Genética e Biologia Molecular - midia.atp.usp.br · RedeFor 48 Genética e BioloGia Molecular A Linha do Tempo do DNA 1865 O tcheco Gregor Mendel publica sobre experimen-tos com

Gentica e Biologia Molecular

DNA: a receita da vida e seu cdigo5

Roteiro da semana Estrutura e Organizao do Genoma Histria da descoberta do modelo Duplicao semiconservativa A replicao de DNA requer DNA pr-existente Desnaturao e renaturao do DNA O gene Mutaes: alteraes nos genes

O DNA a principal molcula da vida, pois carrega em sua estrutura a informao hereditria que determina a estrutura das protenas e as regras que direcionam o cresci-mento, a diviso e a diferenciao celulares. A composio qumica e a organizao do DNA permitem um nmero infinito de combinaes, o que pode ser percebido nas vrias informaes hereditrias que ele transmite. O DNA a base do processo evolutivo,

Uma vez aceito que o DNA o portador da informao gentica, os esforos concen-traram-se em decifrar a estrutura da molcula de DNA e os mecanismos pelos quais a informao nele armazenada expressa para produzir uma caracterstica ou fentipo.

Veja como se faz uma extrao de DNA.
http://genoma.ib.usp.br/educacao/Extracao_DNA_Morango_web.pdf

RedeFor

Gentica e BioloGia Molecular48

A Linha do Tempo do DNA

1865 O tcheco Gregor Mendel publica sobre experimen-tos com ervilhas, surtindo as leis de Mendel (leis da hereditariedade).

1869 O suo Friedrich Miescher isola o cido desoxirribonucleico (DNA).1882 O alemo Walter Flemming descobre os cromossomos dentro do ncleo celular.1902 O americano Walter Sutton e o alemo Theodor Boveri concluem que a hereditariedade se encon-

tra nos cromossomos.1909 O dinamarqus Wilhelm Johannsen cria os termos gene (unidade Mendeliana de hereditarie-

dade), gentipo e fentipo relacionando as caractersticas genticas de uma pessoa com sua aparncia externa.

1911 Thomas Hunt Morgan descreve que os cromossomos carregam os genes. 1912-1927 Ocorrem grandes avanos dos estudos das estruturas do DNA atravs da difrao de raios-X.1931 O russo Phoebus Aoran Levenei identifica os componentes bsicos dos cidos nucleicos. Os termos

DNA e RNA se tornam bem divulgados.1944 O austraco Erwin Schrodinger publica o livro O que a vida.1949 O austraco Erwin Chargaff fala sobre as relaes quantitativas entre as bases que compem o DNA.1950 a americana Barbara McClintock, com base em anlises feitas em milho, prope a existncia de

genes saltadores (transposons). Os americanos Linus Pauling e Robert Corey, aps identificar as estruturas das protenas, propem uma estrutura equivocada do DNA, o modelo da tripla hlice.

1952 A britnica Rosalind Franklin obtm importantes imagens do DNA por difrao de raios-X.1953 O americano James Watson e o britnico Francis Crick propem a estrutura de dupla hlice para o DNA.1955 Joe Hin Tijo define em 46 o nmero dos cromossomos humanos.1958 Matthew Meselson e Franklin Stahl demonstram a replicao semiconservativa do DNA.1960 O americano Arthur Kornberg identifica a polimerase, uma enxima que catalisa a sntese do DNA, e

j se fala sobre engenharia gentica.1961 Vrios cientistas descobrem que o RNA mensageiro o que leva as informaes genticas para a

produo de protenas. 1966 Vrios grupos de pesquisa decifram a srie completa de palavras do cdigo gentico.1976 criada uma companhia de engenharia gentica e comercializada a insulina humana.1980 Tcnicas importantes para o projeto do genoma humano so desenvolvidas.1982 O primeiro animal transgnico obtido nos Estados Unidos. 1983 Mapeado o primeiro gene para doena gentica humana, a sntrome de Huntington.1985 O britnico Alec Jeffreys publica uma tcnica importante para a elucidao de crimes, a Impresso

Digital por DNA. Surge o PCR (reao em cadeia) para a obteno de cpias de segmentos espec-ficos de DNA.

