FUNKCIONALIZACIJA POVRŠINE PET (POLIETILEN … · maja kaisersberger funkcionalizacija povrŠine pet (polietilen tereftalatne) folije za dosego protimikrobnih lastnosti diplomsko

Maja KAISERSBERGER

FUNKCIONALIZACIJA POVRŠINE PET (POLIETILEN TEREFTALATNE) FOLIJE ZA DOSEGO PROTIMIKROBNIH LASTNOSTI

DIPLOMSKO DELO

Maribor, 2010

II

Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa


Študentka: Maja KAISERSBERGER Študijski program: univerzitetni, Kemijska tehnologija Smer: Biokemijska tehnika Predvideni strokovni naslov: univ. dipl. inž. kem. tehnol. Mentorica: red. prof. dr. Maja HABULIN Somentorici: doc. dr. Lidija FRAS

mag. Tina TKAVC

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala sama, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledala sem literaturo iz področja diplomskega dela po naslednjih elementih:

Vir: Science Direct, Web of Science

Gesla: Food industry, meat packaging, active packaging, chitosan, PET, antimicrobial properties

Skupine gesel (unija itd.) Chitosan in food industry, intelligent packaging

Časovno obdobje: februar 2010 – september 2010

Število referenc: 25

Število prebranih člankov: 39

Število pregledanih knjig: 7

Maribor, september 2010 ___________________

Podpis študentke

III

IV

V

ZAHVALA

Zahvaljujem se vsem, ki so kakorkoli

pripomogli k nastanku tega dela, še

posebej somentoricama doc. dr. Lidiji

Fras Zemljič ter mag. Tini Tkavc za ves

trud, ki sta ga vložili v pomoč pri pripravi

mojega diplomskega dela. Hvala za

strokovno podporo, razumevanje,

potrpežljivost in popravke pri temeljitem

pregledu diplomske naloge.

Hvala mentorici red. prof. Maji Habulin

za nasvete in vodenje pri diplomskem

delu.

Iskrena hvala celotni ekipi Laboratorija

za obdelavo in preskušanje polimernih

materialov za pomoč v laboratoriju in vse

koristne nasvete.

Hvala Perutnini Ptuj d.d., da sem lahko

bila del njihovega uspešnega kolektiva, pa

čeprav le za kratek čas.

Posebna zahvala pa gre moji družini in

Simonu, ki so me vzpodbujali in mi lepšali

študijske dni.

VI


Povzetek

Trend pri razvoju inovativnih embalažnih materialov je v funkcionalizaciji površine embalažnih materialov z namenom pridobitve protimikrobnih lastnosti. Zato iz dneva v dan narašča zanimanje za funkcionalizacijske postopke, pri katerih se uporabljajo okolju prijazni in biorazgradljivi reagenti. Eden izmed najperspektivnejših je hitozan, ki je pridobljen s postopkom alkalne deacetilacije hitina in je za celulozo drugi najbolj razširjeni bipolimer na zemlji. Hitozan vsebuje amino skupine, ki elektrostatično reagirajo s površino celic patogenih mikroorganizmov in jih s tem poškodujejo ali celo uničijo.

Dejstvo je, da je večina obstoječih raziskav s hitozanom izvedena v raztopini in ne v obliki filma, tako da razvoj hitozanskih premazov za materiale embaliranja predstavlja velik izziv.

Diplomsko delo podaja bistvene podatke o PET embalaži ter vsebuje primerjave med neobdelanim PET in PET z nanešenim hitozanskim premazom.

Namen naše naloge je bil funkcionalizirati površino PET folij s hitozanom za dosego protimikrobnih lastnosti. Pri funkcionalizaciji polimerov za dosego specifičnih lastnosti je pomembno, da te dodane lastnosti na polimeru uspešno zasleduješ, zato smo obdelane površine PET materialov analizirali z vidika: i) vsebnosti vezave hitozana: določitev amino funkcionalnih skupin ter ii) načina vezave hitozana: reverzibilnost oz. ireverzibilnost vezave.

S potenciometrično titracijo smo dokazovali prisotnost hitozana na površini PET po impregnaciji in desorpciji. Rezultate smo primerjali s suhima spektroskopskima tehnikama ATR FTIR in XPS. Obe tehniki dokazujeta vezavo hitozana na površino PET materiala.

Drugi del diplomske naloge je bil namenjen študiju desorpcije hitozana s površine PET folij. Poleg že uporabljenih tehnik (potenciometrična titracija, ATR FTIR, XPS) je bila za določitev kinetike desorpcije hitozana s površine folij uporabljena indirektna polielektrolitska titracija. Primerjali smo jo s konvencionalno spektrofotometrično metodo – ninhidrinsko reakcijo. Na ta način smo želeli opredeliti naravo vezave hitozana na površino PET.

Eden izmed najpomembnejših aspektov diplomskega dela je bil študij interakcij med funkcionalizirano površino materiala ter spektrom patogenih bakterij in gliv svežega perutninskega mesa, kjer v raziskavah obstaja vrzel – večina objav se nanaša na tekoče medije in ne na kompleksne heterogene sisteme, kot so funkcionalizirani vlaknotvorni polimerni materiali.

Ključne besede: PET, hitozan, potenciometrične in polielektrolitske titracije, ATR FTIR, XPS, protimikrobnost

UDK: 577.15:66.098(043.2)

VII

FUNCTIONALIZATION OF PET (POLYETHYLENE TEREPHTHALATE) SURFACES TO OBTAIN ANTIMICROBIAL PROPERTIES

Abstract

The trend in the development of innovative packaging materials is in packaging materials surface functionalization to obtain antimicrobial properties. Therefore, every day is growing interest in the functionalization procedures, which are environmentally friendly and use biodegradable reagents. One of the most perspective is chitosan, which is obtained by alkaline process deacetilation of chitin and is the second most widely bipolimer on Earth after cellulose. Chitosan contains amino groups that react with the electrostatic cell surface of pathogenic microorganisms and thus damage or even destroy them.

The fact is that most existing researches with chitosan are made in the solution and not in the form of a film, so that the development of chitosan coatings for materials wrapping presents major challenge.

Diploma thesis presents the essential details of PET packaging and includes a comparison between raw PET and PET with chitosan deposited coating.

The aim of our study was to activate surface of PET film with chitosan to achieve antimicrobial properties. For functionalization of polymers to achieve specific properties, it is important that these properties of the polymer are successfully stalked, so we analyzed the treated PET surface materials in terms of: i) the amount of chitosan: the determination of amine functional groups, and ii) how chitosan is bound: reversibility or irreversibility of the binding.

By potentiometric titration we show the presence of chitosan on the surface of PET foils after preservation and desorption. Results were compared with the dry ATR FTIR spectroscopic technique and XPS. Both techniques show the binding of chitosan on the surface of the PET material.

The second part of the thesis was intended to study desorption of chitosan from the surface of PET film. In addition to previously used techniques (potentiometric titration, ATR FTIR, XPS) indirect polyelectrolyte titration was used to determine the kinetics of desorption from the surface of chitosan films. We compared it with conventional spectrophotometric method – ninhydrin reaction. In this way we wanted to define the nature of the binding of chitosan on the PET surface.

One of the most important aspects of this thesis was the study of the interactions between the surface of the functionalized material and spectrum of pathogenic bacteria and fungi on fresh poultry meat, where there is a gap in research – most of the studies relate to the liquid media rather than complex heterogeneous systems such as fibre functionalized polymer materials.

Keywords: PET, chitosan, potentiometric and polyelectrolyte titrations, ATR FTIR, XPS, antimicrobial properties

UDK: 577.15:66.098(043.2)

VIII

VSEBINA

1 UVOD................................................................................................................... 1

2 TEORETIČNI DEL ............................................................................................... 3

2.1 POLIETILEN TEREFTALAT................................................................................... 3

2.1.1 Aplikacije PET-a v pakiranju............................................................................... 6

2.2 HITOZAN............................................................................................................... 7

2.2.1 Pridobivanje hitozana......................................................................................... 7

2.2.2 Fizikalne in kemijske lastnosti hitozana .............................................................. 8

2.2.3 Protimikrobni značaj hitozana ............................................................................ 8

2.2.4 Uporaba hitozana............................................................................................... 9

3 METODE IN MATERIALI ................................................................................... 11

3.1 METODE ..............................................................................................................11

3.1.1 Adsorpcija/desorpcija hitozana..........................................................................11

3.1.1.1 POTENCIOMETRIČNA TITRACIJA ..........................................................11

3.1.1.2 FTIR SPEKTROSKOPIJA .........................................................................13

3.1.1.3 XPS...........................................................................................................15

3.1.2 Kinetika desorpcije hitozana..............................................................................16

3.1.2.1 POLIELEKTROLITSKA TITRACIJA ..........................................................17

3.1.2.2 SPEKTROFOTOMETRIJA (NINHIDRINSKA REAKCIJA) .........................19

3.2 MATERIALI...........................................................................................................20

3.2.1 PET...................................................................................................................20

3.2.2 Raztopina hitozana ...........................................................................................20

3.2.3 CH3COOLi X 2 H2O puffer................................................................................20

3.2.4 Ninhidrinski reagent ..........................................................................................20

4 EKSPERIMENTALNI DEL ................................................................................. 21

4.1 POTENCIOMETRIČNE TITRACIJE......................................................................21

4.2 ATR FTIR SPEKTROSKOPIJA.............................................................................22

4.3 XPS ......................................................................................................................22

4.4 POLIELEKTROLITSKE TITRACIJE......................................................................23

4.5 SPEKTROFOTOMETRIJA (ninhidrinska reakcija) ................................................23

4.6 MIKROBIOLOŠKO TESTIRANJE .........................................................................23

IX

5 REZULTATI IN DISKUSIJA ............................................................................... 25

5.1 Potenciometrične titracije ......................................................................................25

5.2 ATR FTIR spektroskopija ......................................................................................26

5.3 XPS ......................................................................................................................31

5.4 Polielektrolitske titracije.........................................................................................32

5.5 Spektrofotometrija (ninhidrinska reakcija)..............................................................34

5.6 Mikrobiološko testiranje.........................................................................................35

6 ZAKLJUČEK ...................................................................................................... 37

7 LITERATURA IN VIRI ........................................................................................ 39

8 ŽIVLJENJEPIS................................................................................................... 42

X

SEZNAM SLIK

Slika 2.1: Nastanek PET polimera [23]. ............................................................................... 3

Slika 2.2: Reakcijski mehanizem polimerizacije PET [53]. .................................................. 4

Slika 2.3: Kemijska struktura PET materiala [49]. ................................................................. 4

Slika 2.4: DSC (angl. ˝Differential scanning calorimetry )̋ diagram PET materiala [41].......... 5

Slika 2.5: Strukturna formula hitozana. ................................................................................. 7

Slika 2.6: Kemijska zgradba hitozana in hitina. ..................................................................... 8

Slika 3.1: Titracijska krivulja zmesi močne kisline HCl in »šibke kisline« NH3+ [10]. ............12

Slika 3.2: Slika ATR FTIR spektrofotometra.........................................................................14

Slika 3.3: Pot žarka v ATR spektrofotometru [21].................................................................15

Slika 3.4: Princip XPS metode. ............................................................................................15

Slika 3.5: Shema principa polielektrolitske titracije [16]. .......................................................18

Slika 3.6: Ninhidrinska reakcija. ...........................................................................................19

Slika 4.1: Povečevalno steklo namenjeno štetju bakterijskih kolonij [47]. .............................24

Slika 5.1: Vsebnost amino skupin na folijah, impregniranih s hitozanom po desorpciji v

različnih časovnih intervalih (preglednica 5 – 1)....................................................................26

Slika 5.2: ATR FTIR spekter slepega vzorca. ......................................................................27

Slika 5.3: ATR FTIR spekter PET folije, impregnirane z 1,5% hitozansko raztopino. ...........28

Slika 5.4: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 3 min. ..........................29

Slika 5.5: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 5 min. ..........................29

Slika 5.6: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 10 min. ........................30

Slika 5.7: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 24 h. ............................30

Slika 5.8: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 48 h. ............................31

Slika 5.9: Graf polielektrolitske titracije. ...............................................................................33

Slika 5.10: Časovna odvisnost desorbiranega hitozana [mg/mL] iz površine PET. ...............33

Slika 5.11: Umeritvena krivulja.............................................................................................34

Slika 5.12: Odvisnost koncentracije kopeli z desorbiranim hitozanom po času. ...................34

XI

SEZNAM PREGLEDNIC

Preglednica 2 – 1: Fizikalne lastnosti PET materiala [49]. ..................................................... 5

Preglednica 3 – 1: Optimirani kriteriji parametrov titratorja MT T70 za titracijo raztopine

polimera. .............................................................................................................................. 21

Preglednica 5 – 1: Pregled vsebnosti amino skupin na površini PET folij pred in po

impregnaciji ter po različnih časih desorpcije. ....................................................................... 25

Preglednica 5 – 2: Preglednica vrhov, ki jih zasledimo pri ATR FTIR spektroskopiji

referenčne PET folije ter PET folije impregnirane s hitozanom pred in po desorpciji [33]...... 27

Preglednica 5 – 3: Kemijska sestava površine polimerov amorfne PET folije [at. %]. .......... 32

Preglednica 5 − 4: Sposobnost redukcije patogenih bakterij in gliv s protimikrobno

funkcionaliziranimi PET folijami. ........................................................................................... 35

XII

UPORABLJENE KRATICE IN OKRAJŠAVE A amorfno (angl. ámorphous´)

ATR Attenuated Total Reflectance

B biaksialno (angl. ´biaxial´)

cca približno (lat. ćirca´)

CFU colony forming units

CHT hitozan (angl. ćhitosan´)

CO2 ogljikov dioksid

DD stopnja deacetiliranja

DMSO dimetil sulfoksid

DNK deoksiribonukleinska kislina

DSC Differential Scanning Calorimetry

E.coli Escherichia coli

EFSA European Food Safety Authority

ESCA Electron Spectroscopy for Chemical Analysis

EU Evropska unija

FTIR Fourierjeva transformacijska infrardeča spektroskopija (angl. ´Fourier

Transform Infrared´)

