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Funktionelle Regulation des Clathrin Adaptor Komplexes 2 (AP2) · PDF fileFunktionelle Regulation des Clathrin Adaptor Komplexes 2 (AP2) INAUGURAL-DISSERTATION . zur . Erlangung des

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    Funktionelle Regulation des

    Clathrin Adaptor Komplexes 2 (AP2)

    INAUGURAL-DISSERTATION zur

    Erlangung des Doktorgrades

    der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Universität zu Köln

    vorgelegt von

    Thomas Gaffry

    aus Leverkusen

  •  

    Berichterstatter: Prof. Dr. Stefan Höning

    (Gutachter)

    Prof. Dr. Jürgen Dohmen

    Tag der mündlichen Prüfung: 12.10.2010

  •  

  • Inhaltsverzeichnis 

    I

    Inhaltsverzeichnis .....................................................................I

    Abkürzungsverzeichnis ......................................................... VI

    1.  ..........................................................................1 Einleitung 1.1. Vesikulärer Transport....................................................................................... 1 

    1.2. Clathrin umhüllte Vesikel.................................................................................. 3 

    1.2.1. Clathrin................................................................................................... 3 

    1.2.2. Clathrin-Adaptoren ................................................................................. 4 

    1.2.3. Monomere Adaptoren ............................................................................ 6 

    1.2.4. Heterotetramere Adaptorkomplexe (APs) .............................................. 7 

    1.3. AP2 ................................................................................................................ 10 

    1.3.1. Bindung von AP2 an Clathrin ................................................................12 

    1.3.2. Bindung von AP2 an akzessorische Proteine .......................................12 

    1.3.3. Bindung von AP2 an die Plasmamembran............................................14 

    1.3.4. Erkennung von Sortierungsmotiven durch AP2 ....................................15 

    1.3.5. Phosphorylierung von AP2....................................................................18 

    1.4. Einführung in die funktionelle Regulation von AP2 ........................................ 22 

    1.5. Zielsetzung / Fragestellung ............................................................................ 24

    2.  ..................................................25 Material und Methoden 2.1. Materialien ..................................................................................................... 25 

    2.1.1. Geräte ...................................................................................................25 

    2.1.2. Verbrauchsmaterialien ..........................................................................27 

    2.1.3. Chemikalien ..........................................................................................28 

    2.1.4. Molekularbiologische Materialien ..........................................................30 

    2.1.4.1. Reagenzien und Fertiglösungen ....................................................... 30 

    2.1.4.2. Antibiotika ......................................................................................... 30 

    2.1.4.3. Bakterien........................................................................................... 31 

    2.1.4.4. Enzyme............................................................................................. 31 

    2.1.4.5. Kits.................................................................................................... 31 

    2.1.4.6. Nukleotide/ Oligonukleotide .............................................................. 32 

  • Inhaltsverzeichnis 

    II

    2.1.4.7. Plasmide ........................................................................................... 34 

    2.1.4.8. AP2-Mutanten................................................................................... 35 

    2.1.5. Biochemische Materialien .....................................................................36 

    2.1.5.1. Säulen............................................................................................... 36 

    2.1.5.2. Reagenzien und Fertiglösungen ....................................................... 36 

    2.1.5.3. Standard-Puffer................................................................................. 36 

    2.1.5.4. Radioaktive Substanzen ................................................................... 37 

    2.1.5.5. Lipide ................................................................................................ 37 

    2.1.5.6. Peptide.............................................................................................. 37 

    2.1.5.7. Proteine ............................................................................................ 38 

    2.1.6. Antikörper..............................................................................................39 

    2.1.7. Zellbiologische Materialien....................................................................41 

    2.1.7.1. Reagenzien und Fertiglösungen ....................................................... 41 

    2.1.7.2. Medien und Zusätze ......................................................................... 41 

    2.1.7.3. Zelllinien............................................................................................ 41 

    2.1.8. EDV.......................................................................................................42 

    2.2. Molekularbiologische Methoden..................................................................... 42 

    2.2.1. Kultivierung von E. coli..........................................................................42 

    2.2.2. Herstellung kompetenter Zellen ............................................................43 

    2.2.3. Transformation von E. coli mit Plasmid DNA ........................................44 

    2.2.4. Isolierung von Plasmid DNA aus E. coli ................................................45 

    2.2.5. Anlegen einer Glycerinkultur .................................................................45 

    2.2.6. Konzentrationsbestimmung von DNA ...................................................46 

    2.2.7. Agarosegelelektrophorese ....................................................................46 

    2.2.8. DNA Extraktion aus Agarosegelen........................................................47 

    2.2.9. Hydrolyse von DNA mit Restriktionsenzymen.......................................47 

    2.2.10. Hybridisierung von Oligonukleotiden...................................................47 

    2.2.11. Ligation von DNA-Fragmenten............................................................48 

    2.2.12. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ......................................................49 

    2.2.13. Gezielte Mutagenese ..........................................................................50 

    2.2.14. Gewinnung von RNA und m-RNA aus HeLa-Zellen............................51 

    2.2.15. Reverse Transkription .........................................................................51 

    2.2.16. Reinigung von DNA-Fragmenten ........................................................51 

    2.2.17. DNA Sequenzierung ...........................................................................51 

  • Inhaltsverzeichnis 

    III

    2.3. Biochemische Methoden................................................................................ 52 

    2.3.1. Aufschluss von Zellen bzw. Gewebe.....................................................52 

    2.3.2. Bestimmung der Proteinkonzentration ..................................................53 

    2.3.3. Fällung von Proteinen ...........................................................................54 

    2.3.4. SDS-Gelektrophorese (SDS-PAGE) .....................................................54 

    2.3.5. Harnstoff-SDS-PAGE............................................................................56 

    2.3.6. Coomassiefärbung von Proteinen .........................................................57 

    2.3.7. Western-Blot und Immundetektion ........................................................58 

    2.3.8. Ponceaufärbung von Proteinen.............................................................58 

    2.3.9. Immunpräzipitation................................................................................59 

    2.3.10. Präparation von AP1 und AP2 aus Schweinehirn ...............................59 

    2.3.11. Erhöhung der Konzentration von Proteinlösungen..............................63 

    2.3.12. Dialyse ................................................................................................63 

    2.3.13. Expression und Reinigung von 6xHis-Arf6-GDP und 6xHis-Arf6-GTP63 

    2.3.14. Expression und Reinigung von GST-VHS, GST-VHS-GAT und GST-

    GAT-Domänen................................................................................................65 

    2.3.15. Phosphorylierung von AP2..................................................................66 

    2.3.16. Verdau von AP2...............