Doç. Dr. Ercan ARICAN

Gen Mutasyonu, DNA Onarımıve Yer Değiştirebilen Elementler

Mutasyon

� DNA molekülünün 4 önemli özelliği vardır: replikasyon, depolama, ekspresyon (ifade etme) ve mutasyon. Mutasyon, genetik bilginin bozulmaksızın depolanmasındaki başarısızlıktır. Eğer depolanmış bilgide bir değişiklik olursa, bu değişiklik o bilginin ekspresyonunda görülebilir ve replikasyon yoluyla aktarılabilir. �Mutasyon olmazsa � evolusyon olmaz…� Çok fazla mutasyon � hücre ölümü, organizma ölümü,

dahası…� Kararlılık ve mutasyona uğrayabilirlik arasındaki denge

korunmalıdır

Mutasyon

� Gen mutasyonları�Değişiklik bir nukleotitin kazanılması veya

kaybedilmesi, substitüsyon (değiştirme) kadar basit olabileceği gibi, normal DNA dizisi içinde bir çok nukleotitin eklenme ve çıkarılması gibi karmaşık da olabilir.

� Yeni allellerin ve bu nedenle de populasyondaki genetik varyasyonun çoğunun kaynağıdır. Yeni alleller oluştukça ortaya çıkan materyalin zararlı mı, nötral mi ya da yararlı mı olduğuna dair karar verilmek üzere doğal seçilimin evrimsel sürecinde test edilir.

Mutasyon Tipleri

� Spontan mutasyonlar �Sadece doğada olan mutasyonlardır. Oluşumları ile ilgili

hiçbir özgün etken yoktur ve genellikle genlerin nukleotit dizilerinde rasgele olan değişikliklerdir�Bunlar hücrede normal olarak bulunan kimyasalların

(oksijen, asitler vs.) sebep olduğu baz modifikasyonları veya replikasyon hataları olduğu düşünülmektedir.

� Uyarılmış mutasyonlar�Herhangi bir yapay faktörün etkisi sonucu oluşan

mutasyonlardır.�X-ışınları, UV ışığı, hücresel kökenli olmayan

kimyasallar

Adaptif Mutasyon� Bakteri gibi organizmaların çevresel baskının bir sonucu olarak özel bir mutasyon

takımını “seçme” kabiliyetine sahip olabilecekleri fikri genetikçileri uzun süre düşündürmüştür.� Luria-Delbruck fluctuation (Oynama) Deneyi: Adaptasyon ve spontan

mutasyon hipotezleri arasında bir ayırım yapmak amacıyla E.coli/T1 sistemleri ile deneyler gerçekleştirilmiştir.�Adaptasyon hipotezi: Eğer her kültür için sabit sayıda bakteri ve

faj kullanılır ve inkübasyon süresi sabit tutulursa, dirençli bakteri sayısındaki oynamalar (farklar) petri kutusundan petri kutusuna ve deneyden deneye çok az olmalıdır.

�Spontan mutasyon hipotezi: Dirençli hücre sayısının sıvı kültür içinde spontan mutasyonların çoğunluğunun değişik zamanlarda oluşumunu yansıtacak şekilde deneyden deneye oynayacağını öngörür.

�Tabloda da görüldüğü gibi bu deneyde kültürler arasında çok büyük oynamalar görülmüş ve bakterilerdeki kalıtsal varyasyonların spontan mutasyonlar nedeniyle olduğu hipotezi desteklenmiştir. Adaptif mutasyona dair bir kanıt bulunamamıştır

Luria-Delbruck Deneyi

� Faj-Dirençli Bakterilerin Kaynağının Spontan Mutasyonlar Olduğunu Gösteren Luria-Delbrück Deneyi

Mutasyon Lokasyonuna Dayalı Sınıflandırma

� Somatik ve Gametik Mutasyonlar: Bu tür mutasyonların çoğunun ifadesi genellikle dominant allel tarafından maskelenmektedir.

� Otozomal ve X-bağlı� Otozomal resesif

�İlk jenerasyonda genellikle fenotipik olarak görülmezler� Otozomal dominant

�İlk jenerasyonda fenotipik olarak görülürler� Xe bağlı resesif mutasyonlar, etkilenmiş X kromozomunu alan hemizigot

erkeklerde ifade olabilir. Erkek veya dişilerin herhangibirinin gametlerinde oluşan bir otozomal resesif mutasyon heterozigotluk nedeniyle, o allel populasyonda yayılana kadar nesiller boyunca dikkat çekmeden aktarılabilir. Yeni allelin görülmesi, iki kopyasının bir kötü şans evliliği sonucu homozigot durumda biraraya gelmesiyle olur.