GRAS generally recognized as safe

HCl klorovodikova kislina

H2O voda

IR infrardeče območje spektra elektromagnetnega valovanja

MF McFarland

mRNK informacijska RNK

MT Mettler Toledo

Na natrij

NaOH natrijev hidroksid

N dušik

NH2 amino funkcionalna skupina

NH3 amonijak

O2 kisik

PE polietilen

PET polietilen tereftalat

PP polipropilen

PS polistiren

XIII

PVC polivinilklorid

RNK ribonukleinska kislina

R bakterijska redukcija

RP Ruhemannovo vijolično (angl. ´Ruhemann's purple´)

SSP solid-state polymerisation (polimerizacija v trdnem stanju)

TBAH tetrabutilamonijev hidroksid

TPA tereftalna kislina (angl. ´terephthalic acid´)

TTI indikatorji časa in temperature (angl. ´time-temperature indicators´)

UV ultravijolična svetloba

VIS vidna svetloba

ZZV Zavod za zdravstveno varstvo

XPS rentgenska fotoelektronska spektroskopija (angl. ´X-Ray Photoelectron

Spectroscopy´)

XIV

UPORABLJENI SIMBOLI A absorbanca

A št. bakterijskih kolonij (CFU) po 1 minutnem stresanju

B št. bakterijskih kolonij (CFU) po 1 urnem stresanju

c množinska koncentracija mol/L

M natezna trdnost MPa

EV vezavna energija elektrona J

EK kinetična energija izbitega fotoelektrona J

eΦ izstopno delo, potrebno, da elektron zapusti vzorec

Y Youngov elastični modul N/m2

E energija fotona J/kg

M molska masa g/mol

m masa kg

nm povprečno število monomerov N-acetilne oblike

nn povprečno število monomerov amino oblike

ρ gostota kg/m3

R bakterijska redukcija %

tm temperatura tališča º C

tg temperatura steklastega prehoda º C

t čas s

T temperatura º C

λ valovna dolžina m

σ specifična teža N/m³

α razteznost %

k toplotna prevodnost W/m·K

C specifična toplota J/kg·K

V prostornina m3

w masni delež

XV

Funkcionalizacija površine PET folije za dosego protimikrobnih lastnosti 1

1 UVOD

Embaliranje živil je ena izmed najpomembnejših stopenj v razvojnem procesu novega izdelka in temelj inovativnosti, saj ne zagotavlja le fizične zaščite živila, potrošniku privlačnega videza, temveč tudi varnost, kakovost in podaljšano trajnost ter svežino izdelka. Trendi zmanjševanja aditivov in konzervansov v živilih še dodatno nalagajo nove funkcije embalaži in načinu pakiranja živil. Razen že znanih in uveljavljenih načinov pakiranja (vakuumsko pakiranje, pakiranje v modificirani atmosferi, sterilno pakiranje,…) se v svetu vedno bolj uveljavlja aktivno in inteligentno pakiranje. Pogoji, ki vladajo v embalaži pakiranega živila, vplivajo na trajnost živila, v katerem lahko potekajo številni procesi (fiziološki, kemijski, fizikalni, mikrobiološki). Z uporabo odgovarjajočega sistema aktivnega pakiranja se ti procesi lahko bistveno upočasnijo ali celo preprečijo. Smisel inteligentnega pakiranja je v možnosti nadzora nad kakovostjo pakiranega živila, ki ga omogočajo številni indikatorji, ki so vgrajeni v embalažni material ali naneseni nanj. Mednje sodijo TTI (time-temperature indicators) indikatorji, ki kažejo čas ter temperaturo izdelka, posebni geli, ki pokažejo prisotnost mikrobov ter posamezni indikatorji ali senzorji (spremljajo vonj, barvo, itd), ki lahko kažejo tudi zrelost nekega sadja in drugih živil. [57, 59].

Izjemno pomembno živilo, kjer je bio-aktivno embaliranje ključnega pomena, je meso. Zaradi oksidacije lipidov in proteinov se spremenijo organoleptične lastnosti mesa, kot so npr. aroma, tekstura, barva. Med klasičnimi kemijskimi konzervansi se največkrat uporabljajo šibke organske kisline in njihove soli (benzojska kislina oz. benzoati, parabeni, sorbinska kislina oz. sorbati, ocetna in mlečna kislina), ter nitriti. Ker so kupci vse bolj ozaveščeni o možnih negativnih stranskih učinkih nekaterih kemijskih aditivov, kot so parabeni, benzoati in nitriti [1, 6], je pomembno, da v ta namen uporabljamo tudi naravna sredstva. Poleg tega so meso in mesni izdelki še vedno najpogostejši razlog alimentarnih toksikoinfekcij, torej okužb in zastrupitev, ki jih povzročajo patogeni oz. toksigeni mikroorganizmi. V evropskih državah je pogostost obolenj, prenesenih s hrano, še vedno visoka. Npr. kampilobakterioza je najpogostejša zoonoza pri ljudeh, z 200.507 prijavljenimi primeri v letu 2007 v Evropski uniji (EU). To je v povprečju pomenilo 12 % povečanje glede na leto 2006, ki ga je prijavila večina držav EU. Večina kampilobakterioz je prenesenih s kontaminiranimi živili, daleč najpogosteje s svežim piščančjim mesom. Po podatkih EFSA-e (2009) je bilo med leti 2005 in 2007 na EU trgu v povprečju 31,6 % svežega piščančjega mesa v prometu kontaminiranega z bakterijami iz rodu Campylobacter [49]. Drug velik problem je kvarjenje živil, saj v povprečju več kot 25 % proizvodnje propade pred porabo. Poleg tveganja prenosa bolezni in kvarjenja živil, je sodobna tržna globalizacija neizogibno povezana še z daljšimi transportnimi potmi in časi, živila pa morajo v skladu s strogo zdravstveno zakonodajo ostati neoporečna.

Na področju razvoja bioaktivne embalaže je zelo veliko novih znanstvenih izsledkov, a zelo malo tržnih produktov. Vse večja zdravstvena ozaveščenost ljudi in obremenjenost okolja z odpadnimi materiali pa narekujeta hiter razvoj sodobne, ljudem in okolju prijazne embalaže. Glede na to se je pojavil velik interes po vključevanju naravnih ter biorazgradljivih protibakterijskih spojin v osnovni material za embaliranje [40].

Med biološko aktivne substance spadajo do sedaj nekoliko manj znani polisaharidi in njihovi derivati, ki delujejo protibakterijsko. Izmed številnih polisaharidov se kot najbolj obetajoče protimikrobno delujoče snovi kažejo amino-funkcionalni polisaharidi [40]. Mednje sodi tudi


hitozan, primarni alifatski amin, pridobljen s postopkom alkalne deacetilacije hitina. Protimikrobna učinkovitost hitozana je odvisna od večih dejavnikov: njegovega pozitivnega naboja, stopnje deacetiliranja, povprečne stopnje polimerizacije in narave kemijske modifikacije [30]. Hitozan ima odobren status varnega aditiva (GRAS) v živilstvu, kar je pospešilo razvoj številnih in raznolikih aplikacij – kot protimikrobnega dodatka, sredstva za koagulacijo proteinov in lipidov, želirnega sredstva v predelovalni industriji mesa in rib, za bistrenje in deacidifikacijo sadnih sokov, predvsem pa za pripravo užitnih, biorazgradljivih filmov oz. premazov [1].

Dejstvo je, da je večina raziskav s hitozanom izvedena v raztopini in ne v obliki filma, tako da prenos znanj na področje embaliranja ni mogoč direktno na osnovi obstoječih rezultatov. Kljub že znani uporabi hitozana v prehrambeni industriji in farmaciji ter njegovem dokazanem učinkovitem delovanju proti številnim mikroorganizmom, je njegova uporaba skupaj s polimernimi materiali, ki se uporabljajo za izdelovanje embalaž (v glavnem polietilen tereftalat PET, polipropilen PP, idr.) dokaj neraziskana in zahteva obsežnejše študije, kar predstavlja velik izziv na področju razvoja aktivne embalaže [27].

V diplomski nalogi smo proučevali adsorpcijo in desorpcijo hitozana na PET folije za dosego protimikrobne funkcionalizacije same površine. Podana je analiza »in vitro« mikrobiološkega testiranja folij na patogene bakterije in glive. Funkcionalizirani PET materiali bodo ovrednoteni z vidika uporabnosti le-teh v embaliranju piščančjega mesa v Perutnini Ptuj d.d., največji proizvajalki perutninskega mesa in izdelkov v Slovenji. Cil j i raziskovalnega dela so bil i :

- okarakterizirati osnovni PET material in raztopino hitozana, - nanesti hitozan na PET material, - okarakterizirati adsorpcijo hitozana na PET material (določitev amino skupin kot

posledica vezave hitozana: titracije, XPS, ATR FTIR), - proučiti kinetiko desorpcije hitozana s površine PET (titracije, ninhidridska reakcija) in - dokazati protimikrobno delovanje hitozana ter posledično ovrednotiti njegovo uporabno

vrednost za nadaljno izdelovanje embalažnega materiala v živilski industriji.


2 TEORETIČNI DEL

2.1 POLIETILEN TEREFTALAT Polietilen tereftalat (PET) je linearen kondenzacijski poliester, ki so ga prvič proizvedli v Dupontu v poznih 40-ih letih prejšnjega stoletja [23]. Nastane z esterifikacijo med tereftalno kislino (TPA) in monoetilen glikolom z vodo kot koproduktom (slika 2.1), ali pa s transesterifikacijo med dimetil tereftalatom in monoetilen glikolom. Kot koprodukt nastane metanol. Vsi intermediati so naftni derivati.

Slika 2.1: Nastanek PET polimera [23] Poliestri so proizvedeni pri kondenzaciji bifunkcionalnega alkohola in kisline, kjer se v ključnem koraku, ob prisotnosti kovinskega katalizatorja, odcepi voda. Nato sledi polimerizacija v trdnem stanju. Polimerizacija je polikondenzacijska reakcija monomerov (takoj po esterifikaciji/transesterifikaciji) z monoetilen glikolom kot koproduktom (med produkcijo se ga reciklira).

Ko oba intermediata skupaj segrevamo, najprej nastane bishidroksietil tereftalat skupaj z nizkomolekularnimi oligomeri. V naslednji fazi sledi vakuumsko izparevanje vode in nato polimerizacija v trdnem stanju, do visokomolekularnega PET, kar vidimo na sliki 2.2. Ta faza je izredno pomembna, ker z učinkovitostjo te faze, kakor tudi s čistostjo samih vstopnih surovin, kreiramo stopnjo čistosti PET, ki je bistvena za nadaljnje aplikacije materiala [41].

Kot katalizator se v majhnih koncentracijah uporablja antimonov trioksid – Sb2 O3 (možna je tudi uporaba titanovih, germanijevih, kobaltovih, manganovih in magnezijevih soli, vendar obstaja tveganje ostankov v polimerni verigi) [41].


Slika 2.2: Reakcijski mehanizem polimerizacije PET [53]

Za polimerizacijske reakcije velja, da so ravnotežne narave. Če želimo, da poteka reakcija v želeni smeri, moramo znižati raven prostega monoetilen glikola in vode. Ravnotežna konstanta za tako reakcijo daje prednost nastanku oligomernih vrst nižjih molskih mas, zato reakcija polimerizacije običajno poteka v talini pri relativno visokih temperaturah (270 – 300 °C) in v vakuumu (tlakih manjših od 5 mbar) ob prisotnosti katalizatorja.

Pri navedenem temperaturnem režimu nastaja tudi manjša množina acetaldehida (brezbarvna hlapna substanca z vonjem po sadju) zaradi razgradnje monomernih enot monoetilen glikola, ki lahko povzroči neprijeten okus, kar je nezaželeno pri občutljivih proizvodih, zlasti v prehrambeni industriji.

V izogib temu moramo PET za predpakiranje občutljivih proizvodov proizvajati pri nižjih temperaturah po tako imenovani SSP metodi (angl. ˝solid-state polymerisation˝) – polimerizacija v trdnem stanju [41].

Ker imajo kondenzacijski polimeri v svoji glavni verigi tudi neogljikove atome (pri PET je to atom kisika – slika 2.3), obstaja velika tendenca po razgradnji polimera. Kadar je PET material izpostavljen vlagi pri visoki temperaturi in kemijskemu stresu (vlaga, prisotnost O2, itd.), pogosto pride do hidrolize materiala (vsebnost vlage mora biti manjša od 0,005 %). Zaradi slednjega je izredno pomembno, da imamo tekom procesa suh material [41].

Čvrstost polimera, trpežnost, vezljivost, nepropustnost za pline ter termična stabilnost so posledica kristalnih struktur PET materiala. Razteznost, žilavost in difuzija pa so odvisni od amorfnih področij polimera.

Kombinacija aromatskega dela (slika 2.2 in slika 2.3), ki izhaja iz tereftalne kisline in alifatskega dela iz etilen glikola določa specifične lastnosti PET materiala. Aromatski obroč je planaren in tvori s povezanima -CH2CH2- na obeh straneh obroča togo strukturo. Zaradi mnogih enojnih vezi v strukturi (-C-O- in -C-C-) se posamezna veriga lahko nahaja v več konformacijah zaradi rotacije okoli teh vezi [41].

Slika 2.3: Kemijska struktura PET materiala [49]


Več molekul skupaj lahko tvori bodisi amorfno bodisi semi-kristalinično strukturo, kar je odvisno od narave molekul in njihove termične zgodovine. Predvideva se, da posamezne polimerne verige potujejo izmenjaje skozi množico zelo orientiranih kristaliničnih enot ter amorfnih področij [41].

Poleg tega velja, da je notranja struktura PET v veliki meri odvisna od temperature, kar nam tudi prikazuje slika 2.4.