1986 Primeiro gene identificado por clonagem posicional, a Distrofia Muscular de Duchenne.1990 iniciado o plano de sequenciamento do genoma humano, pelo departamento de Energia e Insti-

tuto Nacional de Sade dos EUA.1995 obtida a primeira sequencia completa de DNA em um organismo de vida livre, a bactria Hemo-

philus influenzae.1996 Nasce a famosa ovelha Dolly clonada a partir de um animal adulto.2000 Um consrcio pblico do Projeto Genoma Humano divulga o rascunho do genoma humano. No

Brasil, anunciado o sequenciamento do genoma da bactria Xyrella Fastidiosa.2003 Finalizao do sequenciamento do genoma humano. Morre Dolly por envelhecimento precoce.

Estrutura do DNA O DNA uma longa macromolcula, semelhante a uma escada que se espiraliza para

formar uma hlice dupla. Cada fita da hlice um polmero linear composto de unidades cha-madas nucleotdeos. Cada nucleotdeo composto por um acar (desoxirribose no DNA e ribose no RNA), um grupo fosfato e uma base nitrogenada. No DNA, h quatro nucleotdeos diferentes dependendo da base nitrogenada presente: Adenina (A), Guanina (G), Timina (T) e Citosina (C). Essas quatro bases em milhares de combinaes sequenciais especificam a sequ-ncia de aminocidos das protenas. A molcula do DNA tem duas cadeias acar-fosfato,

Clique no cone ao lado para interagir com a linha do tempo

do DNA. Obs.: aps o trmino da linha do tempo, clique nas datas para ver o evento correspondente.

RedeFor

49semana 5 DNA: a receita da vida e seu cdigo

que so mantidas juntas por pontes de hidrognio formadas entre as bases nitrogenadas com-plementares: duas pontes de hidrognio entre A=T e trs pontes entre GC.

A relao de complementaridade entre adenina e timina e entre guanina e citosina essencial para a funo gnica, servindo como base tanto para a duplicao do DNA quanto para a expresso gnica. Durante ambos os processos, as fitas de DNA servem como moldes para a sntese de molculas complementares. Assim, para qualquer seg-mento de DNA, devido ao pareamento especfico entre as bases, se a sequncia de uma cadeia for conhecida, a sequncia da outra tambm o ser.

Fig. 5.1 Estrutura do DNA

Clique no cone ao lado para ver a animao sobre a estru-

tura do DNA.

RedeFor


Organizao do DNA O DNA associado a protenas (cromossomos) encontra-se dentro do ncleo celular nas

clulas eucariticas. Na clula, a estrutura de cada cromossomo altamente organizada. Mesmo no ncleo

interfsico, a hlice dupla de DNA, de 2 nm, est sujeita a pelo menos dois nveis de enro-lamento. O nucleossomo a unidade fundamental de empacotamento e consiste de um ncleo de oito histonas, protenas bsicas pequenas altamente conservadas, com 103 a 135 aminocidos. O cerne formado por duas molculas de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4, e, ao redor dele, um segmento de 146 pb de DNA fita dupla se enrola em 1,75 volta. Os nucleossomos adjacentes so unidos por um DNA espaador curto. A aparncia desta estrutura em microscopia eletrnica de um colar de contas.

A estrutura em colar de contas, com cerca de 11 nm de dimetro, espiraliza-se for-mando um filamento de cromatina com 30 nm de espessura denominado solenide ou fibra cromossmica. Esta solenide forma vrias alas ao se associar a um esqueleto de protenas cidas que sustenta o cromossomo; este nvel de organizao tem cerca de 300 nm de espessura e constitui o cromonema (filamento cromossmico na interfase). Durante a diviso celular, esse filamento cromossmico enrola-se ainda mais chegando a atingir 700 nm de espessura em cada cromtide no cromossomo metafsico.

A transcrio s possvel quando o cromossomo est no nvel de organizao colar de contas ou DNA livre.

Fig. 5.2 a) Organizao da Cromatina b) Estrutura dos cromossomos humanos

RedeFor


Durante a diviso celular, os cromossomos se tornam cada vez mais condensados, che-gando ao nvel de 1:10000 de seu comprimento quando em completo relaxamento. As alas do filamento de cromatina de 30 nm, contendo 20 a 100 kb de DNA por ala, esto ligadas a uma haste central. Esta consiste de protenas no-histonas, cidas.