Moleküler Değişim Tiplerine dayalı Sınıflandırma

� Nokta mutasyonları (baz yer değiştirmeleri)�Tek bir nukleotit/baz değişimini içerir �Substitüsyon (yer değiştirme), delesyon (eksilmesi)

veya katılma (insersiyon) � Yanlış anlamlı mutasyonları içerir, sessiz ve sessiz

olmayan mutasyonlar �Genetik kod ile translasyon sonrası yapılan

protein üzerindeki etkilere bağlıdır �Transisyon (geçiş)(purin-purin) ya da transversiyon

(değişim)(purin-pirimidin)� Çerçeve kayması mutasyonları

�Diziyi kodlayan proteindeki okuma çerçevesi değişmiştir.

Nokta Mutasyonların Etkileri

� Nokta ve çerçeve kayması mutasyonlarına analoji olarak üç-harfli kelimelerden oluşan bir cümlede, bir harfin insersiyonu (katılması), delesyonu (eksilmesi) ve yer değiştirmesinin (substitüsyonunun) etkisi.

Kedi köpeği gördüYarasa köpeği gördüKedi domuzu gördü

Bir harfin katılması

Bir harfin kaybı

Bir harfin değişmesi

Fenotipik Etkilere Dayalı Sınıflandırma

� Fonksiyon kaybı (ileri) mutasyonları �Gen ürününün fonksiyonunu elimine ederler�Null mutasyonları yada nakavt (knockout) genler

olarak da isimlendirilirler � Fonksiyon kazancı (geri) mutasyonları

�Gen ürününe yeni bir fonksiyon verirler �Genellikle dominant bir alleldir � Bir proteine ya yeni bir fonksiyon verirler ya da eski

proteine yeni koşullar altında yeni bir zamanda düzenleyici bir etkiye sebep olurlar

Fenotipik Etkilere Dayalı Sınıflandırma

� Besinsel veya biyokimyasal varyasyonları gösterenler �Mikrobiyal okzotroflar�Orak hücre anemisi veya hemofili�Gruplar bunlardan ibaret değildir

�Bazı mutasyonlar birden fazla gruba dahil olabilirler

� Davranışsal mutasyonlar�Hayvanların günlük ritimleri veya eşleşme davranışları(meyve sineği-kanat çırpma-eşleşme)

� Düzenleyici mutasyonlar (genlerin regülasyonunu)� E. coli lac operon operator/promotor bölgeleri

� Letal mutasyon� Temel fonksiyonun kaybı (Tay-Sachs ve Huntington)

� Koşullu mutasyonlar� Isıya duyarlı mutasyonlar

�Mutant gen ürünü normal olarak çalışır, kısıtlayıcı sıcaklıklarda fonksiyonunu kaybeder

(Özellikle deneysel genetikte, organizmanın yaşamı için mutlak gerekli olan genlerin fonksiyonunu anlamada…)

� Nötral mutasyonlar� Çoğu mutasyon genomun gen kodlamayan kısımlarında veya genler

içinde bulunan intron bölgelerinde meydana gelir, bir genin ürün/fonksiyonuna etkisi yoktur

Fenotipik Etkilere Dayalı Sınıflandırma

Spontan Mutasyon Oranları

� Çalışılan tüm organizmalar için “çok düşük” � Organizmalar arasında çok önemli ölçüde değişir

� Değerlendirmeler

�Viral ve bakteriyel genler yaklaşık 100 milyon hücre bölünmesinde 1 (10-8) spontan mutasyon, (Neurosporagenleri de benzer bir sıklık)

�Drosophila, mısır, insanlarda çalışılan genler her gamet başına yaklaşık 10 –5 ve 10 -6 arasında mutasyon geçirirler

�Fare genlerinin spontan mutasyon sıklığı 10 -4 ve 10 –5

gibi daha sıktır� Aynı tür içinde bile, spontan mutasyon sıklığı genden gene değişir

İnsan Mutasyon Oranları

� Zararlı mutasyonların oluşum sıklığını yıllar boyu ölçmek mümkün olamamıştı.

� Moleküler tekniklerin gelişmesi ile beraber yapılan tahmine göre; bu sıklık, her nesil başına her birey için en azından 1.6 zararlı genetik değişiklik gibi beklentinin aksine çok yüksek bulunmuştur.