Slika 2.4: DSC (angl. ˝Differential scanning calorimetry )̋ diagram PET materiala. Diagram prikazuje strukturne značilnosti PET materiala [41]

Pod temperaturo 80 °C (tg – temperatura steklastega prehoda) so verige polimera med seboj slabo povezane; nad to temperaturo pa material preide v t.i. gumeno stanje. Za oblikovanje PET materiala je torej potrebno doseči minimalno temperaturo 80 °C. Iz slike vidimo, da nad 120 °C PET material preide v semi-kristalinično stanje (formacija in rast sferičnih struktur v materialu), ki doseže maksimum pri 160 °C (tc – temperatura kristalizacije) in PET material se spremeni v mlečno motno strukturo. Vidimo, da predstavlja temperaturni optimum za oblikovanje PET materiala interval med 90 in 125 °C (optimum je 110 °C) [41]. V praksi so raztezne lastnosti PET odvisne od njegove molekulske mase, nateznega razmerja, stopnje kristalizacije, vlage, temperature in vrste kopolimera ter njegove sestave. V preglednici 2–1 so navedene osnovne lastnosti PET materiala [49].

Preglednica 2 – 1: Fizikalne lastnosti PET materiala [49]

Molekuska formula (C10H804)n

Velikost celic a = 4,56 A b = 5,94 A c = 10,75 A

Temperatura tališča (tm) 212 – 265 °C Temperatura steklastega prehoda (tg) 70 – 80 °C Specifična teža 1,35 – 1,41 Gostota celic 1470 kg/m3

Youngov elatični modul (E) 2800 – 3100 MPa Natezna trdnost ( t) 55 – 75 MPa Razteznost 50 – 150 % Toplotna prevodnost 0,24 W/(m·K) Specifična toplota 1 kJ/(kg·K)


Ena bistvenih prednosti PET materiala od ostalih polimerov je ta, da je v primarni obliki prozoren ter da je ekološko manj problematičen [41].

PET je polimer, katerega raba je v največjem porastu. Najbolje je uporabljen v industriji pijač – več kot 80 %, kjer se je uveljavil tudi na področju t.i. tradicionalnega embaliranja, kjer sta imela doslej vodilno vlogo steklo in kovina. V zadnjem času je PET material vse bolj uporaben kot embalaža za ostala živila (sadje, zelenjava, meso, itd.). Poleg tega v vse večji meri zamenjuje tudi ostale polimerne embalažne materiale, kot so polietilen (PE), polipropilen (PP), polistiren (PS), polivinilklorid (PVC),…

PET material se je uveljavil predvsem na področju nepovratne embalaže. Razlog za to so njegove lastnosti ter sprejemljiva cena. V zadnjem času je razvoj v PET tehnologiji osredotočen predvsem na izboljšave materiala glede prepustnosti za pline ter njegove termične stabilnosti [41]. 2.1.1 Aplikacije PET-a v pakiranju

Embalaža ima poleg tega, da fizično ščiti živila, tudi vlogo zaščite pred mikroorganizmi, kisikom, svetlobo in drugimi nezaželenimi vplivi. Boljše poznavanje fizioloških procesov embaliranih živil omogoča primerno izbiro materiala. S primerno izbiro materiala vplivamo na kakovost živila ter s tem dosegamo vse daljši čas uporabe [41].

Embalažni materiali, ki prihajajo v stik z živili, ščitijo živila pred vplivi okolja, lahko pa nanje tudi negativno vplivajo zaradi prenosa različnih snovi, ki so njihove sestavine ali kontaminanti. Zaradi primerne zgradbe materiala in kemijskih lastnosti pri pakiranju s polietilen tereftalatom niso potrebni dodatni aditivi, kot so antioksidanti, plastifikatorji, toplotni ali UV stabilizatorji, zato je tak način pakiranja primeren za aplikacije v živilski industriji. Tudi pigmenti barvil, ki se uporabljajo v nekaterih aplikacijah, se tesno vgradijo v sam PET material in je zato njihov prehod v samo živilo zanemarljiv.

Najbolj razširjene uporabe PET-a v živilstvu so: posode za hranjenje živil (plastenke, kozarci, tube), nosilci za termično obdelavo (pladnji) in razne folije za ovijanje živil, ki so primerne tudi za pripravo hrane brez odvijanja [49].

Pri izbiri materiala za embaliranje živil niso pomembne samo tiste lastnosti materiala, ki zagotavljajo higiensko neoporečnost, temveč tudi ostale lastnosti, kot na primer možnost enostavne manipulacije, nizka cena, možnost reciklaže, itd. [41]. Najzahtevnejši postopek je postopek izdelave tankih PET filmov, ki se izplača zaradi izrednih fizikalnih lastnosti folije, kot je temperaturna obstojnost med 70 in 150 ºC. Zaradi teh lastnosti je omogočena sterilizacija in se lahko tako folijo uporablja v različne namene v farmaciji, zdravstvu in nenazadnje v živilstvu [26].

Zanimanje za raziskave in uporabo sistemov aktivnega pakiranja mesa in mesnih izdelkov se je v zadnjem času močno povečalo tako na raziskovalnem področju kot tudi pri uvajanju komercialnih protimikrobnih filmov/folij [1]. Aktivno pakiranje živil je aktualno tudi na področju živil, kot so ribe, kruh, siri, sadje, zelenjava, itd.

Nove smernice razvoja PET materiala za embaliranje so v aktivni in inteligentni embalaži. Na tovrstnem področju raziskav so med drugim aktualni številni antioksidativni in protimikrobni premazi, ki so lahko nanešeni na PET folijo med samim postopkom pridobivanja folije ali pa so v obliki filmov, gelov, kroglic ali celo nanodelcev nanešeni naknadno na že izdelano folijo.

Dejstvo je, da je večina raziskav s hitozanom izvedena v raztopini in ne v obliki filma, tako da prenos znanj na področje embaliranja ni mogoč direktno na osnovi obstoječih rezultatov. Kljub že znani uporabi hitozana v prehrambeni industriji in farmaciji ter njegovem dokazanem učinkovitem delovanju proti številnim mikroorganizmom, je njegova uporaba skupaj s polimernimi materiali, ki se uporabljajo za izdelovanje embalaž (v glavnem polietilen tereftalat


PET, polipropilen PP, id) dokaj neraziskana in zahteva obsežnejše študije, kar predstavlja velik izziv na področju razvoja aktivne embalaže [27]. 2.2 HITOZAN

Slika 2.5: Strukturna formula hitozana 2.2.1 Pridobivanje hitozana

Hitozan je naravni polimerni proizvod pridobljen iz hitina, celulozi podobnega ogljikovega hidrata, ki je, med drugim, sestavni del eksoskeleta lupinarjev (raki, školjke itd.). Količina po vsem svetu vzgojenih školjk in rakov zadostuje za pripravo 50.000 ton hitina letno. Hitin je polisaharid, sestavljen iz 2-acetamino-2-deoksi-ß-D-glukoznih enot, povezanih z ß-1,4 vezjo. Ima podobno strukturo kot celuloza, le da hidroksilno skupino na drugem glukozidnem ogljikovem atomu zamenja acetilamin (slika 2.5) [9, 53].

Leta 1859 je profesor C. Rouget med postopkom kuhanja hitina v alkalnem mediju odkril hitozan. Ugotovil je, da je makromolekula hitozana po kuhanju sestavljena iz glukozamino enot s prostimi amino skupinami, ki imajo v kislem mediju sposobnost protoniranja, kar daje hitozanu kopico osupljivih lastnosti [53].

Hitin se pridobiva iz eksoskeleta rakov po sledečem postopku:

• deproteinizacije oklepov v 3-5 % vodni raztopini natrijevega hidroksida ter

• dekalcifikacije in nevtralizacije v 3-5 % vodni raztopini klorovodikove kisline.

Tako pridobljen hitin predelamo v hitozan po sledečih postopkih:

• deacetiliranje v 40-45 % vodni raztopini natrijevega hidroksida,

• spiranje nastale oborine z vodo,

• raztapljanje oborine v 2 % ocetni kislini in

• nevtralizacija raztopine z natrijevim hidroksidom [53]. Vse naštete stopnje predelave morajo biti strogo nadzorovane, saj je od tega odvisna stopnja deacetiliranja, kakor tudi razporeditev molekulske mase ter razporeditev deacetiliranih skupin vzdolž polisaharidne verige. Danes se za deacetiliranje hitina uporabljajo različne kombinacije koncentracij raztopin natrijevega ali kalijevega hidroksida (30 do 60 %), temperature (80 do 140 °C) in časa (do 10 ur) [53].

Poleg zgoraj omenjene metode se lahko hitozan pridobiva tudi iz nekaterih vrst gliv, ker pri pridelavi odpade proces demineralizacije, glive pa ne vsebujejo mineralnih delcev, kot školjke in oklepi rakov [9].


2.2.2 Fizikalne in kemijske lastnosti hitozana

Hitozan raztapljajo skoraj vse vodne raztopine kislin. Etanojska in metanojska kislina sta dve najbolj uporabljeni kislini za raztapljanje hitozana. Primerne so tudi nekatere razredčene anorganske kisline, kot so dušikova kislina, klorovodikova kislina, perklorova kislina in fosforna kislina, vendar le v primeru dovajanja energije v obliki daljšega mešanja in segrevanja. Podobno kot celuloza, tudi hitozan nima tališča, saj se pri segrevanju razgradi še pred točko tališča [53]. Molekulska masa naravnega hitina je navadno višja od enega milijona, medtem ko imajo proizvodi iz komercialnega hitozana molekulsko maso med 100 000 in 1 200 000.

Hitozan je kopolimer β(1-4) povezanih enot glukozamina in N-acetilglukozamina. Njegova strukturna formula je prikazana na sliki 2.2.

↑ ↑

hitozan hitin

Slika 2.6: Kemijska zgradba hitozana in hitina. Hitin je sestavljen v glavnem iz monomerov oblike »m« (N-acetil oblika), medtem ko je hitozan, v odvisnosti od stopnje deacetliranja, sestavljen iz monomerov oblike »n« (amino oblika) [53]. Hitozan se razlikuje od hitina po stopnji deacetiliranja, kar predstavlja razmerje med monomeroma oblike »m« in »n« in je definirana z enačbo (2.1). Ime hitozan se navadno uporablja za produkte, kjer je stopnja deacetiliranja višja od 70 % [3, 53]. Izračun stopnje deacetiliranja hitozana poteka po sledeči enačbi:

100⋅+

=mn

n

nn

nDD [%] (2.1)

kjer sta: nn - povprečno število monomerov amino oblike v makromolekuli hitozana in nm - povprečno število monomerov N-acetilne oblike v makromolekuli hitozana. 2.2.3 Protimikrobni značaj hitozana

Protimikrobno delovanje hitozana pripisujejo predvsem amino skupinam, ki v razredčenih kislinah tvorijo amonijeve soli in imajo sposobnost inhibicije rasti Gram pozitivnih in Gram negativnih bakterij, ki jih ločimo glede na sestavo [62].

V splošnem se pojavljata dva mehanizma protimikrobnega delovanja hitozana in pri tem oba poudarjata pomembnost števila aktivnih amino skupin. Prvi temelji na interakciji polikationskega značaja hitozana z negativnim značajem površine bakterijskih celic, pri


čemer je oviran potek normalnega metabolizma bakterije, ki vodi do uničenja celične stene in posledično do izumrtja bakterije. Drugi mehanizem je vdor hitozana v celice mikroorganizmov, kjer se veže z DNK bakterije in onemogoči sintezo mRNK (informacijske ribonukleinske kisline) [10].

Pri Gram pozitivnih bakterijah je celična stena trdna in debela. Peptidoglikan je le v steni bakterij in je iz dveh gradnikov (N-acetilglukozamin + N-acetil muramilska kislin, iz katere izhajajo kratke polipeptidne verige). Med 40 pentaglikanovimi plastmi obstajajo pentaglicinski mostički, ki dajejo trdnost celični steni. To trdnost pa še dodatno utrjuje teihoična kislina. Gram negativne bakterije pa imajo samo 2-3 plasti pentaglikana. Navzven ji sledi še ena peptidna membrana, med njima pa so vezani proteini. Iz zgornje lipidne membrane izhajajo dolge verige lipopolisaharidov, ki so antigeni in delujejo kot endotoksini (dokler je celica živa so antigeni, ko pa umre so toksini). Tipični predstavnik Gram pozitivnih bakterij je Staphylococcus aureus, ki povzroča vrsto bolezni od manjših okužb kože, kot so ogrci, mozolji, celulitis, do življenjsko nevarnih bolezni, kot so pljučnica, meningitis, endokarditis in sepsa. Tipičen predstavnik Gram negativnih bakterij pa je Escherichia coli, ki predstavlja velik del tako imenovane normalne črevesne flore, a nekateri sevi E. coli lahko povzročajo črevesne in zunajčrevesne okužbe (vnetje sečil, meningitis, peritonitis, mastitis, septikemija, pljučnica, itd.).

Različni literarni viri navajajo, da je protimikrobna aktivnost hitozana odvisna od njegove molekulske mase, stopnje deacetiliranja, koncentracije, vrste mikroorganizmov. Protimikrobno delovanje hitozana je močno odvisno tudi od uporabljenih kislin za pripravo raztopin (raztopine namreč vplivajo na topnost hitozana) – z višanjem koncentracije hitozana se poveča tudi njegovo protimikrobno delovanje [53]. 2.2.4 Uporaba hitozana

Hitozan je v preteklih 30-ih letih doživel nesluten razvoj in se uspešno uveljavil na najrazličnejših področjih, kot so medicina, farmacija, živilska industrija, tekstilstvo, itd. Zaradi njegove biokompatibilnosti in biorazgradljivosti se trend uporabe v industriji, kot tudi v domačem okolju, veča [24]. Zaradi naravnega izvora in dostopnosti ter kemijske strukture, ugodne za nadaljnje modifikacije, je to biopolimer, ki nedvomno še veliko obeta [53].

Hitozan se uporablja na področju:

• medicine (hitozanske membrane kot umetne membrane ledvic, ustavljanje krvavitev ob težkih pogojih nestrjevanja krvi, oskrba rane, tkivni inženiring) [47, 58],

• farmacije (dostavni sistemi, hitozanski nano in mikrodelci za cepiva, pripravki za znižanje holesterola in zmanjšanje telesne teže) [47],

• kmetijstva in prehrane (material za embaliranje, zaščita rastlin in pridelkov pred virusi in bakterijami, stimulacija rasti, konzerviranje) [58],

• čiščenja odpadnih vod in za pripravo pitne vode (koagulacijsko sredstvo in flokulant, absorpcija maščob, olja, težkih kovin in drugih toksičnih spojin) [58] in

• kozmetične industrije (nega las in kože, ustna higiena) [4, 58].


