok is. Ezek

közé tartozik az antioxidáns rendszer is (25). Állatkísérletek alapján a BPD kezelésében

az antioxidánsok pótlása hatékony lehet (1,2,12), ezért felmerült, hogy a természetes

antioxidánsrendszert érintő SNP-k hajlamosíthatnak a BPD kialakulására. Manar és

mtsai. BPD-s populációban vizsgálták a glutation-S-transzferáz enzim (GST-P1-105ile)

genetikáját, és az alacsony aktivitással járó variánst hordozó gyermekeknél 4,5-szörös

BPD kockázatot figyeltek meg (71).

Mivel a véralvadás és fibrinolízis is hozzájárulhat a BPD kialakulásához, Lin és mtsai.

ezen folyamatok genetikájára koncentráltak, és megvizsgálták az urokináz gén egy

gyakori polimorfizmusának szerepét BPD-ben. Az eredményeik azonban nem

erősítették meg ennek a variánsnak a jelentőségét a BPD kockázatában (72).

38

3.8.6.4. A koraszülés és a chorioamnionitis genetikai háttere

A BPD a koraszülöttek szövődménye, prevalenciája drámaian megnő az éretlenebb

VLBW populációban. Ezért feltételezhető, hogy a koraszülöttség kockázatát növelő

SNP-k fokozzák a BPD kockázatát is.

A koraszülés esetében a legnagyobb szerepet a tünetmentes aszcendáló anyai infekció

következtében kialakuló chorioamnionitisnek és korai burokrepedésnek tulajdonítanak

(27-30), ezért elsősorban a gyulladásos kaszkád citokinjeit és a proteolitikus enzimeket

kódoló gének polimorfizmusai és a koraszülés kockázata közötti kapcsolatot vizsgálták.

Számos SNP-ről igazolták, hogy mind anyai, mind magzati hordozásuk koraszülésre,

illetve koraszülöttségre hajlamosíthat (31-36).

A chorioamnionitis fokozza a koraszülés kockázatát, illetve a FIRS révén a posztnatális

gyulladás valószínűségét is emeli (19). Adatok vannak arra vonatkozóan is, hogy a

chorioamnionitis szempontjából a magzat genotípusa is meghatározó lehet (73,74). Bár

nem minden vizsgálat tudott összefüggést kimutatni, több esetben igazolták, hogy

kapcsolat lehet a tumornekrózis faktor alfa (TNFα), és limfotoxin alfa (LTα) SNP-k és

a magzatfüggelékek gyulladása között (73,74).

A citokin genotípusok klinikai szerepét vizsgálták koraszülő és ismételten vetélő (RPL)

nőkben is. Bár ezek a klinikai csoportok néhány patofiziológiai aspektusban bizonyosan

különböznek, a klinikai megjelenésük gyakran nehezen elkülöníthető, és feltételezhető,

hogy a citokin polimorfizmusok hasonló szerepet játszanak mindkettőben.

Bár néhány kisebb vizsgálat az IL-6 G-174C, IL-10 G-1082A, IFNγ A-874T és TNFα G-308A

SNP-k azonos prevalenciáját írta le RPL és kontroll nőkben (75-79), a vizsgálatok

metaanalízise kimutatta, hogy azoknak az SNP-knek a hordozása, melyek magas IFNγ

illetve alacsony IL-10 termeléssel járnak (pl. IFNγ -874T, IL-10-1082A allélek) fokozzák a

RPL kockázatát (79). Hasonló összefüggést figyeltek meg a TNFα G-308A allél és a

RPL kockázata között a fenti a vizsgálatban illetve Reid és mtsai. vizsgálatában (78).

Ezeket, az eredményeket megerősítette az IL-10, IL-6, TGFβ, IFNγ és TNFα

genotípusok közelmúltban elvégzett haplotípus analízise. Costeas és mtsai. RPL nőkben

azoknak a citokin haplotípusoknak a magasabb prevalenciáját figyelték meg, amelyek

alacsony Th2/Th3 illetve magas Th1 citokinmintázattal járnak (80). Az IL-1β-nak és

antagonistájának, az IL-1 receptor antagonistának (IL-1-ra), szerepét is megvizsgálták

39

RPL-ben. Bár az IL-1β C3954T SNP és az RPL között nem találtak kapcsolatot (79,81),

az IL-1-ra alfa lánc gén intronjában lévő tandem repeat variáns (IL-1ra-2N) fokozta az

RPL kockázatát (82).

A spontán koraszülő nők (sPTB) citokin genetikai adataiból sokkal kevesebb áll

rendelkezésre, illetve több az ellentmondó adat. Simhan és mtsai. az IL-6-174CC

genotípust ritkábbnak találták a 34. gesztációs hétnél korábban spontán szülő nőkben,

ami arra utal, hogy ez az SNP csökkentheti a sPTB kockázatát (83). Hartel és mtsai.

eredményei szintén alátámasztják ezt a megfigyelést (84). Az RPL-hez hasonlóan az

IL-1ra-2N genetikai variáns az sPTB-ben is fontosnak tűnik; a bakteriális stimulusra

alacsonyabb IL-1β válasszal járó allélek védenek a sPTB ellen (85).

A TNFα G-308A allél prevalenciáját szintén megvizsgálták sPTB-ben. Dizon-Townson

és mtsai. nem találtak különbséget a TNFα genotípusokban sPTB és kontroll terhes

nőkben (86). Ezzel szemben mások a TNFα-308A allél hordozókban fokozott CA (74) és

sPTB (87) kockázatot figyeltek meg. Egy másik kutatócsoport a koraszülés kockázatát

fokozó allél-asszociációk meghatározását tűzte ki célul. Annels és mtsai. az IL-10-

1082A/-819T/-593A, a TNFα+488A/-238G/-308G és az IL-4-509C/C haplotípusokat azonosították

a koraszülés független kockázati tényezőiként (88).

Ezek a vizsgálatok az anyai genotípus és a terhesség kimenetele közötti kapcsolatot

vizsgálták. CA-ban azonban a magzat a magas proinflammatorikus citokintermelés fő

forrása. Eddig kevés próbálkozás történt a magzati IL-1β és IL-1ra genotípus és a

koraszülöttség közötti kapcsolat leírására. Az IL-1β3954T allél magzati hordozása (ami

fokozott IL-1β aktivitással jár) fokozott sPTB kockázatot jelentett (89), míg az IL-1ra-

2N allél jelenléte a magzatban nem volt hatással a sPTB kockázatára (90). Két másik

vizsgálat azonban az IL-1ra-2N allél homozigóta hordozásának jelentőségét mutatta ki a

koraszülöttség kialakulásában (91,92).

Ezek az eredmények alátámasztják, hogy az anyai és/vagy magzati citokin genetikai

variánsok meghatározhatják a koraszülöttség kockázatát. Bár az anya és a gyermek

között erős genetikai kapcsolat van, szükség lenne olyan vizsgálatokra, amelyek mind

az anya, mind a gyermek genotípusát figyelembe veszik, hogy meghatározható legyen a

genetikai hátterük független hozzájárulása a terhesség kimeneteléhez. Az anyai és

magzati genotípus együttes meghatározásának jelentőségére világítanak rá Kalish és

mtsai. eredményei is, akik megfigyelték, hogy egy a 2N-től különböző IL-1-ra genetikai

40

variáns és az IL-4-590T allél – ami megemelkedett IL-4 szintekhez vezet – anyai illetve

magzati hordozása ikerterhességekben fokozta az sPTB kockázatát, az IL-10 A-1082G,

IL-1β C3954T variánsoké azonban nem (93). Egy bázis cseréje a TNFα génben a -863-as

helyen összefüggésben volt a koraszülés utánai kedvezőtlen kimenetellel anya-gyermek

párokban, a -308-as helyen bekövetkező báziscsere azonban nem (73).

A citokin hálózaton kívül más jelátviteli utak genetikáját is vizsgálták

koraszülöttségben. Mivel a fertőzés a koraszülés egyik legfőbb kiváltó oka, az egyik

lehetőség a bakteriális fertőzés felismeréséért felelős fehérjék SNP-inek vizsgálata.

Annells és mtsai. a kórokozók felismerésében szerepet játszó mannózkötő lektin

(MBL2) esetén a MBL2 codon 54Asp allél anyai jelenlétéről mutatták ki, hogy a 29.

gesztációs hét előtti koraszülés független kockázati tényezője (88). Lorenz és mtsai. a

toll-like receptor 4 (TLR4) polimorfizmusait vizsgálták (48). A TLR4 szintén a

gyulladásos folyamat első lépésében, a baktériumok felismerésében játszik szerepet. A

TLR4 Asp299Gly SNP-je esetén koraszülöttek és az egészséges újszülöttek esetében

sem az anyai, sem a magzati oldalon nem találtak különbséget a mutáns allél

prevalenciájában, viszont a koraszülöttekben az Asp/Gly és Gly/Gly genotípusok

szignifikánsan gyakrabban fordultak elő (48). Ezt a megfigyelést azonban

munkacsoportunk vizsgálata nem tudta megerősíteni (49).

Az L-szelektin a gyulladásos folyamat következő fázisában a leukocyták migrációjában

játszik szerepet. Kutatócsoportunk korábbi vizsgálatai alapján az L-szelektin Pro213Ser

SNP esetén a mutáns 213Ser allél hordozás gyakoribb volt VLBW koraszülöttek között,

mint érett újszülöttekben, illetve VLBW koraszülöttekben a mutáns 213Ser allél

hordozása a BPD kialakulásának fokozott kockázatával járt (68). Ugyanakkor E- és P-

szelektin polimorfizmusok (E-szelektin Ser128Arg, P-szelektin Thr715Pro) esetén az

allélfrekvenciák nem különböztek a vizsgált koraszülött és egészséges újszülött

populációkban (68).

A fertőzésen kívül a praeeclampsia (PE) is gyakori oka a koraszülésnek. A PE

genetikáját is intenzíven kutatják elsősorban a homeosztázist, vérnyomást és gyulladást

szabályozó gének SNP-i és a PE közötti lehetséges kapcsolatok feltárását megcélozva.

A PE genetikájának irodalmi áttekintése azonban meghaladja a disszertációm kereteit,

ezért csak utalok néhány tanulmányra (94-98).

41

Az aszcendáló anyai infekció következtében kialakuló chorioamnionitis során

felszabaduló gyulladásos mediátorok korai burokrepedés révén is kiválthatnak

koraszülést (22,75). Ebben központi szerepe van a gyulladásos citokineknek és a mátrix

metalloproteinázoknak (MMP) (81,82). A mátrix metalloproteinázokat (MMP), amik a

magzatburkok lebomlásért és a korai burokrepedésért (PROM) felelősek, valószínűleg

olyan citokinek aktiválják, mint a TNFα és az IL-6 (19,73,99). A korai burokrepedés

genetikai hátterét is többen vizsgálták, elsősorban a gyulladásos citokin SNP-k illetve a

burokrepedésért közvetlenül felelős mátrix metalloproteináz SNP-k és a korai

burokrepedés között keresve kapcsolatot.

Az MMP-knek több altípusa ismert számos SNP-vel. Ezek közül az MMP8 és MMP9

polimorfizmusai és a korai burokrepedés kockázata között találtak kapcsolatot. Az

MMP8 C-799T, A-381G és C+17G SNP-k egyike sem volt önmagában felelős a korai

burokrepedésért, a három ritkább allél együttes jelenléte azonban (ami a trophoblast

sejtekben a legnagyobb MMP8 szinteket eredményezi), gyakrabban fordult elő korai

burokrepedés után született afroamerikai újszülöttekben (100). Ferrand és mtsai. az

MMP9 megváltozott szintjével járó 14 CA repeat polimorfizmus és a korai

burokrepedés között találtak kapcsolatot afroamerikai anyák újszülöttjeiben (101).

A gyulladásos citokin génpolimorfizmusok és a korai burokrepedés kockázata között is

többen kerestek kapcsolatot. Bár nem mindegyik vizsgálat talált egyértelmű

összefüggést, úgy tűnik, hogy a TNFα G-308A SNP, és a hősokk protein 70 (HSP70)

A+1267G SNP magzati hordozása fokozhatja a korai burokrepedés kockázatát

elsőszülöttekben (102). Roberts és mtsai. szerint a ritkább TNFα-308A allél anyai

hordozása is hajlamosít a korai burokrepedést követő koraszülésre (87). Annels és

mtsai. az IL-10 -1082G/-819C/-593C haplotípus anyai hordozásáról mutatták ki, hogy a

korai burokrepedés független kockázati tényezője (88).

3.8.6.5. A tüdőfejlődés genetikai háttere

A tüdő fejlődése összetett folyamat, ahol a sejtosztódást és a sejtek differenciálódását

egy komplex autokrin-parakrin jelátviteli rendszer szabályozza. Az éretlenség, a

gyulladás és a felszabaduló citokinek megzavarhatják a tüdőfejlődés összetett

folyamatának finom szabályozó mechanizmusait. A tüdőfejlődésért felelős gének közül

42

több esetében is leírtak olyan mutációkat, melyek súlyos tüdőfejlődési zavarokhoz

vezetnek (17,103). Ezek a mutációk a tüdőfejlődés zavarán, vagy az elhúzódó

lélegeztetési igényen keresztül vezethetnek BPD kialakulásához (3).

A 24. és 36. gesztációs hét közötti időszak a tüdőfejlődés legintenzívebb periódusa. Az

arborizáció, alveolarizáció és vascularizáció egymással párhuzamosan következik be; és

összehangolásukért illetve szabályozásukért több száz tagból álló génhálózatok

felelősek.

A tüdő morfogenezisében, a légutak dichotomicus osztódásában központi szerepet

játszik a fibroblaszt növekedési faktor (FGF), a béta-katenin, a bone morphogenetic

protein-4 (BMP-4) és a sonic hedgehog (SHH) protein. A tüdőfejlődés szabályozásában

több transzkripciós faktor is részt vesz. A legfontosabbak közé tartoznak a tireoid

transzkripciós faktor-1 (TTF-1), a GATA-6, a FOX-a2, a FOX-j1, a FOX-f1, a RARa/b,

a HOX-b5 és a Gli család tagjai (101). Az alveolusok kialakulásában az FGF szerepe a

meghatározó, hatását az FGF-R3/R4, PDGFa, FOX-a2 és GATA-6 útvonalon keresztül

fejti ki. A tüdőfejlődésért közvetlenül felelős jelátviteli utakat érintő mutációk általában

súlyos fejlődési zavarokhoz vezetnek, magas mortalitással járnak (103). Például az

SHH/Gli és a TTF mutációja tracheo-oesophageális fisztulát, trachea malformációt, az

FGF receptor mutációja trachea porcrendellenességet, a RARa/b mutációja tüdő

hipopláziát, a HOX-b5 mutációja bronchialis sequestratiót, a FOX-j1 mutációja a

csillók hiányát okozza. A csökkent tüdőfelület illetve a beszűkült légutak, születés után

elhúzódó agresszív gépi lélegeztetést tesznek szükségessé, ami BPD kialakulásához

vezethet. Mivel ezek a mutációk nagyon ritkák, valószínűleg a BPD-s betegek

többségénél nincs jelentőségük (103).

A tüdőfejlődést befolyásoló számos növekedési faktor közül az egyik legfontosabb a

transzformáló növekedési faktor-béta (TGFβ), ami a simaizom sejtek és fibroblasztok

proliferációját stimulálja, de erős antiinflammatorikus hatással is rendelkezik. Adcock

és mtsai. a TGFβ C+915G SNP-t vizsgálták, de nem találtak kapcsolatot a BPD

kockázata éa a polimorfizmus hordozása között (67). A további növekedési faktorok

közül a mi kutatócsoportunk a tüdőfejlődésben is fontos inzulinszerű növekedésifaktor

(IGF) funkcióját befolyásoló SNP-t vizsgált. Nem találtunk kapcsolatot az IGF-1R

G+3174A SNP és a BPD kockázata között (104).

43

Az érfejlődés a bronchusok fejlődésével egyszerre bekövetkező folyamat. A megzavart

érfejlődésnek egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a BPD kialakulásában (1,3,12). Az

érfejlődés irányításában az angiogenetikus faktorok, elsősorban a VEGF és az

angiopoietin játszanak központi szerepet (17). BPD-s állatmodellekben illetve BPD-s

humán mintákban alacsonyabb VEGF szinteket találtak a plazmában és a tüdőmosó

folyadékban (17). Az angiogenetikus faktorok termelését szabályozó gének funkcionális

polimorfizmusai szintén befolyásolhatják a BPD kockázatát. Ezt a hipotézist azonban

munkacsoportunkból Bányász és mtsai. a VEGF G+405C, T-460C és C-2578A SNP-k

vizsgálata során nem tudták igazolni (105).

A nagylégutak fejlődési zavara mellett az alveolarizáció zavara is hajlamosít BPD-re

(12,17,103). Alveolarizációs zavarral járnak az elasztin és a proteoglikán gének

mutációi. Ezek is súlyos tüdőkárosodásal, elhúzódó lélegeztetéssel járnak, ezáltal

hozzájárulhatnak a BPD kialakulásához (12). Az elasztin és proteoglikán gének SNP-i

és a BPD közötti közvetlen kapcsolatot eddig még nem vizsgálták.

A tüdő éretlenségét legkarakterisztikusabban jelző szövődmény a respirációs distressz-

szindróma (IRDS), ami a 2-es típusú pneumocyták éretlensége miatt kialakuló

surfactant hiány következménye (18). Régen az IRDS volt a BPD leggyakoribb oka, de

még napjainkban is a BPD egyik legfontosabb kockázati tényezője. Manapság a

szteroidprofilaxis és az exogén surfactant pótlás korában az IRDS a VLBW gyermekek

30-40%-át érinti (4).

A surfactant négy különböző biológiai funkciójú fehérjét tartalmaz (SP-A, SP-B, SP-C

és SP-D) (87,106,107). Az SP-A és SP-D a surfactanthoz kapcsolódó hidrofil fehérjék,

melyek a surfactant homeostázisban és a tüdő veleszületett immunitásában játszanak

szerepet (108). Az SP-B és SP-C kis, egyedi hidrofób fehérjék, melyek a surfactant

lipidek alveolusokon belüli stabilitásában és eloszlásában játszanak fontos szerepet

(109). Valamennyi surfactant proteint kódoló génnek számos SNP-je ismert, amiket

IRDS-es és/vagy BPD-s gyermekekben vizsgáltak (61-64,110-112) Az SP-A egyik

mutációjáról (az SPA1 6A6 allél hordozásáról) (109) és az SP-B gén 4. intronjának

deléciós variánsáról kimutatták (62,63), hogy az IRDS és BPD független kockázati

tényezői. Míg a surfactant fehérjéket kódoló gének további variációi nem mutattak

közvetlen összefüggést a BPD kockázatával (61,64). Az SP-B (Ile131Thr) és SP-C

(exon 1,4,5) SNP-i összefüggtek az IRDS-sel (12), ezáltal közvetve hatással lehetnek a

44

BPD kockázatára is. Az SP-B és SP-C néhány deléciója és mutációja a surfactant

fehérjék teljes hiányához, vagy kóros surfactant proteinek termelődéséhez vezet, ami

akut és krónikus tüdőkárosodás kialakulását eredményezi a hordozó újszülöttekben,

illetve gyermekekben. A mutációk prevalenciája azonban nagyon alacsony, és ezért

valószínűleg nem járulnak nagymértékben hozzá a BPD-s esetek kialakulásához. A

recesszíven öröklődő SP-B mutációk a proSP-B és érett SP-B képződésének hiányához

vezetnek. Az örökletes SP-B hiányos újszülöttek általában időre születnek, és mégis

IRDS alakul ki náluk az első néhány órában. A surfactant pótlás és a modern

lélegeztetési eljárások ellenére ezek a gyermekek általában néhány hónapos korukban

meghalnak légzési elégtelenség következtében BPD-re és alveoláris proteinózisra

jellemző tünetekkel. AZ SP-C mutációi dominánsan öröklődnek, de gyakoriak az új

mutációk is. Az SP-C mutációi szintén IRDS-t, BPD-t és a tüdőszövet egyéb

karakterisztikus elváltozásait okozzák (109).