(Dr. James Crow, mutasyon araştırmaları, Nature, Ocak’ 1999)

Tautomerik Değişimler

� Watson ve Crick 1953’ te, DNA’nın moleküler yapısını tanıttıktan sonra, DNA’daki purin ve pirimidinlerin tautomerik formlarda, yani azotlu bir bazın her birinin, molekülde sadece tek bir protonun kayması ile farklılık gösteren, yapısal izomerler olarak adlandırılan alternatif kimyasal formları halinde bulunabileceğini ileri sürdüler.� Biyolojik öneme sahip olan tautomerler, sitozin ve adeninin

amino-imino formları ile timin ve guaninin keto-enol formlarını içerir (nadir)

� Bu tür bir kayma molekülün bağ özelliğini değiştireceğinden, tautomerik kaymaların baz çifti değişimlerine veya mutasyonlara yol açacağı ileri sürülmüştür.

Tautomerik Değişimler

� Azotlu bazların en kararlı tautomerleri, DNA’nın çift-sarmal modelinin temelini oluşturan standart baz eşleşmeleridir.�Şekil 1, normal baz-eşleşmeleri ilişkilerini nadir

ve sıra dışı eşleşmelerle karşılaştırmaktadır.� Mutasyona yol açan bir etki, DNA replikasyonu

sırasında kalıp DNA zinciri üzerindeki nadir bir tautomerin komplementer olmayan bir baz ile eşleşmesi durumunda oluşur. � Sonraki replikasyon esnasında, baz çiftinin “mismatched

(yanlış-eşleşmiş) üyeleri ayrılır ve her biri kendisinin normal komplementer (eşlenik) bazını belirler. Sonuç bir nokta mutasyonudur (Şekil 2).

Tautomerler ve Baz Eşleşmesi

� Şekil 1. Tautomerik kaymaların bir sonucu olarak oluşan iki anormal düzenleme ile standart baz eşleşme ilişkilerinin karşılaştırılması. Koyu boyanmış ok ucu pentoz şekerine bağlanma noktasını gösterir.

Depurinasyon ve Depirimidinasyon

� Sağlıklı bir çift-sarmal DNA molekülündeki azotlu bazlardan birinin (sıklıkla adenin ya da guanin) spontan olarak kaybedilmesi bir diğer mutasyon tipidir.� Purin halkasındaki N-glikozidik bağın kırılmasıyla oluşan

bölgelere apurinik bölgeler (AP bölgeleri) denir.� Apirimidik bölgeler, bir pirimidinin kaybedildiği bölgelerde

oluşur ve bunlar da AP bölgeleri olarak tanımlanır.� Bir AP bölgede bir azotlu bazın yokluğu, eğer ilgili zincir

transkripsiyon ve translasyona uğramaktaysa genetik kodu değiştirecektir.

� Eğer replikasyon olursa, AP bölge kalıp olarak uygun olmayacak ve replikasyonun durmasına nedenolabilecektir. Eğer yapıya bir nukleotit girmişse, bu nukleotit genellikle yanlıştır ve diğer bir mutasyonun oluşmasına yol açar (Neyseki, onarım var…)

� Düşük pH da oranlar artar.

Deaminasyon

�Deaminasyon sırasında adenin ve sitozindeki bir amino grubu keto grubuna dönüştürülmektedir.

� Söz konusu mutajen, DNA’daki bazların deaminasyonunu uyarabildiği bilinen nitröz asittir (Şekil 3).�Sitozin, Adenin ve Guanin

�Sitozin � Urasil�Adenin � Hipoksantin�Guanin � Santin�5-metil sitozin � Timin

Deamine Bazların Eşleşmesi

� Şekil 3. Nitröz asitin (HNO2) neden olduğu yeni baz-eşleşmeleri ve mutasyonların oluşumuna yol açan deaminasyonlar. Sitozin, adenin ile eşleşen urasile dönüştürülebilir. Adenin, sitozin ile eşleşen (baz-eşleşmesi yapan) hipoksantine dönüştürülebilir.

Oksidatif Hasar

� Hidrojen peroksit (H202) ve superoksit (02-) gibi

oksijen radikallerinin (reaktif moleküller) aktif formları DNA bazlarına zarar verebilir ve replikasyon sırasında yanlış eşleşmelere neden olurlar.