Fig. 5.3 Nveis de compactao dos cromossomos

RedeFor


Grande parte da cromatina localizada na periferia do ncleo, possivelmente pelo fato de que uma das principais protenas associadas com a heterocromatina se liga a uma protena da membrana nuclear interna.

Conhecem-se dois tipos de cromatina (Fig. 5.4): Eucromatina, que consiste em DNA ativo, ou seja, que se pode expressar como

protenas e enzimas. Heterocromatina, que consiste em DNA inativo e que parece ter funes estrutu-

rais durante o ciclo celular. Heterocromatina constitutiva, que nunca se expressa como protenas

e que se encontra localizada volta do centrmero (contm geralmente sequncias repetitivas).

Heterocromatina facultativa, que, por vezes, transcrita em outros tipos celulares; consequentemente, a sua quantidade varia dependendo da ativida-de transcricional da clula. Apresenta-se condensada na interfase.

Tipos de DNA

45% - DNA de Cpia nica (5% Codifica para Protenas): presente uma nica ou poucas vezes no genoma.

55% - DNA Repetitivo : Sequncias que aparecem de modo repetido (milhares de vezes) no genoma: DNA Repetitivo Disperso (45%) - tende a estar espalhada individualmente por todo o genoma. No ocor-

re em tandem. As formas mais comuns so os Elementos Intercalares curtos (SINEs) e Longos (LINEs). DNA satlite (10%): so sequncias formadas por unidades de nucleotdeos repetidas em tandem (na sequ-

ncia), agrupadas em certas regies do cromossomos. Estas sequncias geralmente no so transcritas. Existem vrias categorias de DNA satlite e alguns destes tipos formam os centrmeros e heterocromatina.

RNAO RNA, outro cido nucleico, quimicamente similar ao DNA, mas geralmente

composto por uma nica fita. Diferentemente do DNA, contm como acar uma ribose e a base nitrogenada uracila, em lugar da timina, nos seus nucleotdeos. O RNA pode formar estruturas complementares com uma fita de DNA.

Fig. 5.4 Maquinaria celular / Fonte: CEPA

RedeFor


tipos de rna Mensageiro (RNAm): Especifica a sequncia de aminocidos da cadeia polipeptdica. Transportador (tRNA): Transporta os aminocidos at o ribossomo, ligando-se

atravs dos anticdons ao RNAm. Ribossmico (rRNA): Associado a protenas, forma os ribossomos.

Histria da descoberta do modeloUma das grandes descobertas do sculo XX foi feita, em 1953, por James Watson e Fran-

cis Crick, que estabeleceram que as duas fitas de DNA so complementares, de modo que a hlice dupla, os degraus da escadas so sempre constitudos pelos pares A=T e GC. Estas descobertas renderam dupla (juntamente com Maurice Wilkins) o prmio Nobel em 1962.

Duplicao semiconservativaO considervel comprimento de um cromossomo humano exige que a duplicao se

inicie em milhares de locais ao mesmo tempo, a fim de completar a sntese de toda a molcula dentro da fase S do ciclo celular.

Em caso de duplicao imprpria, a clula reconhece o erro e ativa o sistema de reparo de DNA: bloqueio do ciclo celular e apoptose.

Cada cadeia complementar do DNA funciona como molde para a sntese da nova cadeia durante a duplicao. Estudos de duplicao do DNA utilizando istopos marcados N14 mostraram que os produtos da duplicao do DNA no incluam a dupla hlice original, mas metade dela. Verificou-se que cada molcula-filha de DNA, aps a duplicao, era composta por uma fita parental, e a nova era recm-sintetizada, contendo o N14 marcado. Dessa forma, comprovou-se que o processo era semiconservativo.

Evidncias por microscopia eletrnica mostraram que o DNA, durante sua duplicao, formava estruturas em Y, que consistiam nas forquilhas de duplicao do DNA, indicando que a separao das duas fitas e a duplicao acontecia simultaneamente. Assim que a dupla hlice comea a se separar, as regies da fita simples so utilizadas como molde, tornando-se imediatamente novas regies de fita dupla.