Az IRDS kockázata más gének SNP-ivel is kapcsolatba hozható. Munkacsoportunk egy

a gyengült sejt védekezéssel összefüggő genotípus (hősokk protein (HSP)-721267GG

genotípus) és az IRDS között talált kapcsolatot, ami felveti a HSP-k és a neonatális

tüdőpatológia közötti kapcsolat lehetőségét (113).

3.8.6.6. A perinatális gyulladásos reakció genetikai háttere

A gyulladás több szinten is befolyásolja a BPD kialakulását. Az aszcendáló anyai

infekciók miatt kialakuló magzatfüggelék gyulladás koraszüléshez vezet, ami a BPD

legfontosabb rizikótényezője (19). Másrészt a lokálisan (tüdőgyulladásban) és

szisztémásan (szepszisben és nekrotizáló enterocolitisben (NEC)) felszabaduló

citokinek és más gyulladásos anyagok aspecifikus tüdőkárosodáshoz vezethetnek (21-

23).

Szisztémás gyulladás (szepszis) esetén a gyulladásos faktorok szintje aspecifikusan

károsíthatja a szöveteket, így a tüdőt is (21-23). A perinatális szepszis kialakulásában

jelentős szerepet tulajdonítanak az egyén genetikai fogékonyságának, a folyamatban

résztvevő fehérjéket kódoló gének SNP-inek (47). Az összetett patomechanizmus miatt

számos SNP-vel kapcsolatban feltételezték, hogy befolyásolhatja az újszülöttkori

szepszis és szövődményeinek kialakulását és lefolyását.

45

A gyulladásos reakció kiváltásához vezető folyamatokban résztvevő fehérjék (így a

CD14, TLR2, TLR4, MBL) SNP-i és az újszülöttkori szepszis között egyik vizsgálat

sem mutatott ki kapcsolatot, annak ellenére, hogy felnőttek esetén több vizsgálat is

összefügést talált a fenti SNP-k és a szepszis kockázata között (49,114). Ahrens és

mtsai. a NOD2-3020insC-mutáció és a szepszis kockázata között találtak gyenge

összefüggést (p=0,052) (114).

A gyulladásos citokinek SNP-i közül a legtöbben a TNFα G-308A SNP-t vizsgálták.

Hedberg és mtsai. vizsgálatai szerint az AA éa AG genotípust hordozó lélegeztetett

VLBW újszülöttekben magasabb volt a szepszis mortalitása (115). Ugyanakkor a mi

kutatócsoportunknak nem sikerült kapcsolatot találni az újszülöttkori szepszis kockázata

és a TNFα, IL-1β, IL-4RA, IL-10 és IL-6 SNP-k között (43). Az IL-6 G-174C SNP

hordozása és az újszülöttkori szepszis kockázata között Ahrens és Harding is talált

kapcsolatot (114,116).

Több adat utal arra, hogy a renin-angiotenzin rendszer a gyulladásban is fontos szerepet

tölt be (47). Az angiotenzin szintet befolyásoló ACE I/D polimorfizmus és az

újszülöttkori szepszis kockázata között ennek ellenére nem találtak összefüggést (117).

A keringési elégtelenség (CF) is lehet az újszülöttkori szepszis tünete, ami általában

légzéstámogatást is igényel. Nobilis és mtsai. az ACE I/D hordozóknál a DD genotípus

védő hatását mutatták ki CF-fel szemben (118). Mások viszont pont ezzel ellentétes

jelenséget figyeltek meg (119).

A szisztémás gyulladás mellett vannak olyan kórképek, melyek szintén magasabb

citokinszintekkel járnak, illetve önmagukban is fokozzák a légzéstámogatás iránti igényt

(41,42). A gépi lélegeztetés és oxigénterápia per se fokozza a tüdőkárosodás kockázatát

(1,3,4). A legtöbb perinatális szövődmény fokozott légzéstámogatási igénnyel jár, és

ezáltal közvetve fokozhatja a tüdőkárosodás kockázatát. A gépi lélegeztetés

tüdőfunkcióra gyakorolt hosszútávú hatásai különösen súlyosak lehetnek, ha a

légzéstámogatás az első életnapokon következik be. Ezért a perinatális adaptáció

zavarai fokozott kockázatot jelenthetnek a tüdőkárosodás és a BPD szempontjából.

Perinatális adaptáció / keringési elégtelenség: a genetikai variánsok perinatális

adaptációban betöltött szerepéről keveset tudunk. Előzetes adatok vannak az

angiotenzin konvertáló enzim (ACE) inzerciós/deléciós (I/D) polimorfizmusáról

koraszülöttek korai cardiorespiratoricus adaptációjában. Harding és mtsai. megfigyelték,

46

hogy a DD genotípus károsan befolyásolhatja a koraszülöttek korai egészségét (119).

Ezzel szemben kutatócsoportunk vizsgálatai alapján egy érettlenebb populációban a DD

genotípus védő hatású volt az első héten kialakuló keringési elégtelenséggel szemben

(118). Ennek az ellentmondásnak a magyarázata is a vizsgált populációk eltérő érettségi

szintje lehet, akárcsak a BPD – ACE I/D kapcsolat esetén.

Nyitott Botallo-vezeték genetikai háttere: az ACE I/D polimorfizmuson kívül az

angiotenzin II 1-es típusú receptorának A+1166C SNP-je is befolyásolja a renin-

angiotenzin rendszer működését. Korábbi vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy fontos

szerepe lehet PDA kialakulásában, mivel a +1166CC genotípus védő hatásúnak bizonyult

a PDA-val szemben (122). A PDA kockázatot csökkentheti egy az ösztrogén

érzékenységet befolyásoló SNP (ER PvuII) hordozása is (121).

NEC: kutatócsoportunkból Szebeni és mtsai. nem találtak kapcsolatot a NEC

gyakorisága és a CD14, TLR4, CARD15 SNP-k között (49). A gyulladásos citokin

SNP-k közül Treszl és mtsai. a TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 SNP-i és a NEC kockázata

között nem tudtak kapcsolatot kimutatni, viszont az IL-4RA mutáns allél hordozása

védő hatást mutatott a NEC-kel szemben (44-46). Héninger és mtsai. megfigyelték,

hogy az IL-18-607AA genotípus fokozza a legsúlyosabb stádiumú NEC kockázatát (120).

Bányász és mtsai. a VEGF-2578, Derzbach és mtsai az ösztogén receptor (ER) PVUII

SNP-je és a NEC kockázata között találtak kapcsolatot (105,121).

A Perinatális agykárosodás: genetikai háttere: a kamrai vérzés (IVH), ami a VLBW

újszülöttek akár 10%-át is érintheti, erősen fokozza a légzéstámogatás iránti igényt. Az

éretlen központi idegrendszerrel rendelkező koraszülötteknél nagy a perinatális

időszakban bekövetkező agykárosodás kockázata, aminek hosszútávú

fejlődésneurológiai következményei lehetnek. A károsodott véralvadási és

immunfunkciók a perinatális agykárosodás legfontosabb kockázati tényezői közé

tartoznak. Az agykárosodás kísérleti modelljeiben a gyulladásos citokinek (TNFα, IL-

1β, IL-18, MCP-1) fokozták az agykárosodás kiterjedését, míg az anti-inflammatorikus

citokinek (IL-6, IL-10, IL-1ra) védő hatásúak voltak. Periventrikuláris leukomaláciában

(PVL) emelkedett TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10 és IL-18 szinteket figyeltek meg.

IVH-ban és cerebrális parézisben emelkedett IL-1β, IL-6 és IL-8 szinteket találtak.

Több megfigyelés is alátámasztja a funkcionális citokin SNP-k IVH kockázatban

betöltött szerepét. A TNFα G-308A, IL-1β C-511T, IL-6 G-174C, IL-4 T-590C, és IL-10

47

G-1082A SNP-k hordozóiban fokozott a perinatális agykárosodás kockázata (123).

Adcock és mtsai. szintén igazolták, hogy a TNFα -308A allél az IVH meghatározó

tényezője (67).

A többi SNP szerepéről az IVH-ban csak korlátozott mennyiségű adat áll rendelkezésre.

Munkacsoportunk korábbi vizsgálatában az ER PvuII polimorfizmus és az IVH között

mutattunk ki összefüggést. Baier és mtsai. összefoglalták a véralvadási rendszer

mutációinak IVH-ban betöltött szerepét. A XIII-as faktor Val34Leu, az V-ös faktor

Leiden, a prothrombin G20210A SNP-i és az IVH között írtak le összefüggést (123).

4. ábra: A BPD kockázati tényezői és genetikai hátterük

A BPD-nek és legfontosabb kockázati tényezőinek genetikai háttere. Ellentmondásos adatok esetén (egyik vizsgálat talált kapcsolatot, míg

a másik nem) mi csak a kapcsolatot tüntettük fel az ábrán. További részleteket és a rövidítéseket lásd a szövegben.

BPD Kapcsolat: L-szelektin, TNFα, IFNγ, GST,

ACE, SPA, SPB, ER Nincs kapcsolat: SPC, LTα, TGFβ, IGF-1R,

MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, E-szelektin, P-szelektin, VEGF, AT1R,

Urokináz

Tüdőfejlődés

IRDSPDA

Légzéstámogatás Kapcsolat: TNFα, IFNγ, ER

IVH

Szepszis Kapcsolat: NOD2, IL-6, IFNγ, ACE

Nincs kapcsolat: CD14, TLR4, TNFα, IL-1β, IL-4ra, IL-10, IL-12

NEC Kapcsolat:IL-4ra, IL-12, IL-18,

ER,VEGF; Nincs kapcsolat: CD14, TLR4,

CARD15, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10, IFNγ

Gyulladás

Chorioamnionitis

Koraszülés

Korai burokredés

Praeeclampsia Fertőzés (pneumonia) Kapcsolat:TNFα,

VEGF, AT, GNβ3,Factor V,

MTHFR Kapcsolat:TNFα, LTα Kapcsolat: TNFα, IL-10, HSP72, MMP8, MMP9

Kapcsolat: TNFα, IFNγ, IL-1ra, IL-4, IL-6, IL-10, MBL, TLR-4, L-szelektin,

VEGF, HSP72, SPC Nincs kapcsolat: IL-12, TLR2, CD14,

CARD15, E-szelektin, P-szelektin

Kapcsolat: SPA, SPB,

Kapcsolat:TNFα, ER,

Kapcsolat: IFNγ, ATR1, ER

Kapcsolat: VEGF, Angiopoietin, FGF, TTF, SHH, HOX, RAR, Elasztin

Kapcsolat: IL-12 Nincs kapcsolat: IFNγ

Perinatális adaptáció, keringési elégtelenség

Kapcsolat: ACE

3.8.6.7. Az általunk vizsgált gén polimorfizmusok

Genetikai vizsgálataink során koraszülöttek mintáival dolgoztunk. A vizsgált populáció

alacsony létszáma miatt igyekeztünk olyan polimorfizmusokat vizsgálni, amelyek

gyakoriak, magas mutáns allélfrekvenciával járnak, illetve az általunk vizsgált 100-200

fős populációban is kimutatható alléldúsulást okoz, ha összefüggésben állnak valamely

vizsgált fenotípussal.

Vizsgálatainkban törekedtünk a genetikai polimorfizmusokkal kapcsolatba hozható

perinatális szövődmények patomechanizmusának magyarázatára is, ezért előnyben

részesítettük a funkcionális polimorfizmusokat, ahol a mutáns allél hordozása a

fenotípusban is megjelenik.

TNFα

A TNFα génje a 6p21.3 locusban helyezkedik el a HLA gének közelében. A TNFα

génje számos SNP-t tartalmaz, több funkcionális SNP is ismert, amelyek bizonyítottan

megváltozott TNFα termeléssel vagy funkcióval járnak. Az irodalomban legtöbbet a

TNFα G-238A és a TNFα G-308A polimorfizmusokat vizsgálták. Mindkét polimorfizmus

funkcionális, és prevalenciájuk elég magas a kaukázusi populációban, ahhoz, hogy az

általunk vizsgált betegcsoportokban szignifikáns eltéréseket detektálhassunk.

Választásunk azért esett a TNFα G-308A promoter polimorfizmusra, mert irodalmi

adatok alátámasztják a szerepét tüdőkárosodásban, lélegeztetésben, és koraszülött

szövődményekben is (51,124,125).

IL-1β

Az IL-1 két formában fordul elő. Az IL-1α és IL-1β aminosav szekvenciájukban

különböznek, de térbeli szerkezetük hasonló, azonos receptoron fejtik ki hatásukat.

Mindkét forma génje a 2. kromoszóma rövid karján helyezkedik el. Az IL-1β génjének

számos polimorfizmusa ismert, ezeket hagyományosan a restrikciós enzim alapján

nevezték el (Alu1, TaqI, BsoF1), azonban a megismert SNP-k számának növekedésével

a pozíció alapján történő elnevezés vált meghatározóvá.

Vizsgálatainkhoz olyan polimorfizmust kerestünk, ami magas prevalenciával fordul elő

a kaukázusi populációban, illetve törekedtünk funkcionális polimorfizmus

50

kiválasztására. Választásunk az 5-ös exon 3954-es helyén található citozin-timin (C-T)

cserével járó SNP-re esett. Irodalmi adatok szerint a T allél jelenlétében nagyobb

mennyiségű IL-1β termelődik. Ezt a polimorfizmust már több betegségben vizsgálták,

munkacsoportunk szeptikus újszülöttekben vizsgálta a szerepét (43,51,126-128).

IL-6

Az IL-6 génje a 7-es kromoszóma rövid karján található. Számos SNP-t írtak le a gén

területén. A legrégebben leírt funkcionális SNP a promoter régióban található IL-6

G-174C SNP. A C-allél hordozása bizonyítottan alacsonyabb citokinszintekkel jár, illetve

jelenlétében csökken az LPS-sel vagy IL-1-gyel indukált IL-6 termelés. Számos

betegségben illetve koraszülöttekben is vizsgálták már ennek a polimorfizmusnak a

szerepét (51,129-133). Prevalenciája elég magas az általunk vizsgált populációban.

IL-10

Az IL-10 génje az 1-es kromoszómán helyezkedik el. Szintén számos polimorfizmusa

ismert. Az általunk vizsgált IL-10 G–1082A funkcionális polimorfizmus bizonyítottan

megváltozott citokin termeléssel jár. Számos irodalmi adat támasztja alá szerepét

gyulladásos mechanizmusú betegségekben és koraszülöttekben (51,134).

IL-12

Az IL-12 p35 alegység génje a 3p12-q13.2 locusban, a p40 alegység génje a 5q31-32

locusban helyezkedik el. Az IL-12 p40 alegység génje sajátos szerkezetű, 8 exonja

közül csak a 2-6 tartalmaz átíródó szekvenciát. Fontos biológiai funkciója miatt a gén

konzervatív szerkezetű, kevés SNP-t tartalmaz. Eddig az irodalomban 14 SNP-t írtak le,

ezek többsége ritka, és nem jár a citokintermelés megváltozásával. A promoter és a

3’UTR régióban is egy-egy polimorfizmust írtak le, de csak a promoter polimorfizmus

járt bizonyítottan csökkent IL-12 expresszióval, gyakorisága is megfelelő a kaukázusi

populációban (allélfrekvencia 30-40%) (51,135-137).

IFNγ

Az IFNγ génje a 12q14 locusban helyezkedik el. Α génben eddig 20 polimorfizmust

írtak le. Ezek többsége nagyon ritka, az irodalomban 3 polimorfizmust vizsgáltak

51

részletesebben. A 3’UTR polimorfizmusnál nem tudtak egyértelmű citokinexpresszió

változást kimutatni. A +1004 CA repeat polimorfizmusról bebizonyították, hogy egyes

allélok csökkent IFNγ expressziót eredményeznek, de ezek kimutatása nehéz, mert

közöttük csak 2 bp különbség van. Szerencsére a CA repeat polimorfizmus szoros

kapcsoltságot mutat a T+874A polymorfizmussal, ami megfelelő gyakorisággal fordul elő

a kaukázusi populációban (51, 138,139).

ACE I/D

Az angiotenzin konvertáló enzim génje a 17q23.3 locusban helyezkedik el. 36 SNP-je

ismert, ezek közül 5 prevalenciája nagyobb 10%-nál. Az irodalomban azoban a legtöbb

vizsgálat nem az SNP-kel hanem az úgynevezett inzerciós-deléciós polimorfizmussal

kapcsolatos. Ez a polimorfizmus több elsősorban cardiovascularis megbetegedéssel is

kapcsolatot mutatott. I allél esetén a gén 16. intronjába beépül egy 287 bp hosszúságú

DNS szakasz. A D allél hordozóknál magasabb AII szinteket mértek a plazmában, és

magasabb volt az ACE szöveti aktivitsa. (140) Kazzi és mtsai. összefüggést találtak a

polimorfizmus és a BPD kockázata között koraszülöttekben, ezért vizsgálatunkban mi is

ennek a polimorfizmusnak az előfordulását vizsgáltuk VLBW koraszülöttekben (50).

AT1R

Az angiotenzinnek két receptora ismert, a hatások többségét az egyes típusú receptoron

(AT1R) keresztül fejti ki. Az AT1R génje több mint 55 kB hosszúságú, a 3q21-q25

locusban helyezkedik el. Legalább négy féle transzkripciós variánsa ismert, a teljes

kódoló szekvencia az 5. exonban található. A génben számos polimorfizmust leírtak, a

legismertebb a 3’ át nem íródó régióban (3’ UTR) elhelyezkedő AT1R A1166C SNP. Ez

a polimorfizmus számos, elsősorban hipertóniával összefüggő állapottal mutatott

összefüggést, bár a pontos hatásmechanizmus nem ismert, hiszen az SNP nem kódoló

régióban helyezkedik el. Egyes vizsgálatok kapcsolatot találtak az ACE I/D és az AT1R

A1166C SNP-k között, ezért mi is mindkét polimorfizmus szerepét megvizsgáltuk a

koraszülöttek tüdőkárosodásában (141).

52

4. Célkitűzések

A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-kel kapcsolatos vizsgálatok

Egyre több adat utal a gyulladás központi szerepére a koraszülöttek tüdőkárosodásában,

a BPD kialakulásában. A gyulladásos reakcióban a sejtek közötti kommunikáció a

gyulladásos citokineken keresztül valósul meg. A gyulladásos citokinek termelődését a

környezeti tényezőkön kívül az egyén genetikai adottságai is meghatározzák. A

funkcionális polimorfizmusok esetén a mutáns allél eltérő citokin expresszióhoz vagy

funkcióhoz vezet. Több vizsgálat igazolta egyes gyulladásos citokin polimorfizmusok

szerepét gyulladásos mechanizmusú kórképekben, szepszisben, koraszülésben, sőt

BPD-ben is. Ez alapján célul tűztük ki a legfontosabb proinflammatorikus citokinek

(TNFα, IL-1β, IL-6) és a legismertebb antiinflammatorikus citokin az IL-10

funkcionális polimorfizmusainak a koraszülöttek tüdőkárosodásában és a BPD

kialakulásában betöltött szerepének vizsgálatát.

