1

BYM613 BYM613

Genetik MGenetik Müühendislihendisliğğii

Hacettepe Hacettepe ÜÜniversitesiniversitesi

BiyomBiyomüühendislik Bhendislik Bööllüümmüü

20122012--2013 G2013 Güüz Dz Dööneminemi

Dr. Eda Dr. Eda ÇÇelikelik--AKDURAKDUR

edacelik@hacettepe.edu.tredacelik@hacettepe.edu.tr

Rekombinant DNA Teknolojisi-II

22

İİççerik (2 hafta)erik (2 hafta)

• Rekombinant DNA teknolojisi

• Tanımlar ve temel basamakları

• Restriksiyon ve Ligaz Enzimleri

• Vektörler

• Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

• Klonlanmış DNA analizi

• DNA Sekans Analizi

• Restriksiyon Analizi

• Rekombinant teknolojinin uygulamaları

• Gen Kütüphaneleri

2

33

13 Kas13 Kasıım im iççin in Sunum Sunum

KonularKonularıınnıızz

Burcu GüvenDNA jel elektroforezi, RE ile kesme18

OlguP1 transdüksiyon yöntemi ile gen silinmesi5

CemDerse hiç gelmedi ???19

�ulePCR için oligonükleotid (primer) tasarımı17

Gökçe KaynakFloresansla etkinleşmiş hücre tasnifleyicisi (FACS)16

Burcu SDNA tamir mekanizmaları15

GamzeMoleküler Tanımlama14

İlkayDNA saklama koşulları ve miktar belirleme13

GöksuPCR optimizasyonu ve PCR çeşitleri12

MerveTotal RNA izolasyonu11

ArazDNA saflaştırma10

Hande

Kimyasal uygulama ve elektroporasyon ile bakterilerde transformasyon, Transformasyon için Yetkin Hücrelerin (Bakteri) Hazırlanması9

NurşenDNA mikrodizinleme (Microarray)8

BakiyeNorthern Blotting7

GökçeSouthern Blotting6

HandanTranspozonların DNA manipülasyonlarında

kullanımı4

ZeynepDNA modifying enzymes/DNA binding proteins 3

EbruHomolog Rekombinasyon Yöntemi ile gen

aktarımı2

Dicle

Burası için web sayfasında bilgi olacak

Bölgesel Yönlendirilmiş Mutasyon (Site-Directed Mutagenesis)1

Sunacak KişiÖrnek Ref (lar)/

NotlarBaşlık#

* Max 8 dk, 10 slide

* Rapor yok

* Slide’lar bana email, 12 Kasım, 17:00 SON.

* Referanslara dikkat, en sonda değil, slide içinde !

* Final için 3 sınav sorusu ve cevabı da email.

* 2012 basımı 1 makaleden örnek.

* Sınıf sizi değerlendirecek, soru soracak.

* 1. Ara sınav yerine sayılacak

44

MolekMoleküüler Klonlama (Gen Klonlama)ler Klonlama (Gen Klonlama)

�ekildeki “DNA parçası”bir gen ise, “gen klonlama”

Seçilen koloniler çoğaltılır ve gerçek rekombinant klonlar mı diye analiz edilir.

3

55

66

4

77

Control Control

88

Dikkat: Gen isimleri, organizmaların isimleri ve RE’lerinin organizmayıtanımlayan kısımları italik yazılır !!

5

99

Determine production target

↓

Recombinant microorganism

development

↓

Structural analysis of the

purified r-product

↓

Medium design and optimization of

bioprocess design parameters

↓

Pilot-scale production

↓

Stoichiometric and kinetic modeling

of the bioprocess

Akım �eması: Doktora çalışmalarımda izlediğim yol.

Diğer sonuçlar, ilerleyen derslerde…

1010

Fig. Pearson Education Inc., 2009

Restriksiyon AnaliziRestriksiyon Analizi

Klonlardan saflaştırılan plazmid, rekombinant plazmidin oluşturulmasıaşamasında kullanılan RE ile tekrar kesilip, istenilen DNA parçasınıiçerip içermediği kontrol edilebilir.

6

1111Fig. Pearson Education Inc., 2009

1212

Sanger Metodu ile DNA Sekans AnaliziSanger Metodu ile DNA Sekans Analizi

� 1977: Sanger DNA sekans tespiti için metot geliştirdi.

� Sanger metodu halen kullanılan DNA sekans analizlerinin temelidir.

� Dideoksinükleotit (ddNTP)’lerin zincir sonlandırma özelliğine dayanır.

Fig. Pearson Education Inc., 2009 Ref: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2008.

7

1313Figure 13.26

1414

Polyacrylamide gel electrophoresis is used to Polyacrylamide gel electrophoresis is used to

visualize the results of the sequencing reactionvisualize the results of the sequencing reaction

8

1515Figure 13.28

Günümüzde floresan ddNTP’ler kullanılıyor.

1616

Floresan boyalar sayesinde otomatik DNA sekanslama

9

1717

4 reaksiyon ayn4 reaksiyon aynıı ttüüpte gerpte gerççekleekleşşebiliyor, ebiliyor, 1 primer ile ~900 b1 primer ile ~900 bçç okunabiliyorokunabiliyor

1818

* Ape

* BioEdit

- DNAStar gibi programlar ile sekanslar karşılaştırılır. “sequence alignment”

www.codoncode.com

10

1919

NCBI BLASTNCBI BLAST

2020

11

2121

2222

NCBI Databases

12

2323

2424

13

2525

2626

14

2727

Genomik Kütüphaneler

• Bir genomik kütüphane genomdaki tüm

dizilerden en az bir kopya içerir.

• DNA izolasyonu

• RE ile muamele

• Uygun vektörün seçilmesi

Fig. modified from: Pierce, B. Genetics: A Conceptual Approach.

2828

Genomik Kütüphanelerin Boyutu

Örneğin “xx genomu kapsayan genomik kütüphane boyu ~109 koloni” ise, transformasyon sonucu elde edilmesi gereken koloni sayısı 109 dur. Bu sayıyı elde etmek için, transformasyon tekniği ve kompetant hücrelerin durumu önem taşır.

15

2929

cDNA Kütüphaneleri

• mRNA üzerinden reverse transcriptase ile cDNA sentezi

• Spesifik bir anda transcripsiyonu gerçekleşen genleri temsil

eder.

• Sentezlenen cDNA’nın her iki ucuna bir RE tanıma dizisini

içeren kısa çift zincirli DNA takılıp klonlanması

• cDNA kütüphaneleri hücre/doku spesifik olarak hazırlanır

3030Fig. Pearson Education Inc., 2009

16

3131Fig. Pearson Education Inc., 2009

Kütüphanelerin taranmasıiçin kullanılan yöntemlerden bir tanesi “Plak Hibridizasyonu”Yöntemidir.