ŽIVILSKA INDUSTRIJA Sama ideja o uporabi zaščitnih užitnih filmov je pritegnila pozornost znanstvenikov že dolgo nazaj. Postopek prekrivanja hrane z voskom ali želatino je bil patentiran že daljnega leta 1800. Tako so užitni filmi v živilski industriji v uporabi že več let (kot želatina, kapsule, ovitki klobas, premazi čokolad, ipd.), uporaba polisaharidov kot premaznih materialov za zaščito hrane pa se je močno razširila v zadnjih letih. Polisaharidi se prednostno uporabljajo v primerjavi s sintetičnimi materiali za pakiranje, saj so dostopni, poceni ter nenazadnje biorazgradljivi [1].

Kot smo že omenili, med polisaharide med drugim spada tudi hitozan, ki se pogosto uporablja za proizvodnjo užitnih premazov in je za embaliranje hrane zanimiv zaradi njegovih protimikrobnih lastnosti ter njegove sposobnosti absorpcije težkih ionov kovin, ki se lahko uporabljajo za zmanjšanje oksidacije v živilih [6].

Hitozanske filme odlikujejo dobre mehanske lastnosti, saj so čvrsti, prožni, vzdržljivi in jih je tako težko strgati. Večino njihovih mehanskih lastnosti lahko primerjamo z veliko srednje-trdnimi komercialnimi polimeri [15]. Ugotovljeno je bilo, da se hitozanski filmi lahko uporabijo za povečanje roka trajanja svežih pridelkov in živil, saj ne prepuščajo kisika in tako vplivajo na kvaliteto živila [6].

Raziskave so pokazale, da so filmi s hitozansko osnovo zelo učinkoviti, ker imajo zelo široko uporabo zaradi njihovih lastnosti, kot si biorazgradljivost, protimikrobna aktivnost, netoksičnost ter prilagodljive kemijske in fizikalne lastnosti.

Naravna mikroflora rib je bila inhibirana s filmi, sestavljenimi od 0,5 do 1 % hitozanske raztopine. Po desetih dneh shranjevanja je bilo v primerjavi s kontrolnimi vzorci zmanjšano število bakterij. Hkrati je potekala redukcija hlapov dušika N2 in preprečen je bil dvig pH v primerjavi s kontrolnimi vzorci. V celoti se je hitozan pokazal kot učinkovita protimikrobna prevleka, ki je lahko primerna za uporabo kot protimikroben užiten film za procesirane ribje izdelke in vzorce sira.

Kannat in sod. (2008) so proučevali ekstrakt mete, ki ima dobro antioksidativno aktivnost in slabšo protimikrobno aktivnost, medtem ko je imel sam hitozan slabe antioksidativne in dobre protimikrobne lastnosti. Zato so raziskovali možnosti kombinacije mešanice hitozana in mete (CM) kot konzervansa za meso in mesne izdelke. Dodatek hitozana ekstraktu mete ni vplival na antioksidativno učinkovitost mete. Mešanica CM je učinkovito odstranila superoksidne in hidroksidne radikale, hkrati pa je bila protimikrobna aktivnost primerljiva proti kvarljivcem in patogenim bakterijam (boljša učinkovitost proti Gram pozitivnim bakterijam).

Vpliv fizikalno-kemijskih parametrov, kot so debelina/gostota filma, pH hranljivega gojišča, nevtralizacija filma, sterilizacija filma z avtoklaviranjem in temperaturna izpostavitev filma so bili testirani proti bakterijam vrste Staphylococcus aureus in v nekaterih primerih tudi proti bakterijam rodu Salmonella. To delo prvič nakazuje vpliv sproščanja ali pozitivne migracije protoniranih glukozamino frakcij iz biopolimera v mikrobno kulturo kot primer, ki je odgovoren za protimikrobno delovanje biopolimera v proučevanih razmerah. Glede na dobljene rezultate je bila razvita zanesljiva in ponovljiva metoda za določanje baktericidne aktivnosti hitozanskih filmov z namenom, da bi standardizirali testne razmere za optimalno oblikovanje aktivnih protimikrobnih embalirnih filmov in premazov za živila.

Kot navajajo različni avtorji, rezultati dosedanjih študij kažejo, da se je hitozan že večkrat pokazal kot učinovita protimikrobna prevleka, ki je lahko primerna za uporabo kot protimikroben užiten film za različna živila.


3 METODE IN MATERIALI

3.1 METODE 3.1.1 Adsorpcija/desorpcija hitozana

Namen naše naloge je bil, da funkcionaliziramo površino PET folij s hitozanom za dosego protimikrobnih lastnosti. Ker protonirane amino skupine v hitozanu narekujejo njegov protimikrobni značaj, je bistvenega pomena zasledovanje adsorbiranega hitozana oz. njegovih amino skupin na površini PET. S potenciometrično titracijo smo dokazovali prisotnost hitozana na površini PET po impregnaciji in desorpciji. Rezultate smo primerjali s suhima spektroskopskima tehnikama ATR FTIR in XPS. Za določitev narave vezave hitozana na površino PET smo poleg navedenih metod s potenciometrično ter polielektrolitsko titracijo in ninhidrinsko reakcijo sledili kinetiki desorpcije. 3.1.1.1 POTENCIOMETRIČNA TITRACIJA

V nalogi smo se osredotočili na kislinsko-bazne nevtralizacijske titracije polimernih suspenzij (PET polimer v vodnem mediju). Pri teh titracijah uporabljamo stekleno elektrodo, ki je idealen potenciometrični senzor za spremljanje spremembe koncentracije oksonijevih ionov med titracijo, kar lahko zasledujemo s spremembo pH vrednosti.

Potenciometrična titracijska krivulja ponazarja odvisnost merjene veličine (pH oziroma potenciala) v odvisnosti od dodanega volumna reagenta (titranta). V bližini ekvivalentne točke je sprememba potenciala indikatorske elektrode največja in naklon krivulje neskončen. Natančnost analize je premo-sorazmerna s strmino krivulje [7, 10, 14]. Oblika titracijske krivulje je odvisna od narave in koncentracije titrantov ter jakosti titrirane kisline oziroma baze. Čim manjša je koncentracija kisline/baze in čim manjša je konstanta disociacije, tem manjši je preskok v bližini ekvivalentne točke. Pri titraciji v vodnih medijih zaznamo skok potenciala v ekvivalentni točki le v primeru, ko je titrirana kislina močnejša kislina/baza kot topilo (voda) [10].

V eksperimentalnem delu naloge smo titrirali šibke kisline referenčnega, kot tudi funkcionaliziranega PET materiala. Izhajali smo iz Broussignacove metode iz leta 1968, kjer so za določevanje množine amino skupin v raztopini hitozana s potenciometrično titracijo analitski raztopini hitozana dodali znan volumen močne kisline HCl.

Glede na to smo kislo vodno suspenzijo PET materiala titrirali z močno bazo NaOH.

Amino skupine v začetni kisli raztopini reagirajo kot akceptor protonov, pri čemer se nabijejo pozitivno [46, 61]:

NH2 + H+Cl- → NH3+ + Cl- (3.1)


Protoniranje amino skupin je ključnega pomena, saj pri nevtralizaciji sproščen vodikov atom vpliva na spremembo potenciala raztopine, ki jo titriramo. Tako lahko posredno ovrednotimo množino amino skupin v raztopini.

Titracija se prične z dodajanjem močne baze (NaOH) v raztopino analita, kjer najprej nevtralizirajo vodikovi ioni HCl (enačba 3.3). V točki, ko je nevtralizirana celotna HCl, dosežemo prvo ekvivalentno točko (Eq1).

H+Cl- + Na+OH- → Na+Cl- + H2O (3.2)

V nadaljevanju nevtralizirajo protonirane amino skupine hitozana skladno z reakcijo:

NH3+ + Na+OH- → NH2 +Na+ + H2O (3.3)

Med reakcijo se amino skupine obnašajo kot donorji protona oz. šibke kisline. Ko zreagirajo vse amino skupine, dosežemo drugo ekvivalentno točko (Eq2).

Slika 3.1 prikazuje potenciometrično titracijo, ki ponazarja odvisnost merjene veličine (pH) v odvisnosti od dodanega volumna titranta. Na sliki sta razvidna dva prevoja, tipična za titracijo zmesi šibke in močne kisline z močno bazo. Razlika med ekvivalentnima točkama močne in šibke kisline predstavlja volumen porabljenega titranta, potreben za nevtralizacijo amino skupin [61].

Slika 3.1: Titracijska krivulja zmesi močne kisline HCl in »šibke kisline« NH3+ [10]


3.1.1.2 FTIR SPEKTROSKOPIJA

FTIR (Fourier Transform Infrared) spektroskopija, ali preprosto FTIR analiza, je analizna tehnika, ki zagotavlja informacije o kemijski vezi ali molekularni strukturi snovi. Tehnika temelji na tem, da kemijske vezi in molekule vibrirajo na karakterističnih frekvencah. Molekula, ki je izpostavljena infrardečim žarkom, absorbira infrardečo energijo na frekvencah, ki so značilne za to molekulo [44]. Vibracijske frekvence molekul so določene z razdaljo med atomi, vezmi oz. koti med vezmi in stalno energijo molekule. Pri absorpciji energije pride do vibracij molekulskih vezi, kot so: raztegovanje, upogibanje, vrtenje in nihanje.

Vzorec presevamo s svetlobo z valovnim številom med 400 in 4000 cm-1, pri čemer merimo prepustnost oziroma količino absorbirane svetlobe v odvisnosti od valovnega števila oziroma valovne dolžine. Pri izpolnjenem resonančnem pogoju zanihajo vezi v funkcionalni skupini, pri čemer se absorbira energija IR svetlobe [51].

Vibracija molekulske strukture povzroči absorpcijo elektromagnetnega valovanja v nekem karakterističnem območju, zato lahko to področje imenujemo področje »prstnih odtisov« [54]. Prepustnost in odbojnost infrardečih žarkov na različnih frekvencah nam predstavlja površina absorpcije IR, ki sestoji iz posameznih vrhov (angl. ´peaks´), se pravi, da se valovanje, ki ga molekula absorbira, pokaže kot pik (signal, vrh). Lego pikov označimo z valovnimi dolžinami (frekvencami). Valovno dolžino, pri kateri je absorpcija največja označimo z λmax in označuje položaj absorpcijskega vrha, na katerega vpliva kemijska struktura snovi. Absorbanco pri določeni valovni dolžini oz. frekvenci definiramo kot razmerje med intenziteto absorbirane (IA

oz. I) in vpadne (I0) svetlobe. Graf, ki prikazuje to odvisnost absorpcije od valovne dolžine, imenujemo spekter. Ker imajo biomolekule različne absorpcijske spektre, lahko rečemo, da je spekter prstni odtis molekul [34].

Pri IR spektroskopiji se opazijo le tiste vibracije, pri katerih pride do ritmične spremembe dipolnega momenta in z njo lahko zasledimo predvsem funkcionalne skupine, delno pa razpoznamo tudi skelet. Spekter, ki ga dobimo kot rezultat te metode, se analizira in nato identificira s pomočjo podatkov v FTIR knjižnici.

Pri površinski spektroskopiji dobimo s pomočjo spektrofotometra (slika 3.2) informacije o kemijski naravi na površini vzorca oziroma bližini le te. FTIR torej predstavlja površinsko občutljivo integrirano metodo, ki omogoča kvantitativno študijo površin na molekularni ravni [36].


Slika 3.2: Slika ATR FTIR spektrofotometra ATR FTIR spektroskopija

ATR (Attenuated Total Internal Reflectance) IR (Infra Red) spektroskopija temelji na popolnem notranjem odboju žarka. Ko žarek IR sevanja vpade v kristal, se v notranjosti popolnoma odbije, zato ker je vpadni kot na površini med kristalom in vzorcem večji od kritičnega. Žarek potuje preko površine, ki jo analiziramo, od katere se ukloni. Ko je material, ki selektivno absorbira sevanje, v tesnem kontaktu s površino kristala, žarek izgubi del energije pri valovni dolžini, pri kateri jo je material absorbiral. Izmerjeno oslabljeno sevanje je podano kot funkcija valovne dolžine in poda absorbcijske spektralne karakteristike vzorca [63]. Sistem takega spektrofotometra vidimo na sliki 3.3.


Slika 3.3: Pot žarka v ATR spektrofotometru [21]

3.1.1.3 XPS

Rentgenska fotoelektronska spektroskopija (X-Ray Photoelectron Spectroscopy – XPS ali Electron Spectroscopy for Chemical Analysis – ESCA) je ena najpogosteje uporabljenih metod za preiskavo elementarne in atomske sestave ter elektronskih lastnosti površin trdnih snovi. Metoda temelji na pojavu fotoefekta (slika 3.4): atome na površini vzorca najprej obsevamo z rentgensko svetlobo, nato pa elektronom, izbitih iz notranjih atomskih energijskih nivojev, izmerimo energijo [28].

Površino vzorca obsevamo z rentgensko svetlobo energije hν. Foton rentgenske svetlobe izbije elektron z enega od notranjih atomskih energijskih nivojev, kjer je vezan z vezavno energijo EV. Med kinetično energijo izbitega fotoelektrona EK, energijo fotona hν, vezavno energijo elektrona EV in izstopnim delom, ki je potrebno, da elektron zapusti vzorec eΦ velja naslednja zveza: EV = hν – EK − e Φ (3.4) Izsevani fotoelektroni, ki imajo kinetično energijo večjo od izstopnega dela, zapustijo površino in jih pri meritvi detektiramo z izredno natančnim sferičnim elektronskim analizatorjem. Tako dobimo fotoelektronski spekter N(E), ki nam prikazuje število elektronov glede na njihovo kinetično energijo [17].

