Funktionelle Regulation des
Clathrin Adaptor Komplexes 2 (AP2)
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Thomas Gaffry
aus Leverkusen
Berichterstatter: Prof. Dr. Stefan Höning
(Gutachter)
Prof. Dr. Jürgen Dohmen
Tag der mündlichen Prüfung: 12.10.2010
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis .....................................................................I
Abkürzungsverzeichnis ......................................................... VI
1. ..........................................................................1 Einleitung
1.1. Vesikulärer Transport....................................................................................... 1
1.2. Clathrin umhüllte Vesikel.................................................................................. 3
1.2.1. Clathrin................................................................................................... 3
1.2.2. Clathrin-Adaptoren ................................................................................. 4
1.2.3. Monomere Adaptoren ............................................................................ 6
1.2.4. Heterotetramere Adaptorkomplexe (APs) .............................................. 7
1.3. AP2 ................................................................................................................ 10
1.3.1. Bindung von AP2 an Clathrin ................................................................12
1.3.2. Bindung von AP2 an akzessorische Proteine .......................................12
1.3.3. Bindung von AP2 an die Plasmamembran............................................14
1.3.4. Erkennung von Sortierungsmotiven durch AP2 ....................................15
1.3.5. Phosphorylierung von AP2....................................................................18
1.4. Einführung in die funktionelle Regulation von AP2 ........................................ 22
1.5. Zielsetzung / Fragestellung ............................................................................ 24
2. ..................................................25 Material und Methoden
2.1. Materialien ..................................................................................................... 25
2.1.1. Geräte ...................................................................................................25
2.1.2. Verbrauchsmaterialien ..........................................................................27
2.1.3. Chemikalien ..........................................................................................28
2.1.4. Molekularbiologische Materialien ..........................................................30
2.1.4.1. Reagenzien und Fertiglösungen ....................................................... 30
2.1.4.2. Antibiotika ......................................................................................... 30
2.1.4.3. Bakterien........................................................................................... 31
2.1.4.4. Enzyme............................................................................................. 31
2.1.4.5. Kits.................................................................................................... 31
2.1.4.6. Nukleotide/ Oligonukleotide .............................................................. 32
Inhaltsverzeichnis
II
2.1.4.7. Plasmide ........................................................................................... 34
2.1.4.8. AP2-Mutanten................................................................................... 35
2.1.5. Biochemische Materialien .....................................................................36
2.1.5.1. Säulen............................................................................................... 36
2.1.5.2. Reagenzien und Fertiglösungen ....................................................... 36
2.1.5.3. Standard-Puffer................................................................................. 36
2.1.5.4. Radioaktive Substanzen ................................................................... 37
2.1.5.5. Lipide ................................................................................................ 37
2.1.5.6. Peptide.............................................................................................. 37
2.1.5.7. Proteine ............................................................................................ 38
2.1.6. Antikörper..............................................................................................39
2.1.7. Zellbiologische Materialien....................................................................41
2.1.7.1. Reagenzien und Fertiglösungen ....................................................... 41
2.1.7.2. Medien und Zusätze ......................................................................... 41
2.1.7.3. Zelllinien............................................................................................ 41
2.1.8. EDV.......................................................................................................42
2.2. Molekularbiologische Methoden..................................................................... 42
2.2.1. Kultivierung von E. coli..........................................................................42
2.2.2. Herstellung kompetenter Zellen ............................................................43
2.2.3. Transformation von E. coli mit Plasmid DNA ........................................44
2.2.4. Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli ................................................45
2.2.5. Anlegen einer Glycerinkultur .................................................................45
2.2.6. Konzentrationsbestimmung von DNA ...................................................46
2.2.7. Agarosegelelektrophorese ....................................................................46
2.2.8. DNA Extraktion aus Agarosegelen........................................................47
2.2.9. Hydrolyse von DNA mit Restriktionsenzymen.......................................47
2.2.10. Hybridisierung von Oligonukleotiden...................................................47
2.2.11. Ligation von DNA-Fragmenten............................................................48
2.2.12. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ......................................................49
2.2.13. Gezielte Mutagenese ..........................................................................50
2.2.14. Gewinnung von RNA und m-RNA aus HeLa-Zellen............................51
2.2.15. Reverse Transkription .........................................................................51
2.2.16. Reinigung von DNA-Fragmenten ........................................................51
2.2.17. DNA Sequenzierung ...........................................................................51
Inhaltsverzeichnis
III
2.3. Biochemische Methoden................................................................................ 52
2.3.1. Aufschluss von Zellen bzw. Gewebe.....................................................52
2.3.2. Bestimmung der Proteinkonzentration ..................................................53
2.3.3. Fällung von Proteinen ...........................................................................54
2.3.4. SDS-Gelektrophorese (SDS-PAGE) .....................................................54
2.3.5. Harnstoff-SDS-PAGE............................................................................56
2.3.6. Coomassiefärbung von Proteinen .........................................................57
2.3.7. Western-Blot und Immundetektion ........................................................58
2.3.8. Ponceaufärbung von Proteinen.............................................................58
2.3.9. Immunpräzipitation................................................................................59
2.3.10. Präparation von AP1 und AP2 aus Schweinehirn ...............................59
2.3.11. Erhöhung der Konzentration von Proteinlösungen..............................63
2.3.12. Dialyse ................................................................................................63
2.3.13. Expression und Reinigung von 6xHis-Arf6-GDP und 6xHis-Arf6-GTP63
2.3.14. Expression und Reinigung von GST-VHS, GST-VHS-GAT und GST-
GAT-Domänen................................................................................................65
2.3.15. Phosphorylierung von AP2..................................................................66
2.3.16. Verdau von AP2...............