Yer değiştirebilen (Transposable) Elementler

� Hem prokaryotlarda hem de ökaryotlarda pek çok spontan mutasyon ajanları; � İnsersiyon (katılım) mutasyonları �Delesyonlar� Yeniden düzenlenmeler

İndükleyen Mutasyon Kaynakları

� Mantar toksinleri�Aflotoksin (fındık)

� Kozmik ışınlar� UV ışını� Kimyasal kirleticiler� X ışını� Kimyasallar

� Endüstriyel�Sigara dumanı

İndüklenmiş Mutasyonlar: Kimyasal Hasar

� Baz Analogları� Nukleik asit biyosentezi sırasında, purin ve pirimidinler yerine

geçebilen moleküllerdir ve genellikle mutajenik kimyasallardır � 5-bromourasil (veya 5-bromodeoksiuridin)

� Timin analoğu gibi davranır (metil grubu yerine brom atomu)� Tautomerik bir kaymanın gerçekleşme olasılığını arttırır

�Enol tautomer çiftleri guanin ve adenin ile eşleşir (Şekil 4).� 2-amino purin, adenin analoğu olarak hizmet verebilir (6-amino purin).

Timin ile eşleşmeye yatkındır, replikasyonu takiben sitozin ile de eşleşerek olası transisyonlara yol açar.� 2-AP gibi mutasyonları uyarmaları nedeniyle baz analogları, yabanıl

nukleotit dizilerine geri dönüşümü (reversiyon) uyarmada kullanılabilirler. Bu değişiklik tersinir mutasyon olarak adlandırılır.

Baz Analogları

� Şekil 4. 5-bromourasil (5-BU) yapısının timin yapısına benzerliği. Yaygın keto formunda, 5-BU bir analog gibi davranarak normal olarak adeninle eşleşir. Nadir olan enol formunda ise hatalı olarak guanin ile eşleşir.

Alkilleyici Ajanlar (Hardal gazları)

� Nukleotitlerdeki amino veya keto gruplarına alkil grubu ekler (örn; metil veya etil)� Etilmetan sülfonat (EMS), guaninin 6 numaralı ve

timinin 4 numaralı pozisyonundaki keto gruplarını alkiller (Şekil 5).

� Baz analoglarında olduğu gibi, baz-eşleşme yatkınlıkları değiştirilmiştir ve sonuçta transisyon mutasyonları oluşur.

� Mutajenik olduğu bilinen ve sık kullanılan birkaç alkilleyici etken

Alkilleyici Ajanlar

Alkilleyicili Bazların Yanlış-Eşleşmesi

� Şekil 5. Etilmetan sülfonat (EMS) tarafından guaninin 6-etilguanine dönüştürülmesi. 6-etilguanin timin ile baz-çifti kurar.

Halkasal Yapılar ile İlişkili Moleküller

� Akridin boyaları adını alan kimyasal mutajenler çerçeve kayması mutasyonlarına neden olur. � Bu mutasyonlar, bir genin polinukleotit dizisinde bir ya da daha

çok bazın eklenmesi ya da çıkarılması sonucu oluşur

� Örnek: proflavin, akridine oranj ve benzer materyaller� Yaklaşık olarak bir azotlu baz çifti boyutlarındadır ve normal

DNA’nın purin ve pirimidinleri arasına sıkışarak girme veya “interkale” yapmaları ile bilinirler. DNA sarmalında genişlemeler oluşturarak delesyon ve eklemelere neden olurlar (Şekil 6).

İnterkale Ajanlar

� Şekil 6. DNA’da çerçeve kayması mutasyonlarına neden olan proflavin ve akridin sarısının kimyasal yapıları

Radyasyon Hasarı

� Dünyadaki tüm enerjiler değişen dalga boylarında elektromagnetik serilerden oluşmuştur. Elektromagnetik spektrum içinde enerji, dalga boyu ile ters orantılı olarak değişir.

� UV ışını bir iyonize radyasyon şeklidir ve DNA hasarına neden olabilir.

Elektromagnetik Spektrum

UV ışığı ile DNA Hasarı

� DNA ışığı maksimum 260 nm dalga boyunda absorblar.� Purinler ve pirimidinler

� UV radyasyonun zararlı etkisi, özellikle iki timin bazı arasında dimerlerin oluştuğu pirimidinler üzerinedir (Şekil 7).� Pirimidinler tarafından ışığın absorbsiyonu onları

reaktif yapar �Dimerler DNA konformasyonunu bozar ve normal

replikasyonu durdurur.�T çok reaktiftir

�En yaygın TT, daha az TC, en az CC

Pirimidin Dimerleri

� Şekil 7. UV radyasyonu tarafından DNA’nın bozulması sonucunu doğuran bir timin dimerinin uyarılması. Pirimidin halkasının atomları çapraz-bağlantıların oluşumunu vurgulamak için gösterilmiştir.