Az IFNγ és IL-12 SNP-kel kapcsolatos vizsgálatok

A koraszülöttek immunrendszere éretlen, gyulladásos folyamataikban a veleszületett

immunitás szerepe a meghatározó. A veleszületett immunitás két központi jelentőségű

citokinje az IFNγ és az IL-12. Ezek termelődését is meghatározza az egyén genetikai

háttere. Ismertek funkcionális polimorfizmusaik, ahol a mutáns allél hordozás

megváltozott citokinexpresszióval jár. Több vizsgálat igazolta a két citokin jelentőségét

a koraszülött patológiában, illetve tüdőbetegségekben.

Vizsgálatunkban célul tűztük ki a veleszületett immunitás két központi citokinjének, az

IFNγ-nak és IL-12-nek, legfontosabb funkcionális polimorfizmusai és a perinatális

szövődmények kockázata közötti kapcsolat vizsgálatát, különös tekintettel a

koraszülöttek tüdőkárosodására és a BPD-re.

53

ACE I/D és AT1R SNP-k vizsgálata

Egyre több adat támasztja alá, hogy a RAAS a vérnyomásszabályozáson kívül a

gyulladásos folyamatokban is szerepet játszik. A közelmúltban Kazzi és mtsai.

kimutatták az ACE I/D polimorfizmusról, hogy befolyásolja a BPD kockázatát. Ez

alapján mi is elvégeztük az ACE leggyakrabban vizsgált I/D polimorfizmusának illetve

a RAAS funkcióját szintén befolyásoló AT1R polimorfizmusnak meghatározását LBW

koraszülött populációban. Vizsgálatunk célja volt a Kazzi és mtsai. által közölt

eredmények verifikálása, a renin-angiotensin-aldoszteron rendszer koraszülöttek

tüdőkárosodásában és a BPD patomechanizmusában betöltött szerepének vizsgálata.

54

5. Betegek és módszerek

5.1. Betegek

A vizsgálatban résztvevő újszülötteket a Semmelweis Egyetem II. sz. Nőgyógyászati

Klinikájának Perinatális Intenzív Centrumában kezelték 2000 és 2003 között. A betegek

személyes adatait (név, anyja neve, születési idő, születési hely) csak a betegek

beazonosítására, a klinikai paraméterek begyűjtésére és a genetikai vizsgálatokhoz

szükséges anyagcsereszűrésből visszamaradt vérminták bekérésére használtuk. (Az

anyagcsere szűrés céljából a vérminták levétele az ötödik életnapon vagy az orális

táplálás megkezdése után 3 nappal történt. Az anyagcsereszűrést a Budai

Gyermekkórház Anyagcsereszűrő Központjában végezték, a vizsgálatból visszamaradt

szűrőpapírra szárított vérmintákat is itt tárolták.) A további vizsgálatok során a

betegekhez kódszámot rendeltünk, az analízis és adatfeldolgozás a kódszám alapján,

anonim módon történt. A vizsgálati protokollt a Semmelweis Egyetem Tudományos

Kutatás Etikai Bizottsága jóváhagyta (engedély száma: 16/2003).

A klinikai adatok közül a születési súly, a gesztációs kor születéskor és a lélegeztetési

paraméterek mellett a perinatális szövődményeket használtuk fel az adatok elemzése

során. A perinatális szövődmények diagnosztizálásánál a II. sz. Nőgyógyászati Klinika

munkatársai nemzetközileg elfogadott kritériumokat használtak. Az infekció klinikai

jeleit és tüneteit – Dollner szerint – hat kategóriába sorolták: (I) pallor és icterus; (II)

letargia, apnoe, bradycardia, irritábilitás és görcsök; (III) tachypnoe és dyspnoe; (IV)

hipotónia, tachycardia és a mikrocirkuláció zavara; (V) hányás és hasi dystensio; (VI)

láz, illetve hőmérséklet instabilitás.

A szepszis diagnózisához legalább 3 kategóriában legalább 1 tünet jelenléte és

emelkedett (>10mg/l) CRP érték volt szükséges.

A pneumonia diagnózia a mellkasröntgen, az infekció jelei és az emelkedett (>10mg/l)

CRP értékek alapján történt.

A nekrotizáló enterocolitis diagnózisát a Bell-féle kritériumok alapján állították fel (I.

stádium: véres széklet és hasi dystensio, II. stádium: intestinalis pneumatosis, III.

stádium: bélperforáció).

55

A nyitott Botallo-vezeték szívultrahangos vizsgálattal, az IRDS a légzési elégtelenség

jelei és a mellkasröntgen alapján került diagnosztizálásra.

A BPD diagnózisát az 3.4. pontban ismertetett definíció alapján állították fel.

Az akut veseelégtelenség (ARF) diagnózisa Modi kritériumain alapult: szérum kreatinin

>120 μmol/l a második posztnatális napon mérve vagy a szérum urea >9mmol/l, illetve

a diurézis <1,0ml vizelet/kg(testsúly)/24óra.

A kamrai vérzés (IVH) diagnózisát a neurológiai tünetek és a kopony ultrahang alapján

állították fel.

A keringési elégtelenséget a tartósan (≥30 perc) fennálló súlyos hipotóniával, ahol a

Hgmm-ben mért artériás középnyomás (MAP) a hetekben mért gesztciós kor

számértéke alatt volt, illetve megemelkedett kapilláris telődési idővel (CRT) definiáltuk.

A CRT-t a homlokra vagy a sternumra 30 másodpercig kifejtett közvetlen nyomás után

vizsgáltuk, és 5 másodperc felett tekintettük megemelkedettnek.

A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP meghatározás

Retrospektív vizsgálatunkba 123 kis születési súlyú (LBW, születési súly ≤ 1500

gramm) koraszülöttet vontunk be. A betegcsoport (59 fiú és 64 lány) heterogén volt a

születési súly (középérték [tartomány]: 1200 [640-1500]), gesztációs kor születéskor

(30 [24-36]), a perinatális szövődmények (nyitott Botall-vezeték: 46/123; respirációs

distressz szindróma: 59/123, szepszis: 30/133; pneumonia: 38/123; nekrotizáló

enterocolitis: 41/123), és a gépi lélegeztetés (2 [0-80] nap) illetve oxigénterápia (10

[0-83] nap) szempontjából. 99 beteget kellett oxigénterápiában részesíteni, közülük 82

gépi lélegeztetést is igényelt. 26 betegnél alakult ki BPD.

IFNγ és IL-12 SNP meghatározás

A vizsgálatba 172 egészséges érett újszülöttet (87 fiút és 85 lányt; születési súly

(középérték[tartomány]): 3400 [2700-4200] gramm; gesztációs kor születéskor: 40 [37-

42] hét; az intrauterin retardáció (IUGR) prevalenciája (IUGR-t a gesztációs kornak

megfelelő születési súly 10 percentilis alatti értékével definiáltuk): 0,03; perinatális

komplikáció a kontrollcsoportban nem fordult elő) és 153 LBW újszülöttet (76 fiút és

77 lányt; születési súly (középérték[tartomány]): 1180 [510-1500] gramm; gesztációs

56

kor születéskor: 29 [24-36] hét; az intrauterin retardáció (IUGR) prevalenciája:0,18)

vontunk be.

Az LBW betegeknél rögzítettük a gépi lélegeztetés időtartamát ((középérték,

[tartomány]) 4 [0-60] nap), az oxigénterápia teljes hosszát (12 [0-80] nap) valamint a

perinatális szövődmények prevalenciáját.

BPD 27 újszülöttnél alakult ki. Pneumonia 36, NEC 52, szepszis 47, ARF 40, infekció

következtében kialakult alacsony vérnyomás 49, IRDS 80, PDA 50, IVH 47 esetben

volt megfigyelhető. 51 koraszülött részesült születés előtti szteroid profilaxisban,

születés után 23 újszülött kapott surfactant kezelést, 44 újszülött kapott dobutamint, és

11 újszülött igényelt sebészeti beavatkozást.

ACE I/D és AT1R SNP vizsgálat

Kazzi és mtsai. vizsgálatából kiundulva, a munkacsoportunk által korábban ACE I/D és

AT1R polimorfizmusok szempontjából megvizsgált koraszülött populációban

vizsgáltuk a légzéstámogatás idejének illetve a BPD előfordulásának kapcsolatát a fenti

polimorfizmusokkal.

120 újszülött szűrőpapírra szárított vérmintája volt hozzáférhető a további vizsgálataink

számára. Az orvosi dokumentáció átvizsgálása után kizártunk a további vizsgálatokból

6 újszülöttet, akik az első 3 életnapon transzfúzióra szorultak. A maradék 114

újszülöttből 33 szorult volumen-pótlásra vagy katecholamin kezelésre az első 3

életnapon kialakuló keringési elégtelenség (CF) miatt.

57

4. táblázat: Az ACE-AT1R SNP vizsgálatban résztvevő betegek klinikai jellemzői

A betegek klinikai paraméterei

ACE genotípus DD/DI (n=105) II (n=9)

Születési súly (gramm) 1233 ± 358 1497 ± 472

Gesztációs kor (hét) 30 ± 3 31 ± 4

Fiú 51% 67%

IRDS 49% 56%

Gépi lélegeztetés ideje

(nap) 2 (0-8) 1 (0-7)

Oxigén terápia ideje (nap) 3 (0-8) 11 (3-13)

BPD 18 (17%) 3 (33%)

Nincs BPD 87 (83%) 6 (67%)

5.2. Módszerek

5.2.1. DNS izolálás szűrőpapíros mintából

A mérésekhez az újszülöttek anyagcsere szűréséből visszamaradt, szűrőpapírra szárított

vérmintáit használtuk. A DNS kivonását Chelex 100 (Chelex®, BioRad, Germany)

gyanta segítségével végeztük. A DNS izolálás során a szűrőpapírból kivágott 2-3 mm2

felületű mintára 200μl 5%-os Chelex 100 oldatot mértünk. Ezután a mintákat előbb 90

percig 56˚C-on, majd 10 percig 99˚C-on inkubáltuk. Az így előkészített mintákat

szobahőmérsékletre hűtöttük, majd vortexxel megkevertük. Végül 10000rpm

fordulatszámmal 2 percig centrifugáltuk a mintáinkat a szennyeződések leülepítése

céljából. A DNS-t tartalmazó felülúszót kódszámmal jelölt eppendorf csövekbe

pipettáztuk és a további vizsgálatokig -20˚C-on tároltuk. A módszer során a DNS

fragmentálódik, ezért néhány ezer bázispárnál hosszabb szakaszok amplifikálására az

így kinyert DNS nem alkalmas.

58

5.2.2. Molekuláris biológiai vizsgálatok

5. ábra: A PCR-RFLP elve

Az ábrán a polimorfizmusok meghatározására használt PCR-RFLP módszer elve

látható. A szűrőpapírra szárított vérmintából Chelex 100 segítségével izoláljuk a DNS-t,

a polimorfizmust tartalmazó néhány száz bázispárnyi DNS szakaszt PCR segítségével

amplifikáljuk, majd restrikciós enzimmel emésztjük, ami csak a mutáns allél

jelenlétében hasítja el a vizsgált DNS szakaszt. A DNS-t agaróz gélelektroforézis

segítségével méret alapján választjuk szét, majd UV fény alatt etidium-bromid festéssel

jelenítjük meg.

A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 meghatározás

A vizsgált génpolimorfizmusok meghatározásához anyagcsereszűrésből visszamaradt,

szűrőpapírra szárított vérmintákból izolált DNS-t használtunk. A PCR reakciót 50μl

végtérfogatú elegyben végeztük, amely tartalmazott 5,0µl 1x PCR puffert (Invitrogen

Corp. Carlsbad, California, USA), 1,0-1,0µl-t az 5. táblázatban jelzett sens és antisens

primerekből (25pmol), 4,0µl dNTP keveréket (végkoncentráció 0,2mM), 3,0µl MgCl2-t

(25mM) (végkoncentráció 1,5mM), 2,0µl genomikus DNS-t, 0,3µl Taq polimeráz-t

gyári pufferben (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA, 10U/μl) és 33,7µl

desztillált vizet.

A mintákra 2 csepp PCR olaj került majd a táblázatban feltüntetett idő és hőmérséklet

értékeken PCR automatában amplifikáltuk a vizsgált DNS szakaszokat. A felszaporított

DNS-t 2,5%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav,

DNS IZOLÁLÁS

59

TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt tettük

láthatóvá.

Sikeres PCR reakció után, a restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP)

vizsgálatot a táblázatban feltüntetett enzimekkel a megadott emésztési körülmények

mellett végeztük el. A restrikciós enzimeket a Fermentas Life Sciences cégtől szereztük

be (Fermentas Inc. Hanover, Maryland, USA). Az RFLP termékeket 3%-os agaróz

gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk

szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt tettük láthatóvá.

60

5. táblázat: A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 meghatározás PCR-RFLP körülményei

TNFa G–308A IL-1ß C3954T IL-6 G–174C IL-10 G–1082A

Forward primer

5’-ATC TGG AGG AAG

CGG TAG TG-3’

5’-ATC TGG AGG AAG

CGG TAG TG-3’

5’-GCC CCC ACC AGT GGC

TAC C-3’

5’-GTC AGT GTT CCT CCC

AGT-3’

Reverse primer

5’-AAT AGG TTT TGA GGG

CCA TG-3’

5’-AGA AGA CCC CCC TCG

GAA CC-3’

5’-GCC TTG TAA CCA GCC

TCT CCT-3’

5’-TTA CCT ATC CCT ACT

TCC TC-3’

Kezdeti denaturáció 94oC, 5perc 94oC, 5perc 94oC, 5perc

Denaturáció 94oC, 10másodperc

97oC, 90/30másodperc 94oC, 1perc 94oC,

30másodperc

Anneláció 55oC, 1perc 55oC, 90/30másodperc 60oC, 1perc 55oC, 1perc

Extenzió 72oC, 30másodperc

72oC, 90/30másodperc 72oC, 1perc 72oC, 1perc

Végső extenzió 72oC, 7perc 72oC, 10perc 72oC, 5perc 72oC, 5perc

Ciklusok száma 35 3/32 30 35

Termék hossz 220bp 249bp 302bp 295bp

Restrikciós enzim 10U NcoI 10U TaqI 10U NlaIII 10U EarI

Restrikció körülményei 37oC, 16óra 65oC, 16óra 37oC, 16óra 37oC, 16óra

202/18bp G-allél esetén

135/114 bp T-allél esetén

134/111/57bp C-allél esetén

275/20bp A-allél esetén Termék

hossz 220bp A-allél esetén

249bp C-allél esetén

302bp G-allél esetén

295bp G-allél esetén

61

6. ábra: A TNFα meghatározás PCR-RFLP képe

Az IFNγ és IL-12 meghatározás

A vizsgált génpolimorfizmusok meghatározásához anyagcsereszűrésből visszamaradt,

szűrőpapírra szárított vérmintákból izolált DNS-t használtunk. A PCR reakciót 50μl

végtérfogatú elegyben végeztük, amely tartalmazott 5,0µl 1x PCR puffert (Invitrogen

Corp. Carlsbad, California, USA), 1,0-1,0µl-t a 6. táblázatban jelzett sens és antisens

primerekből (25pmol), 4,0µl dNTP keveréket (végkoncentráció 0,2mM), 4,0µl MgCl2-t

(40mM) (végkoncentráció 3,2mM), 2,0µl genomikus DNS-t, 0,3µl Taq polimeráz-t

gyári pufferben (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA, 10U/μl) és 32,7µl

desztillált vizet.

A mintákra 2 csepp PCR olaj került, majd a táblázatban feltüntetett idő és hőmérséklet

értékek mellett PCR automatában amplifikáltuk a vizsgált DNS szakaszokat. A

felszaporított DNS-t 2,5%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban

(EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festés (0,4mg/l) után

UV fény alatt vizualizáltuk.

Sikeres PCR reakció után, a restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP)

vizsgálatot a táblázatban feltüntetett enzimekkel a megadott emésztési körülmények

mellett végeztük el. A Restrikciós enzimeket a Fermentas cégtől szereztük be

(Fermentas Inc. Hanover, Maryland, USA). Az RFLP termékeket 3,5%-os agaróz gélen

200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk szét,

majd etidium-bromid festés (0,4 mg/l) után UV fény alatt vizualizáltuk.

GG GG GA GA GA AA A TNFα vizsgálat képe emésztés után

202bp 220bp 200bp 100bp

62

6. táblázat: Az IFNγ és IL-12 meghatározás PCR-RFLP körülményei

IFNg T+874A IL-12GC/CTCTAA

Forward primer 5’-TTC TTA CAA CAC AAA ATC AAG TC-3’

5’-TGT TCT AAT GTG GGG GCC ACG-3’

Reverse primer 5’-AGT ATT CCC AAA AGG CTT ATG T-3’

5’-CTG TTT GTC AGC AGA CCT TCC T-3’

Kezdeti denaturáció 94oC, 5perc 94oC, 5perc

Denaturáció 94°C, 20másodperc 94°C, 20másodperc

Anneláció 50°C, 20másodperc 55°C, 20másodperc

Extenzió 72°C, 30másodperc 72°C, 30másodperc

Végső extenzió 72°C, 7perc 72°C, 7perc

Ciklusok száma 40 40

Termék hossz 366bp 227-223bp

Restrikciós enzim 8U Alw26 10U TaiI

Restrikciós körülmények 37°C, 16óra 65°C 16óra

340/26bp A-allél esetén

205/22 bp CTCTAA-allél esetén Termék hossz

366 bp T-allél esetén 223 bp GC-allél esetén

Az IL-12 CTCTAA/GC polimorfizmus területén a DNS szakasz nem tartalmazott

restrikciós hasító helyet. Az irodalomban a polimorfizmus kimutatására allélspecifikus

PCR-t használtak, ezeket azonban nekünk nem sikerült reprodukálni. Ezért DNA-STAR

program segítségével saját primerpárt terveztünk, majd a polimorfizmus mellett 1 bázis

kicserélésével elértük, hogy az amplifikált DNS-ben CTCTAA allél esetén TaiI

restrikciós hely képződjön.

63

7. ábra: Primer tervezés az IL-12 polimorfizmus detektálásához

8761 tgggatgggg ctcaggaacc tgcattttaa caatggaggt tctaatgtgg tcattggcag GC 8821 gttgttctaa tgtgggggcc acaTTAGAGc ctctctcgga gacaggctgt acatggccag 8881 ccagcattct ggtaatatga gccaaatgcc cattgaccta attttggaga agaggtttat 8941 caacatgtcc cacttcacaa tccagaccct gatcccaggc aaaataaact gatacctata 9001 agctttctat tgcttaccct atgggcgagg aaggtctgct gacaaacaga gggcgtgctg

8843-as A-G módosítással TaiI restrikciós hely (5’-ACGT-3’) kialakítása.

8761 tgggatgggg ctcaggaacc tgcattttaa caatggaggt tctaatgtgg tcattggcag GC 8821 gttgttctaa tgtgggggcc acGTTAGAGc ctctctcgga gacaggctgt acatggccag 8881 ccagcattct ggtaatatga gccaaatgcc cattgaccta attttggaga agaggtttat 8941 caacatgtcc cacttcacaa tccagaccct gatcccaggc aaaataaact gatacctata 9001 agctttctat tgcttaccct atgggcgagg aaggtctgct gacaaacaga gggcgtgctg

Az irodalomban a polimorfizmust CTCTAA/GC névvel szokták jelölni, az ábrán az IL-

12 gén cDNS-ének érintett szakaszán a reverz komplement bázissorrend, TTAGAG/GC

látható. A sárgával kiemelt szakaszok a PCR reakció során alkalmazott primereket, a

zölddel kiemelt szakaszok a polimorfizmust, az aláhúzott bázisok a restrikciós hasítási

helyet jelölik.