Slika 3.4: Princip XPS metode


Vrhovi v spektru so povezani s fotoelektroni, izsevanimi iz različnih elektronskih nivojev v atomu. Če je sestava površine vzorca heterogena, so v XPS-spektru vrhovi različnih atomov. Intenziteta vrhov (ali bolj natančno integral ploskve) je sorazmerna koncentraciji atomov na površini, analiza spektra torej daje kvantitativno informacijo o koncentraciji različnih elementov na površini vzorca [29].

Nizko ločljivostni XPS spektri pokažejo močne in dobro definirane vrhove, ki odgovarjajo notranjim elektronskim prehodom različnih elementov, ki sestavljajo površje vzorca. Visoko ločljivostni spektri pa se koncentrirajo na enega od jedrnih prehodnih vrhov in dobimo še podrobnejše informacije o sestavi funkcionalnih skupin (C−C, C=O, O−C−O, O−C=O) preiskovane molekule.

Tako vidimo, da imajo vrhovi notranje strukture in s pomočjo prileganja krivulje lahko opazimo podvrhove, ki ustrezajo atomu v različnih kemijskih okoljih. Kemijski premik je povezan z elektronsko gostoto, ki jo prispevajo valenčni elektroni. Če imamo prisotne močno elektronegativne skupine, te premaknejo vrhove proti večjim kemijskim premikom in obratno. Ti kemijski premiki so tabelirani, tako da vsaki komponenti lahko pripišemo različne funkcionalne skupine in iz tega dobimo mnogo informacij o kemiji površja vzorca [5].

Ena od prednosti metode XPS je površinska občutljivost, ki omogoča preiskavo površinskih plasti reda velikosti od 1 nm do 10 nm. Fotoelektroni nastajajo sicer tudi globlje pod površino vzorca, vendar jim zaradi neelastičnega sipanja ne uspe zapustiti vzorca ali pa prispevajo samo k ozadju v XPS-spektru. Vse preiskave potekajo v ultravisokem vakuumu v območju od 10-9 do 10-10 mbar. Pri višjem tlaku bi se na površini preiskovanega vzorca zelo hitro adsorbirala plast molekul in atomov iz preostale atmosfere v vakuumski posodi, ki bi

preprečevala preiskavo čistih površin.

Preiskava površin slabo prevodnih ali električno neprevodnih vzorcev z elektronskimi spektroskopskimi metodami, je navadno teže izvedljiva. Pri preiskavi z metodo XPS vzorec obsevamo z električno nevtralnimi rentgenskimi žarki, pri tem pa se zaradi vzbujanja izsevajo fotoelektroni, ki so bili vezani v vzorcu. Tako na površini nastaja presežek pozitivnega naboja, ki vpliva na energijsko lego in obliko vrhov v XPS-spektrih ter navadno onemogoči verodostojne meritve. Da bi se izognili tej omejitvi, je XPS-spektrometer opremljen s posebno elektronsko puško, ki omogoča obstreljevanje površine neprevodnih vzorcev z nizkoenergijskimi elektroni, ki nevtralizirajo pozitivni naboj na površini [29].

Funkcionaliziranim PET folijam smo s pomočjo nizkoločljivostnih XPS spektrov določili atomsko koncentracijo površine PET folij. 3.1.2 Kinetika desorpcije hitozana

Za praktično uporabnost funkcionalizirane PET površine je pomembno poznavanje načina vezave hitozana na PET površino. Hitozan se lahko namreč na PET površino veže reverzibilno ali ireverzibilno. V primeru uporabe neaktivirane PET površine je zaradi njene hidrofobnosti ter hidrofilnega značaja hitozana pričakovati reverzibilno vezavo le-tega na PET površino.

Zaradi možnih hidrofobnih interakcij ter nastanka vodikovih vezi med obema polimeroma (trdni nosilec PET ter tekoči polimer hitozan) pa je nemogoče z zagotovostjo predvideti reverzibilno vezavo. Drugi del diplomske naloge je bil tako namenjen študiju desorpcije hitozana s površine vlaken. Poleg že uporabljenih tehnik (potenciometrična titracija, ATR FTIR, XPS) je bila za določitev kinetike desorpcije hitozana s površine folij uporabljena indirektna polielektrolitska titracija. Primerjali smo jo s konvencionalno spektrofotometrično metodo – ninhidridsko reakcijo, ki je do sedaj uporabna predvsem v farmaciji za detekcijo amino skupin biopolimerov.


3.1.2.1 POLIELEKTROLITSKA TITRACIJA

Polielektrolitska titracija je enostavna in atraktivna metoda za določanje naboja površine polielektrolitov, predvsem proteinov in ostalih biopolimerov [16].

Polimeri se v vodni raztopini elektrolitov električno nabijejo. Površinski naboj je posledica disociacije funkcionalnih skupin polimera in specifične adsorpcije prisotnih ionov ter zavisi od ionske moči vodne raztopine kakor tudi vrste elektrolita in pH medija.

Kemijske in fizikalne lastnosti raztopine polimera so odvisne od njegovega naboja. Ionizacija funkcionalnih skupin, kot so karboksilne (R-COOH), amino (R-NH2) in sulfonske skupine (R-SO3H), ki so največkrat individualno ali sočasno prisotne v polimerih, vodi do naboja polimerov. Potečejo sledeče reakcije disociacije [6]:

R–COOH → R–COO- + H+ (3.5)

R–NH3+

→ R–NH2 + H+ (3.6)

R–SO3H → R–SO3 + H+ (3.7)

Sulfonske kisline so močne kisline in popolnoma deprotonirane skorajda v celotnem pH območju.

Karboksilne skupine so negativno nabite pri višjem pH. Negativni naboj pa vpliva na potek in vrsto vezave s pomembnimi pozitivno nabitimi polielektroliti, kot so recimo proteini. Prav tako je večina negativno nabitih polimerov bioadhezivnih, to pomeni, da tvorijo hitre reakcije z mukusom (sluznico), kar je bistvenega pomena za aplikacije v farmaciji ter medicini.

Amino skupine v vodnem mediju delujejo kot akceptor protonov, pri čemer se pri nizkih vrednostih pH nabijejo pozitivno v NH3

+, kar daje večini biopolimerov protimikrobni značaj. To je še posebej pomembno pri farmacevtskih in medicinskih aplikacijah, saj protonirane amino skupine ovirajo potek normalnega metabolizma mikroorganizmov, to pa vodi do degradacije celične stene Gram pozitivnih ter Gram negativnih bakterij.

Količino anionskih ter kationskih skupin lahko določimo z mnogimi metodami, kot so potenciometrična in konduktometrična titracija, spektrofotometrija in nenazadnje polielektrolitska titracija. Prednost polielektrolitske titracije je v tem, da omogoča titracijo polielektrolitov v obliki njihovih soli (npr. Na oblika soli je komercialno najbolj uporabna). Nadalje, je izredno hitra tehnika z zadovoljivo stopnjo ponovljivosti.

Polielektrolitske titracije s prvotnim imenom koloidne titracije temeljijo na stehiometrični reakciji med nasprotno nabitimi koloidnimi delci, kjer lahko uporabimo različne načine indikacije ekvivalentne točke (meritve fluorescence, absorbance, potenciala, toka, itd.). Pri konvencionalnih polielektrolitskih titracijah določimo končno točko reakcije vizualno ali spektrofotometrično z določanjem spremembe barve indikatorja. Indikatorji so naravne ali sintetične spojine, katerih barva se spreminja glede na pH območje, v katerem se nahajajo.

Polielektrolitske titracije se dandanes uporabljajo za karakterizacijo polielektrolitov v procesu odpadnih voda ter na biomedicinskem in biotehnološkem področju za karakterizacijo biopolimerov kationskega ali anionskega značaja. Prav tako se lahko uporabljajo za spremljanje procesa delignifikacije v papirni industriji, določanje površinskega in celokupnega naboja vlaken, ugotavljanje kakovosti vlaken ter nenazadnje za zasledovanje kislinsko – baznih interakcij med trdnimi nosilci in tekočimi adsorbati [57].


Najbolj uporaben kationski polielektrolit je PDADMAC (angl. ˝poly-diallyldimethylammonium chloride˝). Kot anionski polielektrolit se favorizira PVSK (angl. ˝polyvinyl sulphate˝), medtem ko je najpogosteje uporabljen pozitivno nabit indikator toluidine blue oziroma negativno nabit indikator crystal violet [57].

Princip polielektrolitskih titracij, ki smo jih izvedli v okviru diplomske naloge, je sledeč:

Titracija pozitivno nabitega polielektrolita (hitozan) v prisotnosti pozitivno nabitega indikatorja (toluidine blue) poteče ob dodatku negativno nabitega polielektrolita (titrant PES-Na). Le-ta se veže na prosta protonirana kationska mesta hitozana. V stehiometrični točki je hitozan nevtralno nabit. Molekule indikatorja pa nato reagirajo s titrantom (negativno nabitim polielektrolitom) ter tako tvorijo drugače obarvan kompleks (modra barva v vijoličasto), ki ga okarakteriziramo z merjenjem absorbance [16]. Princip polielektrolitske titracije za pozitivno nabite polimere je prikazan na sliki 3.5.

Slika 3.5: Shema principa polielektrolitske titracije [16]. Na shemi vidimo princip polielektrolitske titracije pozitivno nabitega biopolimera.

TITRANT

PRESKOK BARVE

PET + HITOZAN


3.1.2.2 SPEKTROFOTOMETRIJA (NINHIDRINSKA REAKCIJA)

Ninhidrinska reakcija je ena izmed spektrofotometričnih metod, primernih za določanje primarnih amino skupin. Reakcijo ninhidrina s primarnimi amino skupinami, ki nam da za rezultat škrlatno obarvanje in se danes imenuje Ruhemann´s purple (RP) oz. Ruhemannovo vijolično, je odkril Siegfried Ruhemann leta 1910 [37].

Ninhidrin (2,2-dihidroksindan-1,3-dion ali 1,2,3-indantrion hidrat) je kristalni prah, topen v vodi in drugih polarnih topilih. Raztopina ninhidrina je aminokislinski reagent, ki reagira s primarnimi in sekundarnimi amini (aminokislinami, proteini, peptidi) ter tako povzroči oksidativno deaminacijo primarnih amino skupin in tvori obarvan produkt – Ruhemannovo vijolično barvilo, ki ga lahko določimo spektrofotometrično z merjenjem absorbance pri 570 nm, in sicer tako, da merimo razlike v intenziteti obarvanja v skladu z Beer-Lambertovim zakonom, ki podaja absorbanco kot razmerje med vpadlo ter prepuščeno svetlobo.

Ta metoda je hitra, občutljiva in ponovljiva, a na rezultat reakcije lahko vplivajo: • temperatura, relativna vlažnost • koncentracija raztopine ninhidrina in vrsta podlage • tip aminokisline in njena koncentracija • pH (reakcija je bolj učinkovita v kislem okolju) in • tip hitozana, ki ga določamo (stopnja deacetilacije, molekulska masa).

Mogoči razlogi za neidealno stehiometrijo ninhidrinske reakcije so:

• počasna tvorba Ruhemannovega vijoličnega • stranske reakcije • barvna nestabilnost ali prisotnost drugih barv in • pH odvisnost reakcije.

Tehnika omogoča kvantificiranje različnih produktov hitozana, od raztopin do trdnih nosilcev, kot so placebo tablete, hitozanski filmi, itd.

Če povzamemo, ninhidrin, ki je v originalu rumen, reagira s prosto amino skupino in se pri tem obarva modro do vijoličasto (slika 3.6).

Slika 3.6: Ninhidrinska reakcija. S pomočjo ninhidrinske reakcije dokazujemo proste amino skupine v različnih molekulah. – pozitiven rezultat le-te je škrlatno (modro-vijoličasto) obarvanje [18].


3.2 MATERIALI Za laboratorijsko delo smo uporabili sledeče kemikalije:

• bidestilirana voda, DMSO • etanol (Carlo Erba, Italija) • HCl (Sigma Aldrich, ZDA) • hidrindantin dihidrat (Sigma Aldrich, ZDA) • hitozan (Gillet, Francija) • litijev acetat (CH3COOLi X 2 H2O; Sigma Aldrich, ZDA) • ninhidrin (Sigma Aldrich, ZDA) • ocetna kislina (Kemika, Hrvaška) • PET (amorfna, biaksialna; Goodfellow, Velika Britanija).

3.2.1 PET

Biaksialno in amorfno folijo debeline 0,37 mm smo narezali na kose, ki zadostujejo velikosti A5 formata (cca 1g). Nato smo jih položili v stekleno kadičko, jih povsem prekrili z absolutnim etanolom in jih 45 min čistili v UV kopeli (Elma, Nemčija), Folije smo sprali z bidestilirano vodo do prevodnosti.

Tako očiščene in posušene PET folije smo položili za 72 ur v kadičko z raztopino hitozana (kopelno razmerje 1:100) in jih stresali s ploščnim stresalnikom (Heidolph, Nemčija). Nato smo jih vzeli iz raztopine in jih na steklenih ploščah sušili 72 ur v vakuumu (Kambič, Slovenija), pri 50 °C. Po sušenju smo folije pustili odležati čez noč.

3.2.2 Raztopina hitozana

V bidestilirani vodi smo pripravili raztopine hitozana z masnimi deleži: 0,005; 0,010; 0,015. Med mešanjem raztopin (24 ur) na magnetnem mešalu (Tehtnica, Slovenija) smo postopoma dodajali 37 % HCl do pH 3˙6, pri kateri vrednosti so vse amino skupine v molekulah hitozana v protonirani obliki. Tako pripravljene raztopine smo filtrirali s presesalno bučo skozi stekleni filter št. 2.

3.2.3 CH3COOLi X 2 H2O puffer

4,08 g CH3COOLi X 2 H2O smo raztopili v 6 mL bidestilirane vode. pH raztopine smo uravnali na 5˙2 z uporabo ledocetne kisline. Tako pripravljeni raztopini smo dolili bidestilirano vodo do končnega volumna 10 mL [31].

3.2.4 Ninhidrinski reagent

Za vsako ninhidrinsko reakcijo smo v 10 mL CH3COOLi X 2 H2O pufra primešali še 0,8 g ninhidrina in 0,12 g hidrindantina, raztopljena v 30 mL DMSO [31].