Fig. 5.5 a) O modelo de seis metros de altura do DNA, em metal, feito por Walson e Crick, em 1953. b) Os vencedores do prmio Nobel de 1962: Maurice Wilkins (Fisiologia ou Medicina), J. Steinbeck (Literatura), James Watson (Fisiologia ou Medicina), J. Kendrew (Qumica).

Clique no cone ao lado para ver a animao da duplicao

do DNA.

RedeFor


Uma outra questo importante referente capacidade de duplicao do DNA em fun-o do tempo. Verificou-se que a duplicao se inicia simultaneamente ou gradativamente em diversos pontos do cromossomo, formando fragmentos, chamados fragmentos de Oka-saki, que posteriormente so todos ligados. A velocidade de sntese do DNA de cerca de 1000 nucleotdeos por segundo.

A duplicao requer DNA pr-existenteEstudos realizados no final da dcada de 50, pelo pesquisador Arthur Kornberg, mos-

traram que a duplicao do DNA acontecia somente quando havia cadeias preexistentes de DNA para servir de molde. interessante notar que a composio de bases do DNA produzido em tubo-teste foi idntica composio do DNA molde, mostrando que a ltima determina a composio da primeira.

A duplicao do DNA realizada por um conjunto altamente complexo de protenas e DNA polimerases. Esta maquinaria molecular composta por nove protenas que desempe-nham atividades diversas, inclusive ligar-se fita de DNA, mover-se ao longo da fita, sinteti-zar uma nova fita, verificar se a sntese est correta e interagir com outras protenas essenciais para o processo de duplicao. Alm das polimerases, participam tambm do processo de duplicao as helicases, que atuam na desespiralizao da hlice, as topoisomerases e outras protenas, que diminuem a tenso criada pela desespiralizao e estabilizam o DNA.

Desnaturao e renaturao do DNAEm condies fisiolgicas normais, as cadeias complementares do DNA no se separam

espontaneamente, por causa do grande nmero de pontes de hidrognio entre as bases das cadeias complementares.

Entretanto, em temperaturas prximas ebulio ou em pH extremos, as duas fitas podem ser separadas, ou seja, desnaturadas. A desnaturao reversvel e o DNA capaz de renaturao de forma perfeita, quando as condies originais so resgatadas. A renatu-raao muito especfica e produzir uma dupla hlice perfeita quando as sequncias de bases das duas fitas forem exatamente complementares.

Essa capacidade de anelamento do DNA, ou hibridizao, constitui uma ferramenta fundamental utilizada, atualmente, nas tcnicas de gentica molecular.

O geneO gene o segmento de DNA com informao para a sntese de um polipeptdeo ou

de um RNA. Todo gene expressa-se por meio da transcrio gnica, que o processo de sntese de RNA que tem por modelo o DNA.

A unidade de transcrio gnica o segmento de DNA que transcrito de forma continua em uma molcula de RNA. A transcrio ocorre no sentido 5'- 3' da fita mol-de (anti-senso) do DNA, e os nucleotdeos so sempre adicionados na ponta crescente 3do mRNA Portanto a sequencia do mRNA ser correspondente FITA senso (figura 1). A unidade de transcrio gnica geralmente apresenta uma sequencia que a regio promotora, onde se encaixa a polimerase do RNA, e uma sequencia finalizadora, que determina o desligamento da polimerase do RNA da molcula de DNA-modelo, com-pletando o processo.Entre essas duas sequncias, esto distribudos, em nmero varivel em cada gene, trechos de DNA que sero traduzidos em protenas os xons e trechos intercalares que no sero traduzidos os ntrons.