64

8. ábra: Az IFN-IL12 vizsgálat PCR-RFLP képe

ACE I/D és AT1R meghatározás

A vizsgált génpolimorfizmusok meghatározásához anyagcsereszűrésből visszamaradt,

szűrőpapírra szárított vérmintákból izolált DNS-t használtunk. A PCR reakciót 50μl

végtérfogatú elegyben végeztük, amely tartalmazott 5,0µl 1x PCR puffert (Invitrogen

Corp. Carlsbad, California, USA), 1,0-1,0µl-t a 7. táblázatban feltüntetett sens és

antisens primerekből (25pmol), 4,0µl dNTP keveréket (végkoncentráció 0,2mM), 3,0µl

MgCl2-t (25mM) (végkoncentráció 1,5mM), 1,0µl genomikus DNS-t, 0,2µl Taq

polimeráz-t gyári pufferben (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA, 10U/μl) és

34,8µl desztillált vizet.

A mintákra 2 csepp PCR olaj került majd a táblázatban feltüntetett idő és hőmérséklet

értékeken PCR automatában amplifikáltuk a vizsgált DNS szakaszokat. A felszaporított

DNS-t 2,5%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav,

TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt tettük

láthatóvá.

Az ACE I/D polimorfizmus detektálására két PCR reakciót végeztünk. A D-allél

kimutatására alkalmas primerpár elvileg az inzerció esetén is DNS amplifikációt okoz,

ez azonban a két reakció kompetíciója miatt a megadott körülmények között csak

IL-12GC/CTCTAA

223 bp 205 bp

II DD DI DD II DD II II DD DD200bp 100bp

IFNγ T+874A

300bp 200bp

100bp

366 bp

340 bp TT TA TA TT AA TA TA TT

65

homozigóta II genotípusnál figyelhető meg. Heterozigóta DI genotípus esetén a D-

allélre jellemző (190 kb) termék dominál. Ezért a D-allélre tervezett PCR reakció

elvégzése után, ha kimutatható volt a D allél jelenléte (DI, DD genotípus) elvégeztük a

második I-allélre specifikus PCR reakciót is, ezáltal lehetővé vált a heterozigóták

egyértelmű azonosítása. A D- és I-allél detektálására alkalmas primer párral külön PCR

csőben végeztük el a reakciót a táblázatban feltüntetett körülmények között. Az AT1R

polimorfizmust RFLP segítségével mutattuk ki. Sikeres PCR reakció után, az RFLP

vizsgálatot AflIII restrikciós enzimmel végeztük (New England Biolabs, Beverly, MA,

U.S.A.). Az emésztés körülményeit a 7. táblázat tartalmazza. Az RFLP termékeket 3%-

os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS)

választottuk szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt vizualizáltuk.

66

7.táblázat: Az ACE és AT1R meghatározás PCR-RFLP körülményei

ACE I/D D-allél ACE I/D I-allél AT1R A1166C

Forward primer 5’-CTG GAG ACC

ACT CCC ATC CTT TCT-3

5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC

CTT TCT-3’

5’-ATA ATG TAA GCT CAT CCA

CCA AGA AG-3’

Reverse primer 5’-GAT GTG GCC

ATC ACA TTC GTC AGA T-3’

5’-TCG AGA CCA TCC CGG CTA

AAA C-3’

5’-TCT CCT TCA ATT CTG AAA

AGT ACT TAA-3’ Kezdeti

denaturáció 94oC, 5perc 94oC, 5perc 94oC, 4perc

Denaturáció 94°C, 30másodperc 94°C, 30másodperc 94°C, 30másodperc

Anneláció 64oC, 1perc 64oC, 1perc 50oC, 1perc

Extenzió 72°C, 30másodperc 72°C, 30másodperc 72oC, 1perc

Végső extenzió 72°C, 10perc 72°C, 10perc 72°C, 10perc

Ciklusok száma 35 35 35

Termék hossz 190bp (D)/490bp (I) 278bp (I) 176bp

Restrikciós enzim Afl-III

Restrikciós

körülmények 37oC 16óra

122/54bp

C-allél esetén Termék hossz

176bp

A-allél esetén

67

5.2.3. Statisztikai elemzés

A genetikai számításokhoz szükséges fogalmak

Gén: Az örökítő anyag (DNS) azon részlete, amely egy meghatározott tulajdonság

kialakításáért felelős fehérje felépülését határozza meg. Az öröklődés elemi egysége.

Allél: Génváltozat. Az apai és az anyai kromoszóma ugyanazon helyén (locus) található

gén eltérő módosulatainak egyike. A leggyakrabban előforduló módosulatot hordozó

egyedeket vad típusnak nevezzük.

Homozigóta: Egy adott tulajdonságra nézve azonos génváltozatokat (alléleket) hordozó

egyed. A homológ kromoszómák adott génhelyén azonos allélek találhatók.

Heterozigóta: Egy adott tulajdonságra nézve eltérő génváltozatokat (alléleket) hordozó

egyed. A homológ kromoszómák adott génhelyén eltérő allélek találhatók.

Genotípus: Az élőlény genetikai információ tartalma, azaz tulajdonképpen az egyed

alléljainak összesége. Egy tulajdonságra nézve az egyed lehet homo- vagy heterozigóta.

Fenotípus: Az élőlény mérhető, megnyilvánuló tulajdonságai.

Génmutáció: A gén bázissorrendjében bekövetkező változás, amely megváltoztathatja a

kódolt polipeptidlánc aminosavsorrendjét, így annak funkcióját, vagyis a gén által

meghatározott tulajdonságot (fenotípus) Több típusa lehet: inzerció, deléció, báziscsere,

tandem repeat stb.

SNP: Single nucleotid polymorphism, egy bázis cserével járó polimorfizmus, régi nevén

pontmutáció.

Allélfrekvencia: Az allélok relatív gyakorisága, értéke 0 és 1 között lehet.

Allélfrekvencia számítása:

Legyen egy génnek két allélje „A” és „a”.

Legyen a vizsgált populációban 100 egyed. (N=100)

Ebből „AA” genotípusú 20, „Aa” genotípusú 70, „aa” genotípusú 10.

Az összes allél száma ilyenkor 2N, azaz 200 (2x„AA”+ „Aa”+ „Aa”+2x„aa”).

Az „A” allélek száma: 2x„AA”+ „Aa”=2x20+70=110

Az „a” allélek száma: „Aa”+2x„aa”=2x10+70=90

Az „A” allél relatív gyakorisága:

p=(2x„AA”+„Aa”)/(2x„AA”+„Aa”+„Aa”+2x„aa”)=110/200=0,55 azaz 55%

68

Az „a” allél relatív gyakorisága:

q=(„Aa”+2x„aa”)/(2x„AA”+„Aa”+„Aa”+2x„aa”)=90/200=0,45 azaz 45%

Hardy-Weinberg szabály: Az ideális populáció zárt szaporodási közösségében az egyes

allélok relatív gyakorisága nemzedékről nemzedékre állandó. Az ideális populáció

feltételei a nagy egyedszám, a véletlen szaporodási közösség, az egyes genotípusok

azonos szaporodási esélye, az hogy ne jelenjen meg új mutáció és az, hogy a populáció

legyen elszigetelt, azaz ne keüljenek bele új génváltozatok. Bár a valóságban ideális

populáció nem létezik, populáció genetikai vizsgálatoknál szokás a populációkat

ideálisnak tekinteni, és összehasonlítani a mért illetve a Hardy-Weinberg egyensúly

alapján számoított genotípus gyakoriságokat. Amennyiben a mért és számított értékek

között szignifikáns különbséget találunk, az azt jelenti, hogy a populáció nem tekinthető

ideálisnak, azaz a fenti feltételek valamelyike nem teljesül. Általában valamelyik allél

vagy genotípus szelekciós előnyt jelent, ezért feldúsul a vizsgált populációban, vagy

beteg populációt vizsgálva, ha a vizsgált allél és a betegség között kapcsolat van, akkor

az allél feldúsul a beteg populációban.

A Hardy-Weinberg szabályt matematikailag a Hardy-Weinberg egyenlet írja le.

Legyen egy génnek két allélje „A” és „a”, az allélok gyakorisága az első nemzedékben

p és q. Ez esetben p+q=1.

A következő nemzedékben, mivel az ivarsejtek csak az egyik allélt tartalmazhatják, és

azonos valószínűséggel kombinálódhatnak, az egyes genotípusok gyakorisága a

következő lesz.

„AA”: pxp=p2, „Aa”: 2xpxq=2pq, „aa”:qxq=q2

Az egyes genotípusok relatív gyakoriságának összege ebben a nemzedékben is 1, azaz

p2+2pq+ q2=1

Tehát az allélgyakoriság változatlan maradt.

A Hardy-Weinberg egyenlet általánosítható, kettőnél többallél leírására is alkalmas.

Formája ekkor:

(p+q+r+….)x(p+q+r+….)=1

69

Példa a Hardy-Weinberg egyensúly számításra:

A vizsgált 100 fős populációban „AA” genotípusból 20-t, „Aa” genotípusból 70-t, „aa”

genotípusból 10-t mértünk.

Az allélfrekvenciák ekkor: p=0,55, q=0,45

A Hardy-Weinberg egyenlet (p2+2pq+ q2=1) alapján számított relatív genotípus

gyakoriságok:

p2=0,55x0,55=0,3025, 2pq=2x0,55x0,45=0,495, q2=0,45x0,45=0,2025

A 100 fős populációban az allélfrevenciák alapján tehát a genotípusok száma

„AA”=0,3025x100=30,25 „Aa”=0,495x100=49,5 „aa”=0,2025x100=20,25

lenne a Hardy-Weinberg egyenlet alapján számítva.

A mért genotípusok száma: „AA”=20 „Aa”=70 „aa”=10.

A számított és mért genotípus frekvenciák khí-négyzet próbával összehasonlíthatók,

amennyiben szignifikáns különbséget találunk nem teljesül a Hardy-Weinberg

egyensúly.

Példánkban (30,25-49,5-20,25 : 20-70-10)

Khí-négyzet: 8,67, szabadsági fok: 2, p=0,013

Azaz a mért és számított értékek között szignifikáns különbség van, a Hardy-Weinberg

egyensúly nem teljesül.

Statisztikai módszerek

Power analízis. A statisztikai power a vizsgálat erejét mutatja meg. Alkalmas arra, hogy

a kimutatandó különbséghez megadjuk a szükséges mintaszámot, vagy fordított esetben

arra is alkalmas, hogy egy adott mintaszámnál meghatározzuk a legkisebb kimutatható

különbség mértékét. Vizsgálatainkban a poweranalízist Statistica 6.0-s statisztikai

szoftverel végeztük.

Valamennyi vizsgálatban 100-200 fős populáció állt rendelkezésre, kétszeres különbség

kimutatását tűztük ki célul. A α értéket 0,05-ként, a β értéket (power) 0,8-ként

definiáltuk. A poweranalízis alapján vizsgálataink 20-30%-os különbségek kimutatására

voltak alkalmasak.

A kategorikus változók összehasonlítására khí-négyzet próbát, illetve ennek speciális

esetét a Fischer egzakt próbát használtuk. A folytonos normális eloszlású változók

összehasonlítása t-próbával történt. A változók normális eloszlásának meghatározása

70

Kolgomorov-Smirnov próbát használtunk. A varianciákat F-próbával hasonlítottuk

össze. A nem normális eloszlást követő vagy eltérő varianciájú folytonos változókat

Mann-Whitney féle U-próbával hasonlítottuk össze. A folytonos, normális eloszlású

változók közötti kapcsolat leírására lineáris regressziót használtunk. A kategorikus

függő változók esetén logisztikus regresszióval kerestük a kapcsolatot. A regressziós

vizsgálatok során a legfontosabb ismert kockázati tényezőkre korigáltuk az

összefüggést, hogy a független változók önálló hatását vizsgálhassuk. A szignifikancia

szintet minden vizsgálatnál p<0,05-ként határoztuk meg. Valamennyi statisztikai

számítást az SPSS 10.0 statisztikai programcsomaggal végeztünk. (SPSS Inc, Chicago,

IL).

A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-kel végzett vizsgálatok kiértékelésénél

alkalmazott statisztikai módszerek

A genotípusok és az oxigénterápia és/vagy gépi lélegeztetés iránti igény, illetve a BPD

kockázata között a kapcsolatot khí-négyzet próbával vizsgáltuk. Az összefüggéseket

korrigáltuk a gesztációs korra és a BPD kialakulását befolyásoló perinatális

komplikációkra. Ehhez logisztikus regressziót használtunk. Az oxigénterápia, illetve a

gépi lélegeztetés napokban mért hosszának ezután a logaritmusát képeztük, hogy

normális eloszlású változót kapjunk. Ezután többszörös regressziós analízist végeztünk,

ahol a genotípusok, gesztációs kor és a perinatális szövődmények voltak a független

változók, míg az oxigénterápia illetve gépi lélegeztetés logaritmizált hossza volt a függő

változó. Azt is megvizsgáltuk, hogy a két citokin polimorfizmus variánsainak együttes

hordozása befolyásolja-e a lélegeztetési paramétereket. Ehhez is a korábban ismertetett

módszereket használtuk.

Az IFNγ és IL-12 SNP-kel végzett vizsgálatok kiértékelésénél alkalmazott

statisztikai módszerek

A számított és a mért genotípus gyakoriságok összehasonlításához elvégeztük Hardy-

Weinberg egyensúly kiszámítását. A kategórikus változók közötti kapcsolatot khí-

négyzet próbával vizsgáltuk, a folytonos, normális eloszlású változók összehasonlítása

t-próbával történt. A gépi lélegeztetés és oxigénterápia napokban mért hosszának a

logaritmusát képeztük, hogy normális eloszlású változókat kapjunk. Többszörös lineáris

71

regressziós analízist végeztünk, hogy meghatározzuk a genotípusok hatását a

lélegeztetésre. A BPD és a polimorfizmusok közötti, más tényezőktől független

kapcsolat meghatározása céljából stepwise bináris logisztikus regressziót végeztünk.

Mindkét regressziós vizsgálat során korrigáltuk az összefüggéseket a gesztációs korra és

a klinikai paraméterekre. Megvizsgáltuk a genotípusok kapcsolatát a BPD-től független,

egyéb perinatális szövődményekkel is. Ehhez a vizsgálathoz is logisztikus regressziót

használtunk és az összefüggéseket a gesztációs korra illetve a klinikai paraméterekre

korigáltuk. A vizsgálataink során a szignifikancia szintet p<0,05 értékkel definiáltuk.

Minden statisztikai számítást az SPSS 10.0 statisztikai programcsomaggal végeztünk.

(SPSS Inc, Chicago, IL).

Az ACE I/D és AT1R SNP-kel végzett vizsgálatok kiértékelésénél alkalmazott

statisztikai módszerek

A vizsgálat során a Kazzi és mtsai által közölt BPD és ACE I/D polimorfizmus közötti

kapcsolatra vonatkozó eredményeket hasonlítottuk össze az általunk ACE I/D illetve

AT1R polimorfizmusokra vizsgált populáció klinikai jellemzőivel. A kategorikus

változól összehasonlítását khí-négyzet próbával végeztük, a folytonos normális

eloszlású változókat Student féle t-próbával, a nem normális eloszlást követő folytonos

változókat Mann-Whitney féle U-próbával hasonlítottuk össze. A statisztikai

számításokat az SPSS 10.0 statisztikai programcsomaggal végeztünk. (SPSS Inc,

Chicago, IL).

72

6. Eredmények

6.1. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és a lélegeztetés

Valamennyi vizsgált polimorfizmus esetén a genotípusok eloszlása Hardy-Weinberg

egyensúlyban volt. A TNFα -308A allél gyakorisága 0,12, az IL-1β 3954T allél

gyakorisága 0,23, az IL-6-174C allél gyakorisága 0,27, és az IL-10-1082A allél

gyakorisága 0,46 volt, ami megfelel a korcsoportban mért magyar referencia értékeknek

(43).

A fentiek közül egyik genotípus sem mutatott összefüggést a gépi lélegeztetés illetve az

oxigénterápia idejével vagy a BPD kialakulási kockázatával. A stepwise többszörös

regressziós vizsgálat eredményei ugyanakkor azt mutatták ki, hogy a TNFα -308A allél

hordozása átlagosan 40 órával hosszabb gépi lélegeztetést (p=0,004), és átlagosan 36

órával hosszabb oxigénkezelést (p=0,0008) tett szükségessé. (8. táblázat) A vizsgált

citokin polimorfizmusok együttes hordozása nem járt elhúzódó légzéstámogatással.

8.táblázat: Az oxigénterápia és a gépi lélegeztetés hosszával szignifikáns összefüggést

mutató paraméterek illetve a stepwise többszörös regressziós vizsgálat eredményei a

TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 vizsgálatban

Változók béta p Járulékos légzéstámogatási idő

órákban. (eβ*24) Oxigénterápia hossza

Respirációs distressz-szindróma 0,60 0,014 44

Tüdőgyulladás 0,41 0,020 36

TNFα -308A allél hordozás 0,48 <0,001 39

Gépi lélegeztetés hossza

Respirációs distressz szindróma 0,97 <0,001 63

Születési súly (1000g alatt) -0,28 0,007 4,6/100g

TNFα -308A allél hordozás 0,74 0,004 50

73

6.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés

Valamennyi genotípus Hardy-Weinberg egyensúlyban volt, az összes vizsgált

populációban. Az IFNγ T+874A genotípusok (TT/TA/AA) prevalenciája az érett illetve

LBW újszülöttekben 0,33/0,46/0,21 illetve 0,17/0,56/0,25 volt. Az IFNγ+874A allél

szignifikánsan gyakrabban fordult elő koraszülöttekben (0,44 vs. 0,54, OR [95% CI]:

1,50 [1,10-2,05]). Az IL-12 p40 promoter CTCTAA/GC (I/D) genotípusok (II/ID/DD)

prevalenciája érett illetve LBW újszülöttekben 0,33/0,47/0,20 illetve 0,28/0,50/0,20

volt. A mutáns allél prevalenciája megegyezett a két csoportban (0,44 vs. 0,46).

A stepwise lineáris regressziós modelünk szerint A légzéstámogatás ideje

összefüggésben volt a születéskori gesztációs korral, az IVH előfordulásával és az

IFNγ Α+874T genotípussal. Az IFNγ+874T allél hordozók 41%-kal rövidebb gépi

lélegeztetést illetve 34%-kal rövidebb oxigénterápiát igényeltek, mint az IFNγ+874AA

genotípusú újszülöttek (9. táblázat). A vizsgált IL-12 polimorfizmus nem mutatott

összefüggést a lélegeztetéssel.

Megvizsgáltuk a genotípusok és a perinatális szövődmények közötti kapcsolatot is. Khí-

négyzet próbával csak az IL-12 genotípus (II/ID/DD) eloszlásában találtunk

különbséget azon LBW újszülöttek között, akiknél tüdőgyulladás alakult ki, illetve

akiknél nem (0,23/0,57/0,20 vs. 0,47/0,36/0,17 OR [95% CI]: 1,76 [1,13-2,76]

p=0,014). Azonban stepwise bináris logisztikus regresszióval az IFNγ+874T allél

hordozása a BPD független kockázati tényezőjének bizonyult (OR: 0,35 [0,12-0,99]).