4 EKSPERIMENTALNI DEL

Eksperimentalni del diplomskega dela je zajemal naslednje faze dela: 1. Modifikacija PET materiala s hitozanom

• predobdelava PET folij (čiščenje z etanolom v UV kopeli) • obdelava PET folij s hitozanom

2. Spremljanje celokupnega naboja vzorcev neobdelanih folij in folij, obdelanih s

hitozanom z uporabo titracijskih metod

3. Karakterizacija površine obdelane folije z ATR FTIR spektroskopijo ter XPS metodo

4. Proučevanje kinetike desorpcije hitozana s površine PET folij in

5. Protimikrobno testiranje PET folij, obdelanih s hitozanom.

4.1 POTENCIOMETRIČNE TITRACIJE V stekleno titracijsko čašo z volumnom 100 mL smo z elektronsko pipeto Multipette Pro (Eppendorf, Nemčija) dodali 5 mL suspenzije PET materiala (w/w = 1,5 %). Stekleno čašo smo dopolnili z bidestilirano vodo do skupnega volumna 40 mL. Tako pripravljeno raztopino analita smo titrirali z NaOH (c = 0,1 mol/L) iz 10 mL birete avtomatskega titratorja MT T70 (Mettler Toledo, Švica). Avtomatski titrator vodi proces titracije s pomočjo titracijskih parametrov, ki smo jih nastavili v programu avtomatskega titratorja in so podani v preglednici 3 – 1.

Preglednica 3 – 1: Optimirani kriteriji parametrov titratorja MT T70 za titracijo raztopine polimera

Parameter Enota Potenciometrija

Način dodajanja titranta - dinamično

Volumen dodanega titranta mL [0,001; 0,5]

Minimalni čas med dvema dodatkoma s 10

Maksimalni čas med dvema dodatkoma s 60

Kriterij vzpostavitve ravnotežja (dE/dt) s-1 0,1/10


Pri dinamičnem dodajanju je volumen dodanega titranta odvisen od velikosti spremembe potenciala raztopine. Višja kot je sprememba, manjši je dodatek in obratno. Čas, ki preteče med dvema dodatkoma, je pogojen s kriterijem vzpostavitve ravnotežja potenciala v raztopini analita po nekem dodatku. Strožji kot je kriterij, dlje časa je potrebno, da se vzpostavi ravnotežje, ki zadovoljuje temu kriteriju. Pri tem je treba povedati, da je dE/dt = 0,1/150 s najstrožji in dE/dt = 10/1 s najmilejši kriterij, ki se ga da nastaviti na avtomatskem titratorju MT T70.

Po vsakem dodatku titranta smo v raztopini analita izmerili potencial, in sicer s stekleno pH-potenciometrično elektrodo DG-117 (Mettler Toledo, Švica).

Celoten postopek titracije je bil računalniško voden z uporabo programske opreme LabX Pro 2.6 (Mettler Toledo, Švica). Vsi podatki o meritvah potenciala so bili sočasno preneseni na prenosni računalnik, kjer smo s pomočjo programov Microsoft Excel in Origin 7.0 (Origin Lab, ZDA) izračunali množino amino skupin v vzorcu hitozana po enačbi (4.1).

( )m

cVVA

NaOHEqEq

i

⋅−= 12 (4.1)

kjer so: Ai množina amino skupin hitozana [mmol/kg], VEq1 in VEq2 volumen porabljenega titranta pri prvi in drugi ekvivalentni točki [mL], cNaOH koncentracija titranta NaOH [mmol/mL] in m masa PET folije [g]. 4.2 ATR FTIR SPEKTROSKOPIJA Kemijsko sestavo PET nosilca smo določili z ATR FTIR spektroskopijo (Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared Spectroscopy). Analiza je bila izvedena na spektrometru PerkinElmer Spectrum GX, ki je opremljen s kristalno diamantno prilogo ATR.

Suhi vzorec smo vstavili v ustrezno ohišje in posneli spekter. Še pred snemanjem vzorca smo posneli spekter ozadja in ga odšteli od spektra vzorca. Vsak spekter smo posneli 16 krat, in sicer v valovnem intervalu med 4000 cm-1 in 650 cm-1, pri resoluciji 4 cm-1 . Dobljeni spekter smo ustrezno obdelali v programu Spectrum 2.0 in določili karakteristične signale. 4.3 XPS Površino vzorcev smo preiskali s spektroskopijo fotoelektronov, vzbujenimi z rentgensko svetlobo (angl. X-ray photoelectron spectroscopy XPS ali ESCA). Pri tej metodi v XPS spektrometru obsevamo vzorec z monokromatsko rentgensko svetlobo in analiziramo energijo izsevanih fotoelektronov. V spektru fotoelektronov, ki predstavlja porazdelitev fotoelektronov po njihovi vezavni energiji, so prisotni vrhovi, značilni za elemente, ki so na površini vzorca do globine 10 nanometrov.

Analizo smo izvedli na XPS spektrometru proizvajalca Physical Electronics Inc., model TFA XPS. Analiza je potekala v ultravisokem vakuumu pri okoli 10-7 Pa (10-9 mbar). Uporabili smo aluminijev monokromatizirani rentgenski izvor moči 200 W. Energija rentgenskega žarka je bila 1486,6 eV, energijska ločljivost pa okoli 0,6 eV. Premer površine analiznega mesta je bil


0,4 mm. Posneli smo pregledne spektre preko širokega energijskega območja (0 eV - 1100 eV).

V preglednem spektru smo najprej identificirali prisotne elemente in izračunali njihove koncentracije tako, da smo ugotovljene intenzitete obtežili z relativnimi faktorji občutljivosti, kot jih navaja proizvajalec XPS spektrometra. Dobljeni rezultati so normalizirani na 100 %. Občutljivost metode je okoli 0.5 at.%. Vsak vzorec smo analizirali na dveh različnih mestih in potem izračunali povprečno sestavo.

Ker so vzorci neprevodni in se med analizo električno pozitivno nabijajo, smo jih obstreljevali z nizkoenergijskimi elektroni iz nevtralizacijske puške. 4.4 POLIELEKTROLITSKE TITRACIJE Pripravili smo kislo vodno kopel, v kateri smo omočili folijo, impregnirano s hitozanom (1g/100mL). Po časih 0, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 1200, 1500 in 1800 minut smo iz skupne kopeli odvzemali 5mL raztopine, ji dodali 1mL indikatorja toluidinsko modrilo ter raztopino razredčili do 40mL z bidestilirano vodo.

Tako pripravljenemu vzorcu za titriranje smo z 0,1M HCl uravnali pH na 3˙6 in ga nato titrirali s polielektrolitom PES-Na do ekvivalentne točke ob uporabi fototrode DP 660.

4.5 SPEKTROFOTOMETRIJA (ninhidrinska reakcija) 0,5 mL vzorca iz kopeli (v stekleni posodi) smo dodali 0,5 mL ninhidrinskega reagenta. Raztopine smo dobro zaprli, jih rahlo premešali in segrevali 30 min na 100 °C v vodni kopeli. Nato smo raztopine odstavili in jih ohladili na sobno temperaturo ter jim dodali 15 mL vodne raztopine etanola (1:1). Vzorce smo temeljito premešali (15 s vsakega) in jim pri 570 nm s spektrofotometrom izmerili absorbanco ter iz meritev absorbanc indirektno določili koncentracijo hitozana, desorbiranega v kopel. 4.6 MIKROBIOLOŠKO TESTIRANJE Mikrobiološko testiranje protimikrobno funkcionaliziranih PET folij so opravili v Centru za mikrobiologijo Zavoda za zdravstveno varstvo (ZZV) v Mariboru. Protimikrobno delovanje so testirali na štiri patogene bakterije: Salmonella enterica, Campylobacter spp., Escherichia coli in Listeria monocytogenes ter na patogeno glivo Candida albicans.

Pri testiranju so uporabili t.i. dinamično stresalni test (ASTM E 2149-01), ki vključuje:

• pripravo bakteriološkega gojišča, • pripravo pufrne raztopine in cepitev bakterij, • inkubacijo in • vrednotenje protimikrobne učinkovitosti.

Priprava bakteriološkega gojišča, pufrne raztopine ter cepitev bakterij

V skladu s standardom ASTM E 2149-01 so pripravili bakteriološko gojišče (agar) v napravi Agarklav 5/10. Sledila je priprava fosfatnega pufra in cepitev bakterij. Cepitev poteka tako, da s cepilno iglo prenesejo kolonije bakterij v epruveto s fiziološko raztopino, kateri nato na denziometru izmerijo optično gostoto v enotah McFarland (MF). MF je standardizirana enota


za merjenje gostote bakterij, na podlagi katere se iz McFarland skale odčita koncentracija bakterij v raztopini. Tako pripravljeno cepico ustrezno razredčijo s fosfatnim pufrom (pH=6˙8), da dobijo ´delovno raztopino´ z zahtevano koncentracijo bakterij, ki je 1˙5 · 105 bakterij. Stresanje

V plastične posodice s pokrovčkom natehtajo 0,9 g vzorca in ga prelijejo s 50 mL cepljene ´delovne raztopine´. Prelivanje vzorcev opravijo v neposredni bližini odprtega plamena, da zagotovijo aseptično delovno okolje. Zatem posodice dobro zaprejo in jih stresajo 1 h na stresalniku pri temperaturi 37 ºC. Inkubacija

Inkubacijo bakterij so izvedli po 1 minutnem ter 1 urnem stresanju vzorcev. V aseptičnih pogojih so 0,1 mL raztopine razmazali po površini agarja ter petrijevke inkubirali 24 h pri temperaturi 37 ºC. Vrednotenje protimikrobne učinkovitosti

Po končani inkubaciji so pod posebnim povečevalnim steklom (slika 4.1) prešteli število bakterijskih kolonij, ki so se razrasle na hranljivem agarju med inkubiranjem, in sicer po 1 minutnem stresanju (čas ˝0˝) in po 1 urnem stresanju. Število bakterij v času ˝0˝ je predstavljalo začetno koncentracijo bakterij v ´delovni raztopini´.

Slika 4.1: Števna komora, namenjena štetju bakterijskih kolonij [47] Učinkovitost protimikrobne apreture se določi z izračunom bakterijske redukcije R po naslednji enačbi:

100⋅−

=A

BAR [%] (4.2)

kjer je: R bakterijska redukcija A število bakterijskih kolonij (CFU) po 1 minutnem stresanju (čas ˝0˝) in B število bakterijskih kolonij (CFU) po 1 urnem stresanju

*CFU (ang. CFU – Colony Forming Units)


5 REZULTATI IN DISKUSIJA

5.1 Potenciometrične titracije Iz krivulj potenciometričnih titracij smo po enačbi (4.1) izračunali vsebnost amino skupin na PET foliji kot posledica vezave hitozana na površino PET materiala.

Pregled vsebnosti amino skupin na površini folij pred in po impregnaciji, kakor tudi po različnih časih desorpcije je podan v preglednici 5 – 1.

Preglednica 5 – 1: Pregled vsebnosti amino skupin na površini PET folij pred in po impregnaciji ter po različnih časih desorpcije

Iz preglednice 5 − 1 je razvidno, da smo uspešno funkcionalizirali PET folijo z raztopino hitozana. V primerjavi z neobdelano PET folijo smo namreč določili znatno množino amino skupin hitozana na impregnirani PET foliji, ki znaša 122,6 mmol/kg. Vidimo tudi, da se je po 24-ih urah obdelave PET folije v kislem mediju skoraj ves hitozan desorbiral s folije, kar dokazuje 93 % zmanjšana množina amino skupin hitozana, ki torej po 24 h desorpcije znaša le še 8,9 mmol/kg.

VZOREC NABOJ Ai [mmol/kg]

PET folija 0

impregniran PET 122,6

desorbiran PET po 3 min 115,2



desorbiran PET po 24 h 8,9

desorbiran PET po 48 h 8,4


Preglednica 5 – 1 in slika 5.1 nazorno kažeta, da se je hitozan adsorbiral na površino PET folije reverzibilno. Obdelava folij v kislem pH mediju (optimalni pogoji za desorpcijo hitozana) kaže na izrazit padec amino skupin z naraščanjem časa obdelave. Po 24-urni obdelavi tako dosežemo ravnotežno koncentracijo hitozana v kopeli. Iz rezultatov je razvidno, da se hitozan s površine folij desorbira za več kot 90 %.

Slika 5.1: Vsebnost amino skupin na folijah, impregniranih s hitozanom po desorpciji v različnih časovnih intervalih (preglednica 5 – 1)

5.2 ATR FTIR spektroskopija Za potrditev rezultatov potenciometrične titracije smo izvedli še nekaj meritev z že utečeno ATR FTIR spektroskopijo, ki je za razliko od potenciometrične titracije suha tehnika in daje pomembne kvalitativne informacije o funkcionalizaciji PET materiala. Z ATR FTIR spektroskopijo smo spremljali signale različnih funkcionalnih skupin (preglednica 5 – 2) na referenčni PET foliji, hitozanu ter funkcionalizirani PET foliji. Za nas najpomembnejši podatek je vrh, ki predstavlja amino skupine in se nahaja pri cca. 3300 cm-1 ter potrjuje prisotnost hitozana. Na vseh ATR FTIR spektrih je najmočneje viden vrh pri cca. 1710 cm-1 in predstavlja estersko vez, tipično za strukturo PET materiala.


Preglednica 5 – 2: Preglednica vrhov, ki jih zasledimo pri ATR FTIR spektroskopiji

referenčne PET folije ter PET folije impregnirane s hitozanom pred in po desorpciji [33]

.

FUNKCIONALNA SKUPINA VALOVNA DOLŽINA

AMINO SKUPINA – NH2 3300 – 3400 cm-1

HIDROKSILNA SKUPINA – OH 2900 – 3000 cm-1

KARBONILNA SKUPINA C = O 1700 – 1750 cm-1

METILENSKA SKUPINA – CH2 2850 – 3000 cm-1

AROMATI 720 – 750 cm-1

ALDEHIDNA SKUPINA – CHO 1750 – 1800 cm-1

Na sliki 5.2 vidimo spekter referenčne PET folije. Vrh pri cca. 2900 cm–1 ustreza nihanju metilenske skupine (CH2). Vrh pri 1708 cm–1 pa je posledica vzdolžnega nihanja karbonilne skupine (C=O).