RedeFor


A transcrio de um RNA tem incio quando uma polimerase do RNA se encaixa na regio promotora e separa, nesse local, as duas cadeias da molcula do DNA. A enzima passa ento a orientar o encaixe de ribonucleotdeos nas bases de uma das cadeias do DNA, unindo-os medida que os ordena na cadeia de DNA modelo. Dessa forma, trans-creve tanto as regies de xons como as de ntrons, produzindo uma molcula de RNAm correspondente a toda unidade de transcrio. Ao atingir a sequncia sinalizadora de trmino da transcrio, a polimerase solta-se do DNA e a transcrio termina. Nos euca-riotos, a molcula deste chamado pr-RNA mensageiro sofre um srie de modificaes, que incluem a remoo dos ntrons splicing ou corte e emenda e adio de nucle-otdeos que conferem estabilidade a este RNAm. O corte dos ntrons determinado por sequncias especficas de nucleotdeos. O RNAm processado ir para o citoplasma, onde participa da sntese da protena correspondente. Um mesmo pr-RNA pode ser cortado e montado de diferentes maneiras, dependendo do tipo de clula ou da fase de desen-volvimento, atravs do mecanismo de splicing alternativo. Esta uma das explicaes para o fato de um nmero aproximado de 25.000 genes humanos poder produzir mais de 200.000 protenas diferentes.

Fig 5.6 Estrutura de um gene em eucariotos. / Fonte: CEPA, Adaptado de desenhos de autoria da Dra Mariz Vainzof.

RedeFor


Mutaes: alteraes nos genesMutaes so alteraes nos genes, isto , uma alterao na sequncia ou no nmero

de bases na molcula de DNA que compe um gene. Se a alterao na sequncia de aminocidos na protena no afetar o funcionamento da mol-

cula e no prejudicar o organismo, de modo geral, ela passa despercebida, sendo indiferente.Outras vezes, a alterao leva a um favorecimento. Imagine, por exemplo, que uma certa

clula do seu intestino passe a produzir uma enzima chamada celulase, capaz de digerir a celulose dos vegetais que voc come. Provavelmente, a mutao que levou a esse erro ser vantajosa para voc, que poder eventualmente at se alimentar de papel picado.

Fig. 5.7 Representao esquemtica de mutaes gnicas por perda de um par de bases (acima) e por adio de um par de bases (abaixo) do segmento de DNA representado no centro (DNA original. Compare a sequncia de aminocidos nas protenas mutantes devidas perda (proteina mutante -) e adio (protena mutante +) de bases com a sequncia na protena normal (DNA original). / Fonte: CEPA

RedeFor


tipos de MutaesElas podem resultar na substituio, insero ou deleo de apenas uma base, ou abran-

ger delees ou duplicaes de grandes segmentos de DNA.Mutaes pontuais podem ser causadas por agentes mutagnicos ou erros na duplica-

o do DNA. Quando uma mutao pontual de substituio de uma base ocorre dentro da regio

codificadora da protena, ela pode ser classificada como: Mutao silenciosa: a mudana de base no altera a traduo do cdon, manten-

do o mesmo aminocido. Mutao de sentido trocado ou Missense: a mudana da base causa uma

mudana do aminocido, que, dependendo de seu papel na estrutura da protena, pode ser mais ou menos deletrio para a sua funo.

Mutao sem sentido: a mudana de base leva a um cdon de parada, que inter-rompe a protena antes de seu trmino.

Uma mutao pontual pode ocorrer tambm por: Deleo ou insero: quando ocorre a remoo ou a adio de um ou mais nucle-

otdeos da sequncia de DNA. Essas mutaes geralmente modificam o quadro de leitura do RNAm do gene, resultando na traduo de uma protena truncada.

As mutaes tambm podem ocorrer nos stios de emenda do RNAm, causando altera-es no mecanismo de splicing do gene envolvido, adicionando ou removendo segmen-tos do RNAm e da protena.

Fig. 5.8 Mutaes

Fig. 5.9 Mutao em stio de emenda / Fonte: CEPA, adaptado de desenhos de autoria da Dra Mariz Vainzof.

RedeFor


Quanto sua funo, as mutaes podem ser de: Perda de funo: quando o produto proteico resultante est ausente, modificado

ou no funcional. Ganho de funo: quando o produto proteico modificado, ganhando uma nova

funo, ou quando a funo gnica ocorre no tecido errado ou no tempo errado.Algumas mutaes patognicas alteram tambm a regulao e o funcionamento do

prprio gene, ou atuam de forma anormal na regulao da expresso de outros genes.Na anemia falciforme, a substituio do aminocido cido glutmico pelo amino-

cido valina, em uma das cadeias de hemoglobina, conduz a uma alterao na forma da protena como um todo. Essa alterao muda o formato do glbulo vermelho, que passa a ser incapaz de transportar oxignio. Outra consequncia grave as hemcias com for-mato de foice grudarem umas nas outras nos capilares sanguneos, o que pode provocar obstrues no trajeto para os tecidos.