Az IL-12 polimorfizmus önmagában nem mutatott összefüggést a BPD kockázatával, de

az IL-12 CTCTAA allél hordozókban fokozott volt a tüdőgyulladás kockázata (OR:

1,76 [1,13-2,76]). A Bináris logisztikus regressziós vizsgálat több más összefüggést is

kimutatott a légzéstámogatás hosszát befolyásoló perinatális szövődmények kockázata

és az IFNγ A+874T genotípus között. Az IFNγ+874T allél hordozók védettek voltak PDA

kialakulásával szemben (a megfelelő esélyhányadosokat lásd a 9. táblázatban). Az

IFNγ+874A allél hordozóknál magasabb volt a fertőzés következtében kialakult súlyos

hipotónia és az IRDS kockázata. Ezek az összefüggések adjustálva lettek a gesztációs

korra és más kockázati tényezőt jelentő perinatális szövődményekre.

74

Az IL-12 p40 promoter CTCTAA/GC polimorfizmussal kapcsolatos vizsgálataink

szerint az IL-12 GC allél hordozóknál alacsonyabb volt a tüdőgyulladás kialakulásának

kockázata, illetve az IL-12 CTCTAA allél hordozóknál fokozott volt a NEC

kialakulásának a kockázata. A heterozigótáknál csökkent a tüdőgyulladás és nőtt a NEC

kialakulásának kockázata a homozigótákhoz képest.

Megvizsgáltuk az IFNγ+874A x IL-12 GC allélek együttes hordozásának hatását is a

perinatális szövődmények kialakulására. Azoknál az újszülötteknél, akik mindkét allélt

hordozták nagyobb volt a fertőzés következtében kialakuló súlyos hipotónia kockázata.

75

9. táblázat: Az IFNγ és IL-12 vizsgálat eredményeinek összefoglalása: a vizsgált

genotípusok és a lélegeztetési paraméterek illetve a perinatális szövődmények

kapcsolata

A többszörös lineáris regressziós analízis eredményei

Függő változó Független változók p B eB †

log(gépi lélegeztetés hossza)

IFN T allél hordozás 0,002 -0,533 0,59

log(oxigén terápia hossza)

IFN T allél hordozás 0,003 -0,438 0,65

A stepwise bináris logisztikus regressziós analízis eredményei

Függő változó Független változók p Béta eβ=OR [95% CI]

IFN T allél 0,049 -1,054 0,35 [0,12-0,99] Bronchopulmonális

dysplasia IFN AA x IL-12 ID

genotípus 0,042 1,488 4,43 [1,06-18,6]

Nyitott Botallo-vezeték IFN T allél 0,043 -0,837 0,43 [0,19-0,97]

Idiopátiás respirációs distressz-szindróma IFN A allél 0,016 1,395 4,03 [1,30-12,5]

Fertőzés következtében kialakuló súlyos hipotónia IFN A allél 0,049 1,225 3,40 [1,01-11,5]

IL-12 D allél 0,009 -1,135 0,322 [0,14-0,75] Tüdőgyulladás IL-12 DI

genotípus 0,016 -1,076 0,341 [0,14-0,82]

IL-12 I allél 0,046 0,862 2,369 [1,01-5,53] Nekrotizáló enterocolitis IL-12 DI

genotípus 0,004 1,069 2,914 [4,41-6,02]

Többszörös lineáris regressziós analízis: A gépi lélegeztetés és az oxigénterápia

napokban mért hosszának logaritmusát képeztük, hogy normális eloszlású változót

kapjunk. A változókat korrigáltuk a születéskori gesztációs korra és azokra a perinatális

szövődményekre, amelyek valószínűleg befolyásolják a lélegeztetési paramétereket. A

születéskori gesztációs kor valamennyi összefüggésnél szignifikáns (p < 0,001)

kockázati tényező volt. B jelenti a regressziós koefficienst; † eB = az IFNγ T allélt

76

hordozó illetve nem hordozó újszülöttek gépi lélegeztetési idejeinek, illetve

oxigénterápiás idejeinek aránya.

Stepwise bináris logisztikus regresszió: A genotípusok és a perinatális szövődmények

közötti összefüggéseket a születéskori gesztációs korra és az ismert kockázati

tényezőkre korrigáltuk. A születéskori gesztációs kor valamennyi összefüggés esetén

szignifikáns (p < 0,05) kockázati tényező volt, az IVH szignifikáns kockázati tényezője

volt a lélegeztetési időknek és a BPD kialakulásának, a fertőzés következtében kialakuló

súlyos hipotónia szignifikáns kockázati tényezője volt a tüdőgyulladás kialakulásának,

és az IRDS szignifikáns kockázati tényezője volt a fertőzést kísérő súlyos hipotónia

kialakulásának. Béta a standardizált regressziós koeficiens, OR az esélyhányados, CI a

95%-os konfidencia intervallum.

6.3. Az ACE I/D és AT1R SNP-k és lélegeztetés

Kutatócsoportunk számos más polimorfizmus szerepét is vizsgálta a koraszülöttek

morbiditásában, így az ACE I/D és AT1R A1166C polimorfizmusok is meghatározásra

kerültek több mint száz, 1750g alatti születési súlyú újszülöttben (10. táblázat). Kazzi és

mtsai. ötletére alapozva az adatok újraértékeléséval megvizsgáltam, hogy a fenti

polimorfizmusok befolyásolják-e a BPD kialakulási kockázatát illetve a lélegeztetési

időket. Mindkét vizsgált polimorfizmus Hardy-Weinberg egyensúlyban volt. Érdekes

módon Kazzi és mtsai-val ellentéten nem sikerült összefüggést kimutatni sem az ACE

sem az AT1R genotípusok és a BPD kockázat illetve a lélegeztetési idők között.

77

10.táblázat: ACE I/D polimorfizmus VLBW koraszülöttekben, Kazzi és mtsai. illetve

saját eredményeink összehasonlítása

Az újszülöttek klinikai paraméterei

Vizsgálat Bokodi és mtsai. Kazzi és mtsai.

Genotípus DD/DI

(n=105)

II

(n=9)

DD/DI

(n=97)

II

(n=23)

Születési súly (g)* 1233 ± 358§ 1497 ± 472§ 938 ± 204 925 ± 196

Gesztációs kor születéskor

(hét)* 30 ± 3 31 ± 4 28 ± 3 28 ± 2

Fiú † 51% 67% 42% 48%

Respirációs distressz-

szindróma† 49% 56% 76% 74%

Gépi lélegeztetés ideje

napokban# 2 (0-8) 1 (0-7) 13 (1-45) 8 (1-27)

Oxigénterápia ideje

napokban# 3 (0-8) 11 (3-13) 52 (7-74) 31 (3-60)

BPD† 18 (17%) 3 (33%) 46 (47%)$ 5 (22%) $

Nincs BPD† 87 (83%) 6 (67%) 51 (53%)$ 18 (78%) $

A vastag betűvel jelölt változók különböztek a két vizsgálatban * Student féle t-próba. Az értékek átlag ± szórás formában vannak megadva. †khí2-próba. Az értékek százalékban vannak megadva. #Mann-Whitney féle U-próba, az értékek medián (25-75 percentilis) formában vannak

megadva. § p<0,05, $ p<0,025

78

7. Megbeszélés

7.1. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés

A perinatális tüdőkárosodás patogenezisében tagadhatatlan a citokinek központi

szerepe, bár a pontos kölcsönhatások feltárásához még további vizsgálatok szükségesek

(65,142,143). Egyes vizsgálatok szerint a gyulladásos citokinek (IL-1β, TNFα) szintjei

nőttek, míg az antiinflammatorikus citokinek (IL-6, IL-10) szintjei csökkentek a hosszú

idejű oxigénterápiában részesülő újszülöttek trachea váladékában és vérmintáiban

(65,124,144). A mi vizsgálatunk célja az volt, hogy meghatározzuk, hogy van-e

kapcsolat ezen citokinek funkcionális polimorfizmusai és a BPD kockázata illetve az

oxigénterápia és gépi lélegeztetés hossza között.

Nem tudtunk kimutatni összefüggést a vizsgált SNP-k és a BPD kockázata között. Ez

összhangban van Adcock és mtsai. eredményeivel, akik szintén nem találtak kapcsolatot

BPD kockázata és a TNFα G-308A genotípus között (67). Ennek ellenére a BPD

összetett patomechanizmusa és az érintett populáció heterogenitása miatt további

vizsgálatok szükségesek nagyobb számú VLBW újszülött bevonásával, hogy biztosan

kizárható legyen a vizsgált citokin polimorfizmusok hatása a BPD kialakulási

kockázatára.

Enyhébb tüdőkárosodást elszenvedett betegekben azonban ki tudtuk mutatni, hogy a

TNFα G-308A genotípus – ami emelkedett TNFα szintekkel jár – mégis befolyásolhatja

a VLBW újszülöttek oxygén támogatási igényét. Ez az eredmény összhangban van a

TNFα tüdőkárosodásban betöltött központi szerepével (23,43,67,124).

Érdekes módon az eredményeink különböznek a felnőtt betegekben megfigyeltektől.

Yende és mtsai. hosszabb gépi lélegeztetési időket figyeltek meg coronaria bypass

műtét után azokban a betegekben, akik alacsony TNFα szekrécióval járó haplotípust

hordoztak. (pl. lymphotoxin-α+250G és TNFα-308G allélok) (125). Ezért a különbségért

az eltérő patomechanizmusú kórkép, illetve az eltérő betegpopuláció lehet a felelős,

hiszen Yende és mtsai. egészséges tüdejű felnőtt betegeket vizsgáltak coronaria műtét

után, míg mi tüdőkárosodásra hajlamos VLBW koraszülötteket vizsgáltunk.

79

Összefoglalva az eredményeink alátámasztják azt a hipotézist, hogy a TNFα G-308A

genotípus hozzájárul a beteg koraszülöttek gépi lélegeztetés, illetve oxigénterápia iránti

igényéhez.

7.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés

A veleszületett és adaptív immunreakciók csökkent értékűek koraszülöttekben. Ennek

közismert klinikai jele a koraszülöttek fokozott érzékenysége a fertőzésekkel szemben,

beleértve az intracelluláris kórokozókat is (52-55). Összehangolatlan immunreakciókat

azonban számos más stimulus is kiválthat, ami szerv- és szövetkárosodáshoz vezethet.

Szövetkárosodás szempontjából a tüdő az egyik legérzékenyebb szerv. Több vizsgálat is

kapcsolatot talált a gyulladásos citokinek, mint a TNFα, IL-8 és IL-1β, fokozott

termelése és a gépi lélegeztetés iránti igény illetve a BPD kialakulási kockázata között

(4,23).

Azt is többen kimutatták, hogy a veleszületett immunitás két legfontosabb citokinjének,

az IFNγ-nak és IL12-nek a termelése még nem megfelelő koraszülöttekben. Bár kevés

adat van arról, hogy mi a szerepe ezeknek a citokineknek a perinatális szövődmények

patomechanizmusában, feltételezhető a gyulladásos mechanizmusú szövődmények és a

nem megfelelő IFNγ illetve IL12 termelés kapcsolata koraszülöttekben (52,53).

Ebben a vizsgálatban az IFNγ+874A és IL-12 CTCTAA allélok hordozása – mindkettőt

alacsony citokinszintekkel hozták kapcsolatba – és a születés utáni oxigénigény, illetve

a légzéstámogatás iránti igényt befolyásoló perinatális szövődmények kockázata között

kerestünk kapcsolatot (135,138,145-147). Egészséges, érett újszülöttekben a referencia

értékeknek megfelelő allélfrekvenciákat találtunk mind az IFNγ mind az IL-12

polimorfizmus esetén (42,145,148). LBW koraszülöttekben azonban a IFNγ+874A allél

gyakoribb volt mint érett újszülöttekben. Ez az eredmény utalhat az IFNγ koraszülés

patomechanizmusában betöltött szerepére. Mi azonban csak az újszülöttek genotípusát

vizsgáltuk a szülőkét nem. Mivel az újszülöttek alléljainak fele származik csak az

anyától, nem tudhatjuk, hogy a koraszülés hátterében az újszülött vagy az anya

genotípusa áll. Ezért az IFNγ Τ+874A polimorfizmus koraszülés patomechanizmusában

betöltött szerepének tisztázásához további vizsgálatok szükségesek, amelyek figyelembe

veszik az újszülött mellett az anya és az apa genotípusát is.

80

A genotípusok és a lélegeztetési paraméterek közötti kapcsolat vizsgálata során

megfigyeltük, hogy az IFNγ+874T allél hordozók körülbelül 40%-kal rövidebb gépi

lélegeztetést, illetve oxigénterápiát igényeltek, mint az állélt nem hordozó újszülöttek.

Az IFNγ+874T allél hordozás emelkedett IFNγ szintekkel jár, ezért eredményeink

összhangban vannak Bont és mtsai. megfigyeléseivel, akik összefüggést találtak az

elhúzódó gépi lélegeztetés és az alacsony szérum IFNγ szintek között RSV-vel fertőzött

újszülöttekben (149, 150).

Vizsgálataink szerint az IFNγ+874T allél hordozók a BPD kialakulásával szemben is

védettek voltak, míg az IFNγ+874AA és IL-12 GC/CTCTAA genotípusokat együtt

hordozó újszülötteknél fokozott volt a BPD kialakulásának kockázata. Bár egyelőre

nincsenek adatok emberben a BPD és az IL-12 illetve IFNγ szintek közötti kapcsolatra,

eredményeink összhangban vannak az újszülöttek krónikus tüdőkárosodásának

kialakulását leíró legfrissebb elméletekkel. Ezek szerint a citoknek termelődését a

fertőzések, a gyulladásos mechanizmusú perinatális szövődmények és a gépi

lélegeztetés szövetkárosító hatásai váltják ki. Az emelkedett gyulladásos citokinszintek,

mint az IL-1β, a TNFα és az IL-8 igazoltan központi szerepet játszanak a BPD és a

tüdőkárosodás patomechanizmusában (4,23). Ezekről a citokinekről azt is kimutatták,

hogy befolyásolják más gyulladásos citokinek, így az IL-12 és az IFNγ termelődését,

amik így szintén részt vehetnek a BPD kialakulásában (151).

A gépi lélegeztetés, illetve oxigénterápia iránti igényt számos perinatális szövődmény

befolyásolja (3,23,152-154). Ezért megvizsgáltuk az IL-12 p40 promoter GC/CTCTAA

és IFNγ T+874A genetikai polimorfizmusok és a NEC, tüdőgyulladás, perinatális

fertőzés, illetve szepszis közötti kapcsolatot, mivel mind a négy perinatális szövődmény

kialakulásában központi szerepe van a gyulladásnak. A szepszis és a vizsgált

polimorfizmusok között nem találtunk kapcsolatot, azonban a vizsgált IFNγ allélek

hordozása mégis hatással lehet a szepszis súlyosságára. Ugyanis az alacsony

IFNγ termelésre hajlamosító allél hordozóinál vizsgálataink szerint, fokozódott a

fertőzés következtében kialakuló hipotónia kockázata, ami a szepszis kísérő tünete

lehet. Az alacsony IL-12 termeléssel járó allél hordozóinál fokozott NEC és

tüdőgyulladás kockázatot figyeltünk meg. Bár logikus lenne az összefüggést a

megváltozott citokintermeléssel magyarázni, egyelőre nem áll elegendő emberi

vizsgálatból származó adat a rendelkezésünkre, illetve a vizsgálatunk retrospektív

81

jellege nem tette lehetővé ennek a feltételezésnek az igazolását. A genetikai variánsok

gyulladásos mechanizmusú perinatális szövődmények kialakulásában betöltött

szerepének pontos feltárásához az IL-12 és IFNγ szérum szintjeinek meghatározása is

szükséges lenne.

Az összefüggések lélegeztetést befolyásoló egyéb perinatális szövődményekre történő

adjusztálása közben kimutattuk, hogy az alacsony IFNγ szintekkel járó allél hordozói

között fokozott volt a PDA és az IRDS kockázata. A Botallo-vezeték záródásában

legfontosabb szerepe az érfalban lévő ciklooxigenáz (COX) enzimnek van. Bár az

IFNγ szerepét eddig még nem vizsgálták a PDA kialakulásában, feltételezhető, hogy

mégis részt vesz a folyamatban, hiszen az IFNγ szabályozó tényezője a COX2

enzimnek. (155,156). Ez alapján jogosan feltételezhető, hogy az alacsony IFNγ szint a

COX aktivitáson keresztül fokozza a PDA kockázatát. A vizsgálataink alátámasztják ezt

az elméletet, mert az IFNγ AA genotípus esetén a PDA kialakulásának fokozott

kockázatát figyeltük meg.

Bár az IRDS legfontosabb kockázati tényezője az éretlenség, a gyulladásos citokinek,

mint az IL-1β és a TNFα is befolyásolják a tüdőfejlődést (124,157). Bár nincs adat arra,

hogy az IFNγ-nak milyen közvetlen hatása van az újszülöttek surfactant termelésére, az

eredményeink alapján mégis felmerül, hogy az IFNγ genotípus hatással lehet az IRDS

kialakulásának kockázatára az IFNγ illetve más gyulladásos citokinek termelésére

gyakorolt hatásán keresztül.

Összefoglalva vizsgálataink eredményei felvetik az IFNγ and IL-12 polimorfizmusok és

a perinatális morbiditás kapcsolatát. Az IFNγ+874A allél hordozása esetén, ami

feltételezhetően alacsony szérum IFNγ szintekkel jár, a koraszülöttség, a tüdőkárosodás

és néhány más perinatális szövődmény fokozott kockázatát figyeltük meg. Az IL-12

GC/CTCTAA polimorfizmus a tüdőgyulladás és a NEC kockázatával mutatott

összefüggést. Bár a citokintermelő képesség megváltozása logikus magyarázat lenne az

összefüggésekre, a vizsgálatunk retrospektív jellege miatt nem alkalmas ennek az

elméletnek az alátámasztására. Javasoljuk további vizsgálatok végzését a genotípusok és

a szérum IFNγ illetve IL-12 szintek összehasonlításával, hogy igazolni lehessen, hogy a

megfigyelt összefüggések hátterében valóban a LBW koraszülöttek megváltozott

citokintermelő képessége állt.

82

7.3. Az ACE I/D és AT1R génpolimorfizmusok és lélegeztetés

A Kazzi és mtsai. illetve az általunk végzett vizsgálatok eredményei közötti különbséget

magyarázhatja a vizsgálatokba bevont populációk különbözősége. (Részletesen lásd 10.

táblázat) Az általunk vizsgált betegcsoport érettebb volt, kevesebb légzéstámogatásra

szorult, alacsonyabb volt a BPD prevalenciája. Ezek alapján úgy gondoljuk, hogy a

Kazzi és mtsai. által tett megfigyelések érvényessége valószínűleg csak egy nagyon

éretlen, 1250 gramm alatti súllyal született koraszülött populációra korlátozódik. Több

vizsgálat is igazolta a renin-angiotensin rendszer funkcionális változásait a magzat érése

során (158). Talán az ACE genotípus tüdőfunkcióra gyakorolt hatása is kifejezettebb a

magzati élet korábbi szakaszában és eltűnik az érettebb koraszülöttekben.