To sta vrhova, ki nedvoumno pripadata dvema značilnima atomskima (funkcionalnima) skupinama v PET molekuli.

4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650,0

12,5

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95,5

cm-1

%T

Slika 5.2: ATR FTIR spekter referenčnega PET vzorca

CH2

C=O


Glede na število vodikovih atomov na dušikovem atomu razlikujemo primarne, sekundarne in terciarne amine. Vzdolžna nihanja amino skupine N-H kažejo absorpcijske vrhove pri 3250–3500 cm–1, odvisno od števila vodikovih atomov in prisotnosti ali odsotnosti vodikovih vezi.

V plinastem stanju ali razredčeni raztopini v inertnem topilu kažejo primarni amini dva vrha, in sicer pri 3400 in 3500 cm–1 (simetrično in asimetrično nihanje). Ta dva vrha se v tekočem ali trdnem vzorcu samega amina zaradi nastanka vodikovih vezi pomakneta k nižjim frekvencam, na okrog 3300 in 3370 cm–1.

Sekundarni amini kažejo v tem območju en sam vrh (amino skupina NH2), kar je lepo razvidno iz naših spektrov na slikah 5.3, 5.4 in 5.5.

Kot lahko opazimo iz slike 5.3, je precej izrazit vrh pri vrednosti 3300 cm-1 , ki je značilen za amino skupino in s tem predstavlja hitozan. Vidimo tudi, da je intenziteta vrha pri 1708 cm-1

padla, kar pomeni, da je hitozan prekril začetno strukturo molekule.

4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650,0

12,0

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

97,5

cm-1

%T

Slika 5.3: ATR FTIR spekter PET folije, impregnirane z 1,5% hitozansko raztopino

Na sliki 5.4 vidimo, da po 3 min desorbiranja intenziteta vrha pri 3300 cm-1 pade za polovico; v nadaljevanju desorbiranja intenziteta vrha še naprej pada, do 10 min desorbiranja, kjer se intenziteta vrha izgubi v šumih. Padanje intenzitete tega vrha je dokaz, da je voda počasi razgrajevala strukturo hitozana na PET foliji, saj po 24 h desorpcije z ATR FTIR spektri ne moremo več določiti funkcionalnih skupin, ki so bile prisotne na funkcionaliziranem PET vzorcu pred desorpcijo.

NH2


4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650,0

6,7

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

96,9

cm-1

%T

Slika 5.4: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 3 min

4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650,0

7,0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

106,0

cm-1

%T



4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650,0

24,7

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

98,8

cm-1

%T


4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650,0

4,6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

96,6

cm-1

%T

Slika 5.7: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 24 h

brez amino

skupine


4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650,0

4,6

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

96,6

cm-1

%T

Slika 5.8: ATR FTIR spekter impregnirane PET folije po desorpciji 48 h

ATR FTIR spektri podpirajo rezultate potenciometričnih titracij. Očitno je moč zaznati adsorbiran film hitozana na površini PET materiala po postopku impregnacije. Višina pika, tipičnega za NH2 skupine, z višanjem časa desorpcije pada in po 24 h desorpcije ga skorajda ni več moč zaznati, kar je v skladu z rezultati potenciometričnih titracij.

ATR FTIR tehnika podpira potenciometrično titracijo v sledečem:

i) impregniranje PET folije z raztopino hitozana doprinese na njegovo površino znatno količino amino skupin

ii) obdelava folij po impregnaciji v kislem mediju kaže v odvisnosti od časa sorazmeren padec vsebnosti amino skupin. 24 h obdelava v kislem mediju vodi do cca. 90 % desorpcije hitozana, kar potrjuje reverzibilno vezavo hitozana na površino PET materiala.

5.3 XPS Iz preglednice 5 − 3 lahko sklepamo o kemijski sestavi površine PET folij. Vidimo, da se je z impregnacijo PET folije z 1,5 % hitozansko raztopino močno povečala koncentracija dušika (N) na površini polimerne folije, kar kaže na tvorbo amino skupin zaradi vezave hitozana na površino folije. Po desorpciji pa je koncentracija dušika v ravnotežni točki (24 h) ponovno upadla, kar potrjuje, da se je hitozan vezal na PET folijo reverzibilno.

izrazit C=O

pik


Preglednica 5 – 3: Kemijska sestava površine polimerov amorfne PET folije [at. %]

PET C1s N1s O1s Si2p S2p Cl2p O/C N/C

neobdelan PET 72.9 0.5 25.6 0.6 0.2 0.35 0.01

impregniran PET 1.5% 55.7 5.9 29.7 4.4 0.2 4.1 0.53 0.11

impregniran PET 1.5% po desorpciji (24 h)

75.8 1.1 21.5 1.5 0.28 0.01

Vsebnost dušika na neobdelani PET foliji pripisujemo možnim nečistotam na sami površini referenčne folije oziroma možni kontaminaciji PET površine tekom XPS meritev.

5.4 Polielektrolitske titracije Desorpcijo hitozana s površine PET folije smo določili indirektno z uporabo polielektrolitske titracije. Pri različnih časovnih intervalih smo analizirali kopel (pH = 3˙6), v kateri je bila predhodno namočena in stresana impregnirana PET folija.

Vzorcu kopeli smo določili vsebnost amino skupin kot posledico desorbiranega hitozana iz površine PET folije. Za vsak vzorec smo opravili po dve paralelki polielektrolitskih titracij.

Kot smo že omenili v teoretičnem delu, krivulja E=f(Vdodanega titranta) predstavlja karakteristični potek polielektrolitske titracije. Pri tem je potencial obratno sorazmeren z absorbanco.

Zaradi dodatka indikatorja toluidinsko modro k razredčeni kopeli dobimo modro obarvano raztopino. Raztopino titriramo s PES-Na, ki s hitozanom tvori polielektrolitski kompleks. Po stehiometrični točki (nevtralizacija hitozana s PES-Na) presežek titranta reagira z indikatorjem in nastane roza – vijolično obarvan kompleks PES-Na – indikator. Zaradi zmanjšanja koncentracije indikatorja v kopeli se absorbanca znižuje (potencial zvišuje – naklon krivulje). Po nastalem stabilnem kompleksu PES-Na – indikator se zaradi efekta redčenja (dodajanje titranta) raztopina neznatno razbarva do svetlejše roza, posledično se absorbanca v zaključnem delu titracijske krivulje nekoliko zniža (potencial se zviša).

Na podlagi ekvivalentnega volumna in izbrane koncentracije titranta lahko določimo vsebnost protoniranih amino skupin kopeli ter indirektno sklepamo o desorpciji hitozana iz folij v kislo kopel. Primer polielektrolitske titracije kopeli hitozana je podan na sliki 5.9.


Slika 5.9: Graf polielektrolitske titracije

Rezultati desorbiranega hitozana s površine PET folije v kopeli [mg/mL] v odvisnosti od časa so podani na sliki 5.10.

Slika 5.10: Časovna odvisnost desorbiranega hitozana [mg/mL] iz površine PET

Na ta način smo s polielektrolitskimi titracijami indirektno analizirali desorpcijo hitozana s površine PET folije. Pri titracijah sta razvidna dva platoja, ki ponazarjata hitrost desorpcije s površine PET folije. Hitozan se s površine neobdelanega polimera desorbira v kratkem času, sledi faza počasnejše desorpcije in nato faza podobna začetni, vse do dosega drugega platoja, kjer se v času ≈ 24 h vzpostavi ravnovesje med koncentracijama preostalega hitozana na površini PET ter tistega v kopeli (slika 5.10).

K

on

cen

trac

ija (

mg

/ m

L)

0 20 40 60 80 100 1200 1600 1800 2000

Čas (min)


5.5 Spektrofotometrija (ninhidrinska reakcija)

Grafa na slikah 5.11 in 5.12 prikazujeta umeritveno krivuljo za ninhidrin ter odvisnost koncentracije kopeli z desorbiranim hitozanom po času. Iz slike 5.12 je razvidno, da se na začetku določena količina hitozana iz površine PET desorbira v trenutku, nato pa se hitrost desorpcije upočasni vse do ravnotežne koncentracije, ki je dosežena po 24 h (glej plato na krivulji iz slike 5.12).

Indirektni analizi (ninhidrinska tehnika in polielektrolitska titracija) spremljanja adsorpcije hitozana s površine PET (analiza kopeli) sta v skladu z rezultati direktnih analiz (analiza folij).

Slika 5.11: Umeritvena krivulja

Slika 5.12: Odvisnost koncentracije kopeli z desorbiranim hitozanom po času


Vse navedene tehnike kažejo ravnotežno vrednost desorpcije hitozana s površine PET folije po 24 h obdelavi folije v kisli kopeli.

5.6 Mikrobiološko testiranje Z mikrobiološkim testiranjem smo želeli preučiti vpliv vsebnosti amino skupin (kot posledica vezave hitozana) na protimikrobne lastnosti funkcionaliziranih PET folij. Folije pred in po impregnaciji, ter po različnih časih desorpcije so bile testirane z uporabo dinamično stresalnega testa v skladu s standardom ASTM E 2149-01. Rezultati redukcije (R %) patogenih bakterij Salmonella enterica, Campylobacter spp., Escherichia coli, Listeria

monocytogenes in glive Candida albicans s pripravljenimi materiali so podani v preglednici 5 − 4.

Preglednica 5 − 4: Sposobnost redukcije patogenih bakterij in gliv s protimikrobno funkcionaliziranimi PET folijami

REDUKCIJA R [%]

PATOGENE BAKTERIJE PATOGENA GLIVA VZOREC

VSEBNOST AMINO

SKUPIN Ai

[mmol/kg] Salmonella enterica

Campylobacter

spp.

Escherichia coli

Listeria monocytogenes

Candida albicans

PET 0 - 1 - 12 - 7 - 6 - 6

PET+

hitozan 122,6 25 38 100 100 96

desorbiran

3 min 115,2 19 32 21 25 6

desorbiran

10 min 27,9 18 20 6 20 5

desorbiran

24 h 8,9 5 -21 -20 -54 -16

Iz rezultatov je razvidno, da neobdelana PET folija ne kaže protimikrobnih lastnosti, ampak celo stimulira rast zgoraj navedenih patogenih bakterij kot tudi glive C.albicans. Vzroke za to je moč iskati v prisotnosti nečistot na površini PET folij (kontaminiranost folij).

O protimikrobni učinkovitosti agentov lahko govorimo v primeru, ko je redukcija višja od 75 %. PET folije, funkcionalizirane s hitozansko raztopino, so tako pokazale učinkovito redukcijo patogenih bakterij (E.coli in L.monocytogenes) in glive C.albicans, vendar so bile neučinkovite proti patogenima bakterijama Salmonella enterica in Campylobacter spp.


Pri slednjih je redukcija nižja od 75 %; v primeru Salmonella enterica je redukcija 25 %, medtem ko za Campylobacter spp. redukcija znaša 38 %. Za obe navedeni bakteriji je moč zaznati vsaj minimalno redukcijo, kar je izredno obetavno za nadaljnjo uporabo hitozana na področju embaliranja. Predpostavljamo, da bo ob optimizaciji koncentracije hitozana ter njegovega nanosa na površino PET mogoče v prihodnosti zvišati redukcijo na omenjeni bakteriji, ki sta sicer najbolj patogeni na področju živilstva.

Po desorpciji hitozana s površine PET protimikrobna učinkovitost upade, kar je posledica zmanjšanja vsebnosti amino skupin, odgovornih za protimikrobno aktivnost hitozana (glej preglednico 5 – 4). Po 24 h obdelave hitozanskih folij v kislem mediju je desorpcija hitozana potekla v takem obsegu, da preostali vezani hitozan na površini PET ne omogoča več protimikrobne učinkovitosti PET folije.

Kakorkoli, zaključimo lahko, da smo PET folijo uspešno funkcionalizirali z vidika nanosa hitozana na njeno površino. Vezan hitozan na površino PET zaradi svojih protoniranih amino skupin omogoča uspešno inhibicijo bakterij E.coli ter L.monocytogenes, kakor tudi glive C.albicans. Vsi navedeni patogeni so lahko bolj ali manj prisotni v kvarni verigi živil. Glede na rezultate je pričakovana desorpcija hitozana s površine PET ter sproščanje le-tega na mejno površino mesa in je zato moč pričakovati še učinkovitejšo protimikrobno aktivnost.


6 ZAKLJUČEK

Embaliranje hrane je pomembno vprašanje v živilski industriji in študije v zvezi z embalažo hrane so v zadnjem času povezane predvsem z boljšo zaščito, učinkovitejšim ohranjanjem kakovosti ter izboljšano varnostjo hrane. Potrošniki so namreč vedno bolj zainteresirani za okolju prijazne, biorazgradljive materiale za pakiranje hrane.

Na razvoju PET embalaže je bil v zadnjem času storjen velik korak k temu, da bi dosegli pričakovanja embalerjev in končnih potrošnikov. Obema segmentoma je skupno, da pričakujeta čim daljši rok uporabnosti. Glede na slednje se pojavljajo velike potrebe po razvoju inteligentne in aktivne embalaže.

Aktivno pakiranje se nanaša na vgraditev aditivov v embalažni material z namenom ohranitve kakovosti živila in podaljšanje obstojnosti živila. Raziskave kažejo, da so zelo učinkoviti filmi s hitozansko osnovo, ker imajo zelo široko uporabo zaradi njihovih lastnosti, kot si biorazgradljivost, protimikrobna aktivnost, netoksičnost ter prilagodljive kemijske in fizikalne lastnosti.

V diplomski nalogi smo želeli z uporabo hitozanske raztopine funkcionalizirati površino PET polimernega materiala. Nadalje smo želeli preučiti naravo vezave hitozana, ki se lahko na polimerno površino veže reverzibilno ali pa ireverzibilno. Zanimalo nas je tudi, kako vpliva vsebnost amino skupin na protimikrobne lastnosti funkcionaliziranih PET folij, kar smo analizirali z mikrobiološkimi testi.