İyonize Radyasyon Hasarı

� X-ışınları, gamma ışınları ve kozmik ışınlar� Yüksek enerjili bir ışın hücreye girdiğinde, yolu üzerinde, arkasında

bıraktığı iyonlar çeşitli kimyasal reaksiyonları başlatabilir.� Bu reaksiyonlar doğrudan ve dolaylı olarak genetik materyali

etkiler ve purin ve pirimidinleri değiştirerek nokta mutasyonları oluşturur.

� İyonize radyasyon fosfodiester bağlarını da kırarak kromozomların bütünlüğünü bozar ve çeşitli bozukluklar oluşturur (Şekil 8).

� X-ışınları kromozomları parçalayabilir, terminal konumda ve kromozom içinde yer alan delesyonlara, translokasyonlara ve genel kromozom kırıklarına neden olur. Hasar, mitozda daha yoğundur.

X-ışını Mutagenezi

� Şekil 8. Artan X-ışınları dozlarıyla uyarılan X’e bağlı çekinik mutasyonların yüzdelerinin eğrisi. Eğer bir çıkarım yapılırsa, grafik sıfır aksisle çakışır. Yani çok düşük radyasyon dozları bile mutajeniktir.

İnsanlarda Mutasyonlar

� ABO Kan Grupları�Genelde yaygın olan O tip alleli glikoziltransferaz

geninde çerçeve-kayması mutasyonu ile sonuçlanmaktadır. �mRNA transkripsiyonu tam yapılır ancak fonksiyonel

protein yapılamaz. � Duchenne (DMD) ve Becker (BMD) müsküler distrofileri

�DMD allelik formu olan BMD den daha yaygın ve daha ağırdır.

�Distrofin geni, 2 milyon baz çiftinden uzundur ve 14000 bazlık (14kb) bir elçi RNA oluşturur.

� Bu protein BMD vakalarının çoğunda saptanabilir, fakat DMD de nadiren bulunur.

Üçlü nukleotit-Tekrarı hastalıkları

� Mutant genler, normal insanlarda genellikle 15 kopyadan daha az, etkilenmiş bireylerde ise çok daha fazla sayıda bulunan, basit bir üçlünukleotit tekrar dizisinin bulunuşu ile karakterizedir. �Tekrarlayan diziler her genin mutant olmayan

(normal) allelinde de bulunurken, mutasyonlar trinukleotit tekrar sayısındaki artışın önemli ölçüde değişmesiyle karakterize edilir.

� Örnekler� Kırılgan-X (Frajil-X)�Miyotonik distrofi�Huntington hastalığı

Kırılgan-X (Frajil-X) Sendromu

� Sorumlu olan gen FMR-1� CGG üçlü nukleotit dizisinin birkaç yüzden birkaç bine

kadar kopyasına sahip olabilir � <54 sayıdaki kopyaya sahip bireyler normaldir � 54-230 kopya sayısı taşıyan bireyler taşıyıcı kabul edilir

� Bu kişiler normal olmalarına karşın çocukları daha da fazla sayıda kopya taşıyabilir ve hastalığın belirtilerini gösterebilirler.

� >230 olan bireyler frajil-X fenotipi gösterirler

Miyotonik Distrofi

� MDPK geni (serin-treonin protein kinaz)� CTG dizisinin bir çok kopyasını içerir.

� 5-37tekrarı normal fenotipi verir� >37 etkiler hafif miyopati ve kataraktan, ağır distrofi,

gelişim bozukluğu, erken çocukluk döneminde ölüm �Hastalığın hem ilk görülme zamanı hem de ağırlığı,

tekrarlanan dizinin büyüklüğü ile doğrudan ilişkilidir

Huntington Hastalığı

� Fetal nörodejeneratif hastalık � 4. kromozomdaki HD geni � CAG üçlü nukleotit tekrarı

� 10-35 kez olanlar normal fenotiplidir � >35 semptomları verir (bilinen en fazla 120)

�İlk belirtiler çok erken dönemlerde gerçekleşir�Diğer bir hastalık olan spinobulbar müsküler atrofi

(Kennedy hastalığı) geni de CAG tripletinin tekrarlayan kopyalarını içerir. �(Hastalıklı bireyde 30-60 kopya)

İnsanda Üçlü nukleotit-Tekrarı Bozuklukları