7.4. Az általunk feltárt új összefüggések a perinatális lélegeztetési igény és a BPD

genetikájában

A BPD összetett patomechanizmusú kórkép, melynek kialakulásában egyre nagyobb

szerepet tulajdonítanak a genetikai tényezőknek, elsősorban a genetikai

polimorfizmusoknak. A genetikai polimorfizmusok közvetlenül fokozhatják a BPD

kialakulásának kockázatát, vagy hajlamosíthatnak olyan perinatális állapotokra,

amelyekben gyakrabban alakul ki BPD. Eredményeink az irodalmi adatok tükrében jól

kiegészítik az eddigi ismereteket. Több genetikai polimorfizmus hordozása és a BPD,

illetve más perintális szövődmények kockázata között sikerült összefüggést

kimutatnunk. Az általunk igazolt összefüggések beillesztehetők a BPD iránti genetikai

hajlammal kapcsolatos tudásba (A 2. ábrán összefoglaltuk a BPD legfontosabb

kockázati tényezőit és ezek eddig feltárt genetikai hátterét. Pirossal tüntettük fel az

általunk kimutatott összefüggéseket).

A genetikai polimorfizmusokkal kapcsolatos vizsgálataink arra is rávilágítottak, hogy a

genetikai tényezők mellett a környezeti hatások is jelentős szerepet játszanak a vizsgált

szövődmények kialakulásában. Egyes genetikailag meghatározott tulajdonságok

penetranciája eltérő lehet a különböző környezeti hatásoknak kitett populációkban, mint

83

ahogy a vizsgált ACE I/D polimorfizmus is másként járult hozzá a BPD kockázatához

egy érettebb és egy éretlenebb koraszülött populációban.

A BPD hátterében álló genetikai faktorok ismerete segíthet a jövőben a veszélyeztetett

betegek felismerésében, és a terápia optimálásában, személyre szabott kezelés

alkalmazásában. A genetikai szűrővizsgálatok alkalmazásának feltétele, hogy

nagyszámú polimorfizmust gyorsan és olcsón meg lehessen határozni. A technika

fejlődésével, a chip technika egyre szélesebb körű elterjedésével ez megvalósulni

látszik. Az egyes betegségek hátterében álló genetikai polimorfizmusok ismeretében

lehetővé válik a betegségekre specifikus diagnosztikus DNS-chipek tervezése.

9. ábra: A BPD kockázati tényezői és genetikai hátterük, saját vizsgálataink helye

A BPD-nek és legfontosabb kockázati tényezőinek genetikai háttere. Ellentmondásos adatok esetén (egyik vizsgálat talált kapcsolatot, míg

a másik nem) mi csak a kapcsolatot tüntettük fel az ábrán. További részleteket és a rövidítéseket lásd a szövegben. A pirossal feltüntettet

összefüggések saját vizsgálataink eredményei.

BPD Kapcsolat: L-szelektin, TNFα, IFNγ, GST,

ACE, SPA, SPB, ER Nincs kapcsolat: SPC, LTα, TGFβ, IGF-1R,

MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, E-szelektin, P-szelektin, VEGF, AT1R,

Urokináz

Tüdőfejlődés

IRDSPDA

Légzéstámogatás Kapcsolat: TNFα, IFNγ, ER

IVH

Szepszis Kapcsolat: NOD2, IL-6, IFNγ, ACE

Nincs kapcsolat: CD14, TLR4, TNFα, IL-1β, IL-4ra, IL-10, IL-12

NEC Kapcsolat:IL-4ra, IL-12, IL-18,

ER,VEGF; Nincs kapcsolat: CD14, TLR4,

CARD15, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10, IFNγ

Gyulladás

Chorioamnionitis

Koraszülés

Korai burokredés

Praeeclampsia Fertőzés (pneumonia) Kapcsolat:TNFα,

VEGF, AT, GNβ3,Factor V,

MTHFR Kapcsolat:TNFα, LTα Kapcsolat: TNFα, IL-10, HSP72, MMP8, MMP9

Kapcsolat: TNFα, IFNγ, IL-1ra, IL-4, IL-6, IL-10, MBL, TLR-4, L-szelektin,

VEGF, HSP72, SPC Nincs kapcsolat: IL-12, TLR2, CD14,

CARD15, E-szelektin, P-szelektin

Kapcsolat: SPA, SPB,

Kapcsolat:TNFα, ER, Factor V, Factor XIII, Prothrombin

Kapcsolat: IFNγ, ATR1, ER

Kapcsolat: VEGF, Angiopoietin, FGF, TTF, SHH, HOX, RAR, Elasztin

Kapcsolat: IL-12 Nincs kapcsolat: IFNγ

Perinatális adaptáció, keringési elégtelenség

Kapcsolat: ACE

8. Tézisek

Vizsgálataim alapján a következő új megállapításokat tettem:

1. Bár a TNFα G–308A, IL-1ß C3954T, IL-6 G–174C, IL-10 G–1082A polimorfizmusok

egyike sem mutatott közvetlen összefüggést a BPD kockázatával, kimutattuk, hogy a

TNFα A allél hordozók átlagosan 40 órával hosszabb gépi lélegeztetést (p=0,004) és

átlagosan 36 órával hosszabb oxigénterápiát (p=0,0008) igényeltek, mint az allélt nem

hordozó koraszülöttek. Az összefüggés a tüdőkárosodás perinatális kockázati tényezőire

történő korigálás után is szignifikáns maradt.

2. Az IFNγ+874A allél hordozás gyakoribb volt kis súlyú koraszülöttekben, mint érett

egészséges újszülöttekben.

3. Kimutattuk, hogy az IFNγ+874T allél hordozó koraszülötek 41%-kal rövidebb gépi

lélegeztetésre és 34%-kal rövidebb oxigénterápiára szorultak. A vizsgált IL-12

polimorfizmus nem mutatott összefüggést a légzéstámogatás idejével.

4. Az IFNγ+874T allél hordozás 65%-os BPD kockázat csökkenéssel járt LBW

koraszülöttekben, az IL-12 polimorfizmus nem mutatott összefüggést a BPD-vel.

5. A többi vizsgált perinatális szövődmény esetén az IFNγ+874T allél hordozás védett a

PDA kialakulásával szemben, az IFNγ+874A allél hordozás fokozta az IRDS és a fertőzés

következtében kialakuló súlyos hipotónia kockázatát. AZ IL-12 p40 promoter GC allél

hordozás védett a tüdőgyulladás kialakulása ellen, a CTCTAA allél hordozókban

fokozott volt a NEC kockázata az allélt nem hordozókkal szemben.

6. Kazzi és mtsai. eredményével ellentétben nem sikerült összefüggést találnunk az

ACE I/D és az AT1R A1166C polimorfizmusok és a BPD kockázata, illetve a gépi

lélegeztetés és oxigénterápia ideje között 2000 gramm alatti születési súlyú

koraszülöttekben.

86

9. Összefoglalás

A koraszülöttek tüdőkárosodása a bronchopulmonális dysplasia (BPD). A BPD

kialakulásában szerepet játszó kockázati tényezők az éretlenség, a megzavart

tüdőfejlődés, a szisztémás és lokális gyulladás és a perinatális időszak terápiás

beavatkozásai, mint a gépi lélegeztetés vagy a nem megfelelő táplálás. Újabb

vizsgálatok szerint a genetikai polimorfizmusokis hozzájárulhatnak a BPD és

legfontosabb kockázati tényezőinek kialakulásához.

Vizsgálataink során a BPD genetikai hátterét vizsgáltuk alacsony születési súlyú

koraszülöttekben PCR-RFLP módszerrel. Kimutattuk, hogy a TNFα G–308A, IL-1ß

C3954T, IL-6 G–174C és IL-10 G–1082A polimorfizmusok közül a TNFα A allél hordozása

esetén allél hordozók átlagosan 40 órával hosszabb gépi lélegeztetést (p=0,004) és

átlagosan 36 órával hosszabb oxigénterápiát (p=0,0008) igényeltek, mint az allélt nem

hordozó koraszülöttek. Az összefüggés a tüdőkárosodás perinatális kockázati tényezőire

történő korigálás után is szignifikáns maradt. Az IFNγ T+874A és IL-12 p40 promoter

GC/CTCTAA polimorfizmusok esetén IFNγ+874A allél gyakoribb volt LBW

koraszülöttekben. Az IFNγ+874T allél hordozók 41- illetve 35%-kal rövidebb gépi

lélegeztetést illetve oxigénterápiát igényeltek, mint a T-allélt nem hordozó

koraszülöttek. Az IFNγ+874T allél hordozása védett a BPD (OR[95% CI]: 0,35 [0,12-

0,99]) és a nyitott Botall-vezeték (0,43 [0,19-0,97]) kialakulása ellen is. Az IFNγ+874A

allél hordozóknaál nagyobb volt a súlyos hipotónia (3,40 [1,01-11,52]) és a respirációs

distressz-szindróma (4,03 [1,30-12,50]) kockázata. Az IL-12 GC allél hordozása

védelmet jelentett a tüdőgyulladás (0,32 [0,14-0,75]) kialakulásával szemben. Az IL-12

CTCTAA allél hordozókban nagyobb volt a nekrotizáló enterocolitis (2,37 [1,01-5,53])

kialakulásának kockázata.A vizsgált renin-angiotenzin aldoszteron génpolimorfizmusok

nem függtek össze a lélegeztetés iránti igénnyel.

Eredményeink alapján a genetikai tényezők szerepet játszhatnak a perinatális

tüdőkárosodásban. Ezek ismerete lehetővé teheti a veszélyeztetett betegek korai

azonosítását, így megteremti annak a lehetőségét, hogy az érintett koraszülöttek időben

célzott kezelésben részesüljenek.

87

10. Summary

Chronic lung damage of preterm infants is called bronchopulmonary dysplasia (BPD).

The risk factors for BPD are prematurity, disturbed lung development, systemic and

local inflammation as well as therapeutic interventions of the perinatal period such as

mechanical ventilation and inadequate nutrition. Furthermore, recent research

highlighted the potential implication of genetic polymorphisms, mainly single

nucleotide polymorphisms (SNPs) in BPD and the majority of its risk factors.

In our study we investigated the association of SNPs with BPD and ventilation

characteristics in low birth weight infants. We investigated TNFα G–308A, IL-1ß C3954T,

IL-6 G–174C és IL-10 G–1082A SNPs and demonstrated that the carrier state of the TNFα

G-308A allele was associated with a 40-hour longer period of mechanical ventilation

(p=0.004) and an additional 36 hours of oxygen supplementation on average

(p=0.0008). The association was significant after its adjustment for perinatal risk factors

for lung damage. Examining the IFNγ T+874A és IL-12 p40 promoter GC/CTCTAA

polymorphisms we found that IFNγ+874A allele is overrepresented in LBW infants.

Carriers of IFNγ+874T allele required mechanical ventilation and oxygen

supplementation for a 41% and 35% shorter period of time, respectively, than those not

carrying IFNγ+874T allele. Stepwise logistic regression analyzis revealed that carriers of

IFNγ+874T allele are protected against BPD (OR[95% CI]: 0.35 [0.12-0.99]) and patent

ductus arteriosus (0.43 [0.19-0.97]), while carriers of IFNγ+874A allele are at higher risk

of severe hypotension (3.40 [1.01-11.52]) and respiratory distress syndrome (4.03 [1.30-

12.50]). Some SNPs were associated with other perinatal complications with an impact

on ventilation and BPD-risk. Carriers of IL-12 GC allele were protected against

pneumonia (0.32 [0.14-0.75]). Carriers of IL-12 CTCTAA allele were at higher risk of

developing necrotizing enterocolitis (2.37 [1.01-5.53]). Examining the ACE I/D and

AT1R A1166C polymorphisms we did not detect any association between ACE and

AT1R genotype and BPD or ventilation characteristics.

According to our results genetic factors may play a role in perinatal lung damage.

Identification of genetic risk factors may establish the possibility of indentifying infants

at high BPD risk and the targeted and individual prevenetion and treatment of the

disease.

88

11. Táblázatok és ábrák jegyzéke

Táblázatok jegyzéke

1. táblázat: A régi és új típusú BPD összehasonlítása

2. táblázat: A BPD definíciója

3. táblázat: A BPD kockázati tényezői

4. táblázat: Az ACE-AT1R vizsgálatba bevont betegek klinikai jellemzői

5. táblázat: A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 meghatározás PCR-RFLP körülményei

6. táblázat: Az IFNγ és IL-12 meghatározás PCR-RFLP körülményei

7. táblázat: Az ACE és AT1R meghatározás PCR-RFLP körülményei

8. táblázat: Az oxigénterápia és a gépi lélegeztetés hosszával szignifikáns összefüggést

mutató paraméterek illetve a stepwise többszörös regressziós vizsgálat eredményei a

TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 vizsgálatban

9. táblázat: Az IFNγ és IL-12 vizsgálat eredményeinek összefoglalása: a vizsgált

genotípusok és a lélegeztetési paraméterek illetve a perinatális szövődmények

kapcsolata.

10. táblázat: ACE I/D polimorfizmus VLBW koraszülöttekben, Kazzi és mtsai. illetve

saját eredményeink összehasonlítása

Ábrák jegyzéke

1. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia röntgen képe

2. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia szövettani képe

3. ábra: Az IFNγ és IL-12 hatása egymás termelődésére

4. ábra: A BPD és kockázati tényezői és genetikai hátterük

5. abra: A PCR-RFLP elve

6. ábra: A TNFα meghatározás PCR-RFLP képe

7. ábra: Primer tervezés az IL-12 polimorfizmus detektálásához

8. ábra: Az IFN-IL12 vizsgálat PCR-RFLP képe

9. ábra: A BPD és kockázati tényezői és genetikai hátterük, saját vizsgálataink helye

89

12. Irodalomjegyzék

1. Kinsella JP, Greenough A, Abman SH. (2006) Bronchopulmonary dysplasia. Lancet,

367(9520): 1421-1431.

2. Christou H, Brodsky D. (2005) Lung injury and bronchopulmonary dysplasia in

newborn infants. J Intensive Care Med, 20(2): 76-87.

3. Jobe AH, Bancalari E. (2001) Bronchopulmonary dysplasia. Am J Respir Crit Care

Med, 163(7): 1723-1729.

4. Jobe AH, Ikegami M. (1998) Mechanisms initiating lung injury in the preterm. Early

Hum Dev, 53(1): 81-94.

5. Maródi L. Gyermekgyógyászat. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2002: 285-314.

6. Nelson WE. Textbook of Pediatrics 17th Edition. Saunders, Philadelphia, 2005: 519-

640, 1466-1467, 1510-1512.

7. Parton LA, Strassberg SS, Qian D, Galvin-Parton PA, Cristea LA. (2006) The genetic

basis for bronchopulmonary dysplasia. Front Biosci, 11: 1854-1860.

8. Hallman M, Haataja R. (2003) Genetic influences and neonatal lung disease. Semin

Neonatol, 8(1): 19-27.

9. Bhandari V, Bizzarro MJ, Shetty A, Zhong X, PageGP, Zhang H, Ment LR, GruenJR

and for the Neonatal Genetics Study Group. (2006) Familial and Genetic Susceptibility

to Major Neonatal Morbidities in Preterm Twins. Pediatrics, 117: 1901-1906.

10. Bhandari V, Gruen JR. (2006) The genetics of Bronchopulmonary Dysplasia. Semin

Perinatol, 30(4): 185-191.

11. Northway WH Jr, Rosan RC, Porter DY. (1967) Pulmonary disease following

respiratory therapy of hyaline membrane disease: bronchopulmonary dysplasia. N Eng J

Med, 276(7): 357-368.

12. Bland RD. (2005) Neonatal chronic lung disease in the post-surfactant era. Biol

Neonate, 88(3): 181-191.

13. Kraybill EN, Runyan DK, Bose CL, Khan JH. (1989) Risk factors for chronic lung

disease in infants with birth weights of 751 to 1000 grams. J Pediatr, 115: 115-120.

14. Dreyfuss D, Saumon G. (1998) Ventilator-induced lung injury: lessons from

experimental studies. Am J Respir Crit Care Med, 157(1): 294-323.

90

15. Avery ME, Tooley WH, Keller JB, Hurd SS, Bryan MH, Cotton RB, et al.. (1987) Is

chronic lung disease in low birth weight infants preventable? A survey of eight centers.

Pediatrics, 79: 26-30.

16. Ehrenkranz RA, Walsh MC, Vohr BR, Jobe AH, Wright LL, Fanaroff AA, Wrage

LA, Poole K; National Institutes of Child Health and Human Development Neonatal

Research Network. (2005) Validation of the National Institutes of Health consensus

definition of bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics, 116(6): 1353-1360.

17. Stenmark KR, Abman SH. (2005) Lung vascular development: implications for the

pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol, 67: 623-661.

18. Zoban P, Cerny M. (2003) Immature lung and acute lung injury. Physiol Res, 52(5):

507-516.

19. Jobe AH. (2005) Antenatal associations with lung maturation and infection. J

Perinatol, 25 Suppl 2: S31-35.

20. Li YH, Tullus K. (2002) Microbial infection and inflammation in the development

of chronic lung disease of prematurity. Microbes Infect, 4(7): 723-732.

21. Speer CP. (2003) Inflammation and bronchopulmonary dysplasia. Semin Neonatol,

8(1): 29-38.

22. Speer CP (2006) Inflammation and bronchopulmonary dysplasia: A continuing

story. Semin Fetal Neonatal Med, 11(5): 354-362.

23. De Dooy JJ, Mahieu LM, Van Bever HP. (2001) The role of inflammation in the

development of chronic lung disease in neonates. Eur J Pediatr, 160(8): 457-463.

24. Dammann O, Leviton A, Gappa M, Dammann CE. (2005) Lung and brain damage

in preterm newborns, and their association with gestational age, prematurity subgroup,

infection/inflammation and long term outcome. BJOG, 112 Suppl 1: 4-9.

25. Asikainen TM, White CW. (2005) Antioxidant defense in the preterm lung: role for

hypoxia-inducible factors in BPD? Toxicology and Applied Pharmacology, 203: 177-

188.

26. Alexander JM, McIntire DM, Leveno KJ. (1999) Chorioamnionitis and the

prognosis for term infants. Obstet Gynecol, 94: 274–278.

27. Andrews WW, Hauth JC, Goldenberg RL. (2000) Infection and preterm birth. Am J

Perinatol, 17: 357-365.

91

28. Bracci R, Buonocore G. (2003) Chorioamnionitis: a risk factor for fetal and neonatal

morbidity. Biol Neonate, 83: 85-96.

29. Arias F, Victoria A, Cho K, Kraus F. (1997) Placental histology and clinical

characteristics of patients with preterm premature rupture of membranes. Obstet

Gynecol, 89: 265-271.

30. Dexter SC, Malee MP, Pinar H, Hogan JW, Carpenter MW, Vohr BR. (1999)

Influence of chorioamnionitis on developmental outcome in very low birth weight

infants. Obstet Gynecol, 94: 267-273.

31. Gomez R, Romero R, Ghezzi F, Yoon BH, Mazor M, Berry SM. (1998) The fetal

inflammatory response syndrome. Am J Obstet Gynecol, 179: 194-202.

32. Chaiworapongsa T, Romero R, Kim JC, Kim YM, Blackwell SC, Yoon BH, Gomez

R. (2002) Evidence for fetal involvement in the pathologic process of clinical

chorioamnionitis. Am J Obstet Gynecol, 186: 1178-1182.

33. Keelan JA, Marvin KW, Sato TA, Coleman M, McCowan LM, Mitchell MD.(1999)

Cytokine abundance in placental tissues: evidence of inflammatory activation in

gestational membranes with term and preterm parturition. Am J Obstet Gynecol, 181:

1530-1536.