Fig. 5.10 Anemia falciforme As hemcias, clulas do sangue, possuem uma protena, a hemoglobina, que constituda por quatro cadeias poli-peptdicas, sendo duas dessas cadeias designadas por cadeias e duas por cadeias . A hemoglobina responsvel pelo transporte de oxignio no sangue. A sua alterao conduz ao aparecimento da hemoglobina S, provocando deficincias no transporte de oxignio. / Fonte: CEPA, adaptado de desenhos de autoria da Dra Mariz Vainzof.

RedeFor


as Mutaes so hereditriasDependendo da clula em que a mutao ocorre, ela pode ser transmitida descendn-

cia. Quando as mutaes so somticas, evidentemente, no ocorrer a transmisso dos genes mutantes para os filhos, pois elas ocorrem em clulas no envolvidas na produo de gametas.

J quando a mutao herdada, ela deve ter ocorrido no passado em clulas da linha-gem germinativa de algum antepassado, que a transmitiu aos descendentes.

as causas das MutaesDe maneira geral, as mutaes ocorrem como consequncia de erros no processo de

duplicao do DNA. Acontecem com uma baixssima frequncia. Muitas delas, inclusive, so corrigidas por mecanismos especiais de reparo; por exemplo, a protena codificada pelo gene p53 essencial para proteger as clulas normais dos efeitos dos danos ao DNA e de outros estresses. Essa protena est envolvida na interrupo do ciclo celular, na reparao do DNA e na morte celular programada. Os nveis dessa protena so extremamente baixos nas clulas normais; mas, em clulas onde ocorreram danos ao DNA, os nveis de protena p53 aumentam enormemente.

H, no entanto, certos agentes do ambiente que podem aumentar a taxa de ocorrncia de erros genticos:

substncias existentes no fumo, raios X, luz ultravioleta, gs mostarda, cido nitroso e alguns corantes existentes nos alimentos.

No toa que, em muitos pases, crescente a preocupao com a diminuio da espessura da camada do gs oznio (O3), que circunda a atmosfera terrestre. Esse gs atua como filtro da luz ultravioleta proveniente do Sol. Com a diminuio da sua espes-sura, aumenta a incidncia desse tipo de radiao, o que pode afetar a pele das pessoas. Ocorrem leses no material gentico, que podem levar a certos tipos de cncer de pele.

BibliografiaTHOMPSON & THOMPSON. Gentica Mdica. WILLIAM S. KLUG, MICHAEL R. CUMMINGS, CHARLOTTE A. SPENCER e MICHAEL A.

PALLADINO. Conceitos de Gentica. 9 ed. Editora: Artmed.WATSON J.D. RICHARD M. MYERS. CAUDY AMY A. WITKOWSKI, JAN A. Dna Recom-

binante - Genes e Genomas. A. 3 ed. Editora: Artmed. STRACHAN T. e READ P. A. Gentica Molecular Humana. 2 ed. Editora: Artmed.

RedeFor


Questionrio

1. O esquema abaixo representa a seqncia de reaes que leva sntese de antocia-ninas, pigmentos responsveis pela cor das flores de diversas angiospermas.

Gene A

Enzima A

Pelargonidina(vermelho)

cianidina(violeta)

delfinidina(azul)

Gene B

Enzima B

Os alelos A e B codificam as formas ativas das enzimas e os alelos recessivos a e b codificam formas inativas.

Com base nas informaes fornecidas, respondaa. Qual a cor das flores de plantas AAbb? Justifiqueb. Qual a proporo genotpica e fenotpica esperada da prognie (F1) do cru-

zamento de plantas AAbb X aaBB? Explique.2. A partir da seqncia de DNA da unidade de transcrio abaixo, descreva a seqn-

cia correspondente do mRNA. (3) 5 ATCCGTATCTGAAATTCCGCT 3

Atividades

Font

e: C

EPA

Documents

Genética e Biologia Molecular - midia.atp.usp.br · RedeFor 48 Genética e BioloGia Molecular A Linha do Tempo do DNA 1865 O tcheco Gregor Mendel publica sobre experimen-tos com