Množina in lega prostih amino skupin hitozana bistveno vplivata na njegove protimikrobne lastnosti, zato je kvantitativna določitev amino skupin ključnega pomena pri razumevanju protimikrobnega značaja hitozana, adsorbiranega na PET folijo. V ta namen smo uporabili potenciometrično titracijo, s katero smo določili množino dostopnih amino skupin hitozana na funkcionaliziranih PET folijah.

Potenciometrične titracije kažejo, da smo na površino PET uspešno vpeljali znatno množino amino skupin (122,6 mmol/kg). Adsorpcijo hitozana na površino PET smo spremljali še s kvantitativno tehniko XPS, ki pa daje rezultate le na suhi površini tankega sloja PET (10 nm). Tehnika potrjuje uspešen nanos hitozana na površino PET, saj je v primerjavi z neobdelano folijo atomska koncentracija dušika porasla za ≈ 92 %. Za potrditev rezultatov potenciometričnih titracij ter XPS smo izvedli še nekaj meritev s kvalitativno ATR FTIR spektroskopijo, s katero smo analizirali signal pri 3300 cm-1, ki predstavlja amino skupine in tako potrdili prisotnost hitozana na površini PET folije. Na vseh ATR FTIR spektrih je bil najmočneje viden vrh pri cca. 1710 cm-1, ki predstavlja estersko vez, značilno za PET material.

Drugi del diplomske naloge je bil namenjen študiju desorpcije hitozana s površine vlaken. Za določitev kinetike desorpcije hitozana s površine folij v kislem mediju je bila uporabljena indirektna polielektrolitska titracija v kombinaciji z vsemi ostalimi, že prej omenjenimi direktnimi tehnikami (potenciometrična titracija, XPS, ATR FTIR). Ugotovili smo, da se hitozan s površine PET polimera desorbira najintenzivneje v začetku, sledi faza počasnejše desorpcije vse do ravnotežne koncentracije po 24 h obdelave (plato krivulje). To tehniko smo primerjali s konvencionalno spektrofotometrično metodo – ninhidridsko reakcijo, s katero smo


potrdili rezultate polielektrolitske titracije in ugotovili, da desorpcija poteka do ravnovesja koncentracij hitozana na površini PET ter v kopeli po 24 h.

Iz rezultatov naloge sledi, da tehnike za direktno zasledovanje množine hitozana na foliji po desorpciji v odvisnosti od časa podpirajo indirektne tehnike zasledovanja desorpcije hitozana v kopeli in kažejo padec vsebnosti amino skupin do ravnotežne vrednosti po času 24 h. V vseh priimerih, direktne in indirektne analize, je desorpcija hitozana s površine PET cca. 90%.

Z mikrobiološkim testiranjem smo želeli preučiti vpliv vsebnosti amino skupin (kot posledica vezave hitozana) na protimikrobne lastnosti funkcionaliziranih PET folij. Rezultati kažejo, da smo PET folijo uspešno funkcionalizirali z vidika nanosa hitozana na njeno površino. Vezan hitozan na površino PET zaradi svojih protoniranih amino skupin omogoča uspešno inhibicijo bakterij E.coli ter L.monocytogenes, kakor tudi glive C.albicans. Vsi navedeni patogeni so lahko bolj ali manj prisotni v kvarni verigi živil. Glede na rezultate je pričakovana desorpcija hitozana s površine PET ter sproščanje le-tega na mejno površino mesa in je zato moč pričakovati še učinkovitejšo protimikrobno aktivnost.

Diplomsko delo je bilo opravljeno v sodelovanju s Perutnino Ptuj d.d , eno največjih proizvajalk perutninskega mesa in mesnih izdelkov tako v Sloveniji, kot tudi posameznih delih Evrope. Perutnina Ptuj d.d. skuša zadostiti zahtevam potrošnikov kar v največji meri ter se je na nekatere izzive oziroma zahteve trga odzvala med drugim tudi z idejo aktivne embalaže za meso. Rezultati diplome tako predstavljajo osnovo za razvoj nove aktivne embalaže v Perutnini Ptuj d.d. Tovrstni, a nadgrajeni pristop k razvoju bio-aktivne formulacije premazov bo toksikološko in ekonomsko ugoden ter primernejši za embaliranje živil kot tudi za zdravje človeka. V prihodnosti bi uporaba take embalaže omogočila Perutnini Ptuj d.d. tržni dvig proizvodov kot tudi izboljšanje konkurenčnosti.


7 LITERATURA IN VIRI

[1] AHVENAINEN, R. 2003. Active and intelligent packaging. In Ahvenainen R. editor.

Novel Food Packaging Techniques, CRC Press: 5-21. Woodhead Publishing Limited, Cambridge, UK.

[2] ALBRIGHT L.F., 2009. Albright˙s chemical engineering handbook. Boca Raton: CRC Press, cop.

[3] BALÁZS N., SIPOS P., 2007. Limitations of pH-potentiometric titration for the determination of the degree of deacetylation of chitosan, Carbohydrate research, volume 342.

[4] BRATKO D., 2000. Laboratorijske vaje iz fizikalne kemije, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Ljubljana.

[5] BRIGGS D. and BEAMSON G., 1992. High Resolution XPS of Organic Polymers, The Scienta ESCA300 Database, Wiley.

[6] COMA V., SEBTI I., PARDON P., DESCHAMPS A. and PICHAVANT F.H. 2001. Antimicrobial edible packaging based on cellulosic ethers, fatty acids, and nisin incorporation to inhibit Listeria innocua and Staphylococcus aureus, J Food Protect, 64 (4), 470-5

[7] ČAKARA D., Charging Behavior of Colloidal Particles in the Presence of Oppositely Charged Polyelectrolytes, paper presentation, 78th ACS Colloid and Surface Science Symposium, Yale University, USA

[8] D. Briggs, J. T. Grant, 2003. Surface analysis by Auger and X-Ray Photoelectron Spectroscopy, IM Publications and Surface Spectra Limited.

[9] ESSMANN D., NEUMANN B., VOß T. 2005. Chitin und Chitosan, Universität Bremen. [10] FRAS L., 2002. Uporaba titracijskih metod za ugotavljanje disociacijsko – adsorpcijskih

značilnosti tekstilnih vlaken, magistrsko delo, Fakulteta za strojništvo, Maribor. [11] FRAS L., STRNAD S., ŠAUPERL O., STANA-KLEINSCHEK K. 2009. Characterization

of amino groups for cotton fabric coated with chitosan. Textile Research. [12] FRAS ZEMLJIČ L., PERŠIN Z., STENIUS P. 2009. Improvement of chitosan

adsorption onto cellulosic fabrics by plasma treatment, Biomacromolecules. [13] FRAS ZEMLJIC L., 2006. Determination of dissociable groups in natural and

regenerated cellulose fibers by different titration methods, članek [14] Grzybkowski, 2002. [15] HENNEN W. J. 1996. Chitosan, Woodland publishing, Pleasant Grove. [16] HORN D., HEUCK C.C., 1982. Charge Determination of Proteins with Polyelectrolyte

Titration, The journal of biological chemistry. [17] http://en.wikipedia.org/wiki/X-ray_photoelectron_spectroscopy [18] http://utenti.multimania.it/Pasquale_Petrilli/aastruc/aareac.htm [19] http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab3a.htm [20] http://www.omaplast.com/o-materialih/ [21] http://www.sintef.no/cgi-

bin/MsmGo.exe?grab_id=0&page_id=2691&query=atr&hiword=atr [22] http://www.web.bf .uni-lj.si/zt/kemija/katedra/slo/studenti/.../6.predavanje.ppt


[23] INDEST T. 2007. Study of polyethylene terephthalate surface treatment with

polysaccharides for medical application, doktorska disertacija, Fakulteta za strojništvo, Maribor.

[24] KEREC-KOS M. 2006. Uporaba hitosana v farmaciji, Farmacevtski vestnik, volume 5. [25] KLOFUTAR C. 1995. Uporaba nekaterih osnovnih principov kemijske kinetike pri

napovedi obstojnosti živil. 17. Bitenčevi živilski dnevi: Podaljšanje obstojnosti živil, Ljubljana, BF, Oddelek za živilstvo, 1 – 15.

[26] KERRY in sod., 2006. [27] KIRWAN M.J., STRAWBRIDGE J.W. 2003. Plastics in food packaging, Oxford,

Blackwell Publishing Ltd, Boca Raton. [28] Klančnik s sod., 2009. [29] KOVAČ J. 1998. Rentgenska fotoelektronska spektroskopija z visoko lateralno

ločljivostjo-mikro XPS, Vakuumist. [30] KOVAČ J., ZALAR A. 2005. Zmogljivosti rentgenskega fotoelektronskega

spektrofotometra (XPS) na institutu ˝Jožef Stefan˝, Vakuumist. [31] KUMAR S., NEI M. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University

Press, New York. [32] Leae et al, 2004. [33] LEVENSPIEL O. 1972. Chemical Reaction Engineering. New York: J. Wiley. [34] LOPEZ-RUBIO A., GAVARA R., LAGARON M.J. 2006. Bioactive packaging: turning

foods into healthier foods through biomaterials. Institute of Agrochemistry and Food Technology, CSIC, Novel Materials and Nanotechnology, Food Preservation and Quality, Apdo. Correos 73, 46100 Burjassot, Spain

[35] M. HRIBAR in sodelavci: Svetloba in snov, Gradivo za učence 4. letnika, (Didakta, Radovljica,1995).

[36] MAJCEN N., 2000. Spektroskopija, seminarsko-diplomsko delo, UM, Fakulteta za strojništvo.

[37] MAJCEN N., 2003. Obdelava celuloznih vlaken z naravnimi ciklodekstrini in njihov vpliv na lastnosti vlaken, UM, FS, magistrsko delo, Maribor.

[38] MEYER H., 1957. The Ninhydrin Reaction and its Analytical Applications, The Hebrew University, Jerusalem, Israel.

[39] NETTLES SUTTER C. 2006. Opportunities for bio-based packaging technologies to improve the quality and safety of fresh and further processed muscle foods. Department of Food Science, 111 Borland Laboratory, Pennsylvania State University; University Park, PA 16802, United States

[40] NIEKRASZEWICZ A., 2005. Chitosan medical dressings, Fibres & textiles in eastern Europe, volume 13.

[41] PATTON P.A., SHEN S., HOFFMAN A. J., HARRISON, M.D., BUTLER S.E., CRISWELL E.S. 2006. Pullulan films and their use in edible packaging.

[42] PEKLAR L., 2010. Pivo v PET embalaži, UM, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, magistrsko delo.

[43] PIHLAR B., 2008. Osnove analizne kemije. Zapiski predavanj, I. del.; Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Ljubljana.

[44] PIHLAR B., 1998. Osnove analizne kemije. Zapiski predavanj, II. del.; Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Ljubljana.

[45] PINTAR A., BATISTA J., LEVEC J. 2002. In situ Fourier transform infrared spectroscopy as an efficient tool for determination of reaction kinetics.

[46] RAMACHANDRAN T., RAJENDRAKUMAR K., RAJENDRAN R., 2004. Antimicrobial textiles – an overview, Institution of engineers journal, volume 84.

[47] RAYMOND I.P., BROOKFIELD I. 1993. Packaging system for medication. UDL Laboratories, Inc., Rockford.

[48] RISTIĆ T., 2009. Polisaharidi za razvoj medicinskih tekstilij, diplomsko delo, UM, FS.


[49] Sakthi Kumar D., Asano K., Shoji A.., Yoshida Y., Fujioka M., 2007. Surface

modification of poly(ethylene terephthalate) by plasma polymerization of poly(ethylene glycol), Mater med.

[50] SELKE S.E.M., CULTER J.D., HERNANDEZ R.J., 2004. Plastics packaging: Properties, proccesing, aplications and regulations. 2nd ed. Munich, Carl Hansen Verlag: 448 str.

[51] SHI B., LIANG H., KUHN T., DUFFY L., 2006. Surface properties of cell-treated polyethylene terephthalate, American journal of biochemistry and biotechnology.

[52] Skoog, Holler, Nieman, 1998. Principles of instrumental analysis, 5th edition Harcourt Brace & Company.

[53] SMOLE MOŽINA s sod., 2009. [54] STRNAD S., ŠAUPERL O., FRAS L., JAZBEC A., 2007. Hitozan - vsestransko

uporaben biopolimer, Tekstilec, volume 50. [55] Stuart, 1996. [56] ŠOŠTAR B., 2006. Primerjava metod UV-VIS spektrofotometrije in pretočne injekcijske

analize za določanje hitosana v vodnih raztopinah – diplomsko delo; Univerza v Ljubljani; Fakulteta za farmacijo; Ljubljana.

[57] TANAKA H., SAKAMOTO Y., 1992. Polyelectrolyte titration using fluorescent indicator. II. Analysis of cationic starches and flocculants.

[58] THOMAS s sod., 2009. [59] URAGAMI T., TOKURA S., 2006. Material Science of Chitin and Chitosan, Springer,

Kodasha Ltd., Japan. [60] WEIR s sod., 2009. [61] Wikipedia.org. Pridobljeno 23.7.2010, iz http://en.wikipedia.org/wiki/Beer-Lambert_law [62] XUAN J., LIRONG C., WEI Z. 2003. A new linear potentiometric titration method for

the determination of deacetylation degree of chitosan. Department of Macromolecular Science, The Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers, Fudan University, Shanghai 200433, People's Republic of China

[63] ZITAO Z., LIANG C., JINMIN J., YANLIU H., DONGHUI C., 2003. Antibacterial properties of cotton fabrics treated with chitosan, Textile research journal, volume 73.

[64] ZUPANC M., 2009. Priprava tekstilnih substratov za selektivno filtriranje fenola iz odpadnih vod, magistrsko delo, UM, Fakulteta za strojništvo, Maribor.


8 ŽIVLJENJEPIS

Documents

FUNKCIONALIZACIJA POVRŠINE PET (POLIETILEN … · maja kaisersberger funkcionalizacija povrŠine pet (polietilen tereftalatne) folije za dosego protimikrobnih lastnosti diplomsko