34. Keelan JA, Blumenstein M, Helliwell RJ, Sato TA, Marvin KW, Mitchell

MD.(2003) Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta, 24: S33-46.

35. Makhseed M, Raghupathy R, El-Shazly S, Azizieh F, Al-Harmi JA, Al-Azemi MM.

(2003) Pro-inflammatory maternal cytokine profile in preterm delivery. Am J Reprod

Immunol, 49: 308-318.

36. Winkler M. (2003) Role of cytokines and other inflammatory mediators. BJOG,

110: S20: 118-123.

37. Junqueira LC, Zugaib M, Montes GS, Toledo OM, Krisztán RM, Shigihara KM.

(1980) Morphologic and histochemical evidence for the occurrence of collagenolysis

and for the role of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes during cervical dilation.

Am J Obstet Gynecol, 138: 273-281.

38. Saji F, Samejima Y, Kamiura S, Sawai K, Shimoya K, Kimura T. (2000) Cytokine

production in chorioamnionitis. J Reprod Immunol, 47: 185-196.

39. Baggia S, Gravett MG, Witkin SS, Haluska GJ, Novy MJ. (1996) Interleukin-1 beta

intra-amniotic infusion induces tumor necrosis factor-alpha, prostaglandin production,

92

and preterm contractions in pregnant rhesus monkeys. J Soc Gynecol Investig, 3: 121-

126.

40. Romero R, Gomez R, Ghezzi F, Yoon BH, Mazor M, Edwin SS, Berry SM. (1998)

A fetal systemic inflammatory response is followed by the spontaneous onset of preterm

parturition. Am J Obstet Gynecol, 179: 186-193.

41. Bokodi G, Treszl A, Derzbach L, Balogh A, Vasarhelyi B. (2005) The association

of the carrier state of the tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) -308A allele with the

duration of oxygen supplementation in preterm neonates. Eur Cytokine Netw, 16(1): 78-

80.

42. Bokodi G, Derzbach L, Banyasz I, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006) The association

of Interferon-Gamma T+874A and Interleukin-12 p40 promoter CTCTAA/GC

polymorphism with the need for respiratory support and perinatal complications in low

birth weight neonates. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, [Epub ahead of print]

43. Treszl A, Kocsis I, Szathmari M, Schuler A, Heninger E, Tulassay T, Vasarhelyi B.

(2003) Genetic variants of TNF-[FC12]a, IL-1beta, IL-4 receptor [FC12]a-chain, IL-6

and IL-10 genes are not risk factors for sepsis in low-birth-weight infants. Biol Neonate,

83(4): 241-245.

44. Treszl A, Heninger E, Kalman A, Schuler A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2003)

Lower prevalence of IL-4 receptor alpha-chain gene G variant in very-low-birth-weight

infants with necrotizing enterocolitis. J Pediatr Surg, 38(9): 1374-1378.

45. Treszl A, Kocsis I, Szathmari M, Schuler A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2001)

Genetic variants of the tumour necrosis factor-alpha promoter gene do not influence the

development of necrotizing enterocolitis. Acta Paediatr, 90(10): 1182-1185.

46. Treszl A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006) Genetic basis for necrotizing

enterocolitis--risk factors and their relations to genetic polymorphisms. Front Biosci,

11: 570-580. Review.

47. Holmes CL, Russell JA, Walley KR. (2003) Genetic polymorphisms in sepsis and

septic shock: Role in prognosis and potential for therapy. Chest, 124: 1103-1115.

48. Lorenz E, Hallman M, Marttila R, Haataja R, Schwartz DA. (2002) Association

between the Asp299Gly polymorphisms in the Toll-like receptor 4 and premature births

in the Finnish population. Pediatr Res, 52(3): 373-376.

93

49. Szebeni B, Szekeres R, Rusai K, Vannay A, Veres G, Treszl A, Arato A, Tulassay

T, Vasarhelyi B. (2006) Genetic polymorphisms of CD14, toll-like receptor 4, and

caspase-recruitment domain 15 are not associated with necrotizing enterocolitis in very

low birth weight infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 42(1): 27-31.

50. Kazzi SN, Quasney M. (2005) Deletion Allele of Angiotensin-Converting Enzyme

is Associated with Increased Risk and Severity of Bronchopulmonary Dysplasia. J

Pediatr, 147(6): 818-822.

51. Abbas AK, Lichtman AH. Cellular and Molecular Immunology, 5th ed. Saunders,

Elsevier Science, Philadelphia, 2003: 41-125, 241-297.

52. Marodi L. (2001) IL-12 and IFN-gamma deficiencies in human neonates. Pediatr

Res, 49(3): 316.

53. Marodi L. (2002) Down-regulation of Th1 responses in human neonates. Clin Exp

Immunol, 128(1): 1-2.

54. Gasparoni A, Ciardelli L, Avanzini A, Castellazzi AM, Carini R, Rondini G,

Chirico G. (2003) Age-related changes in intracellular TH1/TH2 cytokine production,

immunoproliferative T lymphocyte response and natural killer cell activity in newborns,

children and adults. Biol Neonate, 84(4): 297-303.

55. Jones CA, Warner JO. (1999) Regulating a regulator: IFNgamma production by the

neonate. Clin Exp Allergy, 29(7): 865-868.

56. Watford WT, Moriguchi M, Morinobu A, O’Shea JJ. (2003) The biology of IL-12:

coordinating innate and adaptive immune responses. Cytokine Growth Factor Rev,

14(5): 361-368.

57. Gessani S, Belardelli F. (1998) IFN-gamma expression in macrophages and its

possible biological significance. Cytokine Growth Factor Rev, 9(2): 117-123.

58. Pestka S, Krause CD, Walter MR. (2004) Interferons, interferon-like cytokines, and

their receptors. Immunol Rev, 202: 8-32.

59. Ruiz-Ortega M, Ruperez M, Lorenzo O, Esteban V, Blanco J, Mezzano S, Egido J.

(2002) Angiotensin II regulates the synthesis of proinflammatory cytokines and

chemokines in the kidney. Kidney Int Suppl, 82: 12-22.

60. Guba M, Steinbauer M, Buchner M, Frolich D, Farkas S, Jauch KW, Anthuber M.

(2000) Differential effects of short-term ace-and AT1-receptor inhibition on

postischemic injury and leukocyte adherence in vivo and in vitro. Shock, 13: 190–196.

94

61. Weber B, Borkhardt A, Stoll-Becker S, Reiss I, Gortner L. (2000) Polymorphisms

of surfactant protein A genes and the risk of bronchopulmonary dysplasia in preterm

infants. Turk J Pediatr, 42(3): 181-185.

62. Makri V, Hospes B, Stoll-Becker S, Borkhardt A, Gortner L. (2002) Polymorphisms

of surfactant protein B encoding gene: modifiers of the course of neonatal respiratory

distress syndrome? Eur J Pediatr, 161(11): 604-608. Epub 2002 Sep 13.

63. Rova M, Haataja R, Marttila R, Ollikainen V, Tammela O, Hallman M. (2004) Data

mining and multiparameter analysis of lung surfactant protein genes in

bronchopulmonary dysplasia. Hum Mol Genet, 13(11): 1095-1104. Epub 2004 Apr 21.

64. Lahti M, Marttila R, Hallman M. (2004) Surfactant protein C gene variation in the

Finnish population - association with perinatal respiratory disease. Eur J Hum Genet,

12(4): 312-320.

65. Speer CP. (2001) Newinsights into the pathogenesis of pulmonary inflammation in

preterm infants. Biol Neonate, 79: 205.

66. Kazzi SN, Kim UO, Quasney MW. (2004) Buhimschi I: Polymorphism of tumor

necrosis factor-alpha and risk and severity of bronchopulmonary dysplasia among very

low birth weight infants. Pediatrics, 114(2): e243-248.

67. Adcock K, Hedberg C, Loggins J, Kruger TE, Baier RJ. (2003) The TNF-alpha -

308, MCP-1 -2518 and TGF-beta1 +915 polymorphisms are not associated with the

development of chronic lung disease in very low birth weight infants. Genes Immun,

4(6): 420-426.

68. Derzbach L, Bokodi G, Treszl A, Vasarhelyi B, Nobilis A, Rigo J Jr. (2006)

Selectin polymorphisms and perinatal morbidity in low birth weight infants. Acta

Paediatr, 95(10): 1213-1217.

69. Bokodi G, Derzbach L, Vasarhelyi B. (2006) Re: Deletion allele of angiotensin-

converting enzyme. J Pediatr, 149(4): 579, author reply 579-580.

70. Yanamandra K, Loggins J, Baier RJ. (2004) The Angiotensin Converting Enzyme

Insertion/Deletion polymorphism is not associated with an increased risk of death or

bronchopulmonary dysplasia in ventilated very low birth weight infants. BMC Pediatr,

4(1): 26.

95

71. Manar MH, Brown MR, Gauthier TW, Brown LA. (2004) Association of

glutathione-S-transferase-P1 (GST-P1) polymorphisms with bronchopulmonary

dysplasia. J Perinatol, 24(1): 30-35.

72. Lin HC, Su BH, Lin TW, Hsu CM, Wan L, Tsai CH, Tsai FJ. (2004) No association

of urokinase gene 3'-UTR polymorphism with bronchopulmonary dysplasia for

ventilated preterm infants. Acta Paediatr Taiwan, 45(6): 315-319.

73. Amory JH, Adams KM, Lin MT, Hansen JA, Eschenbach DA, Hitti J. (2004)

Adverse outcomes after preterm labor are associated with tumor necrosis factor-alpha

polymorphism -863, but not -308, in mother-infant pairs. Am J Obstet Gynecol, 191(4):

1362-1367.

74. Simhan HN, Krohn MA, Zeevi A, Daftary A, Harger G, Caritis SN. (2003) Tumor

necrosis factor-alpha promoter gene polymorphism -308 and chorioamnionitis. Obstet

Gynecol, 102: 162-166.

75. Babbage SJ, Arkwright PD, Vince GS, Perrey C, Pravica V, Quenby S, Bates M,

Hutchinson IV. (2001) Cytokine promoter gene polymorphisms and idiopathic recurrent

pregnancy loss. J Reprod Immunol, 51: 21-27.

76. Baxter N, Sumiya M, Cheng S, Erlich H, Regan L, Simons A, Summerfield JA.

(2001) Recurrent miscarriage and variant alleles of mannose binding lectin, tumour

necrosis factor and lymphotoxin alpha genes. Clin Exp Immunol, 126: 529-534.

77. Karhukorpi J, Laitinen T, Karttunen R, Tiilikainen AS. (2001) The functionally

important IL-10 promoter polymorphism (-1082G-->A) is not a major genetic regulator

in recurrent spontaneous abortions. Mol Hum Reprod, 7: 201-203.

78. Reid JG, Simpson NA, Walker RG, Economidou O, Shillito J, Gooi HC, Duffy SR,

Walker JJ. (2001) The carriage of pro-inflammatory cytokine gene polymorphisms in

recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol, 45: 35-40.

79. Daher S, Shulzhenko N, Morgun A, Mattar R, Rampim GF, Camano L, DeLima

MG. (2003) Associations between cytokine gene polymorphisms and recurrent

pregnancy loss. J Reprod Immunol, 58: 69-77.

80. Costeas PA, Koumouli A, Giantsiou-Kyriakou A, Papaloizou A, Koumas L. (2004)

Th2/Th3 cytokine genotypes are associated with pregnancy loss. Hum Immunol, 65:

135-141.

96

81. Hefler LA, Tempfer CB, Bashford MT, Unfried G, Zeillinger R, Schneeberger C,

Koelbl H, Nagele F, Huber JC. (2002) Polymorphisms of the angiotensinogen gene, the

endothelial nitric oxide synthase gene, and the interleukin-1beta gene promoter in

women with idiopathic recurrent miscarriage. Mol Hum Reprod, 8: 95-100.

82. Unfried G, Tempfer C, Schneeberger C, Widmar B, Nagele F, Huber JC. (2001)

Interleukin 1 receptor antagonist polymorphism in women with idiopathic recurrent

miscarriage. Fertil Steril, 75: 683-687.

83. Simhan HN, Krohn MA, Roberts JM, Zeevi A, Caritis SN. (2003) Interleukin-6

promoter -174 polymorphism and spontaneous preterm birth. Am J Obstet Gynecol,

189: 915-918.

84. Hartel Ch, Finas D, Ahrens P, Kattner E, Schaible T, Muller D, Segerer H, Albrecht

K, Moller J, Diedrich K, Gopel W, Genetic Factors in Neonatology Study Group.

(2004) Polymorphisms of genes involved in innate immunity: association with preterm

delivery. Mol Hum Reprod, 10(12): 911-915.

85. Genc MR, Onderdonk AB, Vardhana S, Delaney ML, Norwitz ER, Tuomala RE,

Paraskevas LR, Witkin SS, MAP Study Group. (2004) Polymorphism in intron 2 of the

interleukin-1 receptor antagonist gene, local midtrimester cytokine response to vaginal

flora, and subsequent preterm birth. Am J Obstet Gynecol, 191(4): 1324-1330.

86. Dizon-Townson DS, Major H, Varner M, Ward K. (1997) A promoter mutation that

increases transcription of the tumor necrosis factor-alpha gene is not associated with

preterm delivery. Am J Obstet Gynecol, 177: 810-813.

87. Roberts AK, Monzon-Bordonaba F, Van Deerlin PG, Holder J, Macones GA,

Morgan MA, Strauss JF, Parry S. (1999) Association of polymorphism within the

promoter of the tumor necrosis factor alpha gene with increased risk of preterm

premature rupture of the fetal membranes. Am J Obstet Gynecol, 180: 1297-1302.

88. Annells MF, Hart PH, Mullighan CG, Heatley SL, Robinson JS, Bardy P,

McDonald HM. (2004) Interleukins-1, -4, -6, -10, tumor necrosis factor, transforming

growth factor-beta, FAS, and mannose-binding protein C gene polymorphisms in

Australian women: Risk of preterm birth. Am J Obstet Gynecol, 191(6): 2056-2067.

89. Witkin SS, Vardhana S, Yih M, Doh K, Bongiovanni AM, Gerber S. (2003)

Polymorphism in intron 2 of the fetal interleukin-1 receptor antagonist genotype

influences midtrimester amniotic fluid concentrations of interleukin-1beta and

97

interleukin-1 receptor antagonist and pregnancy outcome. Am J Obstet Gynecol, 189:

1413-1417.

90. Genc MR, Gerber S, Nesin M, Witkin SS. (2002) Polymorphism in the interleukin-1

gene complex and spontaneous preterm delivery. Am J Obstet Gynecol, 187: 157-163.

91. Bessler H, Osovsky M, Sirota L. (2004) Association between IL-1ra gene

polymorphism and premature delivery. Biol Neonate, 85: 179-183.

92. Kalish RB, Vardhana S, Gupta M, Chasen ST, Perni SC, Witkin SS. (2003)

Interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism and multifetal pregnancy

outcome. Am J Obstet Gynecol, 189: 911-914.

93. Kalish RB, Vardhana S, Gupta M, Perni SC, Witkin SS. (2004) Interleukin-4 and -

10 gene polymorphisms and spontaneous preterm birth in multifetal gestations. Am J

Obstet Gynecol, 190: 702-706.

94. Chappell S, Morgan L. (2006) Searching for genetic clues to the causes of pre-

eclampsia. Clin Sci (Lond), 110(4): 443-458.

95. Broughton Pipkin F. (1999) What is the place of genetics int he pathogenesis of pre-

eclampsia. Biol Neonate, 76(6): 325-330.

96. Morrison ER, Miedzybrodzka ZH, Campbell DM, Haites NE, Wilson BJ, Watson

MS, Greaves M, Vickers MA. (2002) Prothrombotic genotypes are not associated with

pre-eclampsia and gestational hypertension: results from a large population-based study

and systematic review. Thromb Haemost, 87(5): 779-785.

97. Fatini C, Sticchi E, Gensini F, Genuardi M, Tondi F, Gensini GF, Riviello C,

Parretti E, Mello G, Abbate R. (2006) Endothelial nitric oxyde synthase gene influences

the risk of pre-eclampsia, the recurrence of negative pregnancy events, and the

maternal-fetal flow. J Hypertens, 24(9): 1823-1829.

98. Banyasz I, Szabo S, Bokodi G, Vannay A, Vasarhelyi B, Szabo A, Tulassay T, Rigo

J Jr. (2006) Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in severe pre-

eclampsia. Mol Hum Reprod, 12(4): 233-236.

99. Park JS, Romero R, Yoon BH, Moon JB, Oh SY, Han SY, Ko EM. (2001) The

relationship between amniotic fluid matrix metalloproteinase-8 and funisitis. Am J

Obstet Gynecol, 185: 1156-1161.

100. Wang H, Parry S, Macones G, Sammel MD, Ferrand PE, Kuivaniemi H, Tromp G,

Halder I, Shriver MD, Romero R, Strauss JF 3rd. (2004) Functionally significant SNP

98

MMP8 promoter haplotypes and preterm premature rupture of membranes (PPROM).

Hum Mol Genet, 13(21): 2659-2669. Epub 2004 Sep 14.

101. Ferrand PE, Parry S, Sammel M, Macones GA, Kuivaniemi H, Romero R, Strauss

JF 3rd. (2002) A polymorphism in the matrix metalloproteinase-9 promoter is

associated with increased risk of preterm premature rupture of membranes in African

Americans. Mol Hum Reprod, 8(5): 494-501.

102. Kalish RB, Vardhana S, Gupta M, Perni SC, Chasen ST, Witkin SS. (2004)

Polymorphisms in the tumor necrosis factor-alpha gene at position -308 and the

inducible 70 kd heat shock protein gene at position +1267 in multifetal pregnancies and

preterm premature rupture of fetal membranes, 191(4): 1368-1374.

103. Whitsett JA, Wert SE, Trapnell BC. (2004) Genetic disorders influencing lung

formation and function at birth. Hum Mol Genet, 13 Spec No 2: R207-215. Review.

104. Balogh A, Treszl A, Vannay A, Vasarhelyi B. (2006) A prevalent functional

polymorphism of insulin-like growth factor system is not associated with perinatal

complications in preterm infants. Pediatrics, 117(2): 591-592.

105. Bányász I, Bokodi G, Vásárhelyi B, Treszl A, Derzbach L, Szabó A, Tulassay T,

Vannay Á. (2006) Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in

perinatal complications. (in press)

106. Cole FS, Hamvas A, Nogee LM. (2001) Genetic disorders of neonatal respiratory

function. Pediatr Res, 50(2): 157-62.

107. Hallman M, Haataja R, Marttila R. (2002) Surfactant proteins and genetic

predisposition to respiratory distress syndrome. Semin Perinatolm, 26(6): 450-460.

108. Kishore U, Bernal AL, Kamran MF, Saxena S, Singh M, Sarma PU, Madan T,

Chakraborty T. (2005) Surfactant proteins SP-A and SP-D in human health and disease

Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 53(5): 399-417.

109. Jeffrey A. Whitsett SE, Wert YX. (2005) Genetic Disorders of Surfactant

Homeostasis Biol Neonate, 87(4): 283-287.

110. Haataja R, Marttila R, Uimari P, Lofgren J, Ramet M, Hallman M. (2001)

Respiratory distress syndrome: evaluation of genetic susceptibility and protection by

transmission disequilibrium test. Hum Genet, 109(3): 351-355.

99

111. Haataja R, Ramet M, Marttila R, Hallman M. (2000) Surfactant proteins A and B

as interactive genetic determinants of neonatal respiratory distress syndrome. Hum Mol

Genet, 9(18): 2751-2760.

112. Marttila R, Haataja R, Ramet M, Lofgren J, Hallman M. (2003) Surfactant protein

B polymorphism and respiratory distress syndrome in premature twins. Hum Genet,

112(1): 18-23. Epub 2002 Oct 10.

113. Fekete A, Treszl A, Toth-Heyn P, Vannay A, Tordai A, Tulassay T, Vasarhelyi B.

(2003) Association between heat shock protein 72 gene polymorphism and acute renal

failure in premature neonates. Pediatr Res, 54(4): 452-455.

114. Ahrens P, Kattner E, Kohler B, Hartel C, Seidenberg J, Segerer H, Moller J, Gopel

W. (2004) Genetic Factors in Neonatology Study Group. Mutations of genes involved

in the innate immune system as predictors of sepsis in very low birth weight infants.

Pediatr Res, 55(4): 652-656.

115. Hedberg CL, Adcock K, Martin J, Loggins J, Kruger TE, Baier RJ. (2004) Tumor

necrosis factor alpha -- 308 polymorphism associated with increased sepsis mortality in

ventilated very low birth weight infants. Pediatr Infect Dis J, 23(5): 424-428.

116. Harding D, Dhamrait S, Millar A, Humphries S, Marlow N, Whitelaw A,

Montgomery H. (2003) Is interleukin-6 -174 genotype associated with the development

of septicemia in preterm infants? Pediatrics, 112(4): 800-803.

117. Baier RJ, Loggins J, Yanamandra K. (2006) IL-10, IL-6 and CD14 polymorphisms

and sepsis outcome in ventilated Very Low Birth Weight infants. BMC Med, 4(1): 10.

118. Nobilis A, Szabo M, Kocsis I, Sulyok E, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006)

Angiotensin-converting enzyme DD genotype is preventive against circulatory failure in

very-low-birthweight neonates. Acta Paediatr, 95(6): 747-750.

119. Harding D, Dhamrait S, Marlow N, Whitelaw A, Gupta S, Humphries S,

Montgomery H. (2003) Angiotensin-converting enzyme DD genotype is associated with

worse perinatal cardiorespiratory adaptation in preterm infants. J Pediatr, 143: 746-749.

120. Heninger E, Treszl A, Kocsis I, Derfalvi B, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2002)

Genetic variants of the interleukin-18 promoter region (-607) influence the course of

necrotising enterocolitis in very low birth weight neonates. Eur J Pediatr, 161(7): 410-

411.

100

121. Derzbach L, Treszl A, Balogh A, Vasarhelyi B, Tulassay T, Rigo J J. (2005)

Gender dependent association between perinatal morbidity and estrogen receptor-alpha

Pvull polymorphism. J Perinat Med, 33(5): 461-462.

122. Treszl A, Szabó M, Dunai Gy, Nobilis A, Machay T, Tulassay T, Vásárhelyi B.

(2003) Angiotensin II type 1 receptor A1166C polymorphism and prophylactic

indomethacin treatment induced ductus arteriosus (DA) closure in very low birth weight

neonates. Ped Res, 54: 753-755.

123. Baier RJ. (2006) Genetics of perinatal brain injury in the preterm infant. Front

Biosci, 11: 1371-1387.

124. Hitti J, Krohn MA, Patton DL, Tarczy-Hornoch P, Hillier SL, Cassen EM,

Eschenbach DA. (1997) Amnionic fluid tumor necrosis factor-alpha and the risk of

respiratory distress syndrome among preterm infants. Am J Obstet Gynecol, 177: 50-56.

125. Yende S, Quasney MW, Tolley E, Zhang Q, Wunderink RG. (2003) Association of

tumor necrosis factor gene polymorphisms and prolonged mechanical ventilation after

coronary artery bypass surgery. Crit Care Med. 31: 133.

126. Dinarello CA. (1994) The biological properties of interleukin-1. Eur Cytokine

Netw, 5(6): 517-531.

127. Dinarello CA. (2002) The IL-1 family and inflammatory diseases. Clin Exp

Rheumatol, 20(5 Suppl 27): S1-13.

128. Moos V, Rudwaleit M, Herzog V, Hohlig K, Sieper J, Muller B. (2000)

Association of genotypes affecting the expression of interleukin-1beta or interleukin-1

receptor antagonist with osteoartritisz. Artritisz Rheum, 43(11): 2417-2422.

129. Luheshi GN. (1998) Cytokines and fever. Mechanisms and sites of action. Ann N

Y Acad Sci, 856: 83-89.

130. Romagnoli C, Frezza S, Cingolani A, De Luca A, Puopolo M, De Carolis MP,

Vento G, Antinori A, Tortorolo G. (2001) Plasma levels of interleukin-6 and

interleukin-10 in preterm neonates evaluated for sepsis. Eur J Pediatr, 160(6): 345-350.

131. Morecroft JA, Spitz L, Hamilton PA, Holmes SJ. (1994) Plasma interleukin-6 and

tumour necrosis factor levels as predictors of disease severity and outcome in

necrotizing enterokolitis. J Pediatr Surg, 29(6): 798-800.

101

132. Yoon BH, Romero R, Kim KS, Park JS, Ki SH, Kim BI, Jun JK. (1999) A

systemic fetal inflammatory response and the development of bronchopulmonary

dysplasia. Am J Obstet Gynecol, 181(4): 773-779.

133. Kotecha S, Wilson L, Wangoo A, Silverman M, Shaw RJ. (1996) Increase in

interleukin (IL)-1 beta and IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid obtained from infants

with chronic lung disease of prematurity. Pediatr Res, 40(2): 250-256.

134. Bazrafshani MR, Ollier WE, Hajeer AH. (2000) A novel PCR-RFLP assay for the

detection of the single nucleotide polymorphism at position -1082 in the human IL-10

gene promoter. Eur J Immunogenet, 27(3): 119-120.

135. Huang D, Cancilla MR, Morahan G. (2000) Complete primary structure,

chromosomal localisation, and definition of polymorphisms of the gene encoding the

human interleukin-12 p40 subunit. Genes Immun, 1(8): 515-520.

136. Morahan G, Huang D, Wu M, Holt BJ, White GP, Kendall GE, Sly PD, Holt PG.

(2002) Association of IL12B promoter polymorphism with severity of atopic and non-

atopic asthma in children. Lancet, 360(9331): 455-459. Erratum in: Lancet 2002;

360(9348): 1892.

137. Morahan G, Boutlis CS, Huang D, Pain A, Saunders JR, Hobbs MR, Granger DL,

Weinberg JB, Peshu N, Mwaikambo ED, Marsh K, Roberts DJ, Anstey NM. (2002) A

promoter polymorphism in the gene encoding interleukin-12 p40 (IL12B) is associated

with mortality from cerebral malaria and with reduced nitric oxide production. Genes

Immun, 3(7): 414-418.

138. Pravica V, Perrey C, Stevens A, Lee JH, Hutchinson IV. (2000) A single

nucleotide polymorphism in the first intron of the human IFN-gamma gene: absolute

correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-gamma

production. Hum Immunol, 61(9): 863-866.

139. Warle MC, Farhan A, Metselaar HJ, Hop WC, Perrey C, Zondervan PE, Kap M,

Kwekkeboom J, Ijzermans JN, Tilanus HW, Pravica V, Hutchinson IV, Bouma GJ.

(2003) Are cytokine gene polymorphisms related to in vitro cytokine production

profiles? Liver Transpl, 9(2): 170-181.

140. Agerholm-Larsen B, Tybjserg-Hansen A, Schnohr P, Nordestgaard BG. (1999)

ACE gene polymorphism explains 30-40% of variability in serum ACE activity in both

102

women and men in the population at large: the Copenhagen City Heart Study.

Atherosclerosis, 147: 425-427.

141. Baudin B. (2002) Angiotensin II receptor polymorphisms in hypertension.

Pharmacogenomic considerations. Pharmacogenomics, 3(1): 65-73.

142. Committee on Fetus and Newborn. (2002) Postnatal corticosteroids to treat or

prevent chronic lung disease in preterm infants Pediatrics, 109: 330.

143. Rojas MA, Gonzalez A, Bancalari E, Claure N, Poole C, Silva-Neto G. (1995)

Changing trends in the epidemiology and pathogenesis of neonatal chronic lung disease.

J Pediatr, 126: 605.

144. D'Angio CT, Basavegowda K, Avissar NE, Finkelstein JN, Sinkin RA. (2002)

Comparison of tracheal aspirate and bronchoalveolar lavage specimens from premature

infants. Biol Neonate, 82: 145.

145. Warle MC, Farhan A, Metselaar HJ, et al..(2003) Are cytokine gene

polymorphisms related to in vitro cytokine production profiles? Liver Transpl, 9(2):

170-181.

146. Prigoshin N, Tambutti M, Larriba J, Gogorza S, Testa R. (2004) Cytokine gene

polymorphisms in recurrent pregnancy loss of unknown cause. Am J Reprod Immunol,

52(1): 36-41.

147. Daher S, de Arruda Geraldes Denardi K, Blotta MH, Mamoni RL, Reck AP,

Camano L, Mattar R. (2004) Cytokines in recurrent pregnancy loss. J Reprod Immunol,

62(1-2): 151-157.

148. Morahan G, Huang D, Ymer SI,, Cancilla MR, Stephen K, Dabadghao P, Werther

G, Tait BD, Harrison LC, Colman PG. (2001) Linkage disequilibrium of a type 1

diabetes susceptibility locus with a regulatory IL12B allele. Nat Genet, 27(2): 218-221.

Erratum in: Nat Genet, 27(3): 346.

149. Bont L, Heijnen CJ, Kavelaars A, van Aalderen WM, Brus F, Draaisma JM,

Pekelharing-Berghuis M, van Diemen-Steenvoorde RA, Kimpen JL. (2001) Local

interferon-gamma levels during respiratory syncytial virus lower respiratory tract

infection are associated with disease severity. J Infect Dis, 184(3): 355-358.

150. Bont L, Heijnen CJ, Kavelaars A, van Aalderen WM, Brus F, Draaisma JT, Geelen

SM, van Vught HJ, Kimpen JL. (1999) Peripheral blood cytokine responses and disease

severity in respiratory syncytial virus bronchiolitis. Eur Respir J, 14(1): 144-149.

103

151. Suzuki N, Chen NJ, Millar DG, Suzuki S, Horacek T, Hera H, Bouchard D,

Nakanishi K, Penninger JM, Ohashi PS, Yeh WC. (2003) IL-1 receptor-associated

kinase 4 is essential for IL-18-mediated NK and Th1 cell responses. J Immunol, 170(8):

4031-4035.

152. Bourbon J, Boucherat O, Chailley-Heu B,. Delacourt C. (2005) Control

mechanisms of lung alveolar development and their disorders in bronchopulmonary

dysplasia. Pediatr Res, 57(5 Pt 2): 38R-46R.

153. Ng PC, Li K, Wong RP, Chui K, Wong E, Li G, Fok TF. (2003) Proinflammatory

and anti-inflammatory cytokine responses in preterm infants with systemic infections.

Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 88(3): F209-213.

154. Hodge G, Hodge S, Haslam R, McPhee A, Sepulveda H, Morgan E, Nicholson I,

Zola H. (2004) Rapid simultaneous measurement of multiple cytokines using 100

microl sample volumes--association with neonatal sepsis. Clin Exp Immunol, 137(2):

402-407.

155. Hanna N, Bonifacio L, Reddy P, Hanna I, Weinberger B, Murphy S, Laskin D,

Sharma S. (2004) IFN-gamma-mediated inhibition of COX-2 expression in the placenta

from term and preterm labor pregnancies. Am J Reprod Immunol, 51(4):311-318.

156. Stamp LK, James MJ, Cleland LG. (2004) Paracrine upregulation of monocyte

cyclooxygenase-2 by mediators produced by T lymphocytes: role of interleukin 17 and

interferon-gamma. J Rheumatol, 31(7): 1255-1264.

157. Fraser J, Walls M, McGuire W. (2004) Respiratory complications of preterm birth.

BMJ, 329(7472): 962-965.

158. Norwood VF, Fernandez LG, Tufro A, Gomez RA. Development of the renin-

angiotensin system. In: Polin RA, Fox WW, Amban SH, (eds.) Fetal and neonatal

physiology. 3rd ed. Saunders, Philadelphia, 2004: 1249-1255.

104

13. Saját publikációk jegyzéke

Disszertációhoz kapcsolódó közlemények

Bokodi G, Treszl A, Derzbach L, Balogh A, Vasarhelyi B.

The association of the carrier state of the tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) -308A

allele with the duration of oxygen supplementation in preterm neonates.

Eur Cytokine Netw. 2005 Jan-Mar;16(1):78-80. (IF: 1,073)

Bokodi G, Derzbach L, Banyasz I, Tulassay T, Vasarhelyi B.

The association of Interferon-Gamma T+874A and Interleukin-12 p40 promoter

ctctaa/gc polymorphism with the need for respiratory support and perinatal

complications in low birth weight neonates.

Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2007 Jan; 92(1):F25-29. (IF: 0,0)

Bokodi G, Derzbach L, Vasarhelyi B.

Re: Deletion allele of angiotensin-converting enzyme.

J Pediatr. 2006 Oct;149(4):579. (IF: 0,0)

Banyasz I, Bokodi G, Vannay Á, Szebeni B, Treszl A, Vásárhelyi B, Tulassay T, Szabó

A.

Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor and angiopoietin2 in

retinopathy of prematurity

Curr Eye Res. 2006 Jul-Aug;31(7-8):685-90. (IF: 1,116)

Derzbach L, Bokodi G, Treszl A, Vasarhelyi B, Nobilis A, Rigo J Jr.

Selectin polymorphisms and perinatal morbidity in low birth weight infants

Acta Paediatr 2006 Oct;95(10):1213-7. (IF: 1,277)

Bányász I, Bokodi G, Vásárhelyi B, Treszl A, Derzbach L, Szabó A, Tulassay T,

Vannay Á.

Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in perinatal complications

105

Eur Cytokine Netw. (in press). (IF: 1,073)

Disszertációtól független közlemények

Banyasz I, Szabo S, Bokodi G, Vannay A, Vasarhelyi B, Szabo A, Tulassay T, Rigo J

Jr.

Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in severe pre-eclampsia.

Mol Hum Reprod. 2006 Apr;12(4):233-236. Epub 2006 Mar 3. (IF: 3,191)

Derzbach L, Balogh A, Bokodi G, Vásárhelyi B, Rigo J Jr.

The Ser1238Arg E-selectin and Thr715Pro P-selectin polymorphisms and severe

preeclampsia

J Reprod Med (in press). (IF: 0,835)

Derzbach L, Treszl A, Bokodi G , Vasarhelyi B.

Estrogen receptor polymorphism and retinopathy of prematurity. E-letter to the editor

Invest Ophthalmol Vis Sci 2006 May 24. (IF: 3,643)

Szebeni B, Dezsőfi A, Veres G, Rusai K, Vannay Á, Bokodi G, Arató A.

Toll-szerű receptor 2 (TLR2-), TLR3- és TLR4-expresszió cöliákiás gyermekek

vékonybélnyálkahártyájában.

Gyermekgyógyászat 2006;57(3):299-306. (IF: 0,0)

106

14. Köszönetnyilvánítás

Mindenek előtt köszönetet szeretnék mondani Tulassay Tivadar professzor úrnak, az

MTA levelező tagjának, a Semmelweis Egyetem rektorának, az I. sz.

Gyermekgyógyászati Klinika igazgatójának, aki létrehozta azt a szellemi alkotó

műhelyt, ahol az elmúlt két évben nappali tagozatos, ösztöndíjas PhD hallgatóként

dolgozhattam. Ebben a környezetben lehetőségem volt elsajátítani a kutatásban

nélkülözhetetlen problémaorientált látásmódot és kérdésfelvetést. Bekapcsolódhattam

olyan korszerű műszerek és eszközök használatába, amelyek lehetővé tették az orvosi

kutatások nemzetközi szintű művelését.

Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Vásárhelyi Barna tudományos főmunkatársnak,

az I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Kutató Laboratóriumának vezetőjének, aki kutató

munkám során végig mellettem állt. Inspiráló kérdésfeltevésével, ötleteivel hatékonyan

vezette végig kutatásainkat. Már TDK hallgatóként bekapcsolódhattam az Intézetben

folyó tudományos munkába, később önálló kutatási feladatokkal látott el. Segítségével

tanultam meg a tudományos gondolkodás, kérdésfelvetés, adatelemzés és kiértékelés

módszereit.

Köszönetet szeretnék mondani Treszl Andrásnak, aki elkezdte a koraszülöttekkel

kapcsolatos vizsgálatokat, számos klinikai adatot és genetikai vizsgálati eredményt

gyűjtött össze fáradságos munkával. Munkám során mindig segítségemre volt a

statisztikai számítások során felmerülő problémák megoldásában, a cikkíráshoz

szükséges angol nyelvi fordulatok megalkotásában.

Köszönetet szeretnék mondani a laborban dolgozó főállású kutatóknak: Vannay Ádám

tudományos munkatársnak és Kozma Gergely Tibor tudományos segésmunkatársnak,

akikre mindig számíthattam a munkám során felmerülő technikai problémák

megoldásában. Nagyon jól összefogták a PhD hallgatók közösségét, megtanították a

szakmai kooperáció jelentőségét.

Köszönöm a labor valamennyi PhD hallgatójának: Bányász Ilonának, Rusai

Krisztinának, Szebeni Beátának és Balogh Ádámnak, hogy munkám során mindig

számíthattam baráti segítségükre, támogatásukra. Külön kiemelném Derzbach Lászlót,

aki sokáig állt mellettem közös kutatómunkánk során, számos ötletet adott az

107

irodalmazáshoz, és mindig segített kitartani, mikor a felmerülő nehézségek miatt az én

türelmem már elfogyott.

Köszönettel tartozom Bernáth Mária vezető asszisztensnek, aki észrevétlenül mindig

megteremtette a labor hatékony működéséhez szükséges tárgyi feltételeket, és aki nélkül

a vizsgálatok során felmerülő technikai nehézségeket nem sikerült volna legyőzni.

Köszönet illeti Somoskői Zsuzsanna központi gyakornokot, akivel együtt kezdtünk a

laborban TDK tevékenységünket, együtt gyűjtöttük be a klinikai adatokat, és együtt

indultunk el a kutatás ösvényén. Ő később, bár nem lett kutató, gyakorló

gyermekgyógyászként, klinikai szemléletű észrevételeivel mindig segítette

kutatásaimat.

A kutatócsoport a Semmelweis Egyetem I.sz. Gyermek Klinikájának részeként szoros

együttműködésben dolgozott a klinikusokkal. A heti rendszerességgel tartott

tudományos referálókon a klinikusoktól kapott gyakorlati ötletek segítettek bennünket a

kutatások továbbvitelében, gyakorlati jelentőségű kérdések megfogalmazásában,

eredményeink klinikai értelmezésében. Köszönöm Körner Anna, Fekete Andrea, Szabó

Miklós, Reusz György, Arató András, Szabó András, és Szabó Attila segítségét.

A sikeres vizsgálatokhoz más intézetekkel is szoros együttműködésre volt szükség.

Köszönöm Nobilis Andrásnak és munkatársainak, hogy lehetővé tették a koraszülött és

újszülött betegek bevonását vizsgálatainkba, és mindig segítettek a klinikummal

kapcsolatos kérdéseink megválaszolásában. Köszönet illeti a Budai Gyermekkórház

Anyagcsere Szűrő központjának munkatársait, akik lehetővé tették a PKU szűrésből

visszamaradt vérminták megszerzését.